Informatie

Induceer plasmide-acquisitie in bacteriën om ze vatbaar te maken voor antibiotica


Is het mogelijk om plasmiden te gebruiken als een manier om antibioticagevoeligheid bij bacteriën te creëren.

Bijvoorbeeld; in Microbiology, een inleiding 13e editie door Pearson, pagina 230 "de onderzoekers traceerden het geneesmiddelresistentieplasmide naar een plasmide gevonden in E coli die vóór de studie in de vrijwilligers woonden".

Ik vroeg me af of het mogelijk is om plasmiden te induceren die die bacteriën vatbaar maken.

Ze moeten in eerste instantie goed zijn voor de bacteriën, bijvoorbeeld een enzym dat de bacteriën in staat stelt een verbinding te gebruiken. Maar door een antibioticum zou dat enzym nuttige verbindingen van de bacteriën katalyseren, waardoor het antibioticum als een cofactor van een dergelijk enzym zou werken. Is het mogelijk? Ik dacht erover als een "trojan plasmide".

Bedankt.

Bewerking: Koppeling aan deze vraag: Kunnen plasmiden en conjugatiemechanismen worden gebruikt tegen antibioticaresistente bacteriën? , het spreekt over die "trojaanse paard"-plasmiden die ze verwijzen op een manier die lijkt te zijn gekoppeld aan een bacteriedodende functie, als de plasmiden in plaats daarvan zijn gekoppeld aan een goede overlevingskans in één situatie (bijvoorbeeld 36 ° C) maar aan een bacteriostatisch situatie (temperatuur loopt op tot 39°) of zoals hemoglobine werkt met CO, het is fundamenteel voor ons, maar selectie heeft niet gewerkt om dit probleem op te lossen en bindt nog steeds aan het molecuul.

Dit type co-evolutie in Wolbachia https://en.m.wikipedia.org/wiki/Wolbachia maakt het gastheerinsect vatbaar voor het nodig hebben van de bacteriën voor reproductie, ondanks dat het goed is in sommige omgevingscondities, veroorzaakt het onvruchtbaarheid bij anderen.

Of het induceren van varianten van genen die nog steeds functioneel zijn maar onder bepaalde omstandigheden zijn gebundeld, als die omstandigheden niet aanwezig zijn in de omgeving, kan de genvariant zich verspreiden zonder problemen te veroorzaken die concurreren met de oorspronkelijke variant totdat aan die omgevingsomstandigheden is voldaan en een evenwicht bereikt in waarbij een % van de bevolking zou kunnen worden gebruikt als doelwit van dat antibioticum.


Mechanismen van bacteriële resistentie tegen antibiotica

De drie fundamentele mechanismen van antimicrobiële resistentie zijn (1) enzymatische afbraak van antibacteriële geneesmiddelen, (2) wijziging van bacteriële eiwitten die antimicrobiële doelen zijn, en (3) veranderingen in membraanpermeabiliteit voor antibiotica. Antibioticaresistentie kan door plasmide worden gemedieerd of op het bacteriële chromosoom worden gehandhaafd. Het belangrijkste resistentiemechanisme tegen de penicillines en cefalosporines is de hydrolyse van antibiotica die wordt gemedieerd door het bacteriële enzym beta-lactamase. De expressie van chromosomale bèta-lactamase kan worden geïnduceerd of stabiel worden onderdrukt door blootstelling aan bètalactamgeneesmiddelen. Methoden om resistentie tegen bètalactamantibiotica te overwinnen zijn onder meer de ontwikkeling van nieuwe antibiotica die bestand zijn tegen bètalactamase-aanvallen en de gelijktijdige toediening van bètalactamaseremmers met bètalactamgeneesmiddelen. Resistentie tegen methicilline, dat stabiel is tegen grampositieve bèta-lactamase, treedt op door de wijziging van een antibioticum-doelwiteiwit, penicillinebindend eiwit 2. De productie van antibiotica-modificerende enzymen en de synthese van voor antibiotica ongevoelige bacteriële doelwitten zijn de primaire resistentiemechanismen voor de andere klassen van antibiotica, waaronder trimethoprim, de sulfonamiden, de aminoglycosiden, chlooramfenicol en de chinolonen. Verminderde penetratie van antibiotica is ook een resistentiemechanisme voor verschillende klassen antibiotica, waaronder de bètalactamgeneesmiddelen, de aminoglycosiden, chlooramfenicol en de chinolonen.


Klebsiella pneumoniae Major Porins OmpK35 en OmpK36 zorgen voor een efficiëntere diffusie van β-lactams dan hun Escherichia coli-homologen OmpF en OmpC

Klebsiella pneumoniae, een van de belangrijkste nosocomiale pathogenen, wordt een groot probleem in de gezondheidszorg vanwege de resistentie tegen meerdere antibiotica, waaronder cefalosporines van de nieuwste generatie en, meer recentelijk, zelfs carbapenems. Dit is grotendeels te wijten aan de verspreiding van plasmide-gecodeerde -lactamasen met uitgebreid spectrum. Antimicrobiële middelen moeten echter eerst door de buitenste membraanbarrière dringen om hun doelen te bereiken, en hydrofiele en geladen -lactams diffunderen vermoedelijk door de porinekanalen. Helaas zijn de eigenschappen van K. pneumoniae-porinekanalen grotendeels onbekend. In deze studie hebben we schone deleties gemaakt van K. pneumoniae porine-genen ompK35 en ompK36 en hebben we de gevoeligheid voor antibiotica en diffusiesnelheden van β-lactams onderzocht. De resultaten toonden aan dat OmpK35 en OmpK36 grotere, meer permeabele kanalen produceerden dan hun Escherichia coli-homologen OmpF en OmpC. OmpK35 produceerde vooral een diffusiekanaal met opmerkelijk hoge permeabiliteit voor lipofiele (benzylpenicilline) en grote (cefepime) verbindingen. Deze resultaten werden ook bevestigd door verschillende porinen tot expressie te brengen in een E. coli-stam zonder belangrijke porinen en de belangrijkste multidrug-effluxpomp AcrAB. Onze gegevens verklaren waarom de ontwikkeling van geneesmiddelresistentie bij K. pneumoniae zo vaak gepaard gaat met het mutatieverlies van de porines, vooral OmpK35, naast de verschillende door plasmiden gedragen genen voor antibioticaresistentie, omdat zelfs hydrolyse door β-lactamasen inefficiënt wordt bij het produceren van hoge niveaus van resistentie als de bacterie een snelle instroom van β-lactams door zijn brede porinekanalen blijft toestaan.

