Informatie

Hebben de pH en andere ionen invloed op de hydrolyse van ATP


ATP hydroliseert tot ADP en fosfaat in een sterk exergonische reactie en wordt gebruikt voor energieoverdracht en kortetermijnopslag in cellen.

ATP is stabiel in een cel, dus er moet een aanzienlijke activeringsenergie nodig zijn voor de reactie.

Het Engelstalige Wikipedia-artikel impliceert echter dat stabiliteit van ATP geen gegeven is, maar sterk afhangt van de eigenschappen van de omringende oplossing:

  • "ATP is zeer goed oplosbaar in water en is vrij stabiel in oplossingen tussen pH 6,8 en 7,4, maar wordt snel gehydrolyseerd bij extreme pH." en
  • "ATP is een onstabiel molecuul in ongebufferd water, waarin het hydrolyseert tot ADP en fosfaat."

Hoe beïnvloedt de pH de hydrolyse van ATP? Waarom is het zelfs relevant of de oplossing gebufferd is of niet? (stabiliseren de ionen het molecuul op de een of andere manier?) Zijn er andere effecten die de stabiliteit in dierlijke cellen beïnvloeden?


OKE. Laten we de vragen beantwoorden die u stelt:

Hoe beïnvloedt de pH de hydrolyse van ATP?

Hoge concentraties waterstofionen of hydroxylionen ("extremen van pH" - zoals u citeert) veroorzaken zure of alkalische hydrolyse. Het mechanisme van alkalische hydrolyse verloopt vermoedelijk via een cyclisch tussenproduct, zoals bij de hydrolyse van RNA. Zure hydrolyse van ATP vereist een zeer lage pH - het is bijvoorbeeld onderzocht in 3M perchloorzuur - en het mechanisme is vrij complex, volgens werk gepubliceerd door Hutchings et. al. in 1981.

Waarom is het zelfs relevant of de oplossing gebufferd is of niet?

In ongebufferde oplossingen kan de pH gemakkelijk afwijken van het fysiologische bereik. Dit is een praktische overweging van werk in vitro. Fysiologische en cellulaire systemen worden sterk gebufferd door een verscheidenheid aan ionen en zelfs macromoleculen, dus het probleem doet zich niet voor.

Zijn er andere effecten die de stabiliteit in dierlijke cellen beïnvloeden?

U vergist zich in uw veronderstelling dat er een bijzondere noodzaak is om hydrolyse van ATP in dierlijke cellen te voorkomen. Dit lijkt te zijn gebaseerd op een verkeerd begrip van een Wikipedia-artikel dat zich meer bezighoudt met de chemie van ATP dan met de situatie in de cel.


Stabiliteit van ATP is grotendeels te danken aan Mg2+. ATP in cel is eigenlijk Mg2ATP2- De Mg-ionen stabiliseren de negatieve ladingen op de fosfaten. pH is natuurlijk ook belangrijk, maar Mg is de sleutel, vandaar dat je Mg . ziet2+ altijd in biochemische reacties waar ATP bij betrokken is.


Biologie 171

Aan het einde van dit gedeelte kunt u het volgende doen:

  • Beschrijf hoe remming van feedback de productie van een tussenproduct of product in een route zou beïnvloeden
  • Identificeer het mechanisme dat de snelheid van het transport van elektronen door de elektronentransportketen regelt

Cellulaire ademhaling moet worden gereguleerd om evenwichtige hoeveelheden energie te leveren in de vorm van ATP. De cel moet ook een aantal intermediaire verbindingen genereren die worden gebruikt bij het anabolisme en katabolisme van macromoleculen. Zonder controles zouden metabolische reacties snel tot stilstand komen als de voorwaartse en achterwaartse reacties een evenwichtstoestand bereikten. De middelen zouden ongepast worden gebruikt. Een cel heeft niet altijd de maximale hoeveelheid ATP nodig die het kan maken: soms moet de cel enkele van de tussenproducten omleiden naar routes voor de productie van aminozuren, eiwitten, glycogeen, lipiden en nucleïnezuur. Kortom, de cel moet zijn metabolisme controleren.

Regelgevende mechanismen

Een verscheidenheid aan mechanismen wordt gebruikt om de cellulaire ademhaling te regelen. In elk stadium van het glucosemetabolisme bestaat er een soort controle. Toegang van glucose tot de cel kan worden geregeld met behulp van de GLUT-eiwitten (glucosetransporter) die glucose transporteren ((Figuur)). Verschillende vormen van het GLUT-eiwit regelen de passage van glucose naar de cellen van specifieke weefsels.


Sommige reacties worden gecontroleerd door twee verschillende enzymen te hebben - elk één voor de twee richtingen van een omkeerbare reactie. Reacties die door slechts één enzym worden gekatalyseerd, kunnen in evenwicht komen, waardoor de reactie stopt. Als daarentegen twee verschillende enzymen (elk specifiek voor een bepaalde richting) nodig zijn voor een omkeerbare reactie, neemt de mogelijkheid om de reactiesnelheid te regelen toe en wordt er geen evenwicht bereikt.

Een aantal enzymen die betrokken zijn bij elk van de routes - in het bijzonder het enzym dat de eerste toegewijde reactie van de route katalyseert - worden gecontroleerd door de hechting van een molecuul aan een allosterische plaats op het eiwit. De moleculen die in deze hoedanigheid het meest worden gebruikt, zijn de nucleotiden ATP, ADP, AMP, NAD+ en NADH. Deze regulatoren - allosterische effectoren - kunnen de enzymactiviteit verhogen of verlagen, afhankelijk van de heersende omstandigheden. De allosterische effector verandert de sterische structuur van het enzym, wat meestal de configuratie van de actieve plaats beïnvloedt. Deze wijziging van de structuur van het eiwit (het enzym) verhoogt of verlaagt de affiniteit voor het substraat, met als gevolg dat de reactiesnelheid wordt verhoogd of verlaagd. De hechtingssignalen naar het enzym. Deze binding kan de activiteit van het enzym verhogen of verlagen, waardoor een feedbackmechanisme ontstaat. Dit type controle met feedback is effectief zolang de chemische stof die het beïnvloedt, aan het enzym is gehecht. Zodra de algehele concentratie van de chemische stof afneemt, zal deze van het eiwit weg diffunderen en is de controle ontspannen.

Controle van katabole routes

Enzymen, eiwitten, elektronendragers en pompen die een rol spelen bij glycolyse, de citroenzuurcyclus en de elektronentransportketen hebben de neiging om niet-omkeerbare reacties te katalyseren. Met andere woorden, als de eerste reactie plaatsvindt, is het pad verplicht om door te gaan met de resterende reacties. Of een bepaalde enzymactiviteit wordt vrijgegeven, hangt af van de energiebehoeften van de cel (zoals weerspiegeld door de niveaus van ATP, ADP en AMP).

Glycolyse

De controle van glycolyse begint met het eerste enzym in de route, hexokinase ((Figuur)). Dit enzym katalyseert de fosforylering van glucose, wat helpt om de verbinding in een latere stap voor te bereiden op splitsing. De aanwezigheid van het negatief geladen fosfaat in het molecuul verhindert ook dat de suiker de cel verlaat. Wanneer hexokinase wordt geremd, diffundeert glucose de cel uit en wordt het geen substraat voor de ademhalingswegen in dat weefsel. Het product van de hexokinasereactie is glucose-6-fosfaat, dat zich ophoopt wanneer een later enzym, fosfofructokinase, wordt geremd.


Fosfofructokinase is het belangrijkste enzym dat wordt gecontroleerd bij glycolyse. Hoge niveaus van ATP of citraat of een lagere, meer zure pH verminderen de activiteit van het enzym. Een verhoging van de citraatconcentratie kan optreden door een blokkade in de citroenzuurcyclus. Fermentatie, met de productie van organische zuren zoals melkzuur, is vaak verantwoordelijk voor de verhoogde zuurgraad in een cel, maar de producten van fermentatie accumuleren typisch niet in cellen.

De laatste stap in de glycolyse wordt gekatalyseerd door pyruvaatkinase. Het geproduceerde pyruvaat kan worden afgebroken of omgezet in het aminozuur alanine. Als er geen energie meer nodig is en alanine voldoende aanwezig is, wordt het enzym geremd. De activiteit van het enzym wordt verhoogd wanneer de fructose-1,6-bisfosfaatspiegels stijgen. (Bedenk dat fructose-1,6-bisfosfaat een tussenproduct is in de eerste helft van de glycolyse.) De regulatie van pyruvaatkinase omvat fosforylering door een kinase (pyruvaatkinase), wat resulteert in een minder actief enzym. Defosforylering door een fosfatase reactiveert het. Pyruvaatkinase wordt ook gereguleerd door ATP (een negatief allosterisch effect).

Als er meer energie nodig is, wordt er meer pyruvaat omgezet in acetyl CoA door de werking van pyruvaatdehydrogenase. Als ofwel acetylgroepen of NADH zich ophopen, is er minder behoefte aan de reactie en neemt de snelheid af. Pyruvaatdehydrogenase wordt ook gereguleerd door fosforylering: een kinase fosforyleert het om een ​​inactief enzym te vormen en een fosfatase activeert het opnieuw. Het kinase en het fosfatase worden ook gereguleerd.

