Informatie

4.6: Moleculaire imprinting - Biologie


Moleculaire herkenning is de basis van veel biologische processen. Een belangrijk accent in de biotechnologie is de ontwikkeling van synthetische herkenningsmoleculen en -systemen die specifiek zijn voor een ligand van belang. Een tak van moleculair ontwerp omvat de synthese van moleculen met een specifieke stereochemische structuur die is ontworpen om een ​​bepaald ligand te herkennen en ermee in wisselwerking te treden. Moleculaire imprinting daarentegen is een methode om een ​​molecuul te construeren, met specifieke herkenningseigenschappen, door de ligand zelf leiding geven aan de montage van de gewenste structuur

Technische aspecten

De algemene benadering van de techniek is om het gewenste "afdruk"-molecuul te combineren met een oplossing van kleine monomere moleculen die verschillende gewenste eigenschappen heeft. Ze hebben een verscheidenheid aan functionele groepen (bijvoorbeeld waterstofbrugdonoren, acceptoren, mogelijk zure of basische groepen, of alifatische of aromatische groepen). Een of meer van deze groepen kunnen specifiek interageren met het imprintmolecuul (ze kunnen bijvoorbeeld specifieke waterstofbruggen vormen). De monomere moleculen kunnen worden gemaakt om te polymeriseren om een ​​stijf of halfstijf polymeer te vormen. Het afdrukmolecuul is oplosbaar in de monomeeroplossing. De monomeren vormen, in oplossing of tijdens het polymerisatieproces, geen covalente bindingen met het afdrukmolecuul (de interactie is strikt niet-covalent)

Na polymerisatie van de monomeren (in aanwezigheid van het afdrukmolecuul) zijn de algemene kenmerken van het polymeer als volgt:

  1. Het polymeer is poreus genoeg om het afdrukmolecuul naar buiten te laten diffunderen (en ook naar binnen te diffunderen)
  2. Het polymeer is stijf genoeg dat de organisatie van monomere moleculen als reactie op het afdrukmolecuul behouden blijft.
  3. Daarom blijft de stereochemie (d.w.z. grootte, vorm en oriëntatie van geschikte functionele groepen) van de zak waar de afdrukmoleculen zich bevonden behouden.
Deze plaatsen in het polymeer vormen een "geïnduceerd moleculair geheugen" dat in staat is om het afdrukmolecuul selectief te herkennen

De typische polymeerproductietechniek was om een ​​in bulk bedrukt polymeer te produceren en dit vervolgens te vermalen om kleine deeltjes (25 mm) te produceren. Dergelijke kleine korrels zijn geschikt voor vloeistofchromatografiemethoden (d.w.z. kunnen worden gebruikt als chromatografische harsen en in een kolom worden verpakt). "Suspension"-polymerisatie kan kralen direct uit het polymerisatieproces opleveren

De meeste van de gerapporteerde moleculair geprinte polymeren zijn gemaakt van monomeren van acrylaten, styrenen of silicaten, en de imprintstap is uitgevoerd in organische oplosmiddelen. Imprinting in organische oplosmiddelen (bijv. oplosmiddelen met een lage diëlektrische constante) verbetert de waterstofbinding (d.w.z. gedeeltelijke elektrostatische) interacties. Het kan echter de afdrukmoleculen beperken tot die moleculen die oplosbaar zijn in dergelijke oplosmiddelen.

Voorbeeld (PageIndex{1})

Imprinting van het aminozuur L-fenylalanine met methacrylzuurmonomeren en de enantioselectieve binding van het imprintmolecuul.

  • Stap I. "Afdrukken"

Figuur 4.6.1: Imprinting

  • Stap II. Gebruik van het bedrukte polymeer als een chromatografische hars om bij voorkeur de enantiomere selectie van L-fenylalanine te bereiken uit een racemisch mengsel van L- en D-fenylalanine

Figuur 4.6.2: Enantiomere selectie

Toepassingen

Drie belangrijke toepassingsgebieden van MIP's zijn onder meer chromatografische matrices voor moeilijke (bijv. enantiomere) scheidingen, katalytisch actieve polymeren of enzymnabootsers, en biosensor-apparaten.

Scheidingen

Er zijn ongeveer 500 geneesmiddelen op de markt die optisch actief zijn, waarvan ongeveer 90% als racemische mengsels wordt toegediend. De FDA vereist nu dat voor optisch actieve geneesmiddelen beide enantiomeren als afzonderlijke stoffen moeten worden behandeld in farmacokinetische en toxicologische profilering. Er is grote behoefte aan preparatieve methoden voor enantiomeerscheidingen

Andere scheidingen

MIP's gemaakt tegen bepaalde alkaloïden of opiaten kunnen onderscheid maken tussen de ingeprinte verbindingen en nauw verwante verbindingen

Figuur 4.6.3: Nauw verwante verbindingen die kunnen worden gescheiden met MIP's

Bedrukte polymeren als enzymnabootsers

Als afdrukken worden voorbereid tegen overgangstoestand analogen, zal de MIP de overgangstoestand stabiliseren en resulteren in verhoogde katalytische snelheden. Verhoogde katalytische snelheden (omzet) in vergelijking met substraatomzetsnelheden in oplossing zijn waargenomen met polymeren bedrukt met overgangstoestandanalogen. Het zijn echter over het algemeen slechte katalysatoren. Dit is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan het feit dat geen specifieke stereochemische plaatsing van katalytische groepen is geprobeerd. Dergelijke MIP's vormen dus een geschikt kader om katalytische groepen te plaatsen om efficiënte katalyse te bereiken

Figuur 4.6.4: Opdrukken als versterker voor katalytische snelheden

Bedrukte polymeren als substraatselectieve sensoren

"biosensoren" zijn apparaten die specifieke receptormoleculen integreren met signaaltransductieapparaten. De transducer kan de bindingsenergie van de MIP/analyt omzetten in veranderingen in protonen, lichtabsorptie, warmte, enz. Dit fysisch/chemische signaal wordt versterkt en afgegeven aan een meetinstrument. In principe kan de analyt elk molecuul zijn dat specifiek kan worden bedrukt. Bijvoorbeeld een milieutoxine.

Figuur 4.6.5: Bedrukte polymeer als biosensor

Conclusies

Hoewel het meeste werk met MIP betrekking heeft op kleine moleculen, zou het in principe mogelijk moeten zijn om de bruikbaarheid van MIP uit te breiden met herkenning van biomoleculen (d.w.z. eiwitten, nucleïnezuren). Een dergelijke MIP zou vergelijkbare specificiteiten moeten vertonen. Als MIP bindingsplaatsen van biomoleculen kan nabootsen, kunnen ze nuttige alternatieven zijn voor het screenen van nieuwe remmers of antagonisten. Een mogelijke beperking is die van "mutagenese". Kan een polymeer dat al is bedrukt, worden "gemutageniseerd" (chemisch gemodificeerd?) om nieuwe/verbeterde herkenningskenmerken te produceren? Een andere beperking is dat de exacte stereochemische structuur van de afdruk niet bekend is. Daarom is de structurele informatie van een bruikbare afdruk niet beschikbaar.