Belang: Bij Gram-negatieve bacteriën moeten medicijnen eerst het buitenmembraan binnendringen, meestal via porinekanalen. Het kwantitatieve onderzoek van de instroomsnelheden is dus essentieel voor de beoordeling van resistentiemechanismen, maar dergelijke studies bestaan ​​niet voor een zeer belangrijke nosocomiale pathogeen, Klebsiella pneumoniae. We ontdekten dat de porine met groter kanaal van dit organisme, OmpK35, een significant groter kanaal produceert dan zijn Escherichia coli homoloog, OmpF. Dit maakt ongemodificeerde K. pneumoniae-stammen vatbaarder voor relatief grote antibiotica, zoals de cefalosporines van de derde en vierde generatie. Zelfs de verwerving van krachtige β-lactamasen zal ze waarschijnlijk niet volledig resistent maken in de aanwezigheid van een dergelijk effectief instroomproces, wat verklaart waarom zoveel klinische isolaten van dit organisme geen porines hebben.

Copyright © 2016, Amerikaanse Vereniging voor Microbiologie. Alle rechten voorbehouden.

Figuren

SDS-PAGE van het buitenmembraan…

SDS-PAGE van de buitenmembraaneiwitten van K. pneumoniae ATCC 11296 en zijn ...


ANTIBIOTICA-RESISTENTE BACTERILE INFECTIES

Antibioticaresistente infecties zijn al wijdverbreid in de VS en over de hele wereld. 1 Uit een nationaal onderzoek van 2011 onder specialisten op het gebied van infectieziekten, uitgevoerd door het IDSA Emerging Infections Network, bleek dat meer dan 60% van de deelnemers in het voorgaande jaar een panresistente, onbehandelbare bacteriële infectie had gezien. 7 Veel volksgezondheidsorganisaties hebben de snelle opkomst van resistente bacteriën beschreven als een 'crisis' of 'nachtmerriescenario' dat catastrofale gevolgen kan hebben. 8 De CDC verklaarde in 2013 dat de mensheid nu in het 'post-antibioticatijdperk' en in 2014 waarschuwde de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) dat de antibioticaresistentiecrisis nijpend wordt. 15 MDR-bacteriën zijn door de IDSA en het Institute of Medicine, evenals de federale Interagency Task Force on Antimicrobial Resistance, uitgeroepen tot een substantiële bedreiging voor de Amerikaanse volksgezondheid en de nationale veiligheid. 1

Onder grampositieve pathogenen, een wereldwijde pandemie van resistente S. aureus en Enterococcus-soorten vormen momenteel de grootste bedreiging. 5, 16 MRSA doodt elk jaar meer Amerikanen dan hiv/aids, de ziekte van Parkinson, emfyseem en moord bij elkaar. 1, 12 Vancomycine-resistente enterokokken (VRE) en een groeiend aantal andere pathogenen ontwikkelen resistentie tegen veel voorkomende antibiotica. 1 De wereldwijde verspreiding van resistentie tegen geneesmiddelen onder veelvoorkomende luchtwegpathogenen, waaronder: Streptococcus pneumoniae en Mycobacterium tuberculosis, is epidemisch. 16

Gram-negatieve pathogenen zijn bijzonder zorgwekkend omdat ze resistent worden tegen bijna alle beschikbare antibiotische geneesmiddelen, waardoor situaties ontstaan ​​die doen denken aan het pre-antibioticumtijdperk. 1 , 5 , 16 De opkomst van MDR (en in toenemende mate panresistente) gramnegatieve bacillen heeft de praktijk op elk gebied van de geneeskunde beïnvloed. 1 De ernstigste gramnegatieve infecties komen voor in zorginstellingen en worden meestal veroorzaakt door Enterobacteriaceae (meestal Klebsiella pneumoniae), Pseudomonas aeruginosa, en Acinetobacter. 5, 16 Gram-negatieve MDR-pathogenen komen ook steeds vaker voor in de gemeenschap. 16 Deze omvatten bèta-lactamase-producerende met een uitgebreid spectrum Escherichia coli en Neisseria gonorrhoeae. 16


Een van de mechanismen waardoor sommige bacteriën resistent worden tegen antibiotica, is door de medicijnen af ​​te breken of te inactiveren. Door dit te doen, maken ze de medicijnen ondoeltreffend, waardoor ze zich kunnen blijven verspreiden.

Hier is een van de beste voorbeelden het vermogen van sommige bacteriën om de effecten van bètalactamantibiotica te weerstaan ​​door de productie van bètalactamase-enzymen.

Voor veel bacteriën is de celwand, die bestaat uit peptidoglycaan, een belangrijk onderdeel dat niet alleen de cel versterkt, maar ook de vorm van de cel behoudt en ook voorkomt dat de cel barst door osmotische druk.

Peptidoglycaan, een hoofdbestanddeel van de celwand, bestaat uit N-acetylglucosamine, N-acetylmuraminezuur en verknopende aminozuurketens. Enzymen die bekend staan ​​als penicillinebindende eiwitten (transpeptidase en D-alanylcarboxypeptidase) zijn betrokken bij de verknoping tijdens de assemblage van de peptidoglycaanlagen in de celwand.