Citroenzuur cyclus

De citroenzuurcyclus wordt gecontroleerd door de enzymen die de reacties katalyseren die de eerste twee moleculen van NADH maken (Review). Deze enzymen zijn isocitraatdehydrogenase en α-ketoglutaraat dehydrogenase. Wanneer voldoende ATP- en NADH-niveaus beschikbaar zijn, nemen de snelheden van deze reacties af. Wanneer er meer ATP nodig is, zoals blijkt uit stijgende ADP-niveaus, neemt de snelheid toe. Alfa-ketoglutaraatdehydrogenase zal ook worden beïnvloed door de niveaus van succinyl-CoA - een volgend tussenproduct in de cyclus - waardoor de activiteit afneemt. Een afname van de werkingssnelheid van de route op dit punt is niet noodzakelijk negatief, omdat de verhoogde niveaus van de α-ketoglutaraat dat niet door de citroenzuurcyclus wordt gebruikt, kan door de cel worden gebruikt voor de synthese van aminozuren (glutamaat).

Elektronen transportketen

Specifieke enzymen van de elektronentransportketen worden niet beïnvloed door feedbackremming, maar de snelheid van elektronentransport door de route wordt beïnvloed door de niveaus van ADP en ATP. Een groter ATP-verbruik door een cel wordt aangegeven door een opeenhoping van ADP. Naarmate het ATP-gebruik afneemt, neemt de concentratie van ADP af en nu begint ATP zich op te bouwen in de cel. Deze verandering in de relatieve concentratie van ADP tot ATP zorgt ervoor dat de cel de elektronentransportketen vertraagt.

Bekijk meer over de elektronentransportketen en ATP-synthese door Electron Transport Chain: The Movie te bekijken (Flash interactief, video)

Zie (Figuur) voor een samenvatting van feedbackcontroles in cellulaire ademhaling.

Samenvatting van feedbackcontroles bij cellulaire ademhaling
pad Enzym aangetast Verhoogde niveaus van effector Effect op padactiviteit
glycolyse hexokinase glucose-6-fosfaat verminderen
fosfofructokinase laagenergetische lading (ATP, AMP), fructose-6-fosfaat via fructose-2,6-bisfosfaat toename
hoogenergetische lading (ATP, AMP), citraat, zure pH verminderen
pyruvaatkinase fructose-1,6-bisfosfaat toename
hoge energielading (ATP, AMP), alanine verminderen
pyruvaat naar acetyl CoA conversie pyruvaatdehydrogenase ADP, pyruvaat toename
acetyl CoA, ATP, NADH verminderen
citroenzuur cyclus isocitraat dehydrogenase ADP toename
ATP, NADH verminderen
α-ketoglutaraat dehydrogenase calciumionen, ADP toename
ATP, NADH, succinyl-CoA verminderen
elektronentransportketen ADP toename
ATP verminderen

Sectie Samenvatting

Cellulaire ademhaling wordt op verschillende manieren geregeld. Het binnendringen van glucose in een cel wordt geregeld door de transporteiwitten die helpen bij de passage van glucose door het celmembraan. Het grootste deel van de controle van de ademhalingsprocessen wordt bereikt door de controle van specifieke enzymen in de routes. Dit is een soort negatief feedbackmechanisme, waarbij de enzymen worden uitgeschakeld. De enzymen reageren het vaakst op de niveaus van de beschikbare nucleosiden ATP, ADP, AMP, NAD+ en FAD. Andere tussenproducten van de route beïnvloeden ook bepaalde enzymen in de systemen.

Gratis antwoord

Hoe beïnvloedt citraat uit de citroenzuurcyclus de glycolyse?

Citraat kan fosfofructokinase remmen door feedbackregulatie.

Waarom zouden negatieve feedbackmechanismen vaker voorkomen dan positieve feedbackmechanismen in levende cellen?

Negatieve feedbackmechanismen sturen een proces in feite aan, het kan het uitschakelen, terwijl positieve feedback het proces versnelt, waardoor de cel er geen controle over heeft. Negatieve feedback handhaaft natuurlijk de homeostase, terwijl positieve feedback het systeem uit het evenwicht drijft.

Woordenlijst


Hebben de pH en andere ionen invloed op de hydrolyse van ATP - Biologie?

Vraag : 21) Waarom ATP een belangrijk molecuul in de stofwisseling? A) Zijn hydrolyse: 1389714

21) Waarom is ATP een belangrijk molecuul in de stofwisseling?

A) De hydrolyse ervan zorgt voor een input van vrije energie voor exergonische reacties.

B) Het zorgt voor een energiekoppeling tussen exergonische en endergonische reacties.

C) De terminale fosfaatgroep bevat een sterke covalente binding die, wanneer gehydrolyseerd, vrije energie vrijgeeft.

D) De terminale fosfaatbinding heeft een hogere energie dan de andere twee fosfaatbindingen.

22) Wanneer 10.000 moleculen ATP worden gehydrolyseerd tot ADP en i in een reageerbuis, komt er ongeveer half zoveel warmte vrij als wanneer een cel dezelfde hoeveelheid ATP hydrolyseert. Welke van de volgende is de beste verklaring voor deze waarneming?

A) Cellen zijn open systemen, maar een reageerbuis is een geïsoleerd systeem.

B) Cellen zijn minder efficiënt in warmteproductie dan niet-levende systemen.

C) De reactie in cellen moet worden gekatalyseerd door enzymen, maar de reactie in een reageerbuis heeft geen enzymen nodig.

D) Reactant- en productconcentraties in de reageerbuis zijn anders dan die in de cel.

23) Welke van de volgende lijkt qua structuur het meest op ATP?

D) een aminozuur met drie fosfaatgroepen eraan vast

24) Katabole routes _____.

A) moleculen combineren tot meer energierijke moleculen

B) energie leveren, voornamelijk in de vorm van ATP, voor het werk van de cel

D) zijn spontaan en hebben geen enzymkatalyse nodig

25) Wat gebeurt er met de gegenereerde warmte wanneer chemisch, transporterend of mechanisch werk wordt gedaan door een organisme?

A) Het wordt gebruikt om nog meer cellulair werk aan te drijven.

B) Het wordt gebruikt om energie op te slaan als meer ATP.

C) Het wordt gebruikt om ADP te genereren uit nucleotidevoorlopers.

D) Het gaat verloren aan het milieu.

26) Als ATP wat energie afgeeft, komt er ook anorganisch fosfaat vrij. Wat gebeurt er met het anorganische fosfaat in de cel?

A) Het wordt uitgescheiden als afvalstof.

B) Het wordt alleen gebruikt om meer ATP te regenereren.

C) Het kan worden gebruikt om een ​​gefosforyleerd tussenproduct te vormen.

D) Het komt de kern binnen en beïnvloedt de genexpressie.

27) Een aantal systemen voor het pompen van ionen door membranen worden aangedreven door ATP. Dergelijke door ATP aangedreven pompen worden vaak ATPasen genoemd, hoewel ze ATP niet vaak hydrolyseren tenzij ze gelijktijdig ionen transporteren. Omdat kleine verhogingen van calciumionen in het cytosol een aantal verschillende intracellulaire reacties kunnen veroorzaken, houden cellen de cytosolische calciumconcentratie onder normale omstandigheden vrij laag met behulp van ATP-aangedreven calciumpompen. Spiercellen transporteren bijvoorbeeld calcium van het cytosol naar het vliezige systeem dat het sarcoplasmatisch reticulum (SR) wordt genoemd. Als het cytosol van een rustende spiercel een vrije calciumionconcentratie heeft van 10-7 terwijl de concentratie in de SR 10-2 is, hoe werkt de ATPase dan?

A) ATPase-activiteit moet een instroom van calcium van de buitenkant van de cel in de SR stimuleren.

B) ATPase-activiteit moet i naar de SR overbrengen om dit mogelijk te maken.

C) ATPase-activiteit moet calcium van het cytosol naar de SR pompen tegen de concentratiegradiënt in.

D) ATPase-activiteit moet een kanaal openen zodat de calciumionen langs de concentratiegradiënt terug in de SR kunnen diffunderen.

28) Welke van de volgende is de meest juiste interpretatie van de figuur?

A) Energie uit katabolisme kan direct worden gebruikt voor het uitvoeren van cellulair werk.

B) ADP + i zijn een reeks moleculen die energie opslaan voor katabolisme.

C) ATP is een molecuul dat fungeert als tussenpersoon om energie op te slaan voor cellulair werk.

D) i fungeert als een shuttlemolecuul om energie van ATP naar ADP te verplaatsen.

29) Hoe gebruiken cellen de in de figuur getoonde ATP-cyclus?

A) Cellen gebruiken de cyclus om ADP en fosfaat te recyclen.

B) Cellen gebruiken de cyclus om energie te recyclen die vrijkomt bij ATP-hydrolyse.

C) Cellen gebruiken de cyclus om ADP, fosfaat en de energie die vrijkomt bij ATP-hydrolyse te recyclen.

D) Cellen gebruiken de cyclus voornamelijk om warmte te genereren.

30) Welke van de volgende is waar voor enzymen?

A) Enzymfunctie wordt verhoogd als de 3-D-structuur of conformatie van een enzym wordt gewijzigd.

B) Enzymfunctie is onafhankelijk van fysische en chemische omgevingsfactoren zoals pH en temperatuur.

C) Enzymen verhogen de snelheid van chemische reactie door de barrières voor activeringsenergie te verlagen.

D) Enzymen verhogen de snelheid van chemische reactie door activeringsenergie aan het substraat te leveren.