Optisch detectiesysteem voor triazine op basis van moleculair geprinte polymeren

Een nieuw systeem voor de detectie van triazine-herbicide werd bereid met behulp van de moleculaire imprinting-benadering. Deze methode is gebaseerd op de competitie tussen fluorescent-gelabelde en ongelabelde substantie-analyt voor de specifieke bindingsplaatsen, die in polymeer werden geproduceerd door het afdrukken van de sjabloon. Polymeersynthese bestaat uit radicale polymerisatie van functioneel monomeer (diethylamino-ethylmethacrylaat of methacrylzuur) en cross-linker (ethyleenglycoldimethacrylaat) in aanwezigheid van triazine als template. Na het vermalen van het polymeerblok en het afsplitsen van de matrijsmoleculen werd een suspensie van het polymeer gebruikt voor het herbicide-specifieke sensorsysteem. Selectieve detectie van triazine in het concentratiebereik van 0,01-100 mM werd binnen 4 uur bereikt.

Deze methode lijkt toepasbaar voor de ontwikkeling van optische sensoren, waarbij de hoge gevoeligheid en selectiviteit die kenmerkend is voor biologische receptoren en de hoge stabiliteit van de synthetische moleculair ingeprinte polymeren worden gecombineerd.


Klanten-reviews

Recensies met afbeeldingen

Toprecensies uit de Verenigde Staten

Er is op dit moment een probleem opgetreden bij het filteren van beoordelingen. Probeer het later opnieuw.

Het boek zelf is fantastisch. U krijgt echter niet alles waarvoor u heeft betaald. en ik heb VEEL betaald. Er zouden 174 films online toegankelijk moeten zijn, samen met flashcards en dia's. Deze zijn niet meer leverbaar. Aangezien dit de meest recente versie van het boek is, is dit onaanvaardbaar. De uitgever moet dit op zijn minst duidelijk maken in de beschrijving, zodat mensen weten dat dit materiaal ontbreekt. Het is nogal teleurstellend, aangezien de auteurs door het hele boek naar deze films verwijzen.

UPDATE: ik heb mijn beoordeling verhoogd naar 4 sterren, omdat ik op de een of andere manier toegang heb gekregen tot de video's op wwnorton.com. Het was echter een ingewikkeld proces dat meerdere e-mails en tegenstrijdige antwoorden van de uitgever vereiste. Eerst kreeg ik te horen dat de video's niet beschikbaar waren. Toen kreeg ik een link naar de video's, maar werd gevraagd om meer dan $ 100 per jaar te betalen om toegang te krijgen. Uiteindelijk hebben ze het abonnement voor mij gekocht. Alles is goed afgelopen, maar ik weet niet zeker of iedereen een positief resultaat zal hebben. Het hangt af van met wie je praat bij de klantenservice.

[Update, september 2017: een waarschuwing hier dat er nu twee Kindle-edities van het boek beschikbaar lijken te zijn. De originele "eTextbook / Print Replica Kindle Edition'34 die lijkt op een PDF-bestand van het daadwerkelijke gedrukte boek, en een nieuwe '34Kindle Edition'34 die *niet* in Print Replica-formaat is. Deze laatste nieuwe editie heeft een andere ASIN en toont meer dan 3.000 pagina's (pagina-omslag op een Kindle-apparaat, geen echte pagina's). Pas echter op, want het zal niet de mooie lay-out en typografie van de originele versie hebben. Het IS leesbaar op elk Kindle-apparaat (niet alleen degenen die de Print Replica-titels kunnen weergeven), en zou het mogelijk moeten maken de lettergrootte te vergroten om de tekst leesbaarder te maken voor degenen die de paginagrote afbeeldingen van het originele boek te klein of moeilijk te vinden vinden. beheren. Persoonlijk geef ik de voorkeur aan de originele eTextbook-editie die een exacte reproductie is van het gedrukte boek. Zorg er in ieder geval voor dat je de juiste versie bestelt (ze lijken momenteel dezelfde prijs te delen) en maak je geen zorgen over het feit dat de nieuwe Kindle-versie meer '34pagina's'34 toont en een grotere bestandsgrootte heeft dan de originele eTextbook-versie.]

Deze recensie is gebaseerd (meestal, zie update aan het einde) op de Kindle-editie van het boek, een 'Print Replica'34-editie die exact overeenkomt met het gedrukte leerboek (het is in wezen als een PDF van het hele boek). Voor studieboeken, zelfs de meest waardevolle (zoals deze) waar ik van hou en die ik voor lange tijd wil bewaren, geef ik nu om vele redenen de voorkeur aan elektronische versies, niet in de laatste plaats omdat het gemakkelijker is om een ​​tablet vast te houden en te lezen dan een boekdeel van zeven pond. Je kunt ook inzoomen op tekst en figuren als dat nodig is, en de illustraties zijn bijna allemaal in "vector"-vorm, wat betekent dat ze scherp en gedetailleerd blijven als je inzoomt. Je kunt ook de volledige tekst van het boek doorzoeken, elektronisch onderstrepen , bladwijzers instellen, enz.

Ja, de Kindle-studieboeken hebben DRM die beperkt wat je ermee kunt doen, maar ik vind de Kindle-beperkingen minder zwaar dan veel, en in de meeste gevallen geven ze je de optie om studieboeken te 'huren' voor de duur van een les die kan net zo voordelig zijn als het kopen van een fysiek exemplaar en het vervolgens doorverkopen als u klaar bent. Maar als u volledige vrijheid wilt om door te verkopen wat u koopt, of als u gewoon het gevoel wilt hebben een echt boek in uw handen te hebben, dan is het gedrukte exemplaar waarschijnlijk wat u zoekt. Merk op dat ik geloof dat de fysieke versie wordt geleverd met een schijf met de films en aanvullend materiaal voor het boek (blijkt dat niet, zie update hieronder), maar je kunt dit alles ook gratis vinden op de Garland Science-website als je koop een e-bookversie.

Dus met dat uit de weg, laten we het over het boek hebben! Er zijn in principe twee groepen mensen die dit waarschijnlijk lezen. Of je hebt dit boek als leerboek voor een klas toegewezen gekregen of je hebt het niet. Als dit als leerboek is toegewezen, controleer dan eerst of je naar de juiste editie kijkt. Deze zesde editie is heel anders dan de vijfde (de auteurs wijzen erop dat er sinds de vorige editie vijf miljoen wetenschappelijke artikelen zijn geschreven) en je zou *niet* kunnen wegkomen met het kopen van een goedkopere gebruikte vorige editie. Als je klas zo diep gaat dat het dit boek nodig heeft boven iets als Essentiële celbiologie, 4e editie, dan is de kans groot dat je echt de juiste editie nodig hebt. Ook de zesde editie is op dit moment gloednieuw, dus zorg ervoor dat je niet wordt gevraagd om de vorige (vijfde) editie te krijgen!

Dit is een van mijn favoriete studieboeken aller tijden. Een echt goed leerboek is ontworpen om studenten voor te bereiden om beoefenaars in een veld te worden, niet alleen om te proberen verveelde studenten wakker te houden en hun handen vast te houden tijdens een klas die ze echt zouden willen dat ze niet hoefden te volgen. Dit is een geweldig leerboek en het is HET boek dat je moet hebben als je zoveel mogelijk wilt leren over celbiologie uit één deel. Het is nu ook helemaal vers en up-to-date (vanaf 2014), iets dat absoluut cruciaal is in een veld als biologie dat dagelijks vooruitgaat. Alles hier is fascinerend. Als je denkt dat dit spul saai is, dan heb ik medelijden met je :) Het leven is cellen, en dit is 'alles wat we weten over hoe cellen werken', dus het is direct toepasbaar op het begrijpen van elke (bekende) vorm van leven, van bacteriën voor jou en mij. Zelfs als je klas niet in de diepte en fijne details gaat, is dit een geweldig boek om te hebben voor latere zelfstudie als dit je interesseert. Dit kan een leerboek zijn dat u jarenlang bijhoudt en regelmatig raadpleegt.