Bèta-lactam-antibiotica, waaronder penicilline en cefalosporines (die een bèta-lactamring hebben), werken door zich op de twee enzymen te richten en zo de synthese van de celwand te remmen. Daarbij veroorzaken ze schade aan de celwand en resulteren in de vernietiging van de cel vanwege de hoge interne osmotische druk. de cel barst omdat de bouw van de celwand wordt aangetast.

Voor bacteriën die bètalactamase kunnen produceren (van degenen die het vermogen daartoe verwerven), kunnen ze het geneesmiddel deactiveren door de bètalactamring open te breken, waardoor het antibioticum wordt gedeactiveerd via een proces dat bekend staat als hydrolyse.

* Bij grampositieve bacteriën wordt de productie van het bètalactamase-enzym geïnduceerd door de aanwezigheid van het antibioticum (bètalactam-antibioticum). Het enzym wordt echter continu geproduceerd door Gram-negatieve bacteriën, zelfs in gevallen waarin de bacterie niet aan het antibioticum is blootgesteld.

Enkele van de bacteriën die het bètalactamase-enzym produceren, zijn:

    aureus
  • Neisseria gonorrhoeae
  • Anaërobe Gram-negatieve bacillen
  • Haemophilus influenzae
  • E coli

Transposons

Resistentietransposons zijn in wezen springende gensystemen die een resistentiegen in het element opnemen. Ze zijn er in vele vormen, onderscheiden zich door structuur, genetische verwantschap en transpositiemechanisme en kunnen een verscheidenheid aan resistentiegenen dragen (Bennett, 2005). Wat wordt geïllustreerd ( Tabellen 1 en ​ en 2) 2 ) zijn slechts enkele van de bekende. Al deze elementen hebben het vermogen om zowel intra- als intermoleculair te bewegen, dat wil zeggen dat ze van de ene plaats naar de andere kunnen springen binnen een DNA-molecuul of van het ene DNA-molecuul naar het andere, bijvoorbeeld van het ene plasmide naar het andere, of van een plasmide naar een bacterieel chromosoom en vice versa. Deze mechanismen vereisen over het algemeen geen DNA-homologie tussen het element en de insertieplaatsen en hoewel er voorbeelden zijn waarbij een bepaald transposon een sterke voorkeur heeft voor een bepaalde nucleotidesequentie op een insertieplaats, vertonen vele andere geen duidelijke voorkeur en worden ingevoegd in nieuwe plaatsen min of meer willekeurig (Craig, 1997).

Tafel 1

transponerenGrootte (kb)EindelementenMarkering(en)
Gram-negatieve elementen
 Tn55.7IS50 (IR)KmBlSm
 Tn92.5IS1 (DR)Cm
 Tn109.3IS10 (IR)Tc
 Tn9033.1IS903 (IR)km
 Tn15254.4IS15 (DR)km
 Tn235010.4IS1 (DR)km
    
Gram-positieve elementen
 Tn40014.7IS256 (IR)GmTbKm
 Tn40033.6IS257 (DR)Tm

Resistentiefenotypes: Bl, bleomycine Cm, chlooramfenicol Gm, gentamicine Km, kanamycine Sm, streptomycine Tb, tobramycine Tc, tetracycline Tm, trimethoprim.

Afkortingen: bp, basenpaar DR, direct repeat IR, inverted repeat kb, kilobase.

Tafel 2

transponerenGrootte (kb)Terminal IR's (bp)Markering(en)
Gram-negatieve elementen
 Tn1538/38ap
 Tn3538/38ap
 Tn212035/38SmSuHg
 Tn5018.235/38Hg
 Tn172111.435/38Tc
 Tn39267.836/38Hg
    
Gram-positieve elementen
 Tn5515.335Ery
 Tn9175.338Ery
 Tn44516.212Cm

Resistentiefenotypes: Ap, ampicilline Cm, chlooramfenicol Ery, erytromycine Hg, kwikionen Sm, streptomycine Su, sulfonamide Tc, tetracycline.

Afkortingen: bp, basenpaar IR, inverted repeat kb, kilobase.

Transposons behoren tot de verzameling mobiele elementen die transponeerbare elementen worden genoemd en die kleine cryptische elementen omvat die insertiesequenties (IS-elementen) worden genoemd, transposons en transponerende bacteriofagen, zoals bacteriofaag μ (Bennett, 2004). Dit laatste type element is een bacterieel virus dat transpositie gebruikt om te repliceren. Een transposon verschilt van een IS-element doordat het codeert voor ten minste één functie die het fenotype van de cel op een voorspelbare manier verandert, bijvoorbeeld een resistentietransposon geeft resistentie tegen een bepaald antibioticum of bepaalde antibiotica.