Resultaten

In vitro ATPase-activiteit van Hsp90

De Saccharomyces cerevisiae Hsp90 isovorm Hsp82, gezuiverd uit een overproducerende giststam tot kristallijne kwaliteit (Prodromou et al., 1996), werd getest op ATPase-activiteit met behulp van een gevoelige gekoppelde enzymtest (zie Materialen en werkwijzen). De aan pyruvaatkinase (PK)-lactaatdehydrogenase (LDH) gekoppelde test zet elk verontreinigend ADP om in ATP voordat een vermoedelijk ATPase wordt toegevoegd. Omdat ADP bindt aan het nucleotide-bindende domein van Hsp90 met een ∼5-voudig grotere affiniteit dan ATP (Prodromou et al., 1997b), elimineert de verwijdering ervan de mogelijkheid van ADP-remming, die andere onderzoeken in gevaar kan hebben gebracht. Bij 37°C, wat matige hitteschokken vormt voor: S.cerevisiae, zagen we een ATPase-activiteit voor gist Hsp90 van 5000 pmol/min/mg overeenkomend met a kkat van 0,4/min, met a Km van ∼ 100 uM. Bij een normale groeitemperatuur van 30°C was de activiteit ∼4-voudig verminderd, maar bij 43°C verder gestimuleerd tot bijna 1,0/min.

Om aan te tonen dat de ATPase-activiteit die we waarnemen specifiek is voor Hsp90 en niet te wijten is aan verontreinigende proteïnekinasen of andere ATPases, hebben we gebruik gemaakt van de waarneming dat de ATP-bindingsplaats in Hsp90 onthuld werd door structurele en biochemische studies (Grenert et al., 1997 Prodromou et al., 1997b) is ook de bindingsplaats voor het ansamycine-antibioticum geldanamycine (Stebbins et al., 1997) (Figuur 1). Deze verbinding bindt aan het gist Hsp90 N-terminale domein met a KNS van 0, 5 M, waardoor specifieke interacties worden gemaakt met veel van de residuen die een interactie aangaan met ATP, en daarom wordt verwacht dat het een krachtige remmer van ATP-binding is. Toevoeging van geldanamycine interfereerde niet met de functie van de gekoppelde enzymtest, maar schafte effectief de Hsp90-geassocieerde ATPase-activiteit af bij een concentratie van 15 M (Figuur 2).

We hebben ook een ATPase-activiteit gemeten (6500 pmol/min/mg equivalent aan kkat 0,47/min bij 37°C) in de Escherichia coli Hsp90 homoloog HtpG, opnieuw gezuiverd tot kristallijne kwaliteit van een overexpressie E coli deformatie. Deze activiteit was ook gevoelig voor remming door geldanamycine, maar werd slechts in geringe mate gestimuleerd bij 43°C.De aanwezigheid van deze activiteit in Hsp90, gezuiverd uit geheel verschillende achtergronden, is verder bewijs dat het geen artefact is vanwege een gelijktijdig gezuiverde verontreiniging, en suggereert dat de ATPase-activiteit waarschijnlijk een algemene eigenschap is van prokaryotische en eukaryote Hsp90's.

Hoewel de omzetsnelheden die we waarnemen voor de inherente ATPase van Hsp90's laag zijn volgens de normen van veel ATP-hydrolyserende enzymen, zijn ze van dezelfde orde van grootte als de inherente ATPase-activiteit van Hsp70's (O'Brien en McKay, 1995 Bukau en Horwich , 1998 ). Met Hsp70 wordt de ATPase-activiteit duidelijk gestimuleerd door client-eiwitsubstraten en co-begeleiders (Jordan en McMacken, 1995 McCarty et al., 1995 Theyssen et al., 1996 ). Het moet nog worden bepaald of de ATPase-activiteit van Hsp90 op dezelfde manier wordt gemoduleerd door de aanwezigheid van Hsp90-afhankelijke client-eiwitten en/of door de co-chaperonnes die nodig zijn voor Hsp90-actie in beide. in vivo en in vitro gereconstitueerde systemen (Dittmar en Pratt, 1997).

Terwijl dit manuscript in voorbereiding was, heeft Scheibel et al. (1998) rapporteerden een ATPase-activiteit in gist Hsp90 die ook gevoelig was voor remming door geldanamycine. De omzet die in dat onderzoek wordt gerapporteerd, is echter slechts ∼20% van wat we waarnemen bij 30°C. Hoewel we niet in staat zijn om deze verschillen met elkaar te verzoenen, merken we op dat die studie gebruik maakte van een radioactieve niet-regenererende test en mogelijk onderhevig was aan remming door ADP (zie hierboven, en Materialen en methoden), die onvermijdelijk aanwezig is in dergelijke een test.

In vivo ATP-afhankelijkheid

Het bestaan ​​van een inherente ATPase-activiteit in Hsp90 suggereert dat veel, zo niet alle, biologische functies van Hsp90 direct ATP-afhankelijk zijn. Om deze hypothese te testen, hebben we het effect bepaald van mutaties in residuen die betrokken zijn bij ATPase-activiteit op de Hsp90-functie in levende lijve. Saccharomyces cerevisiae heeft twee genen voor het Hsp90-eiwit, HSC82, die constitutief wordt uitgedrukt, en HSP82, die normaal gesproken op een lager niveau wordt uitgedrukt dan HSC82 maar wordt sterk geactiveerd door hitteschok. De gecodeerde eiwitsequenties zijn voor 97% identiek. Deletie van een van deze genen produceert nog steeds levensvatbare cellen, maar deletie van beide is dodelijk (Borkovich et al., 1989 ). We hebben een haploïde geconstrueerd S.cerevisiae stam (PP30) die de coderende regio's van beide heeft HSC82 en HSP82 volledig verwijderd, maar dat is levensvatbaar omdat het een episomale URA3 plasmide met een wildtype kopie van HSC82 (zie Materialen en methoden). Wild-type of mutante versies van een Hsp90-coderend gen kunnen vervolgens worden geïntroduceerd op plasmiden met een enkele kopie LEU2 positieve selectie, en de functionaliteit van het tot expressie gebrachte Hsp90-eiwit wordt bepaald door zijn vermogen om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden wanneer de URA3 plasmide dat het wildtype draagt HSC82 gen wordt gedeselecteerd op 5-fluoro-orotic acid (5-FOA) platen.

Uit de kristalstructuren van het N-terminale domein van de gist Hsp90 chaperonne met gebonden nucleotiden ( Prodromou et al., 1997b), identificeerden we Asp79 als een sleutelresidu in adenine-nucleotidebinding. De carboxylaatzijketen van dit residu maakt een waterstofbinding aan de exocyclische N6-groep van adenine, waardoor de enige directe waterstofbindingsinteractie tussen het eiwit en de base van het gebonden nucleotide wordt verschaft. De waterstofbindende omgeving van dit residu is zodanig dat zelfs een subtiele mutatie naar asparagine de ATP-binding zou benadelen door een sterk afstotende interactie met de adeninebase te genereren, met minimale verstoring van de structuur in de nucleotide-bindingsplaats (Figuur 3). Bovendien, aangezien dit residu op de bodem van een diepe zak in de Hsp90 N-terminale domeinstructuur ligt, kan de mutatie ervan geen directe invloed hebben op interacties met andere domeinen of geassocieerde eiwitten die niet worden gemedieerd door een gebonden nucleotide. Structurele homologie tussen het Hsp90 N-terminale domein en het N-terminale ATPase-domein van het DNA-gyrase B-eiwit (Gerloff et al., 1997 Prodromou et al., 1997b) brengt Glu33 van Hsp90 op één lijn met Glu42 van gyrase B. Glu42 functioneert als een algemene basis in het ATPase-mechanisme van DNA-gyrase B (Jackson en Maxwell, 1993), en mutatie naar alanine vermindert de supercoiling en DNA-afhankelijke ATPase-activiteit aanzienlijk, maar verhindert niet nucleotidebinding (Jackson en Maxwell, 1993). De structurele homologie tussen de ATP-bindingsplaatsen in gyrase B en Hsp90 suggereert dat Glu33 een vergelijkbare rol zou kunnen spelen in de ATPase-activiteit van Hsp90. Van mutaties van Asp79 en Glu33 zou dus worden verwacht dat ze de Hsp90-functie in gevaar brengen in vivo als ATP-binding en hydrolyse inderdaad essentieel zijn.