Dit is ook een verrassend toegankelijk werk voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het zelfstandig leren over moderne biologie. Als je iemand bent die wetenschappelijk ingesteld is en wil begrijpen hoe het leven werkt, dan is het meeste van wat hier staat gemakkelijk te begrijpen en zeer plezierig. In tegenstelling tot veel vakgebieden, zijn er geen jaren van vereisten die nodig zijn om de studie van geavanceerde biologie te beginnen. Als dit natuurkunde was, zou je tien jaar wiskunde en saaie natuurkunde op laag niveau moeten hebben gehad voordat je ooit zou kunnen hopen dingen als kwantummechanica of de algemene relativiteitstheorie te begrijpen. Maar er is geen wiskundige vereiste om biologie te begrijpen (hoewel het meer kwantitatief begint te worden en nieuwere gebieden zoals fysieke biologie snel groeien). Een beetje kennis van concepten uit de scheikunde is nuttig, maar nogmaals, heel weinig van de discussie in dit boek is kwantitatief, dus er is over het algemeen niets om te berekenen, geen vergelijkingen op te lossen, enz. Celbiologie staat veel dichter bij zoiets als computerprogrammering in termen van de mentale aanleg die nodig is om het te begrijpen. Om te beginnen raad ik aan hoofdstuk 1 grondig te lezen en dan hoofdstuk 2 te lezen, maar als je ogen beginnen te glazig worden, sla dan de rest van hoofdstuk 2 voor nu over (de chemie, hoewel duidelijk fundamenteel en cruciaal belangrijk is, is niet nodig om diepgaand te begrijpen om om de rest van het boek te begrijpen, net zoals je spanningen en transistors niet echt hoeft te begrijpen om een ​​computer te leren programmeren), en lees dan grondig hoofdstuk 3, dat gaat over hoe eiwitten het meeste werk in de cel, inclusief het optreden als microprocessors, motoren, pompen, enz. Op dat moment ben je waarschijnlijk verslaafd en kun je teruggaan en de rest van hoofdstuk 2 waarderen als je er klaar voor bent.

Dus hoe verhoudt deze zesde editie zich tot de vijfde? Nou, ten eerste is het zeven jaar geleden sinds de vorige editie, die bijna voor altijd in de wereld van de biologie is, dus alleen al op die basis zal de nieuwe editie een grote vooruitgang zijn. Over het algemeen zijn de grondbeginselen hetzelfde, maar de fijne details van het begrip zijn veel vooruitgegaan.

Een voortdurend probleem voor de auteurs is de ongelooflijke hoeveelheid kennis die bestaat en de bijna oneindige en subtiele complexiteit van zelfs de eenvoudigste cellen. Dit betekent dat het boek gemakkelijk drie keer zo groot kan zijn als het huidige formaat, een druk die de auteurs moeten zien te weerstaan ​​om het boek draagbaar en betaalbaar te houden. In de vijfde editie explodeerde het boek voorbij de omslagen en werd de standaardeditie gedwongen om de laatste vijf hoofdstukken te degraderen naar PDF-supplementen (een enorme referentie-editie met meer dan 1600 pagina's was beschikbaar met alle gedrukte hoofdstukken, en de e-bookversies bevatten alle hoofdstukken). Dit was geen populaire beslissing, omdat het betekende dat zelfs na het kopen en sjouwen met een groot, duur boekdeel, je nog steeds niet eens alle inhoud had afgedrukt.

De zesde editie bevat nu de volledige inhoud van het boek, en er is geen '34Referentie'-editie nodig. Dit betekent echter dat hoewel het gedrukte boek iets langer is geworden, ze de effectieve grootte met ongeveer 250 pagina's hebben moeten inkorten! Dit heeft geresulteerd in veel redactiewerk en een vermindering van het aantal figuren. In sommige gevallen betekent dit meer effectieve en beknopte inhoud, maar op andere plaatsen is interessant materiaal en diepgaande discussie geëlimineerd. Als voorbeeld hoofdstuk 4, Controle van genexpressie, heeft de huidige editie 79 cijfers waar de vorige editie 115 had. Ook het hoofdstuk over seksuele reproductie is volledig geëlimineerd (u kunt de vijfde editie van dit hoofdstuk downloaden als PDF, zie de update hieronder), hoewel een deel van het materiaal is geïntegreerd in andere delen van het boek.

Ik kan het niet helpen, maar vraag me af of de auteurs hier echt de juiste beslissing hebben genomen. De keuze om de (effectieve) omvang van het boek met ongeveer 15% te verkleinen in een tijd waarin de kennis in het veld zo snel groeit, lijkt nogal beperkend. Persoonlijk had ik liever gezien dat ze het idee omarmden dat veel van hun lezers e-books zouden gebruiken waar de lengte geen fysiek effect heeft, of zelfs zouden overwegen om het boek in twee delen te splitsen, zoals vaak wordt gedaan in vakgebieden zoals de studie van geneeskunde. Maar uiteindelijk is dit nog steeds bedoeld als een leerboek, en veel studenten zullen waarschijnlijk alles waarderen dat het aantal pagina's dat ze moeten lezen, vermindert :)

Er is veel werk verzet om het ontwerp op te schonen en ze hebben veel illustraties opnieuw gemaakt in een meer consistente stijl. Deze editie gebruikt een aangenaam blauw thema in vergelijking met het roodachtig roze van de vijfde editie. Het ziet er over het algemeen schoner uit en ik denk dat de veranderingen in titel / kopkleur een duidelijke verbetering zijn voor lezen op het scherm. Er zijn een paar plaatsen waar figuren kleine stukjes wit-op-limoen-groene tekst bevatten waarop ik moet inzoomen om te lezen, maar over het algemeen zijn de veranderingen verbeteringen.

De inhoud in het algemeen is bijgewerkt met veel secties die uitgebreid zijn bijgewerkt of herschreven. Interessant is dat als een teken dat klassieke kwantitatieve methoden uit de natuurkunde steeds verder in de biologie beginnen door te dringen, er een uitgebreide sectie is in hoofdstuk 8, Wiskundige analyse van celfuncties, waarin enige wiskundige (ZOMG! wat wiskunde in een biologieboek!) zaken als genproductevenwicht en genregulatie en dient als een goede introductie op het gebied van fysieke biologie, wat een andere interessante manier is om de studie van het leven te benaderen (als je dit interessant vindt, kan ik ook fysieke biologie van de cel aanbevelen, wat ik gekocht en genoten).

Hoe dan ook, MBoC krijgt alle sterren als een van die magische boeken die je diep meeneemt in een geheel nieuwe en fascinerende wereld, een waarin je leert hoe elke individuele cel in je lichaam veel meer gemeen heeft met een moderne supercomputer dan doet met die doorweekte oude kikker die je op de middelbare school ontleedde. De praktijk van moderne celbiologie is niets minder dan het hacken van buitenaardse computersystemen (niet ontworpen door de geest van de mens) op zoek naar technologie die we kunnen toe-eigenen of aanpassen om ziekten te genezen, de honger in de wereld te verminderen, schone goedkope energie te produceren en anderszins ons leven te verbeteren .

Een spannend boek voor spannende tijden.