Transposons zijn ofwel modulaire systemen, ook wel samengestelde transposons genoemd, opgebouwd uit een paar IS-elementen en een centrale DNA-sequentie die niet inherent in staat is om te transponeren, en waarvan de expressie het celfenotype verandert (Figuur 2 en ​ en3) 3 ) of complexe systemen waar transpositie- en niet-transpositiefuncties niet duidelijk modulair zijn geassembleerd (Figuur 4). Voor een IS-element-afhankelijk resistentietransposon zijn twee kopieën van hetzelfde IS-element nodig als flankerende terminale structuren, hetzij als directe of omgekeerde herhalingen, naar het centrale gedeelte dat het (de) gen(en) bevat die antibioticaresistentie verlenen. Hoewel de omgekeerde rangschikking van IS-elementen genetisch stabieler is, biedt de directe herhalingsrangschikking mogelijkheden om te migreren naar een andere plaats waar het IS-element ook wordt gevonden. Dit gebeurt door een homoloog recombinatieproces in twee fasen waarbij een deel van de composietstructuur eerst uit zijn bestaande plaats wordt weggesneden door een enkele kruising tussen de kopieën van het IS-element, waardoor een cirkelvormige, dubbelstrengs DNA-soort vrijkomt die het centrale gedeelte van de composiet omvat resistentietransposon en één kopie van het IS-element, de andere blijft op de oorspronkelijke genetische locatie. Het vrijgekomen DNA kan dan worden gered, in wezen door de eerste recombinatie om te keren, door homologe recombinatie met een enkele cross-over, met behulp van de kopie van de IS-sequentie op het vrije tussenproduct en een andere kopie op de nieuwe locatie, die het samengestelde transposon op de nieuwe locatie herschept. plaats. Aangezien IS-elementen over het algemeen op veel verschillende plaatsen kunnen worden gevonden, met name op verschillende plasmiden, is het potentieel voor het verplaatsen van resistentiegenen met deze methode aanzienlijk. Aan beide regelingen kleven dan ook voor- en nadelen. De omzettingsmodules, de IS-elementen, behouden over het algemeen de mogelijkheid om als afzonderlijke elementen en als onderdeel van de samengestelde structuur te transponeren. Dit is niet het geval bij complexe elementen, die ondeelbaar zijn voor wat betreft de omzetting. De bekende transposons Tn5, coderend voor resistentie tegen aminoglycosiden zoals kanamycine en neomycine, en Tn10 die coderen voor resistentie tegen tetracycline, zijn samengestelde elementen die worden aangetroffen in een aantal Gram-negatieve bacteriën, met name leden van de enterobacteriaceae. Dergelijke samengestelde structuren worden bij toeval gecreëerd en worden gevestigd in een populatie van cellen door de selectieve krachten die op de bacteriële flora inwerken, bijvoorbeeld blootstelling aan respectievelijk kanamycine/neomycine of tetracycline, wanneer het specifieke element een duidelijk overlevingsvoordeel verleent. Na verloop van tijd heeft de structuur de neiging om veranderingen te ondergaan die het stabiliseren. Veel van dergelijke elementen kunnen een relatief recente ontstaansgeschiedenis hebben. In tegenstelling, Tn3, coderend voor resistentie tegen een aantal β-lactam-antibiotica, waaronder ampicilline, en Tn21 (Figuur 5), die codeert voor resistentie tegen streptomycine, spectinomycine en sulfonamiden evenals kwikionen, zijn voorbeelden van complexe transposons en worden ook vaak aangetroffen op plasmiden in leden van de enterobacteriaceae. De constructie van dit type element is minder gemakkelijk te verklaren en er is nog geen algemeen evidence-based model voorgesteld, hoewel aspecten van constructie van sommige complexe transposons, zoals Tn21, kan afgeleid worden. Tn3, Tn21 en soortgelijke elementen zijn waarschijnlijk iets ouder dan de meeste samengestelde transposons en zijn waarschijnlijk het resultaat van meerdere recombinatiegebeurtenissen, waaronder zowel inserties als deleties, die eerst niet-transpositiefuncties invoegen in een cryptisch element en vervolgens de sequentie verfijnen door deletie tot elimineren van 'niet-essentiële' functies. Deze verfijning zou het element compacter en dus gemakkelijker transponeerbaar maken. Er is aangetoond dat het vergroten van de grootte van een bepaald transponeerbaar element de frequentie van transpositie vermindert.

Een schematische weergave van het samengestelde weerstandstransposon Tn5 dat resistentie verleent tegen kanamycine, bleomycine en streptomycine. O, I, buiten en binnen grenzen van de terminal geïnverteerde IS50 elementen die plaats bieden aan de korte terminale omgekeerde herhalingen (IR's) die IS . definiëren50L (linker exemplaar van IS50) en is50R (rechter exemplaar van IS50) en die essentieel zijn voor de omzetting van beide IS50 en Tn5 km, kanamycine-resistentiegen bl, bleomycine-resistentiegen sm, streptomycine-resistentiegen tnp, gen dat codeert voor de IS50 transposase inh, gen dat codeert voor een remmer van de IS50 transposase bp, basenparen (voor meer informatie zie Reznikoff, 2002).

Een schematische weergave van het samengestelde weerstandstransposon Tn10 dat zorgt voor resistentie tegen tetracyclines. Tn10 geeft terminale omgekeerde herhalingen van IS . weer10 IS10L, linker exemplaar van IS10, een niet-functionele kopie van IS10 door meerdere mutaties in het transposase-gen IS10R, rechter exemplaar van IS10 dat codeert voor een functioneel transposase en een antisense RNA-molecuul dat wordt gebruikt voor neerwaartse gereguleerde expressie van het transposase-gen IR, korte omgekeerde herhalingssequenties gevonden aan de uiteinden van IS10, die essentieel zijn voor de omzetting van beide IS50 en Tn10 tetA, gen dat codeert voor de tetracyclineresistentie-effluxpomp tetC,D, genen gecoreguleerd met tetEEN tetR, gen dat codeert voor een transcriptionele repressor die nodig is voor induceerbare expressie, door tetracycline, van tetracycline-effluxpomp TetA bp, basenparen (zie Haniford, 2002 voor meer informatie).

Een schematische weergave van het complexe weerstandstransposon Tn3 die resistentie verleent tegen ampicilline en sommige andere β-lactam-antibiotica. IR, de korte omgekeerde herhaalde sequenties gevonden aan de uiteinden van het transposon, die essentieel zijn voor Tn3 omzetting tnpA, gencoderend element transposase tnpR, gen dat codeert voor een plaatsspecifiek recombinase dat de door transpositie gegenereerde transpositie-co-integraatstructuur oplost blaTEM-1, gen dat codeert voor de TEM-1 β-lactamase bp, basenparen kb, kilobase.