HSP82 allelen met Asp79Asn-, Asp79Arg-, Asp79Trp- en Glu33Ala-mutaties slaagden er allemaal niet in om de levensvatbaarheid van gistcellen te behouden wanneer het wildtype HSC82 gen werd gedeselecteerd op 5-FOA-platen, terwijl cellen met het wildtype HSP82 bleef perfect levensvatbaar (Figuur 4A en B). Om te verifiëren dat de beoogde mutaties inderdaad verantwoordelijk waren voor het verlies van levensvatbaarheid, werden de mutante genen teruggezet naar wildtype door een tweede ronde van plaatsgerichte mutagenese. Alle teruggekeerde HSP82 allelen verleenden volledige levensvatbaarheid op 5-FOA-platen. Wanneer mede tot expressie gebracht in aanwezigheid van wildtype HSC82, de mutante genen regisseerden de synthese van een full-length HSP82 product wanneer het wordt geïnduceerd door hitteschok, wat aangeeft dat deze mutaties niet eenvoudigweg de expressie van het eiwit voorkomen (Figuur 4C).

een functionele HSC82 gen voldoende is om levensvatbaarheid te behouden in de aanwezigheid van Asp79- of Glu33-mutant hsp82 allelen. Deze cellen die zowel wildtype Hsc90 als een vermeende ATP-bindingsdefecte of ATPase-defecte mutant Hsp90 tot expressie brengen, groeiden echter minder goed dan vergelijkbare cellen die Hsc90 en het wildtype Hsp90 tot expressie brengen, wat wijst op een waarschijnlijke semi-dominantie van deze Hsp90-mutaties. Om dit verder te onderzoeken, hebben we een variant van de PP30-stam geconstrueerd (PP30a zie Materialen en methoden) waarin de Hsp90-functie wordt geleverd door een HSP82 gen op de LEU2 plasmide pHSP82. Mutant of wildtype HSP82 allelen onder controle van de galactose-induceerbare GAL1 promotor werden vervolgens in deze achtergrond geïntroduceerd op een URA3 plasmide, en hun groei onder inducerende of niet-inducerende omstandigheden vergeleken. Ten opzichte van niet-inducerende omstandigheden (Figuur 5A), alle stammen die een mutant herbergen hsp82 allel vertoonde een duidelijke vertraging in groei op galactosesubstraten, een vertraging die niet wordt getoond door isogene cellen die het wildtype Hsp90-eiwit tot expressie brengen (Figuur 5B en C). Dus de expressie van mutante Hsp90's waarvan in andere experimenten is aangetoond dat ze ATP-bindingsdefect of ATPase-defect zijn (zie hieronder) is niet neutraal in vivo, maar oefent sterke dominant-negatieve effecten uit op de groei. We hebben het mechanisme van deze semi-dominantie nog niet gedefinieerd, maar het ontstaat hoogstwaarschijnlijk door sekwestratie van essentiële client-eiwitten en/of co-begeleiders in complexen met deze inactieve Hsp90-dimeren, die vervolgens niet door vouwing kunnen vorderen. Of heterodimeren tussen wildtype en defecte mutanten ook inactief zijn, valt nog te bezien.

In vitro analyse van ATP-bindingsplaatsmutaties

Uit de rollen die door de structurele gegevens aan Glu33 en Asp79 worden toegeschreven, en naar analogie met de homologe residuen in DNA-gyrase (Jackson en Maxwell, 1993), zou worden verwacht dat mutanten van het katalytische residu Glu33 adeninenucleotiden binden, terwijl mutanten van Asp79 dat wel zouden doen. niet. Om te verifiëren dat de waargenomen functionele defecten van mutaties van deze residuen in vivo consistent was met hun voorspelde biochemische rollen, werden de N-terminale domeinen voor de Asp79Asn- en Glu33Ala-mutanten getest op ADP- en ATP-binding met behulp van isotherme titratiecalorimetrie, zoals eerder beschreven voor het wildtype domein ( Prodromou et al., 1997b zie Materialen en methoden). Het N-terminale domein van de Asp79Asn-mutant bond noch ATP noch ADP in enige meetbare mate, in tegenstelling tot de Glu33Ala-mutant die een affiniteit voor ATP behield die vergelijkbaar was met die eerder beschreven voor het wildtype domein ( Prodromou et al., 1997b). Hoewel ATP-binding door het N-terminale domein grotendeels onaangetast was, verminderde de Glu33Ala-mutatie de ATPase-activiteit van het intacte eiwit tot <1% van het niveau dat werd waargenomen voor het wildtype. Ten slotte, om te verifiëren dat het verlies van adenine-nucleotidebinding door de Asp79Asn-mutant te wijten was aan de lokale veranderingen in waterstofbindingsmogelijkheden aan de onderkant van de nucleotide-bindende pocket, en niet aan grove misvouwing van het eiwit als gevolg van de mutatie, het N-terminale domein van de Asp79Asn-mutant werd gekristalliseerd zoals eerder beschreven voor het wildtype eiwit ( Prodromou et al., 1996 ) en de structuur bepaald bij een resolutie van 2,1 . Vergelijking van de verfijnde Asp79Asn mutant N-terminale domeinstructuur met die van de wild-type chaperonne geeft een wortel-mean-square verschil tussen alle eiwitatomen van slechts 0,9 A, wat aangeeft dat de algehele structuren effectief identiek zijn binnen de grenzen van de methode, en zijn niet significant veranderd door de Asp-naar-Asn-mutatie.


Lot van waterstofionen geproduceerd ib ATP-hydrolyse

Wanneer ATP wordt gehydrolyseerd voor cellulaire energie, wat is het lot van de geproduceerde hydronium- of H+-ionen?

Ik weet niet zeker of H+-ionen (protonen) een bepaald lot hebben, tenzij ze aanwezig zijn in buffersystemen zoals hierboven aangegeven. Zodra de fosfoanhydridebindingen (hoogenergetische bindingen) van het onstabiele ATP zijn verbroken, valt het water nucleofiel de ATP-fosfaatgroepen aan, de geproduceerde ADP + Pi worden door resonantie gestabiliseerd en worden geïoniseerd, vandaar dat H+ wordt geproduceerd. Ik vermoed dat dit bijdraagt ​​aan de pH en aan de H+/ATP-verhouding, die de energietransductie in cellen beïnvloedt.

Laat me wat context geven. Ik ben een acute interne geneeskunde arts. Een van de problemen waarmee zeer onwelpatiënten worden geconfronteerd, is lactaatacidose (of beter gezegd hyperlactatemie met acidemie aangezien lactaat een geconjugeerde base is in de Brønsted-Lowry-zuurbasetheorie). Ons begrip van de acidose en daaropvolgende acidemie die ontstaat bij een verhoogd lactaat in deze setting, is dat wanneer weefselhypoxie het aerobe metabolisme veroorzaakt, effectief stopt met een verschuiving naar anaëroob gegenereerd lactaat. ATP wordt verder gehydrolyseerd als energiebron totdat de intracellulaire voorraden zijn uitgeput. Mijn vraag heeft betrekking op waar de acidose en dus acidemie vandaan komt bij een verhoogd lactaat. Sommige bronnen hebben gezegd dat het afkomstig is van ATP-hydrolyse en aangezien de verkiezingstransportketen niet werkt in hypoxische omstandigheden, accumuleren de protonen effectief (in plaats van het binnenste mitochondriale membraan te passeren voordat de uiteindelijke hersynthese van ATP-moleculen via ATP-synthase op de elektronentransportketen plaatsvindt). Ik heb begrepen dat de accumulerende protonen in eerste instantie intracellulair getitreerd worden voor extracellulaire titratie totdat de buffersystemen uitgeput zijn en systemische ECF acidemie optreedt. Ik wil alleen weten of deze theorie klopt?


Hebben de pH en andere ionen invloed op de hydrolyse van ATP - Biologie?

pH is een maat voor de concentratie van waterstofionen (= H + ) (= protonen) in een oplossing.

Numeriek is het de negatief logaritme van die concentratie uitgedrukt in mol per liter (m).

Zuiver water dissocieert spontaan in ionen en vormt een 10-7 M oplossing van H + (en OH - ). De min van deze logaritme is 7, dus de pH van zuiver water is 7.

Oplossingen met een hogere concentratie H+ dan in zuiver water voorkomen, hebben een pH-waarde lager dan 7 en zijn zuur.

Oplossingen die moleculen of ionen bevatten die de concentratie van H + verlagen tot onder die van zuiver water, hebben een pH-waarde van meer dan 7 en zijn basis of alkalisch.

De eigenschappen van de meeste eiwitten, enzymen bijvoorbeeld, zijn gevoelig voor pH.

  • H + binden aan de carboxylgroepen (COO - ) van asparaginezuur (Asp) en glutaminezuur (Glu), waardoor hun negatieve lading wordt geneutraliseerd, en
  • H + binden aan het onbezette elektronenpaar op het N-atoom van het amino (NH2 ) groepen van lysine (Lys) en arginine (Arg) waardoor ze een positieve lading krijgen.

Het resultaat: Niet alleen verandert de nettolading op het molecuul (het wordt positiever), maar veel van de mogelijkheden die de R-groepen hebben voor ionische interacties met andere moleculen en ionen worden veranderd.

  • H + worden verwijderd uit de COOH-groepen van Asp en Glu, waardoor ze een negatieve lading krijgen (COO - ), en
  • H+ worden verwijderd uit de NH3 + groepen Lys en Arg die hun positieve lading verwijderen.

Het resultaat: Opnieuw verandert de nettolading op het molecuul (het wordt negatiever) en nogmaals, veel van de mogelijkheden die de R-groepen hebben voor ionische interacties met andere moleculen of ionen worden gewijzigd.


Referenties

George, A. ABC transporters - 40 jaar verder. ABC Transporters - 40 jaar later (Springer International Publishing, 2015). https://doi.org/10.1007/978-3-319-23476-2

Rees, D.C., Johnson, E. & Lewinson, O. ABC-transporters: de kracht om te veranderen. nat. ds. Mol. Cel Biol. 10, 218–227 (2009).

ter Beek, J., Guskov, A. & Slotboom, D. J. Structurele diversiteit van ABC-transporters. J. Gen. Physiol. 143, 419–435 (2014).

Holland, B., Cole, P.C. S., Kuchler, K. & Higgins, C.F. ABC-eiwitten - van bacterie tot mens. (Academische pers, 2003).

Lewinson, O. & Livnat-Levanon, N. Werkingsmechanisme van ABC-importeurs: behoud, divergentie en fysiologische aanpassingen. J. Mol. Biol. 429, 606–619 (2017).