Update: ik heb nu ook een exemplaar van het fysieke boek gekocht, gewoon omdat ik het zo leuk vind. Het is een boekdeel van zes pond, 13 ounce dat twee centimeter dik is. Het is ingebonden en heeft hetzelfde gevoel en dezelfde kwaliteit als de Reference-editie van de vijfde editie. De papierkwaliteit (dikte, helderheid) is weer vergelijkbaar met de vijfde editie. Het is zeker niet zo verpletterend als de oude Reference-editie (dat extra pond of zo maakt een groot verschil).

Het fysieke boek wordt NIET geleverd met cd-media voor de aanvullende films en zo, dus je moet naar de Garland Science-site gaan om ze te vinden (onder het tabblad Student kun je naar de filmnummers van het boek zoeken zonder een account aan te maken , of u kunt een account maken en het boek eraan toevoegen om de toegang tot dingen een beetje gemakkelijker te maken). De GS-site lijkt nog steeds informatie over de nieuwe editie uit te rollen, dus op een gegeven moment kunnen ze een pagina/site hebben die aan het boek is gewijd, net als voor sommige andere recente studieboeken. Ze hebben nu ook een downloadbare pdf toegevoegd van "MBOC, Fifth Edition - Chapter 21: Sexual Reproduction: Meiosis, Germ Cells, and Fertilization'34 in het downloadgebied van de zesde editie. Dit hoofdstuk is verwijderd uit de zesde editie (de meiose-sectie in het hoofdstuk over de celcyclus is een beetje uitgebreid om te compenseren), dus dit is een nuttige referentie om te hebben.

Update 2: Ik heb zojuist de nieuwe versie van Molecular Biology of the Cell 6E - The Problems Book opgehaald en deze heeft veel ZEER mooie verbeteringen ten opzichte van de vorige versie. Het moet echt worden beschouwd als "deel twee" van het leerboek. Er zit een enorme hoeveelheid aanvullende kennis in en het is geweldig om gewoon te lezen, niet alleen als een werkboek. Ga het bekijken.


Reagentia en kits voor moleculaire biologie

Moleculaire biologische reagentia worden gebruikt voor een verscheidenheid aan technieken, processen en procedures voor het testen van genetisch materiaal dat in cellen en weefsels wordt aangetroffen. Deze tests kunnen DNA- en RNA-analyse, genexpressie, biochemische analyse, eiwitoutput en vele andere manieren omvatten om genetische veranderingen te meten.

DNA-testproducten

DNA-reagentia zijn moleculair-wetenschappelijke producten die worden gebruikt om veranderingen in individuele genen, delen van genen of zelfs verschillen in enkele nucleotide "letters" van een DNA-sequentie te identificeren.

RNA-testproducten

RNA-reagentia worden gebruikt om specifieke RNA's te detecteren en te kwantificeren. Ribonucleïnezuur (RNA) codeert, decodeert, reguleert en brengt genen tot expressie. Het katalyseert biologische reacties, regelt genexpressie en detecteert en reageert op cellulaire signalen.

FISH-reagentia

fluorescerend ter plaatse hybridisatie (FISH) wordt gebruikt om specifieke DNA-sequenties op chromosomen te detecteren en te lokaliseren. Het kan worden uitgevoerd op cellen of op vaste en in paraffine ingebedde weefselcoupes.

Reagentia voor nucleïnezuur Inleiding

Procedures die deze materialen vereisen, omvatten transfectie en zowel chemische als elektroporatietransformaties. Deze processen omvatten het introduceren van nucleïnezuren in cellen om genexpressie te moduleren.

Nucleïnezuurlabeling en detectiereagentia

DNA, RNA en andere oligonucleotiden kunnen worden gebruikt als probes die met fluorescentie gemerkt, met biotine gemerkt of radioactief gemerkt zijn. Deze worden gebruikt in ter plaatse hybridisaties, microarrays of andere toepassingen in de moleculaire biologie.

Transcriptie- en vertaalreagentia

Transcriptie omvat de overdracht van informatie van DNA naar mRNA. Het DNA fungeert als een sjabloon voor RNA-polymerase, dat een enkelstrengs kopie van het gen creëert dat zich vervolgens vertaalt in een eiwitmolecuul.


Een epitoop-bedrukte bio-interface met dynamische bioactiviteit voor het moduleren van cel-biomateriaal-interacties

In deze studie werd een epitoop-imprintstrategie gebruikt voor de dynamische weergave van bioactieve liganden op een materiële interface. Een bedrukt oppervlak werd aanvankelijk ontworpen om specifieke affiniteit voor een kort peptide (d.w.z. het epitoop) te vertonen. Dit oppervlak werd vervolgens gebruikt om een ​​epitoop-gelabeld celadhesief peptideligand (RGD: Arg-Gly-Asp) te verankeren. Dankzij de reversibele epitoopbindingsaffiniteit kon de ligandpresentatie en daardoor de celadhesie worden gecontroleerd. In vergelijking met de huidige strategieën voor de fabricage van dynamische bio-interfaces, bijvoorbeeld door omkeerbare covalente of gastheer-gast-interacties, kan een dergelijk moleculair afstembaar dynamisch systeem op basis van een oppervlakte-imprintproces nieuwe toepassingen in in situ celbiologie, diagnostiek en regeneratieve geneeskunde.

Cellulaire processen zijn cruciaal afhankelijk van dynamische receptor-ligand-interacties die plaatsvinden op het grensvlak tussen het celmembraan en de extracellulaire matrix (ECM). 1 Veranderingen in deze interacties als gevolg van ECM-remodellering geven aanleiding tot specifieke celsignalering en intracellulaire cascades. Deze processen staan ​​centraal in fysiologie en pathologische processen, zoals zelfherstel van weefsel en tumorigenese. 1b, 1c Als nabootsers van dergelijke dynamische interacties hebben kunstmatige matrices met de omkeerbare weergave van bioactieve liganden veel aandacht getrokken. Oppervlakken die cel-biomateriaal-interacties kunnen moduleren, worden vaak gebruikt voor in-situ celbiologische experimenten en in weefselmanipulatie. 1c, 2 Bovendien is een dynamische bio-interface met reversibel geïmmobiliseerde liganden ook veelbelovend gebleken bij het richten op geneesmiddelen en isolatiemethoden voor therapieën en diagnostiek. 3

Huidige methoden om de presentatie van omkeerbare liganden op biomateriaalinterfaces te regelen, zijn voornamelijk afhankelijk van oppervlaktefunctionalisering met omkeerbare linkers (bijv. Niet-covalente of omkeerbare covalente interacties) waaraan het biologisch actieve ligand is vastgemaakt. Door middel van bijvoorbeeld gastheer-gast-interacties, 4 omkeerbare covalente interacties, 5 moleculaire assemblage, 6 of andere meervoudige niet-covalente interacties, 7 zou het op integrine gerichte cel-adhesieve peptide RGD (Arg-Gly-Asp) 8 dynamisch en omkeerbaar kunnen worden geïmmobiliseerd op biointerfaces om celadhesiegedrag te reguleren. Deze benaderingen voor de simulatie van omkeerbare ligandpresentatie in een biologisch systeem hebben de ontwikkeling van dynamische bio-interfaces en een nieuwe generatie kunstmatige ECM-materialen sterk bevorderd. Tot op heden zijn slechts enkele omkeerbare koppelingschemieën geëxploiteerd. Gezien het enorme aantal natuurlijke receptor-ligandparen in de biologie, is verdere inspanning geboden. Koppelingen die de voortreffelijke complementariteit nabootsen die wordt vertoond door natuurlijke ligand-receptorparen, zijn bijzonder aantrekkelijk, maar de huidige strategieën in deze richting laten nog steeds veel ruimte voor verbetering.