Een schematische weergave van het complexe weerstandstransposon Tn21 die resistentie verleent tegen streptomycine, spectinomycine, sulfonamiden en kwikionen. meerTPCAD, genen die coderen voor resistentie tegen kwikionen en sommige organo-kwikverbindingen meerR, gen dat codeert voor de transcriptionele repressor van het induceerbare mer-operon sul1, gen dat codeert voor resistentie tegen sulfonamiden aadA1, gen dat codeert voor resistentie tegen streptomycine en spectinomycine int, integrase-gen attI, integron-gencassette-insertieplaats tnpA, gen dat codeert voor de Tn21 transposase tnpR, gen dat codeert voor een plaatsspecifiek recombinase dat verantwoordelijk is voor de resolutie van de transpositie-co-integraatstructuur gegenereerd door transpositie pint, int promotor pC, promotor voor integron-gencassettes en sul1.


DISCUSSIE

Hulpmiddelen voor ter plaatse manipulatie van de microbiota staat momenteel in de kinderschoenen. Hier demonstreren we het vermogen van de TAP-antibacteriële strategie om een ​​efficiënte en stamspecifieke antibacteriële activiteit uit te oefenen binnen populaties van meerdere soorten in vitro. TAP's selectieve dodende activiteit induceert een verlies van ∼4-log levensvatbaarheid van de geteste soort. TAP's die gericht zijn op de pOXA-48a carbapenem-resistentieplasmiden resulteren in een toename van 4 tot 5 logs van de gevoeligheid van de stam voor het geneesmiddel. De meeste CRISPR-afgiftemethodologie die momenteel in ontwikkeling is, is gericht op het gebruik van bacteriofagen, die een intrinsiek smal gastheerbereik hebben (35, 36, 7). Bovendien gebruiken verschillende recente onderzoeken met succes het brede gastheerbereik RK2-conjugatiesystemen om CRISPR-systeem te leveren dat zich richt op E coli ( 7–9, 37) of S. enterica ( 11) in vitro. Een belangrijk voordeel van onze strategie ten opzichte van deze benaderingen is de veelzijdigheid die wordt verleend door het CSTB-algoritme dat de robuuste identificatie van gRNA mogelijk maakt die moet worden gebruikt om de TAP's specifiek opnieuw te richten op een of meerdere bacteriële stammen van belang, zonder zich op andere soorten te richten. Ondanks de beschikbaarheid van talrijke programma's die zijn gewijd aan de identificatie van CRISPR-motieven, heeft de CSTB tot nu toe geen equivalent (34). Een ander voordeel is het modulaire ontwerp en de relatief kleine omvang van de mobiliseerbare TAP's (vergeleken met autonome conjugatieplasmiden) die gemakkelijk kunnen worden gewijzigd. De spacer-sequentie die de TAP tegen de beoogde stam(men) richt, evenals de andere samenstellende biobricks (oorsprong van replicatie, oorsprong van overdracht, Cas9, resistentiegen) kunnen worden gewijzigd in eenstapsklonering (zie methoden), waardoor de snelle opbouw van een bibliotheek van TAP's die is aangepast aan de beschouwde toepassingen mogelijk wordt. Ten slotte vermijdt de constitutieve expressie van het CRISPR-systeem (en de fluorescerende reporters) van promotor die actief zijn in een breed scala van Enterobacteriaceae de vereiste van een externe inductor, waardoor de TAP-benadering geschikter wordt voor de modificatie van natuurlijke bacteriële gemeenschappen in vivo.

TAP's die zijn ontworpen om Cas9-gemedieerde dubbelstrengs breuken (DSB's) op het chromosoom van de beoogde bacteriën te induceren, veroorzaken aanzienlijk verlies van levensvatbaarheid. We observeren echter de opkomst van gerichte bacteriën die mutaties hebben ontwikkeld waardoor ze kunnen overleven ondanks de verwerving van de TAP. De frequentie van deze TAP-escape-mutanten varieert van ∼3 × 10 −4 tot 6 × 10 −5, afhankelijk van de spacer en de gebruikte ontvangende stammen (figuren 1D, 3A, 4B en 5B). De fenotypische en sequentieanalyse van E coli en C. rodentium escape-mutanten onthullen twee hoofdmechanismen om aan TAP-activiteit te ontsnappen: (i) Het eerste mechanisme is de verwerving van inserties (transposase of insertiesequenties, IS) of deleties van enkelvoudige nucleotiden die de cas9 gen gedragen door de TAP. Dit soort mutaties waardoor bacteriën kunnen ontsnappen aan CRISPR-activiteit is eerder gemeld met vergelijkbare frequentie (7, 38, 39, 11). Er is ook gemeld dat mutaties of deleties in tracrRNA- of crRNA-sequenties een andere manier zijn om CRISPR-systemen te inactiveren (7, 40, 39, 38). Toch werden dergelijke mutaties niet gevonden in de C. rodentium noch E coli TAP-escape-mutanten geanalyseerd, mogelijk vanwege hun lagere frequentie van voorkomen. (ii) Het tweede mechanisme dat we hebben geïdentificeerd, is de verwerving van puntmutaties of deletie die de beoogde locus wijzigen, waardoor de herkenning door het gRNA wordt belemmerd. Deze werden ook eerder beschreven (15, 28, 11, 38, 7). Bij gebruik van TAP's die gericht zijn op één chromosoomlocus in E coli en C. rodentium, ontsnappingsmutaties vinden plaats door cas9-inactivatie (eerste mechanisme) in 38,7 en 42,8%, en door wijziging van de gerichte locus (tweede mechanisme) in 61,3% en 57,2%, dienovereenkomstig.

