Informatie

Boek over reproductie, evolutie en het gebruik van gist als modelorganisme


Ik ben op zoek naar een goed boek in:

  • Gist reproductie
    • paringstypes
    • recombinatie
    • mechanisme voor het bepalen van het paringstype:
  • Gist evolutie
  • Gist als modelorganisme en het gebruik ervan in experimentele biologie
    • Het moet algemene technieken bevatten die worden gebruikt om met gist te werken. Bijvoorbeeld: we kunnen een plasmide toevoegen om gist voor de gek te houden en ze te laten denken dat ze een ander paringstype hebben dan ze in werkelijkheid hebben.

Opmerking: ik ben natuurlijk vooral geïnteresseerd in Saccharomyces cerevisiae.


Hier is mijn lijst, in willekeurige volgorde.

Methoden in gistgenetica

Enkele andere gistboeken bij CSHL

Fred Sherman's inleiding, gratis verkrijgbaar op verschillende sites, waaronder hier.

De Freiburg-handleiding hier

De tijdloze klassiekers (link naar deel 3 maar bekijk alle delen)

The YeastBook is een poging om een ​​huidige encyclopedie te bouwen om het vorige item op mijn lijst te vervangen.

De Saccharomyces-genoomdatabase, waarschijnlijk de beste organismespecifieke bron ooit.


24.5 Belang van schimmels in het menselijk leven

Hoewel we schimmels vaak zien als organismen die ziekten en rottend voedsel veroorzaken, zijn schimmels op veel niveaus belangrijk voor het menselijk leven. Zoals we hebben gezien, beïnvloeden ze het welzijn van menselijke populaties op grote schaal omdat ze deel uitmaken van de nutriëntenkringloop in ecosystemen. Ze hebben ook andere ecosysteemrollen. Als dierlijke ziekteverwekkers helpen schimmels de populatie van schadelijke plagen onder controle te houden. Deze schimmels zijn zeer specifiek voor de insecten die ze aanvallen en besmetten geen dieren of planten. Schimmels worden momenteel onderzocht als potentiële microbiële insecticiden, waarvan er al verschillende op de markt zijn. Bijvoorbeeld de schimmel Beauveria bassiana is een pesticide dat wordt getest als een mogelijk biologisch bestrijdingsmiddel voor de recente verspreiding van smaragdgroene asboorder. Het is uitgebracht in Michigan, Illinois, Indiana, Ohio, West Virginia en Maryland (Figuur 24.27).

De mycorrhiza-relatie tussen schimmels en plantenwortels is essentieel voor de productiviteit van landbouwgrond. Zonder de schimmelpartner in wortelstelsels zou 80-90 procent van de bomen en grassen niet overleven. Mycorrhiza-inoculanten voor schimmels zijn verkrijgbaar als bodemverbeteraar in tuinierswinkels en worden gepromoot door voorstanders van biologische landbouw.

We eten ook sommige soorten schimmels. Paddenstoelen spelen een prominente rol in het menselijke dieet. Morieljes, shiitake-paddenstoelen, cantharellen en truffels worden als delicatessen beschouwd (Figuur 24.28). De nederige weidepaddenstoel, Agaricus campestris, komt in veel gerechten voor. Schimmels van het geslacht Penicillium veel kazen laten rijpen. Ze zijn afkomstig uit de natuurlijke omgeving, zoals de grotten van Roquefort, Frankrijk, waar wielen van schapenmelkkaas worden gestapeld om de schimmels te vangen die verantwoordelijk zijn voor de blauwe aderen en de scherpe smaak van de kaas.

Fermentatie - van granen om bier te produceren en van fruit om wijn te produceren - is een oude kunst die mensen in de meeste culturen al millennia beoefenen. Wilde gisten worden uit de omgeving gehaald en gebruikt om suikers te vergisten tot CO2 en ethylalcohol onder anaërobe omstandigheden. Het is nu mogelijk om geïsoleerde stammen van wilde gisten uit verschillende wijnregio's te kopen. Louis Pasteur speelde een belangrijke rol bij de ontwikkeling van een betrouwbare biergiststam, Saccharomyces cerevisiae, voor de Franse brouwerij-industrie in de late jaren 1850. Dit was een van de eerste voorbeelden van biotechnologische octrooiering.

Veel secundaire metabolieten van schimmels zijn van groot commercieel belang. Antibiotica worden van nature geproduceerd door schimmels om bacteriën te doden of de groei ervan te remmen, waardoor hun concurrentie in de natuurlijke omgeving wordt beperkt. Belangrijke antibiotica, zoals penicilline en de cefalosporines, worden geïsoleerd uit schimmels. Waardevolle geneesmiddelen geïsoleerd uit schimmels zijn onder meer het immunosuppressivum cyclosporine (dat het risico op afstoting na orgaantransplantatie vermindert), de voorlopers van steroïde hormonen en moederkoren-alkaloïden die worden gebruikt om bloedingen te stoppen. Psilocybine is een verbinding die wordt aangetroffen in schimmels zoals: Psilocybe semilanceata en Gymnopilus junonius, die al duizenden jaren door verschillende culturen worden gebruikt vanwege hun hallucinogene eigenschappen.

Als eenvoudige eukaryote organismen zijn schimmels belangrijke modelonderzoeksorganismen. Veel vooruitgang in de moderne genetica werd bereikt door het gebruik van de rode broodvorm Neurospora crassa. Bovendien zijn veel belangrijke genen die oorspronkelijk zijn ontdekt in S. cerevisiae diende als startpunt bij het ontdekken van analoge menselijke genen. Als eukaryoot organisme produceert en wijzigt de gistcel eiwitten op een manier die vergelijkbaar is met menselijke cellen, in tegenstelling tot de bacterie Escherichia coli, die de interne membraanstructuren en enzymen mist om eiwitten te labelen voor export. Dit maakt gist een veel beter organisme voor gebruik in experimenten met recombinant-DNA-technologie. Net als bacteriën groeien gisten gemakkelijk in cultuur, hebben ze een korte generatietijd en zijn ze vatbaar voor genetische modificatie.


Functionele genomica: gen-eiwit-functie-associatie via mutanten

Waarschijnlijk de belangrijkste en meest duurzame bijdrage van de modelgisten (S. cerevisiae en Schizosaccharomyces pombe) en de wetenschappelijke gemeenschappen die de biologie van deze organismen bestuderen, is de verbinding van genen en eiwitten met de functies die ze aan cellen leveren. Zoals we in 1988 aangaven, hebben de methoden voor het naar believen introduceren van mutaties in en uit het gistgenoom het bijzonder gemakkelijk gemaakt om niet alleen de biochemische functie van genproducten te bestuderen, maar ook de biologische gevolgen van het falen van de genen om functie. Door elke onderzoeker werden mutaties geproduceerd en geïntroduceerd in giststammen, dit werd al snel gezien als snelheidsbeperkend.

Niet lang na de publicatie van de gistgenoomsequentie, Saccharomyces gemeenschap organiseerde een gezamenlijke inspanning die een bijna volledige set van verwijderingen van elk open leeskader produceerde (zie. Winzeler et al. 1999 en Giaever et al. 2002). Elk gen werd vervangen door een geneesmiddelresistentiegen en gemarkeerd met synthetische "barcode" -sequenties. Deze kenmerken maakten elke deletie selecteerbaar, vergemakkelijkten de overdracht door DNA-transformatie, en maakten elke deletie te onderscheiden van alle andere, zodat individuele mutanten kunnen worden gevolgd in schermen van de gehele bibliotheek van deletiemutanten. Mutaties in elk gistgen en vele ensembles van mutaties zijn onderworpen aan diverse biologische testen, wat vaak heeft geleid tot een beter begrip van de biologische rollen van veel van de genen. De bibliotheek van deletiemutanten en zijn derivaten is in de loop der jaren met groot effect geëxploiteerd in experimenten op genoomschaal. Veel van de succesvolle methoden die we samenvatten, zijn gebaseerd op deletiebibliotheken (zie Scherens en Goffeau 2004 voor een overzicht). Een vergelijkbare deletiebibliotheek voor splijtingsgist (S. pombé) is sinds kort beschikbaar (Kim et al. 2010).