Om moleculair afstembare omkeerbaarheid te bereiken in analogie met natuurlijke receptor-ligand-interacties, hebben we ons tot moleculaire imprinting en moleculair imprinted polymers (MIP's) gewend. 10 De herkenningsplaatsen in MIP's, over het algemeen gecreëerd door een template-imprinting-proces, zijn ruimtelijk complementair aan de vorm en functionaliteit van de template-moleculen. 10a – 10c Moleculaire herkenning in MIP's vindt dus plaats door een "slot en sleutel" -mechanisme dat vergelijkbaar is met natuurlijke receptor-ligand-interacties. In tegenstelling tot het schaarse aantal dynamische covalente of gastheer-gast-gebaseerde koppelingen, kan imprinting worden gebruikt om omkeerbare affiniteit voor verschillende liganden aan te passen, waaronder kleine moleculen, peptiden en eiwitten. 12 Het is aangetoond dat MIP's nu de prestaties van antilichamen in affiniteitsgerelateerde toepassingen zowel in vitro als in vivo kunnen uitdagen en zelfs overtreffen. 12a, 13 Tot op heden zijn er echter weinig pogingen gedaan om moleculaire imprinting te gebruiken voor de omkeerbare introductie van oppervlaktebioactiviteit. 14

Onlangs hebben we een met RGD-peptide bedrukt substraat ontworpen om het snel oogsten van celvellen te vergemakkelijken. 12c Aangezien we vervolgens bioactieve liganden als sjablonen per se in dat systeem gebruikten, zou sjabloonbinding twee tegenwerkende effecten hebben: 1) het zou de bioactieve moleculen nabij het grensvlak concentreren, en 2) strak gebonden bioactieve moleculen zouden ontoegankelijk zijn voor receptorbinding.

Om het laatste probleem aan te pakken, hebben we in deze studie een epitoop-imprintstrategie 15 toegepast voor het introduceren van cel-adhesieve RGD in een volledig blootgestelde vorm. Het principe is gebaseerd op het gebruik van een kort peptide (het epitoop) als matrijs tijdens het imprintingproces en vervolgens het gebruik van dit epitoop als een RGD-tag voor het verankeren van de RGD-sequentie aan het substraatoppervlak. In dit ontwerp zou het epitooppeptide kunnen werken als een omkeerbaar anker van RGD-peptide, waardoor de laatste blootgesteld blijft voor interactie met integrinereceptoren op het celoppervlak. Bovendien zou de toevoeging van een geschikte hoeveelheid epitooppeptide aan het systeem geleidelijke afgifte van de gebonden op RGD gebaseerde peptiden induceren door middel van competitieve moleculaire uitwisseling, dat wil zeggen dat de biologische activiteit aan het materiële grensvlak dynamisch kan worden gecontroleerd.

Om hoge epitoopaffiniteit te verkrijgen in de resulterende MIP's voor stabiele RGD-verankering, hebben we ons gericht op geladen peptidesequenties die in staat zijn om meerdere ionische interacties aan te gaan met een functioneel monomeer. Exploitatie van de amidine-carboxylaat-interactie leek bijzonder de moeite waard gezien de hoge stabiliteit in concurrerende oplosmiddelen en het eerdere succes bij moleculaire imprinting, 16 bijvoorbeeld, het gebruik van benzamidine-dragende monomeren voor stoichiometrische imprinting. 13a, 16b, 16c

De epitoop-imprinted bio-interface (EIB) werd bereid door een microcontact imprinting-methode (schema 1). 17 Als proof-of-concept werd een structureel symmetrisch en carboxyl-rijk peptide (DDDGGDDD) gebruikt als de epitoop-peptide-template voor imprinting. Ondertussen werd een bioactief lang peptide (DDDGGDDDSSSSSRGDS) bestaande uit de epitoop-tag (DDDGGDDD) aan de N-terminus, een hydrofiele spacer (SSSSS) in het midden en een op integrine gericht peptide (RGDS) aan het C-terminale uiteinde, ontworpen voor daaropvolgende peptide-rebinding en celherkenningsexperimenten. Vóór microcontact-imprinting werd de epitoopsjabloon covalent geïmmobiliseerd op een dekglas aan het C-terminale uiteinde (zie figuur S1 in de ondersteunende informatie). De imprinting werd vervolgens uitgevoerd tussen het dekglas met het geïmmobiliseerde epitoop en een methacrylaat-gemodificeerd kwartssubstraat (diameter 10 mm). De polymerisatiereactie werd fotochemisch gestart door een UV-lamp na het druppelen van 3 L van een fosfaatbufferoplossing (PBS, 0,02 m , pH 7,4) die 1 m 2-hydroxyethylacrylamide (hydrofiel ruggengraatmonomeer), 0,01 m 4-acrylamidofenyl(amino)methaniminium bevatte. chloride (benzamidine-dragend monomeer zie figuur S2), 13d en 0,05 methyleenbisacrylamide (cross-linker) op het dekglas. Door polymerisatie en afpellen van het dekglas werd gemakkelijk een met peptide bedrukte laag (ca. 4 m, zie figuur S3) op het kwartssubstraat met georiënteerde herkenningsplaatsen voor DDGGGDDD verkregen (zie de ondersteunende informatie). Deze met epitoop bedrukte biointerface (EIB) werd vervolgens gebruikt om het bioactieve peptide DDDGGDDDSSSSSRGDS met epitoop-gelabelde reversibel te verankeren.

Generatie van een epitoop-bedrukte biointerface (EIB) en dynamische celadhesie.

De epitoop-peptide-affiniteit van EIB en zijn controle-NIB (niet-bedrukte biointerface) werd eerst bestudeerd door isotherme adsorptie-experimenten. Door C-terminaal fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) gelabelde peptiden te gebruiken (zie figuren S4-S11) kon de hoeveelheid gebonden peptide indirect worden bepaald door de veranderingen in fluorescentie-intensiteit in oplossing te registreren. Voor isothermische adsorptie werd EIB of NIB dus geïncubeerd in PBS-oplossingen van FITC-gelabeld epitoop (DDDGGDDDSSSSSSK-FITC) in verschillende concentraties. De hydrofiele spacer SSSSS die we verwachtten, zou de niet-specifieke binding van het gelabelde peptide aan de EIB en NIB verminderen. Na 12 uur incubatie om te zorgen voor evenwichtsadsorptie, werd de hoeveelheid gebonden epitooppeptide op EIB en NIB gekwantificeerd. EIB vertoonde een significant hogere peptidebindingscapaciteit in vergelijking met NIB over een breed scala aan peptideconcentraties (Figuur 1a). Scatchard-analyse onthulde ook een hogere associatieconstante van EIB (Keen=9,75×107 m −1 ) dan die van NIB (Keen=0.81×10 7 m −1 ), thus preliminarily indicating the successful imprinting of the epitope peptide on EIB (see Figure S12 and Table S1). Meanwhile, the apparent maximum number of recognition sites (i.e., imprinting sites) on EIB was estimated to be 7.35 pmol cm −2 . Although the theoretical amount of imprinting sites on EIB was only one third of those of a previously reported epitope-imprinted film, the Keen value in this study was seven times higher. 15 Such strong binding affinity could be ascribed to the multiple electrostatic interactions between carboxy and benzamidine groups in the imprinting sites during peptide rebinding. The selectivity of EIB and NIB towards the epitope peptide was also examined to further confirm the imprinting mechanism (Figure 1 b). The binding capacity of EIB and NIB towards the FITC-labeled epitope (DDDGGDDDSSSSSK-FITC), a FITC-labeled scrambled peptide with a similar symmetrical structure (GGGDDGGGSSSSSK-FITC), and a FITC-labeled spacer peptide (SSSSSK-FITC) was compared. In line with the results of isothermal adsorption, EIB showed significantly higher binding capacity towards the epitope peptide than NIB. However, the binding capacity of EIB towards the scrambled peptide and the spacer peptide was significantly lower as compared to the epitope peptide. As expected, there was no significant difference in the binding capacity of NIB towards the three different peptides. The high selectivity featured by EIB towards the epitope peptide confirms the presence of specific recognition sites for the epitope as imparted by the imprinting process.