We laten zien dat de bijdrage van ontsnappingsmutaties door modificatie van de chromosoomsequentie dramatisch, zo niet volledig kan worden verminderd door de TAP's tegen meerdere chromosoomloci te richten. Inderdaad, de waarschijnlijkheid van het muteren van meerdere chromosoomplaatsen binnen dezelfde bacteriecel zal naar verwachting afnemen naarmate het aantal gerichte plaatsen toeneemt. Bij gebruik van de Cr22-spacer die gericht is op 22 loci van C. rodentium chromosoom, dragen alle negentien geteste ontsnappingsmutanten mutaties die de TAP-geborenen inactiveren cas9 gen. Bijgevolg zien we een 2,9-voudige afname in de frequentie van TAP-Cas9-Cr22-escapers (8,56 × 10 5) in vergelijking met TAP-Cas9-Cr1 (2,47 × 10 −4) die zich richt op één enkele chromosoomlocus. Deze afname is consistent met onze schattingen van de relatieve bijdragen van elk ontsnappingsmechanisme.

De waargenomen frequentie van ontsnappingsmutaties door cas9 inactivatie houdt waarschijnlijk verband met de intrinsieke omzettingssnelheid die naar schatting schommelt tussen 10 −5 en 10 −6 in E coli (41) en de snelheid van spontane mutaties (10 8 en 10 −10 per basenpaar en generatie). In het geval van TAP's is het ook mogelijk dat de inductie van DSB's resulteert in een toename van de mutatiesnelheden door het triggeren van het SOS-geïnduceerde hypermutatorfenotype. Cui en Bikard toonden aan dat een manier om de efficiëntie van CRISPR te verbeteren in E coli gastheercel is om de RecA-activiteit te remmen, wat essentieel is voor DSB-herstel en voor de inductie van de SOS-respons (15). meerb et al. verder voorgesteld om de RecA-activiteit te remmen door het CRISPR-systeem mede tot expressie te brengen met een dominant negatief allel van de recA gen (42). Deze strategieën zijn echter minder relevant in het geval van de TAP's-benadering, omdat ze waarschijnlijk de recombinatievaardigheid en dus de levensvatbaarheid van de niet-gerichte populatie zouden veranderen.

We hebben ook de mogelijkheid aangepakt dat een deel van de mutaties in TAP's al in de donorcellen naar voren komen, wat resulteert in de overdracht van reeds inactieve TAP's naar het ontvangende doelwit. Deze mogelijkheid wordt ondersteund door de sequencing-analyse van één C. rodentium escape-mutant die TAP-Cas9-Cr1 heeft gekregen van een E coli schenker. De sequencing onthulde de invoeging in cas9 van insAB genen die coderen voor transposase-elementen die aanwezig zijn in E coli maar afwezig C. rodentium genomen. Dit resultaat geeft aan dat een mutatie die leidt tot inactivering van TAP's kan optreden in de donorcellen voorafgaand aan de overdracht, zonder uit te sluiten dat ze ook kunnen optreden in de beoogde ontvanger na plasmide-acquisitie.

Ons werk laat zien dat de efficiëntie van TAP's voornamelijk wordt bepaald door twee belangrijke beperkende factoren. De eerste beperkende factor is de ∼10 −4 –10 −5 frequentie van escaper-klonen die mutaties verwerven die de uit het plasmide geboren cas9 gen, of mutaties die de beoogde sequentie wijzigen. Het optreden van escaper-klonen als gevolg van de verwerving van TAP's die vóór de overdracht zijn geïnactiveerd, kan worden verminderd door een transposon-vrij E coli donorstam (43). Zoals getoond in C. rodentiumkan de opkomst van escaper-klonen door mutatie van de beoogde sequentie worden vermeden door zich op meerdere plaatsen op het genoom te richten. Als alternatief is aangetoond dat een andere manier om het ontstaan ​​van ontsnappingsmutanten te voorkomen door de wijziging van het chromosoom is om essentiële genen aan te pakken, welke mutatie vaak dodelijk is voor de cel (40). De tweede beperkende parameter is de efficiëntie van de overdracht van TAP's naar de beoogde stam(men). Deze efficiëntie hangt voornamelijk af van het conjugatieve systeem dat is gekozen om de TAP's te mobiliseren. Hier gebruiken we het F-plasmide als een helperplasmide dat relatief efficiënte TAP's-overdracht (10 −1 – 10 −2) naar nauw verwante Enterobacteriaceae bemiddelt. Daarom lijken TAP's geschikt om zich te richten op een reeks klinisch relevante pathogene of resistente Gram-negatieve bacteriën (E coli, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Salmonella, Yersinia, Shigella, Serratia,enzovoort.). Onlangs is het pPD1-plasmide met smal gastheerbereik ook gebruikt om CRISPR / Cas-systemen over te brengen naar de Gram-positieve Enterococcus faecalis ( 44). Andere gerapporteerde antibacteriële (7, 11) of anti-drug (8-10) methodologieën die gebruik maken van conjugatie zijn meestal gebaseerd op het incP RK2-conjugatieve systeem, dat een breed gastheerbereik biedt, maar een lage efficiëntie van overdracht (10 −4 –10 −5 ). Hamilton et al. hebben aangetoond dat de overdrachtsefficiëntie kunstmatig kan worden verhoogd met behulp van glasparels in vitro (11). Het is ook mogelijk om conjugatiesystemen met een breed gastheerbereik te isoleren met verhoogde overdraagbaarheid. Dergelijke superspreader-plasmidemutanten zijn met succes geïsoleerd via de Tn-seq-benadering (45, 46) en zouden een waardevolle optie kunnen zijn om het bereik van bacteriën te verbreden waarnaar TAP's efficiënt kunnen worden overgedragen.