Andere uitgebreide mutantbibliotheken zijn geconstrueerd en gebruikt om gistgenfuncties te karakteriseren. De introductie van groen fluorescerend eiwit (GFP) fusietechnologie om eiwitlokalisatie en interacties te visualiseren, werd gebruikt om lokalisatie-informatie te verschaffen voor de meeste eiwitten van gist (Ghaemmaghami et al. 2003 Huh et al. 2003). Bibliotheken van fusies met andere sequentietags zijn geconstrueerd om immunoprecipitatie en detectie van eiwitinteracties te vergemakkelijken. Kenmerkend is dat de gistgemeenschap deze stammen algemeen beschikbaar maakte, wat het werk van iedereen vergemakkelijkte.

Tegenwoordig biedt de Saccharomyces Genome Database (SGD http://www.yeastgenome.org/) informatie over elk gistgen, niet alleen gebaseerd op de literatuur, maar ook op de systematische studie van elk Saccharomyces gen waarover iets is geleerd.

Sinds 1996 is de fractie van de bijna 5800 eiwitcoderende Saccharomyces genen waarvoor een rudimentair begrip van hun biologische rol bekend is, is gestegen van ∼30% tot ∼85%. Deze fractie is veel hoger voor deze gist dan voor elke andere eukaryoot. Bijna 1000 gistgenen (d.w.z., ∼17%) zijn leden van orthologe genfamilies die geassocieerd zijn met ziekten bij de mens (Heinicke et al. 2007). Voor de meeste van deze genen is hun zoogdierhomoloog functioneel in gist en complementeert de gistdeletiemutant. Hoewel we in 1988 slechts op een handvol gevallen van functionele complementatie tussen soorten konden wijzen, zijn ze al lang routine geworden (zie Dolinski en Botstein 2007 voor een overzicht).


Experimentele toolkit en gerelateerde bronnen

Een van de auteurs maakt vaak grapjes met studenten dat het gemak van experimentele manipulatie wordt geboden door S. cerevisiae zou kunnen doen denken dat het geen natuurlijk voorkomend organisme is, maar dat het alleen bestaat voor het plezier van diegenen die geïnteresseerd zijn in het begrijpen van de ingewikkelde werking van eukaryote cellen. Hoewel deze opmerking af en toe een verbijsterde blik kan trekken, weerspiegelt het een sentiment dat door veel gistgeneticisten wordt gevoeld. Om veel van de hulpmiddelen en middelen te illustreren die beschikbaar zijn voor onderzoekers die ontluikende gist als een experimenteel organisme gebruiken, beschrijven we hieronder een hypothetisch scenario en een reeks experimentele benaderingen die een ontluikende gistonderzoeker (de lezer in dit voorbeeld) zou kunnen gebruiken om een ​​wetenschappelijk onderzoek uit te voeren. onderzoek. Om het leerproces verder te bevorderen, hebben we aan het einde van dit gedeelte een activiteit opgenomen waarin we de lezers uitnodigen om samen te vatten wat ze hebben geleerd om een ​​mogelijk model te formuleren dat het biologische proces dat wordt onderzocht, beschrijft en om mogelijke toekomstige onderzoekspaden voor te stellen (zie Tafel 1).

Stel je voor dat je, na een aantal jaren intensief werk als afgestudeerde student, een nieuwe chemische verbinding hebt ontdekt, die we "Kill-It" zullen noemen, die zeer giftig lijkt te zijn voor gistcellen, maar die zoogdiercellen niet schaadt. U bent erg enthousiast over deze ontdekking, aangezien Kill-It, gezien zijn duidelijke specificiteit voor gistcellen, een veelbelovend nieuw antischimmelmedicijn kan zijn. In andere experimenten heb je echter ontdekt dat gistcellen resistent kunnen worden tegen dit medicijn. Je wilt nu het moleculaire mechanisme bepalen dat aan deze resistentie ten grondslag ligt. Bij het definiëren van de basis van resistentie, zul je het begrip van het werkingsmechanisme van het medicijn vergroten, het behandelontwerp beïnvloeden dat is gericht op mogelijk synergetische medicijnen en mogelijk in de toekomst het op doelwit gebaseerde medicijnontwerp van antischimmelmiddelen beïnvloeden. De experimentele strategieën en hypothetische resultaten voor dit project worden hieronder weergegeven.

Isolatie van mutanten

Om het mechanisme te bepalen waarmee gist resistentie tegen Kill-It kan ontwikkelen, begin je met het isoleren van de mutant S. cerevisiae cellen die blootstelling aan het medicijn kunnen weerstaan. Er zijn verschillende hulpmiddelen tot uw beschikking om dergelijke mutanten te isoleren. Je kunt een genetisch selectie-experiment uitvoeren en miljarden mitotisch delende cellen overbrengen naar een vast groeimedium dat Kill-It bevat en selecteren op cellen die kunnen groeien. Dergelijke cellen zouden op een bepaald moment tijdens hun groei een of meer spontane mutaties hebben gekregen voordat ze aan Kill-It werden blootgesteld, waardoor ze resistent werden tegen Kill-It. Indien gewenst kan de snelheid van mutagenese drastisch worden verhoogd door het gebruik van mutagenen, zoals ethylmethaansulfonaat. Als alternatief kunt u interessante mutanten identificeren door middel van genetische screening. Voor deze experimenten kunnen kolonies of patches van haploïde cellen, elk afgeleid van een enkele cel die een onafhankelijke reeds bestaande mutatie draagt, worden gekweekt op permissief vast medium en vervolgens worden overgebracht naar Kill-It-bevattend medium om te screenen op die mutanten die kunnen groeien in aanwezigheid van het medicijn. Om uw studies te vergemakkelijken, kunt u profiteren van een van de verschillende ontluikende gistverwijderingsbibliotheken die worden gegenereerd door de Saccharomyces Genome Deletion Project consortium (http://www-sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/deletions3.html), een verzameling voorwaardelijke mutanten (Li et al. 2011), of een reeks mutanten gegenereerd door insertiemutagenese (zie Vidan en Snyder 2001).

Klassieke genetische analyses van mutanten

Met behulp van een spontaan selectie-experiment isoleer je 40 mutanten die kolonies vormen in de aanwezigheid van Kill-It, je noemt deze mutanten “kir" voor Kziek-lt Rweerstand. U kunt nu profiteren van aspecten van S. cerevisiae die het zo'n effectief experimenteel organisme maken. Ten eerste kun je eenvoudig genetische kruisingen opzetten tussen de kir mutanten en wildtype cellen om diploïden te verkrijgen die heterozygoot zijn voor de kir mutaties om te bepalen of de mutaties recessief of dominant zijn. Deze informatie zal belangrijk zijn bij uw inspanningen om het gen in kwestie te identificeren en biedt ook perspectief op mogelijke mechanismen van de resistentie tegen geneesmiddelen die u in uw oorspronkelijke mutant hebt waargenomen. Een dominante mutatie zou bijvoorbeeld op de een of andere manier het effect van een medicijn kunnen inactiveren, terwijl een recessieve mutatie een doelwit van het medicijn zou kunnen zijn. Vervolgens, aangezien je het originele selectie-experiment slim hebt opgezet met beide MATeen en MATα cellen, je hebt wat MATeen kir mutanten en sommige MATα kir mutanten. Door resultaten van genetische kruisingen tussen recessieve kir mutanten, kunt u complementatietests uitvoeren die u zullen helpen bepalen hoeveel verschillende genen vertegenwoordigd zijn in uw mutante stammen. Je leert dat alle 40 originele mutanten recessief zijn en dat ze kunnen worden gegroepeerd in in totaal vijf complementatiegroepen. In andere experimenten stel je vast dat telkens een enkele genetische mutatie verantwoordelijk is voor het Kill-It-resistentie-fenotype. De mutanten die je hebt geïsoleerd, definiëren dus mutaties in vijf verschillende genen, die je tijdelijk een naam geeft KIR1-KIR5 (zie Tabel 2 voor gennomenclatuur in S. cerevisiae).