a) Binding isotherms for the epitope peptide to EIB and NIB in PBS. Peptide-binding capacity was measured by incubating EIB or NIB in a solution of FITC-labeled epitope (DDDGGDDDSSSSSK-FITC, FITC-epitope) over a concentration range of 0–124 n m at 25 °C for 12 h. F(n m ) refers to the equilibrium concentration of epitope peptide after binding experiments. b) Selective binding of EIB and NIB towards different FITC-labled peptides at a concentration of 51.8 n m in PBS. Epitope peptide, scrambled peptide, and spacer peptide refer to DDDGGDDDSSSSSK-FITC, GGGDDGGGSSSSSK-FITC, and SSSSSK-FITC, respectively.

To investigate the dynamic binding properties, we immersed FITC-peptide-loaded EIB and NIB in PBS and subsequently followed peptide release by monitoring the substrate fluorescence intensity (Figure 2 a). After incubation for 12 h, the fluorescence intensity of EIB had decreased by only 27 %, whereas the fluorescence on NIB had decreased by nearly 50 %. More importantly, the fluorescence on EIB at 12 h was still more than three times stronger than that on NIB, thus demonstrating the stability of the bound epitope on EIB. In contrast, when it was incubated in PBS with free epitope peptide (0.1 mg mL −1 ), the fluorescence intensity on EIB decreased dramatically (only 25 % left after overnight incubation). Also, we found that EIB and NIB both exhibited weak fluorescence intensity after incubation with free epitope peptide for 12 h (Figure 2 b). This phenomenon is similar to observations in previously reported studies, in which reversible covalent or host–guest interactions could be switched by a competitive molecular exchange. 4b, 5 According to the binding isotherms, the surface-bound amount of epitope peptide on EIB (initial epitope concentration: 51.8 n m ) was estimated to be 8.9 ng, which is far less than the amount of free epitope in solution (0.1 mg mL −1 in 1 mL of PBS). Thus, the surface-bound peptide could be readily exchanged by the free epitope peptide, thus leading to a dramatic decrease in surface fluorescence intensity. These results demonstrated that EIB could not only bind the epitope peptide with high affinity but also release it through an epitope-molecule-exchange process.

a) Fluorescence intensity changes of FITC-epitope-bound EIB and NIB (denoted as FITC-EIB and FITC-NIB, respectively) after incubation in PBS with or without the epitope peptide (0.1 mg mL −1 ). FITC-EIB and FITC-NIB were obtained by incubation in FITC-epitope solution (51.8 n m in PBS) for 12 h. b) Representative fluorescence microscope photographs of FITC-EIB and FTC-NIB before and after incubation with the epitope. Scale bar: 500 μm.

EIB and NIB were then incubated in a solution with the epitope-tagged RGD peptide DDDGGDDDSSSSSRGDS (51.8 n m in PBS) to introduce integrin-targeted peptide RGD on the surface. The surface bioactivity of RGD was checked with integrin αvβ3, a cell-membrane receptor. 8a Atomic force microscopy (AFM) demonstrated that integrin αvβ3 could be efficiently recognized and bound to the RGD-modified surface (see Figure S13), thus confirming the existence and accessibility of the surface-bound RGD for cell recognition. We then checked the cell-adhesion behavior of the RGD-bound EIB and NIB by seeding mouse 3T3 fibroblasts on them (Figure 3). Without binding with RGD, the cell morphology only showed a typical non-adhesive round shape (Figure 3 a,c) after culture for 3 h in α-minimal essential medium (α-MEM) supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS). After rinsing, almost no cells could adhere to either EIB or NIB. This cell-repellant property is presumably due to the high hydrophilicity of EIB and NIB (see Figure S14) and thus reduced nonspecific protein adsorption. In contrast, the cell-adhesion behavior on EIB was dramatically increased following RGD introduction. We observed a significant increase in adhered cells with a typical spreading shape on the RGD-modified EIB (Figure 3 d see also Figure S15). Also, EIB modified with different amounts of RGD all exhibited enhanced cell adhesion (see Figure S16). However, cells on the RGD-modified NIB still featured the non-adhered round shape. Such a significant difference between EIB and NIB can be ascribed to the markedly lower epitope-binding constant of NIB, which resulted in weak affinity and low uptake of the peptide by this substrate. Poor cell adhesion was also observed on EIB modified with epitope-tagged non-adhesive RGE peptide DDDGGDDDSSSSSRGES, thus further confirming the RGD/integrin-triggered cell-adhesion mechanism (Figure 3 e).

Representative micrographs of mouse 3T3 cells after culture for 3 h on a) NIB, b) NIB with RGD-based peptide, c) EIB, d) EIB with RGD-based peptide, and e) EIB with non-adhesive RGE-based peptide. RGE=Arg-Gly-Glu. The RGD- or RGE-bound surfaces were obtained by incubation in peptide solutions (51.8 n m in PBS) for 12 h. Insets are the representative fluorescence micrographs of attached cells on differrent surfaces. Schaalbalk: 50 m. f) Cell-adhesion efficiency on different surfaces. Statistically significant differences are indicated by * P<0.001 as compared with others.

We further applied 4′-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and fluorescein phalloidin to stain the nuclei and F-actin of the adhered cells. The F-actin networks of cells on RGD-modified EIB exhibited typical focal adhesion patterns and spreading shape (inset in Figure 3 d see also Figure S17). However, only sporadic round cells with no stress fibers were found for the other groups after cell staining. Taken together, these results demonstrated that the peptide-recognition sites created by epitope imprinting could be employed to introduce an integrin-targeted RGD peptide on a material surface and thereby induce specific cell adhesion.

The above peptide-release experiments verified that the bound epitope on EIB could be released by an epitope-triggered molecule-exchange process. Thus, cell detachment from EIB was further examined to determine whether the cell-adhesion behavior could be reversed by adding free epitope peptide to the medium. First, EIB was modified with DDDGGDDDSSSSSRGDS. After incubation for 3 h to allow cell spreading, the initial cell-culture medium α-MEM was changed to another α-MEM medium containing 0.1 mg mL −1 free epitope DDDGGDDD. A gradual transition of the cell morphology from a spread-out shape to a round shape was clearly observed in the first 4.5 h (Figure 4). After incubation for 12 h, more than 90 % of the adhered cells on EIB had been released (Figure 4). In contrast, no significant cell-morphology change was observed on EIB without addition of the free epitope (see Figure S18). This result demonstrated the molecule-exchange-induced cell-release property of our system. The cell-release rate was much slower than for our previously reported biointerface based on monosaccharide-responsive dynamic covalent bonds. 5 We believe that the slower rate is due to the high peptide affinity of EIB and mass-transfer limitations at the imprinted sites. The released cells could re-adhere on a new petri dish, thus implying that the molecule-exchange-induced cell release from EIB occurs in a non-invasive manner.