Het heden vertalen in vitro proof of concept om ter plaatse instellingen zouden een belangrijke stap zijn in de richting van de ontwikkeling van een niet-antibiotische strategie voor de ter plaatse manipulatie van de samenstelling van de microbiota, op een gerichte manier. De efficiëntie van de TAP-methodologie binnen met de gastheer geassocieerde bacteriële gemeenschappen zou voornamelijk afhangen van de conjugatiesnelheden ter plaatse, die vaak verschilt van behaalde tarieven in vitro (47). Zo werd onlangs gemeld dat het IncI2-plasmide TP114 en IncX-type plasmiden zeer actief worden overgedragen in respectievelijk het darmkanaal van de muis (47) en in menselijke fecale microbiomen (48), waardoor ze een goede kandidaat zijn om TAP's in deze gegeven ecosystemen te mobiliseren. . TAP's kunnen worden gebruikt voor de remming van schadelijke pathogene en resistentiestammen van een geïnfecteerde gastheer of omgeving, of als antivirulentiestrategie door remming van virulentie-effectorgenen of genen die betrokken zijn bij biofilmvorming. Voor de toekomstige implementatie van de TAP-benadering in klinische of omgevingsomgevingen zou rekening moeten worden gehouden met de snel evoluerende regelgeving op het gebied van GGO's, CRISPR en biocontainment (49-51).


Hoogtepunten

Antibioticaresistentie (AR) bij bacteriën is een van de grootste bedreigingen waarmee de mensheid momenteel wordt geconfronteerd, en plasmiden spelen een essentiële rol bij de verspreiding van AR onder klinisch belangrijke pathogenen.

Bepaalde associaties tussen AR-plasmiden en pathogene bacteriële klonen komen zeer veel voor.

Bij afwezigheid van selectie op plasmide-gecodeerde eigenschappen, verminderen de meeste plasmiden de bacteriële fitheid. recente in vitro bevindingen tonen aan dat deze kosten worden verlicht door compenserende evolutie. Deze evolutionaire dynamiek (kosten versus compensatie) bepaalt het lot van de plasmide-dragende kloon in de bacteriepopulatie.

De betrokkenheid van plasmidekosten en compenserende evolutie bij de opkomst en verspreiding van succesvolle plasmide-bacterieassociaties in klinische contexten blijft onontgonnen.

Antibioticaresistente infecties zijn een urgent probleem in klinische omgevingen omdat ze het sterfterisico bij ernstig zieke patiënten sterk verhogen. De horizontale verspreiding van antibioticaresistentiegenen onder bacteriën wordt aangedreven door bacteriële plasmiden, wat de evolutie van resistentie bevordert. Cruciaal is dat er specifieke associaties bestaan ​​tussen resistentieplasmiden en bacteriële klonen die vooral succesvol worden in klinische omgevingen. De factoren die ten grondslag liggen aan het succes van deze associaties blijven echter onbekend. recente in vitro bewijs onthult (i) dat plasmiden fitnesskosten veroorzaken bij bacteriën, en (ii) dat deze kosten in de loop van de tijd worden verlicht door compenserende mutaties. Ik beargumenteer dat de door plasmiden opgelegde kosten en de daaropvolgende compenserende aanpassing het succes van associaties tussen plasmiden en bacteriën in klinische omgevingen kunnen bepalen, waardoor de in vivo evolutie van antibioticaresistentie.


Twee-op-één bacteriële virulentiefactor onthuld

Regenboog van kleuren wordt gecreëerd door verschillende concentraties sideroforen, moleculen die door bacteriën worden uitgescheiden om tijdens een infectie ijzer van een gastheer te stelen. Krediet: Shangwen Luo/ Universiteit van Illinois in Chicago

We've all seen the headlines. "Man found to be shedding virulent strain of polio" "Virulent flu strain in Europe hits the economy" "Most virulent strain of E. coli ever seen contains DNA sequences from plague bacteria."

To most of us "virulent" means "aggressive," or just plain "bad," but to a microbiologist it has a more specific meaning. Virulent strains of bacteria are ones that produce "virulence factors," small molecules and proteins that convert a benign bacterium into a pathogen.

They make the difference between E coli that are helpful members of our gut microbiome and the E coli O157:H7 responsible for the Jack-in-the-Box outbreak.

Virulence factors allow bacteria to evade the human immune system, to infect tissues and cells and to establish a foothold within the body. Without them, bacteria would be rapidly cleared by the immune system and unable to establish an infection.

Tim Wencewicz, PhD, assistant professor of chemistry in Arts & Sciences at Washington University in St. Louis, thinks we should be looking for agents that block virulence factors rather than continuing to search for ones to kill bacteria outright. In his vision, antivirulence antibiotics would replace failing bactericidal ones.

"Do we have to find molecules that kill bacteria to fight bacterial infections?," he asks. "Is that really what we have to do?"

The siderophore actinobactin secreted by the bacterium A. baumannii clutching an iron atom (orange) it has stolen from the host for the bacterium's benefit. Credit: Tim Wencewicz

Traditional antibiotics carry with them the seeds of their own destruction, he said. The megadoses of broad spectrum antibiotics often given to patients in clinical medicine apply tremendous selective pressure to bacterial communities, creating rich opportunities for resistant strains by eliminating all susceptible ones.

"Antivirulence antibiotics would apply much less selective pressure," Wencewicz said. "If you treat bacteria in a test tube with an antivirulence antibiotic, the bacteria will grow as if there is no antibiotic there. But if you treat bacteria in the human body, bacterial growth will be suppressed. The antivirulence antibiotic behaves like a traditional bacteriostatic antibiotic, suppressing pathogen's growth until the immune system has time to recognize and clear it.

"We could give anti-virulence antibiotics to people with healthy immune systems, who would be able to clear infections with this assistance," he said, "and traditional antibiotics combined with antivirulence therapies to people with compromised immune systems, who really need them."

In the online issue of the February issue of the ACS journal Infectieziekten, Wencewicz describes one possible drug target: an iron-seeking molecule secreted by the bacterium Acinetobacter baumannii. Now that the complex biochemistry of this virulence factor is better understood, he plans to start looking for agents that block its synthesis or activity.