Tools voor genidentificatie en initiële functionele karakterisering

U besluit uw vragen te concentreren op: KIR1. Wat is bijvoorbeeld de identiteit van de KIR1 gen? Heeft KIR1 al door anderen bestudeerd, of ben jij de eerste die het identificeert? Is er informatie over de mogelijke functie van? KIR1? Op welk chromosoom doet? KIR1 wonen? Om deze vragen te beantwoorden, onderzoek je of: KIR1 is betrokken bij morfologische of celcyclusprocessen in de cel. U kunt gebruik maken van een eenvoudige microscopische analyse van gist met de kir1 mutatie, waarbij eventuele veranderingen in celvorm of celcyclusdistributie worden genoteerd (het ontluiken valt samen met de voortgang van de celcyclus en daarom kunnen defecten in de regulatie van de celcyclus aanvankelijk worden gekarakteriseerd door deze waarneming). Je vindt dat de kir1 mutatie heeft geen invloed op de cellulaire morfologie sinds kir1 mutante cellen lijken op wildtype cellen.

Vervolgens ontwerp je een experiment om de KIR1 gen met behulp van een functionele complementatiebenadering van de recessieve kir1 allel. Voor deze experimenten verkrijg je een genomische DNA-bibliotheek die is afgeleid van een wildtype stam. Deze bibliotheken bevatten normaal gesproken willekeurige stukjes wildtype genomisch DNA van gist ingebracht in centromere plasmiden van gist, die een centromeer en een ARS-element dragen en dus functioneren als mini-chromosomen. Elk plasmide in de bibliotheek bevat een stuk wild-type DNA dat groot genoeg is om meerdere genen te dragen, en de verzameling van alle bibliotheekplasmiden beslaat over het algemeen het hele genoom meerdere keren. Je introduceert de plasmiden in kir1 cellen met behulp van een van de verschillende transformatieprotocollen, die in ontluikende gist zeer efficiënt zijn (zie bijvoorbeeld Kawai et al. 2010). Om te selecteren voor kir1 cellen die na transformatie een bibliotheekplasmide bevatten, plaats je de cellen op medium waarop alleen cellen die een plasmide bevatten kunnen groeien. De resulterende transformanten worden vervolgens in replica uitgeplaat op medium dat Kill-It bevat om de transformanten te identificeren die zijn hersteld tot een normaal fenotype, d.w.z., zijn nu Kill-It-gevoelig, omdat deze waarschijnlijk een plasmide bevatten dat het wildtype bevat KIR1 gen. De bibliotheekplasmiden van Kill-it-gevoelige kolonies kunnen vervolgens gemakkelijk worden teruggevonden met behulp van een van de verschillende technieken voor het terugwinnen van plasmiden (Robzyk en Kassir 1992) en de sequentie ervan bepalen. Na analyse van het genomische bibliotheekfragment, verkrijgt u de DNA-sequentie die overeenkomt met de wildtype-versie van de KIR1 gen. Met afnemende kosten voor genomische sequencing, wordt het steeds gebruikelijker om functionele complementatie te omzeilen en in plaats daarvan de plaats van een mutatie te lokaliseren door het genoom van de mutante stam direct te sequencen. Een nadeel van deze benadering van genoomsequencing is echter dat het in veel gevallen moeilijk kan zijn om de mutatie te identificeren die verantwoordelijk is voor het fenotype dat wordt onderzocht als er ook aanvullende niet-verwante mutaties aanwezig zijn in het genoom van de mutante stam.

Met de DNA-sequentie van KIR1 in de hand gaat u nu naar de schat aan informatie in de SGD (http://www.yeastgenome.org/ zie ook Cherry et al. 2012). Als opslagplaats voor de S. cerevisiae genoomsequentie (in het bijzonder de S288C-referentiestam), bevat SGD een enorme hoeveelheid informatie over gen- en eiwitfunctie en verspreidt het nieuws dat relevant is voor ontluikende gistonderzoekers. U begint met het gebruik van de BLAST-functie, die de KIR1 sequentie die u hebt verkregen tot de volledige sequentie van het gistgenoom. De BLAST-analyse laat zien dat: KIR1 komt overeen met het gen met de systematische naam YGL264W. [Elk gen, al dan niet eerder onderzocht, krijgt een systematische naam volgens bepaalde richtlijnen (zie tabel 2)]. Als je leest over YGL264W op SGD, ben je enthousiast om te ontdekken dat de functie ervan nog niet is ontdekt! U bent misschien de eerste onderzoeker die een functie ontdekt die verband houdt met dit gen. Met behulp van de Genenregistratie-functie bij SGD kunt u nu “reserveren” KIR1 als de standaardnaam voor YGL264W, die de officiële standaardnaam wordt zodra u deze in een wetenschappelijk tijdschrift publiceert. (Opmerking: YGL264W bestaat niet, het is speciaal voor dit voorbeeld gemaakt.)

Computationele benaderingen voor het onderzoeken van de eiwitfunctie

Als een manier om de mogelijke functie van het Kir1-eiwit in cellen te onderzoeken (zie tabel 2 voor eiwitnomenclatuur), gebruikt u de BLAST-functie die beschikbaar is op de website van het National Center for Biotechnology Information (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/) om de Kir1-eiwitsequentie te vergelijken met eiwitdatabases van andere organismen om te zien of een eiwit dat qua sequentie vergelijkbaar is met Kir1 eerder door anderen is gekarakteriseerd. Tot uw vreugde ontdekt u dat Kir1 aanzienlijke sequentie-overeenkomsten heeft met een eiwit in de fruitvlieg Drosophila melanogaster waarvan bekend is dat het een transcriptiefactor is. SGD maakt ook sequentievergelijkingen tussen organismen van eiwitten of DNA mogelijk om sequenties te identificeren die vergelijkbaar zijn met KIR1 onverschillig S. cerevisiae stammen (http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/FUNGI/alignment.pl) of in andere schimmels (http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/FUNGI/showAlign). Hoewel dergelijke vergelijkingen waarschijnlijk geen inzicht geven in de functie van Kir1, kunnen ze evolutionair geconserveerde kenmerken van een gen of eiwit benadrukken en zo helpen bij de karakterisering van het gen en het eiwit dat wordt onderzocht.

Genetische benaderingen voor het onderzoeken van de eiwitfunctie

Er zijn veel genetische hulpmiddelen beschikbaar in gist om u te helpen de functie van een voorheen niet-gekarakteriseerd eiwit te onderzoeken. Je besluit om te beginnen met het bepalen van de effecten van een volledige knock-out van KIR1 op celfunctie met behulp van een eenstaps-genvervangingsbenadering (Figuur 4A). Om dit te doen, transformeert u een PCR-product dat een selecteerbare marker herbergt, geflankeerd door DNA-sequenties die homoloog zijn aan genomische regio's die flankeren KIR1 in wildtype diploïde cellen en plaat de cellen op selectief medium met behulp van een standaardprotocol (zie bijvoorbeeld Brachmann et al. 1998). De transformatie wordt gedaan in diploïde cellen, zodat de resulterende cellen in leven blijven, zelfs als een verwijdering van KIR1 (kir1∆) dodelijk zouden zijn. Om de effecten van te onderzoeken kir1Δ, dan laat je de diploïde cellen meiose ondergaan, wat resulteert in de vorming van vier meiotische producten (twee wildtype en twee kir1∆) per originele diploïde cel, en vormt wat gistonderzoekers een "tetrad" noemen (Figuur 4B). De resulterende tetrads kunnen vervolgens worden ontleed op vast groeimedium met behulp van een lichtmicroscoop uitgerust met een micromanipulator en de sporen mogen ontkiemen in zichtbare kolonies (Figuur 4B), die vervolgens kunnen worden geanalyseerd op specifieke fenotypes met behulp van een procedure die gewoonlijk wordt aangeduid als tetrad-analyse . Op basis van je tetrad-analyse vind je dat haploïde kir1∆ cellen kunnen groeien en net als de mutanten die je in het eerste selectie-experiment hebt geïsoleerd, zijn ze ook resistent tegen Kill-It (Figuur 4B). Dus, KIR1 is geen gen dat essentieel is voor het leven van een gistcel. Bovendien heeft u de mogelijkheid uitgesloten dat resistentie tegen Kill-It wordt veroorzaakt door een cryptische, secundaire mutatie in uw oorspronkelijke onderzoeken in plaats van door uw kir1 mutatie. Een overvloed aan extra fenotypes kan ook gemakkelijk worden gescoord om inzicht te krijgen in de aard van de kir1∆ mutanten (zie Hampsey 1997). Deze en enkele van de experimenten die in de eerdere secties zijn beschreven, onderstrepen hoe het vermogen om gemakkelijk onderling te converteren S. cerevisiae cellen tussen de haploïde en diploïde toestanden kunnen zeer nuttig zijn bij het uitvoeren van genetische analyses.