Time-dependent detachment of the adhered cells from RGD-bound EIB by incubation in α-MEM with free epitope peptide (0.1 mg mL −1 ). Schaalbalk: 50 m. The histogram on the right-hand side indicates that the number of adhered cells had significantly decreased after incubation for 12 h. Statistically significant differences are indicated by * P<0.001 as compared with others.

In summary, we have developed an epitope-imprinted biointerface for the reversible presentation of bioactivity and dynamic control of cell–material interactions. The surface molecular-recognition sites, prepared by the epitope-imprinting process, could be used to bind an epitope-tagged bioactive peptide featuring the epitope tag at one terminus and a cell-adhesive peptide RGD at the other terminus. Owing to the reversible-binding property, the epitope-imprinted biointerface exhibited dynamic RGD presentation and subsequently controllable cell-adhesive behavior. As compared to the limited chemical means to achieve dynamic biointerfaces, such a biomimetic interaction may unlock new applications in cell biology, diagnostics, and regenerative medicine.

Dankbetuigingen

We acknowledge financial support from Marie Skłodowska-Curie Actions (H2020-MSCA-IF-2014-EF, 658953), the National Natural Science Foundation of China (21574091), and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20160056).

Belangenverstrengeling

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Als service aan onze auteurs en lezers biedt dit tijdschrift ondersteunende informatie van de auteurs. Dergelijke materialen worden door vakgenoten beoordeeld en kunnen opnieuw worden georganiseerd voor online levering, maar worden niet nabewerkt of gezet. Problemen met technische ondersteuning die voortkomen uit ondersteunende informatie (anders dan ontbrekende bestanden) moeten aan de auteurs worden gericht.

Bestandsnaam Beschrijving
anie201708635-sup-0001-misc_information.pdf1.8 MB Aanvullend

Let op: De uitgever is niet verantwoordelijk voor de inhoud of functionaliteit van eventuele ondersteunende informatie die door de auteurs wordt aangeleverd. Alle vragen (behalve ontbrekende inhoud) moeten worden gericht aan de corresponderende auteur van het artikel.


Important topics of solutions for NCERT class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance:

6.1.1 Structure of Polynucleotide Chain

6.1.2 Packaging of DNA Helix

6.2 The Search for Genetic Material

6.2.1 The Genetic Material is DNA

6.2.2 Properties of Genetic Material (DNA versus RNA)

6.4.1 The Experimental Proof

6.4.2 The Machinery and the Enzymes

6.5.2 Transcription Unit and the Gene

6.5.3 Types of RNA and the process of Transcription

6.6.1 Mutations and Genetic Code

6.6.2 tRNA– the Adapter Molecule

6.8 Regulation of Gene Expression

6.9.1 Salient Features of Human Genome

6.9.2 Applications and Future Challenges

In CBSE NCERT solutions for class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance, you will also get solutions to the questions based on the human genome project as it was a megaproject that aimed to sequence every base in the human genome. This project has yielded much new information among us. Many new areas and avenues have opened up as a consequence of the project. In NCERT solutions for class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance, you will get an explanation of DNA Fingerprinting. It is a technique to find out variations in individuals of a population at the DNA level. It works on the principle of polymorphism in DNA sequences.

In solutions for NCERT class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance, you will get solutions to the questions based on two important nucleic acid which is also called as genetic materials for living organisms and these are:

DNA and RNA are the two types of nucleic acids found in living systems whereas DNA is double-stranded and RNA is single-stranded, DNA acts as the genetic material in most of the organisms and RNA acts as genetic material in some viruses, mostly functions as a messenger. In NCERT solutions for class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance, you will get solutions to the questions on Central dogma which consists of three important things that are:

After going through solutions for NCERT class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance you will be able to answer all the questions which are given at the end of this chapter.


Best Molecular Biology colleges in the U.S. 2021

Duke University offers 2 Molecular Biology degree programs. It's a large, private not-for-profit, four-year university in a large city. In 2019, 6 Molecular Biology students graduated with students earning 5 Doctoral degrees, and 1 Master's degree.

Dartmouth College offers 1 Molecular Biology degree programs. It's a medium sized, private not-for-profit, four-year university in a remote town.

University of California-San Diego offers 1 Molecular Biology degree programs. It's a very large, public, four-year university in a large city. In 2019, 48 Molecular Biology students graduated with students earning 48 Bachelor's degrees.

Cornell University offers 2 Molecular Biology degree programs. It's a very large, private not-for-profit, four-year university in a small city. In 2019, 8 Molecular Biology students graduated with students earning 6 Doctoral degrees, and 2 Master's degrees.

University of Minnesota-Twin Cities offers 2 Molecular Biology degree programs. It's a very large, public, four-year university in a large city. In 2019, 2 Molecular Biology students graduated with students earning 2 Doctoral degrees.

Wake Forest University offers 2 Molecular Biology degree programs. It's a medium sized, private not-for-profit, four-year university in a midsize city. In 2019, 6 Molecular Biology students graduated with students earning 6 Doctoral degrees.

Johns Hopkins University offers 2 Molecular Biology degree programs. It's a very large, private not-for-profit, four-year university in a large city. In 2019, 43 Molecular Biology students graduated with students earning 27 Master's degrees, and 16 Doctoral degrees.

Boston University offers 2 Molecular Biology degree programs. It's a very large, private not-for-profit, four-year university in a large city. In 2019, 62 Molecular Biology students graduated with students earning 59 Bachelor's degrees, and 3 Doctoral degrees.

University of Wisconsin-Madison offers 3 Molecular Biology degree programs. It's a very large, public, four-year university in a large city. In 2019, 38 Molecular Biology students graduated with students earning 27 Bachelor's degrees, 10 Doctoral degrees, and 1 Master's degree.

Princeton University offers 3 Molecular Biology degree programs. It's a medium sized, private not-for-profit, four-year university in a small city. In 2019, 97 Molecular Biology students graduated with students earning 49 Bachelor's degrees, 27 Doctoral degrees, and 21 Master's degrees.


Extended Data Fig. 1 Seed developmental stages assayed, FANS profiles, and impact on endosperm enrichment.

(a) Summary of seed developmental stages in the different genotypes and timepoints assayed. Number of seeds imaged for each bar shown at top. Scale bar 100 μm. (b) FANS sorting profiles of Col x Cvi (CxV) seeds at 2 DAP (sorted 09/26/17), 3 DAP (08/10/17), 4 DAP (11/16/17) and 5 DAP (11/14/17). The 2 DAP sample was processed on a different FACS machine than the other three samples. (c) Percent of allelic reads that were derived from the maternally inherited allele, for nuclei assigned as embryo, endosperm, and seed coat (see methods). Median, interquartile range and upper-/lower-adjacent values (1.5*IQR) indicated by center line, box, and whiskers of each boxplot, respectively. (d) Percent of nuclei per batch (96-well plate) assigned to endosperm. Nuclei from later timepoints, as well as from the 6C peak, are more likely to correspond to endosperm than nuclei from earlier timepoints or from the 3C peak.

Extended Data Fig. 2 Clustering of all 1437 high-quality nuclei in the dataset.