The bacterium Wencewicz studied illustrates how quickly and spectacularly traditional antibiotics can fail.

A. baumannii, sometimes called "Iraqibacter," emerged as a battlefield pathogen during the wars in the Middle East. "People would be injured, go to the hospital with an open wound and get an Actinetobacter infection," Wencewicz said. "Doctors tried to treat these infections with every drug at their disposal and they found that they were resistant to almost every FDA approved antibiotic. Nothing worked against these infections."

The resistant bacteria soon spread globally and leaked out of hospitals into communities.

A. baumannii is a bad pathogen not because of the number of infections it causes— Staphylococcus aureus causes many more—but because its hallmark is multi-drug resistance.

A Gram-negative bacterium, it has a double cell wall and so is intrinsically resistant to most classes of antibiotics. "Just the fact that it is Gram-negative tosses off the table many antibiotics that would work against Staph, which is Gram-positive," Wencewicz said.

"So you start with a smaller set of antibiotics, but A. baumannii are often resistant to those as well because they swap resistance genes," Wencewicz said. A strain that caused an outbreak in China in 2008 carried a "massive" plasmid, or mobile DNA element, that included 45 resistance genes, he said.

As the pH of its surroundings rises, the siderophore pre-actinobactin (top) rearranges itself structurally to form the molecule actinobactin (bottom) that functions better at the new pH. Two copies of the molecules join to grasp an iron atom. Credit: Tim Wencewicz

If a patient has resistant A. baumannii, the standard of care is to drop back to polymixins, compounds developed in the 1950s that were abandoned in the 1950s because they are so toxic to kidneys, he said. Now, strains resistant to polymixins are being found in hospitals.

"Given the speed with which pathogens resistant to bactericidal antibiotics took over when we selected for them with broad spectrum antibiotics, we should design the next generation of drugs with bacterial evolution in mind," he said.

One class of virulence factors common to many pathogens is siderophores, small molecules whose job is to seek out iron in the environment, wrap around it, and bring it back to the bacterial cell.

"When you get an infection, your body's first response is to starve out the invader. You hide all your nutrients: you flush your amino acids into your kidneys, and drain all nutrient supplies in the blood," Wencewicz said.

This is a particularly effective strategy in the case of iron, because iron is in short supply to begin with. The concentration of iron in the blood can be 10-24 molar (one yoctomole or about one atom of iron per 1.6 liters of blood). Living things need about 10-6 molar concentrations of iron (micromoles) to survive, Wencewicz said.

"Bacteria have to fight this huge concentration gradient in order to grab enough iron to proliferate," he said.

A. baumannii makes three siderophores which work in concert to create a gradient of iron chelation that feeds the metal back to the bacterial cell. But in this research he focused on acetintobactin, a siderophore found in every single clinical isolate of A. baumannii.

A fish pathogen provides a clue

The structure of acinetobactin was published in 1994, and, by 1997, ,scientists had discovered that it was created by the rearrangement (isomerization) of a precursor molecule called pre-acinetobactin.

Wencewicz knew that the fish pathogen Vibrio anguillarum makes a similar compound, called pre-anguibactin, but pre-anguibactin is locked in the "pre" form and does not isomerize. So in this case, it seemed, the "pre" form is a functional siderophore.

He wondered which of the two forms of acinetobactin was the real siderophore: the pre-acinetobactin, the acinetobactin—or both.

He also knew from the literature that A. baumannii could prosper over a wide range of pHs but most sites of infection are acidic. In feite, A. baumannii can induce lactic acidosis by lowering the pH of its surroundings by converting glucose to lactic acid and secreting the acid.

So as a first step his lab measured pre-acinobactin's rate of isomerization over a pH range from 5.5 to 8.0 (roughly from the pH of Pepto Bismol to the pH of baking soda).

"We discovered that pre-acinetobacin is stable at a slightly acidic pH of 5, but at the more basic pH of 8, it rapidly isomerizes to acnetobactin," Wencewicz said.

Why is this siderophore pH sensitive? "Suppose A. baumannii has established itself in a slightly acidic open wound," Wencewicz said, "but depletes the resources there. To gain access to more nutrients it enters the bloodstream, but the pH of blood is 7.4 not 5. When the pH of the bacterium's environment changes, the pre-acinetobactin converts to acinetobactin, which performs better at the new pH."

In short, A. baumannii has evolved a two-for-one siderophore whose conversion from one form to another is triggered by a change in pH.

This strategy pays off, Wencewicz said, because siderophores are metabolically expensive to make. If the bacteria can make one convertible molecule, they don't have to build and maintain two separate pathways for two siderophores.

"We think this may be a general strategy," he said, "because there are other classes of siderophores that also isomerize.

"Now that we know how this siderophore works, we can properly frame techniques to block it," he said. "For example, we might attach something bulky to the siderophore so that when it docks on the bacertium's receptor, it plugs it, preventing the siderophore from ferrying the iron inside."

Wencewicz does not underestimate the enormous distance between a potential drug target and a safe and effective clinical drug.

But given the rapid evolution of bacteria, he feels we shouldn't be turning over every stone looking for new bactericidal compounds that would be just as brittle as those that have already failed. Instead, we should look for antibiotics that, if not evolution-free, at least apply much less selective pressure on bacterial communities to evolve resistance.


How do you know if it worked?

After transformation, bacteria are grown on a nutrient rich food called agar . Only bacteria containing a plasmid with antibiotic resistance will grow in the presence of antibiotic.

For example, if the bacteria are grown on agar containing the antibiotic ampicillin , only the bacteria that have been transformed with a plasmid containing the resistance gene for ampicillin will survive.

Transformed bacteria can then be grown in large amounts. The DNA of interest, or the protein coded for by the DNA, can then be isolated and purified.


Bekijk de video: UJI RESISTENSI BAKTERI - Lab Mikrobiologi (December 2021).