Genvervanging in één stap en analyse van meiotische producten door middel van tetrad-analyse. (A) Verwijdering van KIR1. Stap 1: A KIR1 homozygote diploïde cel (KIR1/KIR1: alleen de celkern wordt hier getoond) wordt getransformeerd met een lineair DNA-molecuul (meestal gegenereerd door PCR) dat een selecteerbaar markergen bevat, geflankeerd door regio's die identiek zijn in sequentie aan die die het endogene flankeren KIR1 gen (rode gebieden in het middenpaneel). Stap 2: Na homologe recombinatie tussen het ingebrachte DNA-fragment en een van de twee KIR1 genen, is de getransformeerde cel heterozygoot voor de KIR1 gen en zijn genotype is KIR1/kir1∆. (B) Generatie van sporen, tetrad-manipulatie en tetrad-analyse. De KIR1/kir1∆ cel van A wordt vervolgens getriggerd om meiose te ondergaan door stikstofgebrek om een ​​tetrad te produceren - een set van vier sporen ingekapseld in een ascuszak. Stap 1: Het ascusmembraan wordt gedeeltelijk verteerd en door het gebruik van een lichtmicroscoop die is uitgerust met een micromanipulator, worden de vier sporen vrijgegeven en in een rij op een toelaatbaar vast groeimedium geplaatst en mogen ze ontkiemen. Merk op dat er geen cellen zichtbaar zijn voor de het blote oog onmiddellijk na deze manipulatie op het groeimedium (de donkere rechthoek is een foto van een sectie van een groeischijf zoals deze eruit zou zien na de tetrad-dissectie). Stap 2: Na ∼ 3 dagen incubatie bij 30°, geven de gekiemde sporen aanleiding tot zichtbare kolonies op het groeimedium (de foto toont werkelijke gistkolonies afgeleid van gekiemde sporen). Stap 3: De kolonies worden vervolgens in replica uitgeplaat op vast groeimedium dat Kill-It bevat en men laat ze gedurende 2 dagen bij 30° incuberen. Het 2:2-groeipatroon van de kolonies op de medicijnplaat (twee levend en twee niet in staat om te groeien) komt overeen met de klassieke Mendeliaanse segregatie van een heterozygote eigenschap en kan worden gebruikt om de genotypen van de cellen in elke kolonie af te leiden (en, door uitbreiding van de originele sporen) zoals rechts op de foto aangegeven. (Gezien de hypothetische aard van het experiment, moet worden opgemerkt dat de werkelijke genotypen van de in deze afbeelding gefotografeerde cellen niet zijn zoals aangegeven in de afbeelding en dat het medium op de laatste foto geen Kill-It bevat.)

Het ontluikende gistsysteem is ook bijzonder geschikt voor een reeks genetische experimenten die genetische interacties tussen een gen van belang en andere genen kunnen blootleggen. Deze genetische interacties weerspiegelen vaak fysieke en/of functionele interacties tussen eiwitten en kunnen daarom van cruciaal belang zijn bij het onderzoeken van de functie van een niet-gekarakteriseerd eiwit. Voorbeelden van dergelijke genetische benaderingen omvatten de isolatie van spontane suppressormutaties en suppressors met een hoog aantal kopieën (voor een uitgebreide discussie over suppressieanalyse in gist, zie Prelich 1999) en de implementatie van synthetische letale screenings. Onderdrukking en synthetische dodelijke interacties, evenals andere soorten genetische interacties, kunnen ook worden onthuld door het gebruik van een high-throughput-methodologie die bekend staat als Synthetic Gene Array (SGA) -analyse (voor een gedetailleerde beschrijving, zie Tong en Boone 2006). In een voorbeeld van een SGA-experiment wordt een query-haploïde stam met een nulmutatie in een gen van belang gekruist met een haploïde deletiebibliotheek (bestaande uit ∼ 5000 haploïde stammen, elk met een deletie van een enkel niet-essentieel gen) van de tegenovergestelde paring type. Met behulp van een reeks replica-platingstappen kunnen haploïde cellen die de oorspronkelijke nulmutatie dragen en een van elk van de ∼ 5000 gendeleties die in de bibliotheek worden weergegeven, worden geselecteerd en getest op onderdrukking of synthetisch-dodelijke interacties. Terwijl deze experimenten handmatig kunnen worden uitgevoerd, maken onderzoekers vaak gebruik van robots om de honderden platen te hanteren die nodig zijn voor de analyse van duizenden mutanten. De fenotypische gegevens worden vervolgens samengevoegd tot geninteractienetwerken die toegankelijk zijn als interactieve kaarten. U kiest er in plaats daarvan voor om door te gaan met de hieronder beschreven benaderingen.

Bepalen van de cellulaire lokalisatie van een ontluikend gisteiwit

De functie van een eiwit in de cel is nauw verwant aan zijn subcellulaire lokalisatie. Om de lokalisatie van een eiwit in de cel te onderzoeken, vertrouwen gistgenetici vaak op het efficiënte homologe recombinatiesysteem van S. cerevisiae genfusies genereren tussen een gen van belang en het gen dat codeert voor groen fluorescerend eiwit (GFP) van de kwal Aequorea victoria. Van het resulterende gemanipuleerde gen zou dan worden verwacht dat het een eiwit tot expressie brengt dat bestaat uit het eiwit van belang dat is gefuseerd met GFP, dat kan worden gevisualiseerd in levende cellen met behulp van fluorescentiemicroscopie (zie figuur 1, panelen A en B). U kunt besluiten om deze benadering te gebruiken om twee Kir1-GFP-fusie-eiwitten te genereren - een waarin GFP is gefuseerd aan het N-uiteinde van Kir1 en een andere waarin GFP is gefuseerd aan het C-uiteinde - om u te beschermen tegen de mogelijkheid dat één fusie-eiwit verkeerd gevouwen en dus mogelijk afgebroken (Longtine et al. 1998). Het is echter verstandig om eerst een bezoek te brengen aan de Yeast GFP Fusion Localization Database (http://yeastgfp.yeastgenome.org/), die doorzoekbare eiwitlokalisatiegegevens bevat van een genoombrede studie waarin alle ontluikende gist-ORF's zijn gefuseerd met GFP (Huh et al. 2003). Misschien kunt u uw vraag beantwoorden zonder ook maar één experiment uit te voeren! Uw resultaten suggereren dat Kir1 een nucleair eiwit is, een bevinding die consistent is met zijn orthologie met een transcriptiefactor voor vliegen. Het Kir1-GFP-fusie-eiwit functioneert echter mogelijk niet zoals het wildtype Kir1-eiwit en lokaliseert mogelijk niet naar zijn normale subcellulaire locatie. Het is dus van cruciaal belang om te bepalen of de GFP-gelabelde versie van uw eiwit functioneel blijft. Om de functionaliteit van Kir1-GFP te testen, controleer je haploïde cellen die het fusie-eiwit tot expressie brengen op Kill-It-gevoeligheid en slaak je een zucht van verlichting als je ziet dat de cellen nog steeds gevoelig zijn voor Kill-It. Het Kir1-GFP-fusie-eiwit heeft dus een normale functie, tenminste met betrekking tot de groei op Kill-It, en uw gekarakteriseerde lokalisatiepatroon is waarschijnlijk fysiologisch relevant voor uw studies.