(a) Heatmap of SC3 clustering of all 1437 nuclei. Genotype, FANS peak, prep method (see ‘Seed nuclei FANS’), sequencing type, % maternal (percent of allelic reads derived from maternal allele), and seed age also shown. (b) Partitioning of the variance in CPM values for the 22,950 expressed genes in the dataset over the 1437 nuclei samples, according to tissue, peak, genotype and DAP, using the R package ‘variancePartition’ 53 . Median, interquartile range and upper-/lower-adjacent values (1.5*IQR) indicated by center line, box, and whiskers within each violin plot. (c) Same as (b), over the 1096 Col x Cvi and Cvi x Col 4 DAP samples only. In this group, prep and sequencing type are less confounded with sources of biological variation (for example all washed samples are either Col x Cvi or Cvi x Col 4 DAP, so prep is confounded with genotype and DAP in the full dataset), so their contribution to the variation could be more reliably estimated. (d) Average expression of marker genes for various seed compartments (globular and heart stage) 9,52 for nuclei in each cluster. Size indicates the average percent of nuclei with > 0 counts, color indicates average log2(CPM) for all nuclei with CPM > 0.

Extended Data Fig. 3 Characterization of seed coat nuclei.

(a) SC3 clustering of 4 DAP seed coat nuclei. (b) Average expression of LCM seed tissue markers 9,52 , over seed coat clusters. Dot color: average log2(CPM) dot size: average percent nuclei with CPM > 0. (c) Cell cycle phase by cluster. (d) Average expression of genes specific to particular seed coat cell layers 54,55,56 across nuclei clusters. Schematic of seed coat cell layers, from ii1 (the endothelium, innermost) to oi2 (epidermis, outermost) layers where expression was observed in indicated study highlighted green. Red star: significantly higher expression in cluster (permutation test, p < 0.05). (e) Top 5 GO terms for significantly upregulated genes in each cluster. (f) Cluster identities and characteristics false-colored Col x Cvi (left) and Cvi x Col (right) seed images. EB = embryo, EN = endosperm, CSC = chalazal seed coat. Inset: the five seed coat cell layers.

Extended Data Fig. 4 Heatmaps of the 5 most significantly enriched GO terms among genes upregulated (top) and downregulated (bottom) in each seed coat cluster.

Significant terms are flagged in left heatmap, while average expression ‘enrichment score’ across all genes associated with GO term is shown at right. Average includes any genes associated with the GO-term that are not significantly up/downregulated in the indicated cluster, so average may not reflect expectations. Full lists of significant GO-terms, and specific lists of genes in each significant GO-term that are up/downregulated in cluster, are in Supplementary Data 2. Order of rows and columns same for left and right heatmaps.

Extended Data Fig. 5 Heatmaps of the 5 most significantly enriched GO terms among genes upregulated (top) and downregulated (bottom) in each endosperm cluster.

Significant terms, p < 0.005, are flagged in left heatmap, while average expression ‘enrichment score’ across all genes associated with GO term is shown at right. Average includes any genes associated with the GO-term that are not significantly up/downregulated in the indicated cluster so average may not reflect expectations. Full lists of significant GO-terms, and specific lists of genes in each significant GO-term that are up/downregulated in cluster, are in Supplementary Data 2. Order of rows/columns same for left and right heatmaps.

Extended Data Fig. 6 In situ hybridization analysis for additional cluster-specific transcripts.

(a) Expression data for four additional marker genes used for RNA ter plaatse hybridization experiments, across endosperm and seed coat clusters. (B) In situ hybridization (purple signal) results for two micropylar/peripheral clusters. AT4G11080 is most notably expressed in peripheral and micropylar endosperm and in the embryo. AT1G09380 is most notably expressed in the micropylar endosperm and seed coat. In gene summaries, expression indicated by hatched pattern indicates variable expression in that zone among seeds. (C) In situ hybridization results for two additional chalazal endosperm transcripts not shown in Fig. 2: AT4G13380 is predominantly expressed in the chalazal cyst, while AT1G44090 is predominantly expressed in the chalazal nodules. (b-c) Black arrowheads indicate sites of transcript accumulation white arrowheads indicate examples of sites without transcripts. Number of seeds with expression in specific zones relative to the number of seeds examined is shown in bottom left of panels expression in one zone does not exclude expression in other zones. Seeds were from three independent controlled pollination events, collected together. For all antisense probes, in situ experiment was performed at least twice, except for AT4G11080, which was performed once. Both sense and antisense probe images shown. Scale bars = 25 μm.

Extended Data Fig. 7 Cell cycle is a source of variability among endosperm clusters.

(a) t-SNE projection and trajectory analysis of 1,309 nuclei in the dataset, based on expression of a manually curated list of 22 cell cycle-dependent marker genes. Dotted line represents cell cycle trajectory from G0 -> G1 -> S -> G2 -> M. (b) Average expression of six of the 22 marker genes used in analysis shown in (a), with nuclei ordered according to their linear projection onto the cell cycle trajectory, starting from G0 (left) to M (right). Moving averages were calculated using a sliding window of 200 data points. (c) Percent of nuclei in each phase of the cell cycle that were sorted from the 3C or 6C FANS peak (d) Distribution of nuclei among cell cycle phases in seed coat and endosperm. Endosperm data are further divided into peripheral, micropylar, and chalazal the chalazal region is also divided into the cyst and nodules. (e) Distribution of nuclei among cell cycle phases for each of the endosperm clusters.

Extended Data Fig. 8 Statistical power and accuracy of imprinting model under various simulated conditions.

(a) Percent of simulations (out of 200) where the null hypothesis of no parental bias was rejected, for simulations with varied total expression and log2(m/p) ratio (r). Simulations mimicked degree of maternal skew in the Col x Cvi data, so ‘unbiased’ simulations had r = 1.5. Twelve values of total expression were tested: 0.01, 0.05, 0.1, 0.15, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 3.5, 15, and 50. The 1st, 25th, 50th, 75th and 99th percentiles for total expression in the Col x Cvi dataset are 0.033, 0.21, 0.58, 1.57 and 15.4, respectively. Blue lines indicate paternal bias, red indicate maternal bias. (b) Effect of number of observations (nuclei) in simulations on power to reject H0 adj . Highly expressed and highly biased genes can be detected even with as few as 5 observations. Blue lines indicate tests for paternal bias, red indicate tests for maternal bias.

Extended Data Fig. 9 Expression of chromatin-related genes.

(a) Sperm ChIP-seq profiles from 28 over non-imprinted genes, all PEGs, chalazal PEGs and non-chalazal PEGs. (b) Heatmap of expression enrichment scores (ES) across endosperm nuclei clusters, for 464 chromatin-related genes with variable expression across the clusters. Inset: subset of genes enriched in chalazal nodules, cyst, or both (top) subset of genes with depleted expression in chalazal endosperm, grouped by expression pattern (bottom). Not all genes in highlighted region in left plot shown. (c) Heatmap of expression ES for the full 4 DAP endosperm + seed coat dataset, over cell cycle phases. 227 chromatin-related genes with variation across cell cycle shown. Color bar same as (b). (d) Expression ES in endosperm vs. seed coat for 553 chromatin-related genes. Color bar same as (b). (e) Average expression profiles across the endosperm clusters for four genes shown in (b) (see arrows). Stars indicate clusters with significantly enriched expression based on a permutation test. CPM = counts per million.


Bekijk de video: Moleculaire genetica - CRISPR (December 2021).