Informatie

14.3: De biologie van mRNA-sequencing - biologie


De eerste stap in mRNA-sequencing is het lyseren van de cellen van belang. Na het vaststellen van deze gesequeneerde uitlezingen, kan het computationele deel van RNA-Seq in drie delen worden verdeeld: leestoewijzing, reconstructie en kwantificering.


14.3 Basisprincipes van DNA-replicatie

Aan het einde van dit gedeelte kunt u het volgende doen:

  • Leg uit hoe de structuur van DNA het replicatieproces onthult
  • Beschrijf de experimenten van Meselson en Stahl

De opheldering van de structuur van de dubbele helix gaf een hint over hoe DNA zich deelt en kopieën van zichzelf maakt. In hun artikel uit 1953 schreven Watson en Crick een ongelooflijk understatement: "Het is ons niet ontgaan dat de specifieke koppeling die we hebben gepostuleerd onmiddellijk een mogelijk kopieermechanisme voor het genetische materiaal suggereert." Met specifieke basenparen kan de sequentie van een DNA-streng worden voorspeld uit zijn complement. Het model met dubbele helix suggereert dat de twee strengen van de dubbele helix tijdens replicatie scheiden, en elke streng dient als een sjabloon van waaruit de nieuwe complementaire streng wordt gekopieerd. Wat niet duidelijk was, was hoe de replicatie plaatsvond. Er werden drie modellen voorgesteld (Figuur 14.12): conservatief, semi-conservatief en dispersief.

Bij conservatieve replicatie blijft het ouderlijke DNA bij elkaar en zijn de nieuw gevormde dochterstrengen bij elkaar. De semi-conservatieve methode suggereert dat elk van de twee ouderlijke DNA-strengen fungeert als een sjabloon voor nieuw DNA dat na replicatie moet worden gesynthetiseerd, elk dubbelstrengs DNA omvat één ouderlijke of "oude" streng en één "nieuwe" streng. In het dispersieve model hebben beide kopieën van DNA dubbelstrengs segmenten van ouderlijk DNA en nieuw gesynthetiseerd DNA afgewisseld.

Meselson en Stahl waren geïnteresseerd in het begrijpen hoe DNA repliceert. Ze groeiden E coli gedurende meerdere generaties in een medium dat een "zware" isotoop van stikstof (15 N) bevat, die wordt opgenomen in stikstofbasen en uiteindelijk in het DNA (Figuur 14.13).

De E coli kweek werd vervolgens in medium geplaatst dat 14 N bevatte en men liet het gedurende verschillende generaties groeien. Na elk van de eerste paar generaties werden de cellen geoogst en werd het DNA geïsoleerd en vervolgens met hoge snelheden in een ultracentrifuge gecentrifugeerd. Tijdens het centrifugeren werd het DNA geladen in een verloop (meestal een oplossing van zout zoals cesiumchloride of sucrose) en gecentrifugeerd met hoge snelheden van 50.000 tot 60.000 rpm. Onder deze omstandigheden zal het DNA een band vormen volgens zijn drijvende dichtheid: de dichtheid binnen de gradiënt waarop het drijft. DNA gekweekt in 15 N zal een band vormen met een hogere dichtheidspositie (dwz verder naar beneden in de centrifugebuis) dan dat gegroeid in 14 N. Meselson en Stahl merkten op dat na één generatie groei in 14 N nadat ze waren verschoven van 15 N. N, bevond de enkele band die werd waargenomen zich tussen het DNA van cellen die uitsluitend in 15 N en 14 N waren gekweekt. Dit suggereerde ofwel een semi-conservatieve of dispersieve wijze van replicatie. Het DNA dat was geoogst uit cellen die gedurende twee generaties in 14 N waren gekweekt, vormde twee banden: één DNA-band bevond zich op de tussenpositie tussen 15 N en 14 N en de andere kwam overeen met de band van 14 N DNA. Deze resultaten kunnen alleen worden verklaard als DNA zich op een semi-conservatieve manier repliceert. En om deze reden werden daarom de andere twee modellen uitgesloten.