Tools beschikbaar voor gistonderzoekers om eiwit-eiwitinteracties te detecteren

Weten welke andere eiwitten fysiek interageren met Kir1 kan licht werpen op de functie ervan. Gistbiologen hebben verschillende experimentele technieken tot hun beschikking om eiwit-eiwit interacties te onderzoeken. Een krachtige benadering wordt geboden door het twee-hybride systeem van gist, dat de identificatie en analyse van eiwit-eiwit-interacties in een in vivo instelling (Figuur 5 en Chien et al. 1991). Er zijn globale analyses van twee hybride gisten uitgevoerd voor het ontluikende gistproteoom en hebben een schat aan informatie opgeleverd over eiwit-eiwitinteractienetwerken op wereldschaal (Uetz et al. 2000 Ito et al. 2001 Yuu et al. 2008). Standaard biochemische coprecipitatie-experimenten waarin onderzoekers fusies genereren tussen een eiwit van belang en een affiniteitstag (opnieuw profiteren van efficiënte homologe recombinatie in gist) en interagerende eiwitten analyseren met behulp van affiniteitszuivering gevolgd door massaspectrometrie zijn ook veel gebruikte benaderingen voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties. Een populaire affiniteitstag die voor dergelijke experimenten wordt gebruikt, is de zogenaamde Tandem Affinity Purification (TAP) tag (Puig et al. 2001), en er zijn bibliotheken gegenereerd met volledige sets van ontluikende gisteiwitten die aan deze tag zijn gefuseerd (bijv., Ghaemmaghami et al. 2003). Deze technieken zijn toegepast op het gist-proteoom met behulp van high-throughput-technologieën, waardoor complexe netwerken van vermeende eiwit-, RNA- en genetische interacties zijn gegenereerd. Doordat de samenvattende resultaten van deze onderzoeken bij SGD te vinden zijn, hoeft u (weer) zelf geen experimenten te doen om meer informatie over Kir1! En ja hoor, je controleert de samenvatting van de interactiegegevens bij SGD en ontdekt dat Kir1 lijkt te interageren met componenten van Swi/Snf, een chromatine-remodelleringscomplex dat vaak betrokken is bij activering van transcriptie, nogmaals wijzend op de mogelijkheid dat Kir1 betrokken is bij transcriptionele regulatie .

Het twee-hybride systeem van gist. (A) (Boven) Vertegenwoordiging van de gist Gal4-transcriptieactivator met de DNA-bindings- en transcriptieactiveringsdomeinen gekleurd in verschillende tinten blauw, zoals aangegeven. (Onder) Voorstellingen van twee hypothetische hybride eiwitten. Het lokaas bestaat uit een fusie van het Gal4-DNA-bindende domein en eiwit X (oranje), en de prooi bestaat uit het Gal4-activeringsdomein dat is gefuseerd met eiwit Y (groen). (B) (Links) Hypothetisch scenario waarin eiwitten X en Y geen interactie met elkaar hebben. In dit geval wordt het lokaas-eiwit gerekruteerd naar het regulerende gebied van een reportergen (lacZ) maar kan de transcriptie niet activeren zonder een activeringsdomein. Gistkolonies afgeleid van dergelijke cellen blijven wit als ze worden gekweekt in de aanwezigheid van X-gal, een substraat voor de lacZ Product. (Rechts) Hypothetisch scenario waarin eiwitten X en Y fysiek met elkaar interageren. Het lokaas, gebonden aan het regulerende gebied van het reportergen, rekruteert de prooi door een interactie tussen eiwitten X en Y, die op hun beurt de lacZ transcriptie via het activeringsdomein. Kolonies afgeleid van deze cellen zullen blauw worden wanneer ze worden gekweekt in aanwezigheid van X-gal. De interactie tussen eiwitten X en Y kan dus gemakkelijk worden getest door de kleur van de gistkolonie te volgen. Merk op dat interacties tussen aas- en prooi-eiwitten niet noodzakelijk direct hoeven te zijn, maar kunnen worden gemedieerd door overbruggende eiwitten. Omdat eiwitten X en Y uit elke bron kunnen worden afgeleid, kunnen interacties tussen eiwitten van elke soort worden beoordeeld met behulp van dit systeem.

Uw project afronden met behulp van aanvullende technieken die vaak worden gebruikt door gistgenetici

De resultaten die u tot nu toe hebt verkregen, suggereren dat Kir1 een transcriptiefactor kan zijn die betrokken is bij de regulatie van genexpressie. Om deze mogelijkheid verder te onderzoeken, besluit je om een ​​high-throughput-versie van de chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) -techniek (bekend als ChIP-Seq) te gebruiken om te onderzoeken of en waar Kir1 fysiek interageert met chromosomen en de RNA-Seq-techniek om te bepalen welke genen , indien aanwezig, worden onderdrukt of geactiveerd door Kir1. Als je deze benaderingen gebruikt, ontdek je dat Kir1 interageert met het regulerende gebied van een gen dat codeert voor een eerder bestudeerde aminozuurtransporter en dat de expressie van dit gen sterk verminderd is in cellen die zijn verwijderd voor KIR1.

Wat heb je geleerd over het vermogen van ontluikende gistcellen om resistentie tegen Kill-It te ontwikkelen?

Het hypothetische project over Kill-It heeft gediend als een handig platform om veel van de tools en bronnen (samengevat in tabel 3) te bespreken die beschikbaar zijn voor de gistgeneticus. We nodigen nu studenten van gistgenetica uit om terug te gaan naar het begin van deze discussie en na te denken over wat je hebt geleerd over Kill-It met behulp van de verschillende beschreven experimentele benaderingen. Kun je na het invullen van de kolom "Resultaat" in tabel 1 een model bedenken dat de relatie kan verklaren die je hebt ontdekt tussen de Kir1-functie en de toxiciteit van Kill-It? Welke soorten toetsbare hypothesen kunnen op basis van uw model worden geformuleerd? Welke aanvullende experimenten zouden kunnen worden ontworpen om uw begrip van de Kir1-functie in de cel te verdiepen? Hoe zou je de functies van de andere Kir-eiwitten die je hebt geïdentificeerd gaan onderzoeken? Stel je voor dat Kir2 zich op het plasmamembraan bevindt, hoe zou dit in jouw model passen? Er zijn andere genetische hulpmiddelen om de gen- en eiwitfunctie in gist te onderzoeken. Kun je bedenken hoe je een experimentele procedure die hier niet is besproken, zou kunnen opnemen in je zoektocht om de biologie van Kill-It en de Kir-eiwitten te begrijpen?


Invoering

Stel je voor hoe het leven zou zijn als jij en de mensen om je heen niet konden communiceren. Je zou je wensen niet aan anderen kunnen uiten, noch zou je vragen kunnen stellen over je locatie. Sociale organisatie is afhankelijk van communicatie tussen de individuen waaruit die samenleving bestaat, zonder communicatie zou de samenleving uit elkaar vallen.

Net als bij mensen is het van vitaal belang dat individuele cellen kunnen interageren met hun omgeving. Dit geldt zowel voor een eencellig organisme dat in een plas groeit als voor een groot dier dat op een savanne leeft. Om goed te kunnen reageren op externe prikkels, hebben cellen complexe communicatiemechanismen ontwikkeld die een bericht kunnen ontvangen, de informatie over het plasmamembraan kunnen overbrengen en vervolgens veranderingen in de cel kunnen produceren als reactie op het bericht.

In meercellige organismen verzenden en ontvangen cellen voortdurend chemische berichten om de acties van verre organen, weefsels en cellen te coördineren. De mogelijkheid om snel en efficiënt berichten te verzenden, stelt cellen in staat hun functies te coördineren en te verfijnen.

Hoewel de noodzaak van cellulaire communicatie in grotere organismen duidelijk lijkt, communiceren zelfs eencellige organismen met elkaar. Gistcellen signaleren elkaar om te helpen bij het vinden van andere gistcellen voor reproductie. Sommige vormen van bacteriën coördineren hun acties om grote complexen te vormen die biofilms worden genoemd, of om de productie van toxines te organiseren om concurrerende organismen te verwijderen. Het vermogen van cellen om te communiceren via chemische signalen is ontstaan ​​in afzonderlijke cellen en was essentieel voor de evolutie van meercellige organismen. De efficiënte en relatief foutloze werking van communicatiesystemen is van vitaal belang voor al het leven zoals we dat kennen.

Als Amazon Associate verdienen we aan in aanmerking komende aankopen.

Wilt u dit boek citeren, delen of wijzigen? Dit boek is Creative Commons Attribution License 4.0 en je moet OpenStax toeschrijven.