Tanaka, K.J., Song, S., Mason, K. & Pinkett, H.W. Selectieve substraatopname: de rol van ATP-bindende cassette (ABC) importeurs in pathogenese. Biochim. Biofysica. Acta Biomemb. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2017.08.011 (2017).

Oldham, M. L. & Chen, J. Kristalstructuur van de maltosetransporter in een pretranslocatie-tussentoestand. Wetenschap (80). 332, 1202–1205 (2011).

Jardezky, O. Eenvoudig allosterisch model voor membraanpompen. Natuur 211, 969–970 (1966).

Bao, H. & Duong, F. ATP alleen triggert de naar buiten gerichte conformatie van de maltose ATP-bindende cassettetransporter. J. Biol. Chem. 288, 3439–3448 (2013).

Fabre, L., Bao, H., Innes, J., Duong, F. & Rouiller, I. Negatieve kleuring van één deeltje EM van de maltosetransporter in nanodiscs onthult asymmetrische sluiting van MalK2 en katalytische rollen van ATP, MalE en maltose. J. Biol. Chem. 292, 5457–5464 (2017).

Alvarez, F.J.D. et al. Volledige betrokkenheid van geligandeerd maltosebindend eiwit stabiliseert een semi-open ATP-bindend cassettedimeer in de maltosetransporter. Mol. microbiologisch. 98, 878–894 (2015).

Böhm, S., Licht, A., Wuttge, S., Schneider, E. & Bordignon, E. Conformationele plasticiteit van de type I maltose ABC-importeur. Proc. nat. Acad. Wetenschap. 110, 5492–5497 (2013).

Bao, H., Dalal, K., Cytrynbaum, E. & Duong, F. Sequentiële werking van MalE en maltose maakt het mogelijk om ATP-hydrolyse te koppelen aan translocatie in de MalFGK2-transporter. J. Biol. Chem. 290, 25452–25460 (2015).

Weng, J., Gu, S., Gao, X., Huang, X. & Wang, W. Maltose-bindend eiwit stabiliseert effectief de gedeeltelijk gesloten conformatie van de ATP-bindende cassettetransporter MalFGK2. Fys. Chem. Chem. Fys. 19, 9366–9373 (2017).

Hsu, W.-L., Furuta, T. & Sakurai, M. Het mechanisme van nucleotide-bindende domeindimerisatie in de intacte maltosetransporter zoals bestudeerd door moleculaire dynamica-simulaties met alle atomen. Eiwitten structuur. Functie Bio-informatica. 86, 237–247 (2018).

Wen, P.C. & Tajkhorshid, E. Dimer opening van de nucleotide-bindende domeinen van ABC-transporters na ATP-hydrolyse. Biophys J 95, 5100–5110 (2008).

Oloo, E. O. & Tieleman, D. P. Conformationele overgangen geïnduceerd door de binding van MgATP aan de vitamine B12 ATP-bindende cassette (ABC) transporter BtuCD. J. Biol. Chem. 279, 45013–45019 (2004).

Hsu, W.L., Furuta, T. & Sakurai, M. Analyse van de vrije-energielandschappen voor de openings-sluitingsdynamiek van de maltosetransporter ATPase MalK2 met behulp van simulatie met verbeterde bemonstering van moleculaire dynamica. J. Fys. Chem. B 119, 9717–9725 (2015).

Weng, J.W., Fan, K.N. & Wang, W.N. De conformationele overgangsroute van ATP-bindende cassettetransporter MsbA onthuld door atomistische simulaties. J. Biol. Chem. 285, 3053–3063 (2010).

Zo, J.G. et al. Analyse van conformationele bewegingen en gerelateerde interacties van sleutelresiduen die verantwoordelijk zijn voor een specifieke functie van eiwitten met een elastisch netwerkmodel. J. Biomol. structuur. Din. 34, 560–571 (2016).

Huang, W. & Liao, J.-L. Katalytisch mechanisme van de maltosetransporteur die ATP hydrolyseert. Biochemie 55, 224–231 (2016).

Hsu, W.-L., Furuta, T. & Sakurai, M. ATP-hydrolysemechanisme in een maltosetransporter onderzocht door QM / MM-metadynamica-simulatie. J. Fys. Chem. B 120, 11102–11112 (2016).

Oliveira, A. S., Baptista, A. M. & Soares, C. M. Conformationele veranderingen veroorzaakt door ATP-hydrolyse in een ABC-transporter: een moleculaire dynamica-studie van de Sav 1866-exporteur. Eiwitten-structuur. Functie Bioinf. 79, 1977–1990 (2011).

Oldham, M.L., Chen, S. & Chen, J. Structurele basis voor substraatspecificiteit in de Escherichia coli maltose transportsysteem. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 110, 18132–18137 (2013).

Orelle, C., Ayvaz, T., Everly, R.M., Klug, C.S. & Davidson, A.L. Zowel maltose-bindend eiwit als ATP zijn vereist voor sluiting van het nucleotide-bindende domein in de intacte maltose-ABC-transporter. 105, 12837–12842 (2008).

Verhalen, B. et al. Energietransductie en afwisselende toegang van de zoogdier ABC-transporter P-glycoproteïne. Natuur 543, 738–741 (2017).

Misra, S. et al. Conformationele dynamiek van de nucleotide-bindende domeinen en de krachtslag van een heterodimere ABC-transporter. Elife 3, e02740 (2014).

Wen, P.C. & Tajkhorshid, E. Conformationele koppeling van de nucleotide-bindende en de transmembraandomeinen in ABC-transporters. Biofysica. J. 101, 680–690 (2011).

Jacso, T., Schneider, E., Rupp, B. & Reif, B. Substraattransportactivering wordt gemedieerd door de tweede periplasmatische lus van het transmembraaneiwit MalF in het maltosetransportcomplex van Escherichia coli. J. Biol. Chem. https://doi.org/10.1074/jbc.M112.340679 (2012).

Grote, M. et al. Transmembraansignalering in de maltose ABC-transporter MalFGK2E: periplasmatische MalF-P2 LOOP communiceert substraatbeschikbaarheid naar het ATP-gebonden MalK-dimeer. J. Biol. Chem. 284, 17521–17526 (2009).

Ehrle, R., Pick, C., Ulrich, R., Hofmann, E. & Ehrmann, M. Karakterisering van transmembraandomeinen 6, 7 en 8 van MalF door mutatieanalyse. J. Bacteriol. 178, 2255 LP - 2262 (1996).

Steinke, A., Grau, S., Davidson, A., Hofmann, E. & Ehrmann, M. Karakterisering van transmembraansegmenten 3, 4 en 5 van MalF door mutatieanalyse. J. Bacteriol. 183, 375 LP - 381 (2001).

Nelson, B. D. & Traxler, B. Onderzoek naar de rol van integrale membraaneiwitten in ATP-bindende cassettetransporters: analyse van een verzameling MalG-insertiemutanten. J. Bacteriol. 180, 2507 LP - 2514 (1998).

Korkhov, V. M., Mireku, S.A. & Locher, K.P. Structuur van AMP-PNP-gebonden vitamine B12-transporter BtuCD-F. Natuur 490, 367–372 (2012).

Quistgaard, E.M., Löw, C., Guettou, F. & Nordlund, P.Inzicht in transport door de grote faciliterende superfamilie (MFS): Structuren maken de weg vrij. nat. ds. Mol. Cel Biol. 17, 123–132 (2016).

Park, M. Moleculaire dynamische simulaties van de menselijke glucosetransporter GLUT1. PLoS ONE 10(4), e0125361 (2015). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0125361

Sheena, A., Mohan, S.S., Haridas, N.P.A. & Anilkumar, G. Opheldering van de glucosetransportroute in glucosetransporter 4 via gestuurde moleculaire dynamische simulaties. PLoS ONE 6(10), e25747 (2011).

Ranquin, A. & Gelder, P.V. Maltoporine Suiker Phys. Biol. 155, 611–616 (2004).

Danelon, C. Onderzoek naar de oriëntatie van gereconstitueerde maltoporinekanalen op het niveau van één eiwit. J. Biol. Chem. 278, 35542–35551 (2003).

Dutzler, R., Schirmer, T., Karplus, M., Fischer, S. &. Pasteur, L. Translocatiemechanisme van lange suikerketens over het Maltoporin-membraankanaal. 10, 1273–1284 (2002).

Oldham, M. L. & Chen, J. Snapshots van de maltosetransporter tijdens ATP-hydrolyse. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 108, 15152–15156 (2011).

Sali, A. & Blundell, T. L. Vergelijkende eiwitmodellering door bevrediging van ruimtelijke beperkingen. J. Mol. Biol. 234, 779–815 (1993).

Schmidt, T. H. & Kandt, C. LAMBADA en InflateGRO2: efficiënte membraanuitlijning en insertie van membraaneiwitten voor moleculaire dynamische simulaties. J. Chem. Inf. Model. 52, 2657-2669. https://doi.org/10.1021/ci3000453 (2012).

Bashford, D. Macroscopische elektrostatische modellen voor protoneringstoestanden in eiwitten. Voorkant. Biosc. 9, 1082–1099 (2004).

Baptista, A. M. & Soares, C. M. Enkele theoretische en computationele aspecten van de opname van proton-isomerie in het protonatie-evenwicht van eiwitten. J. Fys. Chem. B 105, 293–309 (2001).

Abraham M.J., van der Spoel D., Lindahl E., H.B. en het ontwikkelingsteam van G.. GROMACS Gebruikershandleiding versie 5.0.7.