Tijdens DNA-replicatie dient elk van de twee strengen waaruit de dubbele helix bestaat als een sjabloon waaruit nieuwe strengen worden gekopieerd. De nieuwe strengen zullen complementair zijn aan de ouderlijke of "oude" strengen. Wanneer twee dochter-DNA-kopieën worden gevormd, hebben ze dezelfde sequentie en worden ze gelijk verdeeld in de twee dochtercellen.


De opkomende biologie van RNA post-transcriptionele modificaties

Het is al lang bekend dat RNA-modificaties centraal staan ​​in de juiste functie van tRNA en rRNA. Terwijl chemische modificaties in mRNA decennia geleden werden ontdekt, is hun functie tot voor kort grotendeels mysterieus gebleven. Met behulp van verrijkingsstrategieën gekoppeld aan sequencing van de volgende generatie, zijn nu meerdere modificaties in kaart gebracht op een transcriptoombrede schaal in verschillende contexten. We weten nu dat RNA-modificaties de celbiologie beïnvloeden door veel verschillende mechanismen - door de RNA-structuur te beïnvloeden, door interacties binnen het ribosoom af te stemmen en door specifieke bindende eiwitten te rekruteren die andere signaalroutes kruisen. Ze zijn ook dynamisch en veranderen in distributie of niveau als reactie op stress zoals hitteschok en tekort aan voedingsstoffen. Hier geven we een overzicht van recente thema's die zijn voortgekomen uit de substantiële vooruitgang die is geboekt in ons begrip van chemische modificaties in veel belangrijke RNA-klassen in eukaryoten.

trefwoorden: Epitranscriptome RNA-modificatie genexpressie post-transcriptionele regulatie eiwittranslatie.

Figuren

Chemische structuren van RNA-modificaties...

Chemische structuren van RNA-modificaties die momenteel worden gekenmerkt in mRNA, geschematiseerd met hun gerapporteerde ...


Inhoud

Het korte bestaan ​​van een mRNA-molecuul begint met transcriptie en eindigt uiteindelijk in afbraak. Tijdens zijn leven kan een mRNA-molecuul ook worden verwerkt, bewerkt en getransporteerd voorafgaand aan translatie. Eukaryote mRNA-moleculen vereisen vaak uitgebreide verwerking en transport, terwijl prokaryotische mRNA-moleculen dat niet doen. Een molecuul van eukaryoot mRNA en de eiwitten eromheen worden samen een boodschapper-RNP genoemd.

Transcriptie

Transcriptie is wanneer RNA wordt gekopieerd van DNA. Tijdens transcriptie maakt RNA-polymerase indien nodig een kopie van een gen van het DNA naar mRNA. Dit proces verschilt enigszins in eukaryoten en prokaryoten. Een opmerkelijk verschil is dat prokaryotische RNA-polymerase associeert met DNA-verwerkende enzymen tijdens transcriptie, zodat de verwerking tijdens transcriptie kan plaatsvinden. Daarom zorgt dit ervoor dat de nieuwe mRNA-streng dubbelstrengs wordt door een complementaire streng te produceren die bekend staat als de tRNA-streng, die, wanneer gecombineerd, geen structuren kan vormen door basenparing. Bovendien is de matrijs voor mRNA de complementaire streng van tRNA, die in sequentie identiek is aan de anticodonsequentie waaraan het DNA bindt. Het kortlevende, onbewerkte of gedeeltelijk verwerkte product wordt genoemd voorloper mRNA, of pre-mRNA eenmaal volledig verwerkt, wordt het genoemd volwassen mRNA.

Eukaryote pre-mRNA-verwerking

De verwerking van mRNA verschilt sterk tussen eukaryoten, bacteriën en archaea. Niet-eukaryotisch mRNA is in wezen rijp bij transcriptie en vereist geen verwerking, behalve in zeldzame gevallen. [2] Eukaryotisch pre-mRNA vereist echter verschillende verwerkingsstappen voordat het naar het cytoplasma wordt getransporteerd en het door het ribosoom wordt getransleerd.