    Als u dit boek geheel of gedeeltelijk in gedrukte vorm opnieuw distribueert, moet u op elke fysieke pagina de volgende bronvermelding opnemen:

  • Gebruik de onderstaande informatie om een ​​citaat te genereren. We raden aan om een ​​citatietool zoals deze te gebruiken.
    • Auteurs: Mary Ann Clark, Matthew Douglas, Jung Choi
    • Uitgever/website: OpenStax
    • Titel van het boek: Biologie 2e
    • Publicatiedatum: 28 mrt. 2018
    • Locatie: Houston, Texas
    • Boek-URL: https://openstax.org/books/biology-2e/pages/1-introduction
    • Sectie-URL: https://openstax.org/books/biology-2e/pages/9-introduction

    © 7 januari 2021 OpenStax. Tekstboekinhoud geproduceerd door OpenStax is gelicentieerd onder een Creative Commons Attribution License 4.0-licentie. De OpenStax-naam, het OpenStax-logo, de OpenStax-boekomslagen, de OpenStax CNX-naam en het OpenStax CNX-logo zijn niet onderworpen aan de Creative Commons-licentie en mogen niet worden gereproduceerd zonder de voorafgaande en uitdrukkelijke schriftelijke toestemming van Rice University.


    Sandwalk

    Hier is het probleem. De meeste schimmels zijn meercellig en Saccharomyces cerevisiae (ontluikende gist) is vrijwel zeker geëvolueerd van een voorouder die hyfen kon vormen. In feite zijn wildtype diploïde stammen of Saccharomyces cerevisiae zullen meercellige filamenten (pseudohypha) vormen als reactie op de honger naar stikstof (Liu et al., 1996).

    Veel van de gangbare laboratoriumstammen hebben het vermogen verloren om meercellige pseudohyfen te vormen, omdat ze een onzinnige mutatie in de FLO8 gen (Liu et al., 1996). Presumably, those strains have been selected by bakers and brewers over the past several thousand years.

    In their discussion, Ratcliff et al. (2012) say .

    I don't this this is quite fair since the yeast strain is just reverting to a primitive condition. This might only have required one or a few mutations. It's not a very good model for de novo evolution of multicellarity.

    The work from Gerry Fink's lab (e.g. Liu et al. 1996) is a good example of why we should be cautious using yeast as a model for anything. The yeast strains used in the lab have been selected for specific characteristics since bread-making and beer-making were first invented over 4000 years ago. We need to be cautious about drawing general conclusions based on work with lab yeast strains.

    The lab exercise based on the Ratcliff et al. (2012) paper [Experimental Evolution of Multicellularity] may be interesting but it's also misleading. The description of that experiment implies that students are reproducing the ancient evolution of multicellularity from single-cell organisms. Instead, what students are actually looking at is the reversion of a derived, exclusively single-cell strain, to the more primitive multicellular state. That's not the same thing.

    [Photo Credit: That's Ford at a rally in Ottawa where we were protesting the Conservative government's clamp-down on science in Canada. He took advantage of the audience to advertise his book.

    Liu, H., Styles, C.A. and Fink, G.R. (1996) Saccharomyces cerevisiae S288C has a mutation in FL08, a gene required for filamentous growth. Genetics 144:967-978. [PDF]

    Ratcliff, W.C., Denison, R.F., Borrello, M. and Travisanoa, M. (2012) Experimental evolution of multicellularity. Proc. nat. Acad. Wetenschap. (USA) 109:1595-1600. [doi: 10.1073/pnas.1115323109]

    8 comments:

    I seem to remember an old experiment using single algae cells (maybe Chlamydomonas) that formed multicellular structures reminiscent of Volvox (multicellular alga) when challenged by predatory amoebae.
    Wouldn't that be a better system to study the evolution of multicellularity?

    I'm guessing you're referring to this article from 1998, on the algae, Chlorella vulgaris. This article directly addresses Larry's concern that the model organism should have no history of multicellularity. Zie onder.

    Boraas, Martin E, Seale, Dianne B, and Boxhorn, Joseph E (1998). Phagotrophy by a flagellate selects for colonial prey: a possible origin of multicellurity. Evolutionary Ecology. 12 (2), 153-64. DOI:10.1023/A:1006527528063

    Abstract: Predation was a powerful selective force promoting increased morphological complexity in a unicellular prey held in constant environmental conditions. The green alga, Chlorella vulgaris, is a well-studied eukaryote, which has retained its normal unicellular form in cultures in our laboratories for thousands of generations. For the experiments reported here, steady-state unicellular C. vulgaris continuous cultures were inoculated with the predator Ochromonas vallescia, a phagotrophic flagellated protist (‘flagellate’). Within less than 100 generations of the prey, a multicellular Chlorella growth form became dominant in the culture (subsequently repeated in other cultures). The prey Chlorella first formed globose clusters of tens to hundreds of cells. After about 10󈞀 generations in the presence of the phagotroph, eight-celled colonies predominated. These colonies retained the eight-celled form indefinitely in continuous culture and when plated onto agar. These self-replicating, stable colonies were virtually immune to predation by the flagellate, but small enough that each Chlorella cell was exposed directly to the nutrient medium.

    Since I've written about this research a couple times, I thought it would be useful to provide some comments from the lead author, William Ratcliff, that he left on my blog when similar questions arose:

    "Well, I don’t buy it that yeast are multicellular in nature. Certainly some yeast in nature form small clusters (like strain RM11), but as far as I know, these are the exception to the rule. Most strains isolated in nature are unicellular, or at most, flocculating (which I still count as unicellular but social). [CZ: "Flocculating" refers to the clumps that unrelated yeast cells form when they starve.]

    In our case, we’re working with strain Y55, a yeast that is is not highly lab adapted (we know this because it still sporulates at nearly 100% efficiency. Sporulation efficiency is typically lost after long periods of lab adaptation.) We’ve known through knockout mutation libraries that breaking the ability to release daughter cells after mitosis gives you a snowflake-shaped cluster. We’re not claiming that we’re the first to observe this phenotype. What we claim is that we’re the first to systematically examine the transition to multicellularity. We see the evolution of clusters from single cells as a result of selection acting on de novo mutations, we see a shift to between-cluster selection, and we see subsequent adaptation occurring cluster-level traits (like division of labor).

    Our yeast are not utilizing ‘latent’ multicellular genes and reverting back to their wild state. The initial evolution of snowflake yeast is the result of mutations that break the normal mitotic reproductive process, preventing daughter cells from being released as they normally would when division is complete. Again, we know from knockout libraries that this phenotype can be a consequence of many different mutations. This is a loss of function, not a gain of function. You could probably evolve a similar phenotype in nearly any microbe (other than bacteria, binary fission is a fundamentally different process). We find that it is actually much harder to go back to unicellularity once snowflake yeast have evolved, because there are many more ways to break something via mutation than fix it. The amazing thing we see is that we rapidly see adaptations to this adaptation. If we select for more rapid settling, snowflake yeast evolve to delay reproduction until the parent is larger, allowing it settle more quickly. We see the evolution of higher rates of apoptosis as a way to regulate the size and number of propagules produced. We show that the transition to multicellularity in yeast is surprisingly easy, and have no reason to suspect it would be any harder in other microbes with a reproductive process similar to yeast."

    Thanks for reposting that comment.

    I don't buy it. The fact is that many yeasts can form hyphae and unless Fink and his group are lying, they have observed strains of Saccharomyces cerevisiae that have multicellular stages.

    That means that this is not a good model for the de novo evolution of multicellularity. I suggest that Ratcliff et al. actually try the same experiment with E coli, paramecium, or diatoms. If they were successful with those species in only a few weeks, it really would be exciting.


    Population genomics of wild and domesticated lineages

    Population genomics has provided a powerful means by which to illuminate the evolutionary history of budding yeast. In initial genome sequencing studies, half of the S. cerevisiae strains sequenced fell into a number of distinct lineages (Figure 3A). Genetic variants within these lineages are mostly unique to a subpopulation and absent in others and evenly distributed across the genome (Liti et al., 2009). Variation in phenotype tends to follow population structure (Warringer et al., 2011). Some of these lineages are characteristic of distinct fermentation processes and might represent examples of domesticated breeds (Fay and Benavides, 2005 Schacherer et al., 2009). These strains do not strictly follow geographic boundaries, for example, wine strains from Europe, Australia, Chile and New Zealand share recent ancestry and reflect human migration history (Legras et al., 2007 Liti et al., 2009 Goddard et al., 2010 Dunn et al., 2012).