Poger, D. & Mark, A.E. Over de validatie van moleculaire dynamica-simulaties van verzadigde en cis-enkelvoudig onverzadigde fosfatidylcholine-lipidedubbellagen: een vergelijking met experiment. J. Chem. Theorie Berekening. 6, 325–336 (2010).

Hansen, H. S. & Hünenberger, P. H. Een opnieuw geoptimaliseerd GROMOS-krachtveld voor op hexopyranose gebaseerde koolhydraten, rekening houdend met de relatieve vrije energieën van ringconformeren, anomeren, epimeren, hydroxymethylrotameren en glycosidische koppelingsconformeren. J. Computer. Chem. 32, 998–1032 (2011).

Oliveira, A.S.F., Baptista, A.M. & Soares, C.M. Communicatiemechanismen tussen domeinen in een ABC-importeur: een moleculaire dynamica-studie van de MalFGK2E-complex. Plos Computer. Biol. 7, e1002128 (2011).

Oliveira, A.S.F., Baptista, A.M. & Soares, C.M. Inzichten in het moleculaire mechanisme van een ABC-transporter: conformationele veranderingen in het NBD-dimeer van MJ0796. J. Fys. Chem. B 114, 5486–5496 (2010).

Damas, J.M. et al. Voorspellen van de thermodynamica en kinetiek van helixvorming in een cyclisch peptidemodel. J. Chem. Theorie Berekening. 9, 5148–5157 (2013).

Bussi, G., Donadio, D. & Parrinello, M. Canonieke bemonstering door middel van snelheidsaanpassing. J. Chem. Fys. 126, 014101 (2007).

Parrinello, M. & Rahman, A. Polymorfe overgangen in eenkristallen: een nieuwe methode voor moleculaire dynamica. J. Appl. Fys. 52, 7182–7190 (1981).

Darden, T., York, D. & Pedersen, L. Particle mesh Ewald: een N log (N) -methode voor Ewald-sommen in grote systemen. J. Chem. Fys. 98, 10089–10092 (1993).

Essmann, U. et al. Een gladde deeltjesgaas Ewald-methode. J. Chem. Fys. 103, 8577–8593 (1995).

Hess, B., Bekker, H., Berendsen, HJC & Fraaije, J.G.E.M. LINCS: een lineaire beperkingsoplosser voor moleculaire simulaties. J. Computer. Chem. 18, 1463–1472 (1997).

Miyamoto, S. & Kollman, P. A. Settle - een analytische versie van het schud- en rammelalgoritme voor starre watermodellen. J. Computer. Chem. 13, 952–962 (1992).

Smith, P.E. & Vangunsteren, W.F. Consistente diëlektrische eigenschappen van de eenvoudige puntlading en uitgebreide eenvoudige puntlading watermodellen bij 277 en 300 K. J. Chem. Fys. 100, 3169–3174 (1994).

Abreu, B., Lopes, E.F., Oliveira, A.S.F. & Soares, C.M. F508del verstoort de dynamiek van de nucleotide-bindende domeinen van CFTR voor en na ATP-hydrolyse. Eiwitten structuur. Functie Bioinf. 88, 1-14. https://doi.org/10.1002/prot.25776 (2019).

Damas, J.M., Oliveira, A.S.F., Baptista, A.M. & Soares, C.M. Structurele gevolgen van ATP-hydrolyse op de ABC-transporter NBD-dimeer: ​​moleculaire dynamische studies van HlyB. Eiwit Sc. 20, 1220–1230 (2011).

Lindorff-Larsen, K. & Ferkinghoff-Borg, J. Gelijkenismaatregelen voor eiwitensembles. PLoS ONE 4, e4203 (2009).

Tiberti, M., Papaleo, E., Bengtsen, T., Boomsma, W. & Lindorff-Larsen, K. ENCORE: software voor kwantitatieve ensemblevergelijking. PLoS-computer. Biol. 11, 1–16 (2015).

Naveen, M., J., D.E., B., W.T. & Oliver, B. MDAanalyse: een toolkit voor de analyse van moleculaire dynamica-simulaties. J. Computer. Chem. 32, 2319–2327 (2011).

Gowers, R.J. et al. MDAnalysis: een Python-pakket voor de snelle analyse van moleculaire dynamische simulaties. In Proceedings van de 15e Python in Science Conference 98–105 (2016).

Smart, O. S., Goodfellow, J. M. & Wallace, B. A. De poriënafmetingen van gramicidine A. Biofysica. J. 65, 2455–2460 (1993).

Kabsch, W. & Sander, C. Woordenboek van secundaire eiwitstructuur: patroonherkenning van waterstofgebonden en geometrische kenmerken. Biopolymeren 22, 2577–2637 (1983).

Campos, S.R. & Baptista, A.M. Conformationele analyse in een multidimensionaal energielandschap: studie van een arginylglutamaatherhaling. J. Fys. Chem. B 113, 15989–16001 (2009).

Laskowski, R. A., Jabłońska, J., Pravda, L., Vařeková, R. S. & Thornton, J. M. PDBsum: structurele samenvattingen van PDB-items. Eiwit Sc. 27, 129–134 (2018).

Efron, B. 1977 Rietz-lezing - bootstrap-methoden - een andere kijk op het Jackknife. Ann. stat. 7, 1–26 (1979).

Schrödinger LLC. Het PyMOL Molecular Graphics System, versie 1.8. (2015).

Hunter, J.D. Matplotlib: een 2D grafische omgeving. Berekenen. Wetenschap. Ing. 9, 90–95 (2007).

Williams, T., Kelley, C. & vele anderen. Gnuplot 4.6: een interactief plotprogramma. (2013).

Abraham, M.J. et al. GROMACS: Hoogwaardige moleculaire simulaties door parallellisme op meerdere niveaus van laptops tot supercomputers. SoftwareX 1–2, 19–25 (2015).

Kästner, J. & Thiel, W. Het overbruggen van de kloof tussen thermodynamische integratie en paraplu-bemonstering biedt een nieuwe analysemethode: "Paraplu-integratie". J. Chem. Fys. 123, 144104 (2005).

Kästner, J. & Thiel, W. Analyse van de statistische fout in simulaties van paraplu-bemonstering door paraplu-integratie. J. Chem. Fys. 124, 234106 (2006).

Stroet, M. Paraplu-integratie: eerste versie. https://doi.org/10.5281/ZENODO.164996 (2016).


Een update van de chemiosmotische theorie zoals gesuggereerd door mogelijke protonstromen in het koppelingsmembraan

Begrijpen hoe biologische systemen energie omzetten en opslaan, is een primair doel van fundamenteel onderzoek. Ondanks Mitchell's chemiosmotische theorie zijn we echter verre van de volledige beschrijving van basisprocessen zoals oxidatieve fosforylering (OXPHOS) en fotosynthese. Na meer dan een halve eeuw moet de chemiosmotische theorie mogelijk worden bijgewerkt, dankzij de nieuwste structurele gegevens over ademhalingsketencomplexen. In het bijzonder hebben up-to-date technologieën, zoals die met behulp van fluorescentie-indicatoren na protonverplaatsingen, aangetoond dat protontranslocatie lateraal is in plaats van transversaal ten opzichte van het koppelingsmembraan. Bovendien is de definitie van de fysieke soorten die betrokken zijn bij de overdracht (proton-, hydroxyoniumion- of protonstromen) nog steeds een onopgeloste kwestie, hoewel de laatste aanwinsten het idee ondersteunen dat er protonische stromen, moeilijk te meten, bij betrokken zijn. Bovendien, FOF1- Het alomtegenwoordige motorenzym van ATP-synthase heeft de eigenaardigheid (in tegenstelling tot de meeste enzymen) dat het het thermodynamische evenwicht van ATP-synthese beïnvloedt. Het lijkt erop dat het concept van diffusie van de protonlading, meer dan twee eeuwen geleden verwoord door Theodor von Grotthuss, in overweging moet worden genomen om deze problemen op te lossen. Al deze onzekerheden herinneren ons eraan dat ook in de biologie rekening moet worden gehouden met het onbepaaldheidsprincipe van Heisenberg, dat grenzen stelt aan analytische vragen.

1. Inleiding

De ‘chemiosmotische theorie’ geformuleerd door Mitchell [1], een onderzoeker met een Angelsaksische opleiding in de chemie, gaat meer dan 50 jaar terug. De theorie is universeel aanvaard, hoewel het onmiddellijk verschillende controverses opriep, die tot op de dag van vandaag duurden. Een opwaardering van de chemiosmotische theorie lijkt noodzakelijk in het licht van de enorme vooruitgang van bioanalytische technieken die de fijne structuur van de macromoleculaire complexen die betrokken zijn bij oxidatieve fosforylering (OXPHOS) [2–7] bepalen, met name studies over complex I (NADH: ubiquinone oxidoreductase) en complex IV (cytochroom C oxidase) [2,3,8]. Deze gegevens geven meer inzicht in de protonroute, een belangrijk punt van de theorie. Het feitelijke protonenpad door het membraan, de vermeende protonconcentraties aan weerszijden van het membraan en de daaruit voortvloeiende membraanpotentiaal zijn het onderwerp geweest van talloze studies. In alle bewijzen lijkt het erop dat een vrije protonosmose onmogelijk zou zijn, aangezien het een kwantumdeeltje is dat zich bindt aan water en hydroniumionen (H3O+). In feite zou elk vrij proton in het membraan snel worden afgevoerd door de waterige fase, waardoor de energie die gepaard gaat met het solvatatieproces vrijkomt, ten koste van het membraan. Ook vertonen vrije protonen een enorme vernietigende kracht op elk biologisch membraan waar ze doorheen gaan. Dienovereenkomstig zijn sommige membraantransporters (zoals de potentiaalafhankelijke protonpomp Hv1) ​​specifiek ontworpen om de protondestructieve kracht te voorkomen [9]. Ook stellen een aantal rapporten dat protonen die zich ophopen op het ademhalingsmembraan nooit in de waterige fase verblijven [10–13].