Splicing

De uitgebreide verwerking van eukaryotisch pre-mRNA dat leidt tot het rijpe mRNA is de RNA-splitsing, een mechanisme waarmee introns of outrons (niet-coderende gebieden) worden verwijderd en exons (coderende gebieden) worden samengevoegd.

5' dop toevoeging

EEN 5' pet (ook wel een RNA-cap, een RNA 7-methylguanosine-cap of een RNA m7G-cap genoemd) is een gemodificeerd guanine-nucleotide dat kort na het begin van de transcriptie. De 5'-cap bestaat uit een eindstandig 7-methylguanosineresidu dat via een 5'-5'-trifosfaatbinding is verbonden met het eerste getranscribeerde nucleotide. De aanwezigheid ervan is van cruciaal belang voor herkenning door het ribosoom en bescherming tegen RNasen.

Cap-additie is gekoppeld aan transcriptie en vindt co-transcriptioneel plaats, zodat elk de ander beïnvloedt. Kort na de start van de transcriptie wordt het 5'-uiteinde van het mRNA dat wordt gesynthetiseerd gebonden door een cap-synthetiserend complex dat is geassocieerd met RNA-polymerase. Dit enzymatische complex katalyseert de chemische reacties die nodig zijn voor mRNA-capping. Synthese verloopt als een meerstaps biochemische reactie.

Bewerken

In sommige gevallen zal een mRNA worden bewerkt, waardoor de nucleotidesamenstelling van dat mRNA verandert. Een voorbeeld bij mensen is het apolipoproteïne B-mRNA, dat in sommige weefsels wordt bewerkt, maar niet in andere. De bewerking creëert een vroeg stopcodon, dat bij translatie een korter eiwit produceert.

Polyadenylering

Polyadenylering is de covalente binding van een polyadenylylgroep aan een boodschapper-RNA-molecuul. In eukaryote organismen zijn de meeste boodschapper-RNA (mRNA)-moleculen gepolyadenyleerd aan het 3'-uiteinde, maar recente studies hebben aangetoond dat korte stukken uridine (oligouridylering) ook vaak voorkomen. [3] De poly(A)-staart en het eraan gebonden eiwit helpen bij het beschermen van mRNA tegen afbraak door exonucleasen. Polyadenylering is ook belangrijk voor transcriptieterminatie, export van het mRNA uit de kern en translatie. mRNA kan ook worden gepolyadenyleerd in prokaryotische organismen, waar poly(A)-staarten werken om exonucleolytische afbraak te vergemakkelijken in plaats van te belemmeren.

Polyadenylatie treedt op tijdens en/of direct na transcriptie van DNA in RNA. Nadat de transcriptie is beëindigd, wordt de mRNA-keten gesplitst door de werking van een endonucleasecomplex dat is geassocieerd met RNA-polymerase. Nadat het mRNA is gesplitst, worden ongeveer 250 adenosineresiduen toegevoegd aan het vrije 3'-uiteinde op de splitsingsplaats. Deze reactie wordt gekatalyseerd door polyadenylaatpolymerase. Net als bij alternatieve splicing, kan er meer dan één polyadenyleringsvariant van een mRNA zijn.

Polyadenylatieplaatsmutaties komen ook voor. Het primaire RNA-transcript van een gen wordt gesplitst op de poly-A-additieplaats en 100-200 A's worden toegevoegd aan het 3'-uiteinde van het RNA. Als deze plaats wordt gewijzigd, wordt een abnormaal lang en onstabiel mRNA-construct gevormd.

Vervoer

Een ander verschil tussen eukaryoten en prokaryoten is mRNA-transport. Omdat eukaryote transcriptie en translatie in compartimenten gescheiden zijn, moeten eukaryote mRNA's van de kern naar het cytoplasma worden geëxporteerd - een proces dat kan worden gereguleerd door verschillende signaalroutes. [4] Rijpe mRNA's worden herkend door hun bewerkte modificaties en vervolgens geëxporteerd door de kernporie door te binden aan de cap-bindende eiwitten CBP20 en CBP80, [5] evenals aan het transcriptie/exportcomplex (TREX). [6] [7] Er zijn meerdere mRNA-exportroutes geïdentificeerd in eukaryoten. [8]