    S. cerevisiae genome relationships and population structure.

    (EEN) A phylogenetic tree of S. cerevisiae isolates, adapted from (Wang et al., 2012). The main worldwide and Chinese lineages (denoted, CHN I-V) are highlighted. Lineages CHN-I, CHN-III, CHN-V were mostly isolated from Fagaceae trees in the rainforest of the tropical Hainan Island in the South China Sea. Lineages CHN-II and CHN-IV were isolated from temperate areas in north China (Shaanxi province and Beijing province, respectively). (B) Sequence similarity plots of the Y55 and SK1 laboratory strains showing the relationships to the five, worldwide genetically distinct lineages (listed on the right) along chromosome II. Similarity is defined as N/(D+1), where N is the number of positions in a chromosomal window and D is the number of those positions where the nucleotides differ. The genomes of both Y55 and SK1 are mostly derived from the West African lineage (red line). However, large blocks of the chromosome show drops in similarity to the West African lineage and higher similarity to other lineages. Y55 has three segments (0–50 kb, around 400 kb, from 650 kb to the right telomere) with high similarity to the Wine/European genome (yellow line). Likewise, SK1 has a large segment (650–750 kb) with higher similarity to the Sake lineage (light green line). This type of analysis has revealed the mosaic genome structure of many S. cerevisiae isolates (Liti et al., 2009). Image credit: Anders Bergström and Gianni Liti.

    Other lineages are not associated with human activity and appear to be characteristic of the geographic area. These include oak strains from woodlands in North America and bertam palm strains from the Malaysian rainforest. The Malaysian lineage has the peculiarity of being reproductively isolated from all other lineages due to a complex series of chromosomal rearrangements (Cubillos et al., 2011 Marie-Nelly et al., 2014).

    Although full genome information is not yet available for Chinese isolates of S. cerevisiae, they appear to exhibit strong population structure, with essentially double the combined amount of genetic variation identified in S. cerevisiae isolates sampled from the rest of the world (Wang et al., 2012). Chinese isolates from primeval forests fall into ancient and remarkably diverged lineages (Figure 3A). These results suggest that China harbours a reservoir of S. cerevisiae natural genetic variation, which perhaps gives an indication as to where the species originated. This enrichment of genetic diversity is not limited to S. cerevisiae intra-species variation as Far East Asia is also the only region where all the Saccharomyces sensu stricto species have been isolated.

    In addition to these distinct lineages, many S. cerevisiae strains have been found, after sequencing, to have mosaic recombinant genomes, which reflect a mixed ancestry likely originating from outcrosses between genetically distinct lineages (Figure 3B). Mosaic strains have probably arisen as result of human activities (Liti et al., 2009). Clinical isolates and those used in bakeries and in the laboratory tend to be mosaics, and most of their genomes can be traced to already characterized genetically distinct lineages. Future population genomics studies should further define the genomic features of S. cerevisiae and allow the hybridisation events that generated these mosaic strains to be reconstructed.


    Vragen over wetenschappelijke praktijkuitdaging

    Gamow (1954) proposed that the structure of DNA deduced by Watson and Crick (1953) could be interpreted as a way of forming roughly 20 "words" of the common amino acids from the four "letters" A, T, C, and G that represent DNA nucleotides.

    Crick and coworkers (1961) used a method developed by Benzer to induce mutations in the DNA of a virus by the insertion of a single nucleotide. The mutant could not infect the bacterium Escherichia coli and neither could viruses with a second insertion of a second DNA nucleotide. However, a third nucleotide insertion restored the ability of the virus to infect the bacterium.

    In 1961, Nirenberg and Matthaei conducted a series of experiments to better understand the flow of genetic information from gene to protein. They discovered that in solutions containing the contents of ruptured E coli bacterial cells from which DNA had been removed, polymers containing only one repeating amino acid, phenylalanine, would be synthesized if synthetic mRNA composed of only the single nucleotide, uracil (U), was added to the solution in which phenylalanine was also present. In solutions containing mRNA with only adenine (A) or cytosine (C) and the amino acids lysine or proline, polymers containing only these amino acids would be synthesized. The researchers found that when ribosomes were removed by filtration, these polymers did not form. Nirenberg and Leder (1964) extended this work to include other nucleotides.

    A. Summarize the conclusions regarding the encoding and decoding of heritable information supported by these studies. Explain how these studies provided evidence to support the Triplet Code.

    Khorana (1960) developed a technique for synthesizing RNA composed of predictable distributions of repeated pairs or triplets of nucleotides. He found, for example, that RNA synthesized when A and U were present in relative concentrations of 4:1, respectively, will produce RNA sequences with these distributions determined by their relative probabilities: AAU:AAA, AUA:AAA, and UAA:AAA 0.8 2 × 0.2/0.8 3 = 1/4 [calculated as follows: i) 4/5 of the bases are A, so the likelihood of selecting A is 0.8 ii) the selection is repeated to determine the second letter of the three-letter codon iii) the likelihood of selecting a U is 1 in 5 iv) the probability of selecting the set AUU is the product v) similarly, the probability of AAA is (4/5) 3 and vi) the ratio of these probabilities is their relative likelihood]: AUU:AAA, UUA:AAA, and UAU:AAA 0.8 × 0.2 2 /0.8 3 = 1/16 and UUU:AAA 0.2 3 /0.8 3 = 1/64.

    B. Based on Khorana’s findings, calculate the relative distributions of the following ratios of concentrations of RNA triplet sequences from mixtures in which the relative concentrations of guanine and cytosine, G:C, are 5:1.

    C. Based on the work of Nirenberg, Matthaei, Leder, and Khorana, the following table was constructed (taken from Khorana's Nobel Prize address):

    A solution containing the amino acids shown in the table above and equal concentrations of the two nucleotides C and G is prepared. Predict the proteins that can be synthesized from this mixture in terms of each possible codon and their relative concentrations in terms of their amino acid repeat sequences.

    D. Describe the effects of the codons UAA, UAG, and UGA on protein synthesis.

    The yeast life cycle is usually dominated by haploid cells, each with a single set of unpaired chromosomes. The cell propagates asexually, and the genetic material is replicated through mitosis. Cell division occurs every 2–4 hours, leading to 60–100 generations in a single day. Yeast also reproduce sexually, particularly under adverse environmental conditions. When two haploid cells—with DNA containing complementary mating-type alleles—conjugate, a diploid zygote results. The diploid zygote can then complete the sexual segment of the life cycle through meiosis. After meiosis, four haploid spores are produced, which can germinate.

    Researchers can grow yeast easily on nutrient-containing plates. Because both asexual and sexual reproduction is rapid, yeast has become an important organism for the experimental investigation of mutagenesis and evolution among eukaryotes. Environmental factors, such as chemicals or radiation, induce mutations. High-energy UV-c radiation of less than 1 minute in duration will result in many mutated yeast cells. UV-c can be used to mutate a strain of yeast in which the synthesis of adenine is blocked. This mutation is observable because the ade-2 mutant has a red color when cultured on nutrient-containing plates. Exposure to uv-c also can result in additional mutations. In particular, one mutant, ade-7, changes the color of the ade-2 mutant to white.

    A. You have a uv-c lamp, culture plates, and growth chambers at 23 °C and 37 °C. You also have available known haploid strains that are (ade-2,+,+), waar + denotes the wild type. Ontwerp a plan to determine the rate of uv-c-induced mutations in nutrient-containing plates inoculated with yeast.

    Earth's ozone layer removes high-energy ultraviolet radiation, uv-c, from the solar radiation received at the surface. Lower-energy ultraviolet radiation, uv-b, strikes Earth’s surface. Damage to DNA induced by ultraviolet radiation occurs with the formation of bonds between an adjacent pair of pyrimidine nucleotides, thymine and cytosine, on the same strand of DNA. A repair enzyme, photolyase, which is activated by visible light, is present in plants and most animals, but not in humans. In characterizing the relationship between environmental mutagens and cell damage, a useful assumption is often made and referred to as the linear hypothesis. This assumption states that the extent of damage is proportional to the amount of radiation received.

    Mutation rates for a strain (preac) that does not produce photolyase and a wild-type (+) strain were studied. Cultures of the two strains of yeast were diluted, and nutrient-containing plates were inoculated in triplicate at 23 °C. The plates were exposed to bright sunlight for varying time intervals. After exposure, the plates were incubated in the dark at 23 °C. After incubation between 1 and 8 hours, data shown in the table below were collected by counting the density of living cells relative to the control, and averaging these among replicates.

    B. Using the data table below, graph the average survival fraction, relative to the wild-type control. Predict the number of mutations in a sample of 1,000 cells of the preac type that are exposed to bright sunlight for 15 seconds.