Daarom veronderstellen we in dit werk dat de koppelingsmodaliteit tussen de elektronentransportketen en de protonische beweging binnen het membraan zou kunnen plaatsvinden om een ​​protonafgifte te voorkomen, waardoor nieuwe scenario's worden geopend om de basismechanismen van het aerobe metabolisme te verklaren. Met andere woorden, in deze review bespreken we de mogelijkheid om de chemiosmotische theorie te actualiseren en de rol van lokale processen in de koppeling te ontrafelen. Dit kan helpen bij het ontwikkelen van nieuwe strategieën voor innovatief onderzoek gericht op cellulaire bio-energetica.

2. De chemiosmotische theorie en FOF1-ATP-synthase

De basisformulering van Mitchell's theorie is schematisch weergegeven in figuur 1, waar ATP-synthase ook werd aangegeven, anders dan de oorspronkelijke uitgave van 1961, waar het noodzakelijkerwijs niet was afgebeeld. Destijds werd ATP-synthese toegeschreven aan het membraan als geheel, in de vorm van een generieke aftrekking van H+ en OH − tot ADP en orthofosfaat om ATP te vormen.

Figuur 1. Schema van de chemiosmotische theorie van Mitchell uit 1961. Een gedelokaliseerde koppeling wordt afgebeeld tussen protonen geëxtrudeerd door de elektronentransportketen (ETC) en ATP-synthese. Het totale proces is willekeurig verdeeld in twee fasen: de ‘RedOx-koppeling’, waarbij de protonenbeweging wordt aangestuurd door de ETC, en de ‘protonenkoppeling’, waarbij de protonenbeweging wordt gekoppeld aan ATP-synthese, door FOF1-ATP-synthase.

De experimentele gegevens ter ondersteuning van de theorie kwamen achtereenvolgens en worden in de literatuur gerapporteerd als een enorme hoeveelheid bijdragen. Recensies zijn gepubliceerd en we verwijzen naar hen voor een volledige documentatie [14,15], alleen de belangrijkste problemen worden hier genoemd. Bijzonder invloedrijk waren de gegevens die in 1966 werden geproduceerd door A.T. Jagendorf & E. Uribe in het beroemde ‘zuurbadexperiment’ [16]. Ze verkregen een ATP-synthese die een transmembraansprong van pH in chloroplasten induceerde in vitro. In hetzelfde jaar stelden Y. Kagawa & E. Racker vast dat de synthese van ATP plaatsvond op de zogenaamde 'sferen' die F worden genoemd.1 subeenheden van het ATP-synthase [17]. Sindsdien is de basisbijdrage van FOF1-ATP-synthase (ATP-synthase) naar de OXPHOS werd duidelijk.

een elektronentransportketen, die de energie levert voor H + -overdracht van de ene kant naar de andere kant van het membraan

ATP-synthase, synthese/hydrolyseren van ATP via H+-translocatie en

ondoordringbaarheid van het binnenste mitochondriale membraan voor ionische soorten, waardoor protonen worden opgenomen.

Daarentegen lijkt de 'protonkoppeling' of 'tweede koppeling' (zie figuur 1, rechts) de meest kritische passage van het hele OXPHOS-proces. In de literatuur wordt melding gemaakt van verschillende experimenten die zijn uitgevoerd met gereconstrueerde systemen [27,28] (d.w.z. ATP-synthase ingebouwd in fosfolipideblaasjes) die ongeveer vijftien jaar na de hypothese van Mitchell werden uitgevoerd. Blaasjes verkregen uit de membranen van de paarse Halobacterium salinarum gesynthetiseerd ATP als resultaat van verlichting, en zo werd aangetoond dat protonbewegingen door het membraan de synthese van ATP ondersteunen. In 1977, N. Sone et al. waargenomen dat ATP-synthase gezuiverd door Thermofiele bacterie, ingebracht in kunstmatige membranen, was in staat ATP te synthetiseren dankzij een tijdelijke verschuiving in membraanpotentiaal (ΔΨ) geïnduceerd door valinomycine, waardoor een snelle passage van K+-ionen door een membraan mogelijk is aan de zijkanten waarvan verschillende zoutconcentraties waren ingesteld [28]. Deze experimenten toonden aan dat protontranslocatie de cruciale stap is voor de 'protonkoppeling' tussen protonische beweging en ATP-synthese. Over dit algemene onderwerp staat de minirecensie van Junge [29, p. 197], waarin enerzijds de veelzijdigheid van het ATP-synthase, een nanomachine 'uniek in het omzetten van elektrochemische, mechanische en chemische vormen van energie' wordt benadrukt, en anderzijds erop wijst dat er nog veel te begrijpen valt over de chemische –fysieke basis van een dergelijk proces.

3. Controverses over de chemiosmotische theorie

Er was een lange strijd nodig om de door Mitchell geformuleerde chemiosmotische theorie [1] breed te laten aanvaarden. De controverse, die al meer dan een halve eeuw centraal staat in de geschiedenis van de bio-energetica, lijkt te worden aangepakt door meer dan 200 artikelen en heeft tot de meest recente jaren geduurd. GF Azzone, vele jaren geleden (1972), publiceerde het manuscript 'Oxidative fosforylation, a history of mislukte pogingen: is het slechts een experimenteel probleem?' [30], dat al de niet-overtuigende delen van de theorie belichtte, op zoek naar antwoorden uit de fijne analyse van de macromoleculaire structuren die betrokken zijn bij chemiosmosis.

De hardste kritiek kwam van J. Prebble, die het gebrek aan experimentele gegevens ter ondersteuning van de theorie benadrukte [31]. W. Junge beschreef in zijn recente recensie 'Een halve eeuw moleculaire bio-energetica' effectief de kroniek van het geschil, dat zelfs harde toon aannam [32]. S. Brown & D.C. Simcook [33] hebben de motivaties overwogen die de wetenschappelijke gemeenschap hebben overtuigd om de chemiosmotische theorie te accepteren. De auteurs merken op dat: 'de wetenschap een enorme weerstand toont tegen verandering en er is buitengewoon doorzettingsvermogen voor nodig om de gemeenschap te overtuigen' [33, p. 178].

Een controversieel onderwerp was de correlatie tussen de membraanpotentiaal (ΔΨ) en de protonmotorische kracht, vaak beschouwd als gelijkwaardige entiteiten [34]. Er werd gepostuleerd dat eenΨ met positieve lading aan de externe p-kant van het interne mitochondriale membraan en negatief aan de n-kant in contact met de mitochondriale matrix (figuur 1) zou protonen de F binnen laten gaanO rotor die ATP synthetiseert in de matrix dankzij de mechanische verbinding met de F1 deel. Protonen zouden zich als chemische ionen over het koppelingsmembraan verzamelen en een drijvende kracht vormen voor FOF1-ATP-synthase om ATP te synthetiseren, waardoor de 'protonkoppeling' wordt gerealiseerd. De opbrengst aan ATP correleert echter slecht met het membraanpotentiaal van bulk naar bulk [35,36], wat de basisprincipes van de chemiosmotische theorie in twijfel trekt [37].

De toekenning van de Nobelprijs voor scheikunde in 1978 aan Peter Mitchell bekoelde het geschil, maar niet definitief. In 1979 werd er zelfs een verhitte confrontatie gepubliceerd in Trends in de biochemische wetenschappen tussen H. Tedeschi, die het idee weerlegde dat de metabolische activiteit van mitochondriën zou kunnen bijdragen aan het membraanpotentieel, en H. Rottenberg, die in plaats daarvan de theorie van Mitchell verdedigde [38]. De oorspronkelijke theorie voorziet in een geprotoneerde 'gedelokaliseerde koppeling' (zoals weergegeven in figuur 1), in tegenstelling tot een 'gelokaliseerde koppeling' ondersteund door Williams [39]. Lee [40] rapporteerde een rigoureus chemisch/fysisch experiment ten gunste van gelokaliseerde koppeling, wat bovendien aantoont dat het thylakoïdemembraan een 'protoncondensator' kan zijn. Het vermeende bestaan ​​van een protoncondensator is van groot belang, en later toonden Saeed & Lee [10] aan dat protonen zich daadwerkelijk kunnen ophopen op het membraanoppervlak, ook al verblijven ze nooit in de waterige fase. Bovendien, met betrekking tot de experimentele verificatie van de 'protonkoppeling', een recent elegant onderzoek in HeLa-cellen, bio-engineered met groen fluorescerend eiwit als pH-indicator ingevoegd in ademhalingscomplex III en in FO deel van ATP-synthase, wijst op een gelokaliseerde koppeling [41].