In ruimtelijk complexe cellen worden sommige mRNA's getransporteerd naar bepaalde subcellulaire bestemmingen. In volwassen neuronen wordt bepaald mRNA van het soma naar dendrieten getransporteerd. Eén plaats van mRNA-translatie bevindt zich op polyribosomen die selectief onder synapsen zijn gelokaliseerd. [9] Het mRNA voor Arc/Arg3.1 wordt geïnduceerd door synaptische activiteit en lokaliseert selectief nabij actieve synapsen op basis van signalen die worden gegenereerd door NMDA-receptoren. [10] Andere mRNA's verplaatsen zich ook naar dendrieten als reactie op externe stimuli, zoals β-actine-mRNA. [11] Bij export uit de kern associeert actine-mRNA zich met ZBP1 en de 40S-subeenheid. Het complex is gebonden door een motoreiwit en wordt getransporteerd naar de doellocatie (neurietextensie) langs het cytoskelet. Uiteindelijk wordt ZBP1 gefosforyleerd door Src om de translatie te starten. [12] Bij het ontwikkelen van neuronen worden mRNA's ook getransporteerd naar groeiende axonen en vooral groeikegels. Veel mRNA's zijn gemarkeerd met zogenaamde "zip-codes", die gericht zijn op hun transport naar een specifieke locatie. [13]

Vertaling

Omdat prokaryotisch mRNA niet hoeft te worden verwerkt of getransporteerd, kan de translatie door het ribosoom onmiddellijk na het einde van de transcriptie beginnen. Daarom kan worden gezegd dat prokaryotische vertaling is gekoppeld naar transcriptie en komt voor co-transcriptioneel.


Met mRNA een nieuwe categorie medicijnen ontwikkelen.

Bij Moderna maken we gebruik van de fundamentele rol die mRNA speelt bij de eiwitsynthese. We hebben eigen technologieën en methoden ontwikkeld om mRNA-sequenties te creëren die cellen herkennen alsof ze in het lichaam zijn geproduceerd. We richten ons op ziekten waarbij het in staat stellen van gerichte cellen om een ​​of meer bepaalde eiwitten te produceren - of 'aan' te zetten - het lichaam in staat stelt een bepaalde ziekte te bestrijden of te voorkomen.

  • We beginnen met onze gewenste volgorde voor een eiwit.
  • We ontwerpen en synthetiseren de corresponderende mRNA-sequentie - de code die dat eiwit zal creëren.
  • Vóór de synthese hebben we die mRNA-sequentie ook gemanipuleerd om de fysieke eigenschappen van het mRNA te optimaliseren, evenals die van het gecodeerde eiwit.
  • We leveren de mRNA-sequentie aan de cellen die verantwoordelijk zijn voor het maken van dat eiwit via een van de verschillende modaliteiten. Het bereiken van verschillende soorten cellen vereist verschillende toedieningsmethoden.
  • En als het mRNA – de instructies – eenmaal in de cel zijn … neemt de menselijke biologie het over. Ribosomen lezen de code en bouwen het eiwit op, en de cellen brengen het eiwit tot expressie in het lichaam.

Het gebruik van mRNA als medicijn biedt een breed scala aan mogelijkheden om ziekten te behandelen en te voorkomen. mRNA-medicijnen kunnen in cellen gaan om de eiwitproductie te sturen, iets wat niet mogelijk is met andere geneesmiddelenbenaderingen. We hebben het potentieel om ziekten te behandelen of te voorkomen die tegenwoordig niet kunnen worden aangepakt, waardoor de menselijke gezondheid mogelijk wordt verbeterd en levens over de hele wereld worden beïnvloed.

Leer meer over de intrinsieke eigenschappen van mRNA, hoe het wordt gebruikt in cellen door het hele lichaam en de diversiteit aan mogelijke toepassingen voor het gebruik van mRNA om nieuwe medicijnen te ontwikkelen.


Bekijk de video: DNA translatie, transcriptie en eiwitsynthese (November 2021).