    Yeast can also be used to study sexual reproduction, a somewhat puzzling phenomenon. Cloning of cells through mitosis is molecularly much less complex than meiosis, consumes less energy, and is less risky. Two alternative explanations for the evolution of sexual reproduction are popular. In one model, through assortment of genes, meiosis leads to an increase in the frequency of beneficial mutations. In the second model, detrimental mutations are purged from a population through sex. Studies using yeast (Gray and Goddard, Evol. Biol., 2012 and McDonald et al., Natuur 2012) have provided a mechanism to study these models. As shown below, the fitness (defined as the log of the ratio of the number of cells in successive generations) of yeast is graphed as a function of number of mitotic reproductions in yeast grown in low-stress and high-stress environments, and with and without alternating induction of sexual reproduction.

    C. Based on these data, evaluate the merits of the alternative theories of the adaptive advantage provided by sexual reproduction.

    A. Beschrijven the storage and retrieval of genetic information with the following model. Use the list to fill in the blanks with the letter corresponding to the correct term.

    1. aminozuur
    2. tRNA
    3. DNA
    4. transcriptie
    5. mRNA
    6. vertaling
    7. protein
    8. RNA polymerase
    9. rRNA

    Within the cytoplasm, __ is synthesized from __ bound to __ in a sequence that corresponds to information provided by __. This process is called __.

    Within the nucleus, information originating in __ is encoded as a sequence of bases in __, which is synthesized by the enzyme __ that is embedded in the __. This process is called __.

    B. During development, cell differentiation occurs, and the expression of genes is permanently switched off. Using the model summarized above, explain where information flow is most effectively blocked.

    C. A chemical message is received by the cell regulating the timing of events controlled by gene expression. Using the model summarized above, explain where information flow is most effectively managed.

    Structure and function in biology result from both the presence of genetic information and the expression of that information. Some genes are continually expressed, whereas the expression of most genes is regulated, commonly at the level of transcription. At the initiation of transcription, the TATA-binding protein (TBP) provides access to the DNA strand to be transcribed. The 5’TATAAA3’ sequence called the TATA box is found in prokaryotes, archaebacteria, and eukaryotes. Even among eukarya, when the TATA box is not present among eukaryotes, the initiation of transcription involves TBP. Scientists attribute this common characteristic to the relative thermostability of the A-T interaction. Hydrogen bonds hold the two strands of the DNA double helix together. This type of bond has the smallest interaction energy of all intermolecular forces as temperature increases, these bonds are broken.

    A. Leg uit the advantage, in terms of the energy required, which is provided by an AT-rich region in the sequence where transcription is initiated.

    B. The fact that the TATA box or the associated TBP are common to all domains provides evidence of common ancestry among all life. Pose a scientific question that would need to be addressed by a valid alternative explanation of this fact.

    C. A whole-genome survey of prokaryotes (Zheng and Wu, BMC Bio-informatica, 2010) showed that the relative amounts of guanine and cytosine in DNA poorly predicted the temperature range conditions that are suitable for an organism. Refine the question posed in part B, taking this result into account.

    Only a fraction of DNA encodes proteins. The noncoding portion of a gene is referred to as the intron. The intron fraction depends upon the gene. Introns are rare in prokaryotic and mitochondrial DNA in human nuclear DNA, this fraction is about 95%. The intron is transcribed into mRNA, but this noncoding mRNA is edited out before translation of the coding portion, or exon, of a gene. The edited exon segments are then spliced together by a spliceosome, a very large and complex collection of RNAs and proteins.

    Although introns do not encode proteins, they have functions. In particular, they amplify expression of the exon, although the mechanism is unknown. When introns are very long, which is common among mammalian genes with roles in development, they can significantly extend the time required to complete transcription. Analysis of genes common to different plant and animal species shows many shared intronic positions and base sequences, although in some organisms, such as yeast, many introns have been deleted. Because introns do not encode proteins, mutations can remain silent and accumulate.

    A. As described above, introns are ancestral remnants that are replicated because they do not disadvantage the organism. Consider the claim that introns are “junk DNA.” Evaluate the claim with supporting evidence.

    B. Introns may be retained during transcription. Leg uit how the retention of a transcribed intron between two transcribed exons within a gene could do the following:


    Book on yeast reproduction, evolution and on the use of yeast as model organism - Biology

    Alle door MDPI gepubliceerde artikelen worden direct wereldwijd beschikbaar gesteld onder een open access licentie. Er is geen speciale toestemming nodig om het door MDPI gepubliceerde artikel geheel of gedeeltelijk te hergebruiken, inclusief figuren en tabellen. Voor artikelen die zijn gepubliceerd onder een open access Creative Common CC BY-licentie, mag elk deel van het artikel zonder toestemming worden hergebruikt, op voorwaarde dat het originele artikel duidelijk wordt geciteerd.

    Feature Papers vertegenwoordigen het meest geavanceerde onderzoek met een aanzienlijk potentieel voor grote impact in het veld. Feature Papers worden ingediend op individuele uitnodiging of aanbeveling door de wetenschappelijke redacteuren en ondergaan peer review voorafgaand aan publicatie.

    De Feature Paper kan ofwel een origineel onderzoeksartikel zijn, een substantiële nieuwe onderzoeksstudie waarbij vaak verschillende technieken of benaderingen betrokken zijn, of een uitgebreid overzichtsdocument met beknopte en nauwkeurige updates over de laatste vooruitgang in het veld dat systematisch de meest opwindende vooruitgang in de wetenschappelijke literatuur. Dit type paper geeft een blik op toekomstige onderzoeksrichtingen of mogelijke toepassingen.

    Editor's Choice-artikelen zijn gebaseerd op aanbevelingen van de wetenschappelijke redacteuren van MDPI-tijdschriften van over de hele wereld. Redacteuren selecteren een klein aantal artikelen die recentelijk in het tijdschrift zijn gepubliceerd en waarvan zij denken dat ze bijzonder interessant zijn voor auteurs, of belangrijk zijn op dit gebied. Het doel is om een ​​momentopname te geven van enkele van de meest opwindende werken die in de verschillende onderzoeksgebieden van het tijdschrift zijn gepubliceerd.


    Chapter 6 - Yeast Ecology

    This chapter reviews the studies of the ecology of yeasts in their natural habitats, and the ways in which yeasts have been used to investigate ecological questions. Yeasts are among the earlier colonizers of nutrient rich substrates, where they are followed by a succession of organisms that degrade dead organic matter. However, yeasts are not just decomposers but can assume a diversity of forms and functions in the natural world. Along with their role in the transformation of nutrients, they can engage in intimate relationships with other organisms as mutualists, competitors, parasites, or pathogens. They occur together in communities or guilds linked together through intricate interrelationships. Yeasts are widely distributed throughout all biomes of the world. They have been found in the upper levels of the atmosphere (above the clouds in the stratosphere), in the deepest parts of the oceans, in aquifers under the sea, in ancient glacial ice, and are abundant throughout the phyllosphere. Associates of yeasts include viruses, bacteria, other fungi, algae, vascular plants, and animals of almost any sort.


    Appendix: Spore Germination and Within-Tetrad Mating Frequency

    Relationship between spore germination and within-tetrad mating frequency. We measured the spore germination frequency of the five wild strains on 10% YPD, YPD, and SOE and used this to calculate the proportion of tetrads in which within-tetrad mating was possible (i.e., those containing pairs of germinated spores of opposite mating types). The correlation is statistically significant (R13 = 0.797, P < .001 Student’s t-test), and the linear regression is shown as a dashed line. Error bars show the standard error across three independent assays for within-tetrad mating. YPD = 2% dextrose, 2% bactopeptone, 1% yeast extract 10% YPD = 10% of each component of YPD SOE = 1% sucrose, 0.5% dextrose, 0.5% fructose, 0.15% bactopeptone, 0.1% yeast extract.

    Spore germination of six strains after 24 hours in three environments (average percent ± SE)

    Note. YPD = 2% dextrose, 2% bactopeptone, 1% yeast extract 10% YPD = 10% of each component of YPD SOE = 1% sucrose, 0.5% dextrose, 0.5% fructose, 0.15% bactopeptone, 0.1% yeast extract.


    Bekijk de video: Mijn boekenkast: sapiens een kleine geschiedenis van de mensheid door Yuval Noah Harari (December 2021).