Een rapport getiteld 'Protonmigratie langs het membraanoppervlak en vertraagd oppervlak naar bulkoverdracht' door Heberle et al. [11] brengt op interessante wijze de twee visies met elkaar in overeenstemming en levert het bewijs dat de overdracht van protonen van een protongenerator (bacteriorhodopsine) naar een acceptor (in water oplosbare pH-indicatoren) sneller is als ze op het membraan plaatsvinden dan wanneer protonen vrijkomen in de waterige massa. Ferguson [12] benadrukte Heberle et al.'s experimenten, waarbij werd geconcludeerd dat de gedelokaliseerde koppeling en laterale protonoverdracht (gelokaliseerde koppeling) tussen de protongenerator en gebruiker zeer snel op het membraan plaatsvindt, in vergelijking met de langzamere en transversale passage door de waterige bulk. In deze context merkte het recente artikel van de groep van C. von Ballmoos op dat ΔΨ en ΔpH zijn equivalent voor de koppeling met ATP-synthase [34]. Een primaire rol voor membraanbuffering op protonmobiliteit in het algemeen kan worden verondersteld [42]. De experimentele gegevens [43,44] die een nauwe thermodynamische correlatie aantonen tussen door valinomycine geïnduceerdeΨ en ATP-synthese in gereconstitueerde systemen zijn erg belangrijk, maar het lijkt aannemelijk dat ze een transmembraan protonische stroom induceren die waarschijnlijk verschilt van het pad in een natuurlijke omgeving.

Bovendien verwierp de eminente Engelse chemicus R.J. Williams duidelijk de hypothese van de accumulatie van protonen vanaf de p-zijde: ‘de p-fase komt overeen met de oneindig uitgebreide externe ruimte. Als protonen in deze "Stille Oceaan" worden geëxtrudeerd, zouden ze worden verdund en zou de entropische component van de pmf verloren gaan' [13, p. 18]. R. Williams merkte op dat 'protonen in het membraan in plaats van een osmotische transmembraangradiënt van protonen nodig waren om ATP-vorming aan te drijven', gebaseerd op een reeks overwegingen die de aanwezigheid van vrije protonen van de p-zijde uitsloten [39, p. 123].Een elegante demonstratie van Williams' gelokaliseerde koppelingshypothese kwam in 1976 [45] door een experiment waarbij gezuiverd ATP-synthase werd toegevoegd aan het octaan-water-interface. Er werd waargenomen dat protonen zich ophopen in octaan, een Brønsted-zuur, wat leidt tot ATP-synthese door ATP-synthase. Deze gegevens zijn onlangs ook bevestigd [46]. Achttien jaar later werd gemeld dat 'onze resultaten suggereren dat protonen efficiënt kunnen diffunderen langs het membraanoppervlak tussen een bron en een put (bijvoorbeeld H+-ATP-synthase) zonder dissipatieverliezen in de waterige bulk' [11, p. 379]. Uit alle geciteerde gegevens kan worden geconcludeerd dat protonen (of meer waarschijnlijke protonische stromen) in het membraan zijn opgesloten, terwijl het verlaten van het membraan van protonen alleen moet worden beschouwd als een uitwijkmogelijkheid, meestal via in vitro opnieuw samengestelde voorwaarden.

Een directe meting van de membraanpotentiaal van het mitochondriale binnenmembraan met micro-elektroden werd alleen uitgevoerd door H. Tedeschi, die het bestaan ​​aantoonde van een positieve binnen- en een negatieve buiten mitochondriale ΔΨ [47,48]. Een dergelijke potentiaal (in tegenstelling tot de canonieke) valt interessant samen met die berekend op basis van de ionensoorten die aanwezig zijn op de membraanzijden [49]. Het is duidelijk dat kennis van de entiteit en vooral het teken van dit potentieel van fundamenteel belang is voor het begrijpen van de basiswerking van chemiosmosis, zoals blijkt uit het reeds genoemde historische geschil tussen Tedeschi en Rottenberg [38].

MetenΨ, laboratoriumtests gebruiken momenteel lipofiele fluorescerende verbindingen waarvan de reactie wordt beschouwd als gerelateerd aanΨ. Tests uitgevoerd met rhodamine hebben echter twijfels doen rijzen over een dergelijke correlatie [50] omdat deze indicatoren de mitochondriale ademhaling remden, waardoor ze het systeem verstoren. Aangezien dergelijke verbindingen in de membranen oplossen, kunnen ze het membraangedrag weerspiegelen, in feite remmen ze een intrinsiek membraanproces (d.w.z. de OXPHOS), maar interfereren ze niet met ΔΨ. Zeker, in vitro, kan protonpassage door membranen worden geforceerd met snelle bewegingen van kaliumionen door toevoeging van valinomycine [28,51]. Een laboratoriumprocedure waarbij valinomycine en ook nigericine worden gebruikt, is op grote schaal gebruikt om een ​​voorbijgaande . te creërenΨ het bedienen van een gedelokaliseerde koppelingskoppeling ΔΨ en ATP-synthese, maar dit sluit niet uit dat in de natieve membranen een gelokaliseerde koppeling onafhankelijk van Δ . zou werkenΨ.

4. Een cruciaal punt: de doorlaatbaarheid van het membraan voor protonen

In een eerdere studie (1986) heeft M. Zoratti et al. benadrukte de onzekerheden van de protoncyclus [52]. In hetzelfde jaar toonden Grzesiek & Dencher [53] aan dat de fosfolipidemembranen intrinsiek permeabel zijn voor protonen. Gegevens tonen aan dat fosfolipidemembranen, die normaal gesproken ondoordringbaar zijn voor ionische opgeloste stoffen (transversale of permeabiliteitscoëfficiënten variërend tussen 10 12 tot 10 −14 cm s 1), een significante protonpermeabiliteit vertonen, variërend van 10 −3 tot 10 −9 cm s 1 . Een dergelijke variabiliteit kan worden gerechtvaardigd door een buffercapaciteit van de membranen voor protonen: de protondiffusiewaarde kan afhangen van de hogere of lagere graad van reeds bestaande protonering. Onlangs werd het protonlek door lipidedubbellagen gemodelleerd als een gecoördineerd mechanisme [53-55]. Tepper & Voth [54] gaven een theoretische interpretatie van protonpermeabiliteit, gebaseerd op de vorming van een tijdelijke membraan die de waterige oplosmiddelstructuur overspant. Hoge protonpermeabiliteit is ook bevestigd in liposomen, onafhankelijk van hun fosfolipidesamenstelling [56]. Het is duidelijk dat een hoge mate van permeabiliteit voor protonen per se in tegenstelling tot de derde van de bovengenoemde basispostulaten van de chemiosmotische theorie. Met betrekking tot de relatie tussen het membraan en de waterige fasen bevestigen veel waarnemingen het bestaan ​​van een laag watermoleculen aan de twee zijden van het membraan, die het tot op zekere hoogte isoleert van de waterige fasen die aan de twee zijden aanwezig zijn [57-59] ]. In het bijzonder E. Deplazes et al. waargenomen dat op het membraanniveau, H3O+ vormt sterke en langlevende waterstofbruggen met de fosfaat- en carbonylzuurstoffen in fosfolipiden [60].

5. Protonsolvatie

Centraal staat de eigenlijke chemische soort van het proton: vrij, of in de vorm van H3O+? Dit is afhankelijk van de fase waarin het proton zich bevindt. Protonen hebben eigenaardige chemische eigenschappen, omdat ze in wezen een atoomkern zijn. Vrije protonen bestaan ​​niet in de waterige fase, gesolvateerd tot H3O + , waaruit de extractie van een proton vrijwel onmogelijk zou zijn. In feite, in de overgang van H3O+ om proton vrij te maken moet een sterke energiebarrière van meer dan 500 meV worden overwonnen. De desolvatiebarrière [61] komt overeen met de enorme hoeveelheid van 262 400 Cal mol −1 [62]. Er bestaat een immense literatuur over het onderwerp [40,61,63,64]. Een interessant rapport [65], waar onvoldoende rekening mee gehouden werd, berekende het aantal vrije protonen (eigenlijk in de vorm van H3O + ) in het volume van een mitochondrion, waarvan de orde van grootte femtoliter is. Uitgaande van fundamentele fysisch-chemische gegevens (Avogadro-getal, ionisch waterproduct, wiskundige pH-expressie en mitochondriaal volume), toonde deze studie aan dat er te weinig vrije protonen in een mitochondriale periplasmatische ruimte zijn (minder dan 10) om enig proces te ondersteunen dat afhankelijk is van protontranslocatie in de waterige massa over het membraan en absoluut ontoereikend om de duizenden ATP-synthasemoleculen die in een mitochondrion aanwezig zijn te ondersteunen. Bovendien bleek de pH-waarde in het mitochondrion 0,5 eenheden af ​​te wijken van wat eerder werd aangenomen [66]. De enorme energie die gepaard gaat met het oplossen van protonen zou inderdaad een negatief gevolg hebben: een vrij membraanproton zou snel worden 'gezogen' door de bijna waterige fase, waardoor de enorme energie die gepaard gaat met het solvatatieproces vrijkomt, ten koste van het membraan.

6. Grotthuss-mechanisme en protontranslocatie door de membranen

Een vermeend mechanisme voor protondiffusie werd meer dan twee eeuwen geleden verondersteld door von Grotthuss [67] en wordt synthetisch verklaard door S. Serowy en collega's: 'Protondiffusie volgens het Grotthuss-mechanisme vindt veel sneller plaats dan moleculaire diffusie omdat het losgekoppeld is van de zelfverspreiding van zijn massa' [68, p. 1031]. Protonen zouden niet als massa diffunderen, maar als een lading, waarbij de laatste zich tussen watermoleculen of protoneerbare groepen van geschikte macromoleculen van de membranen zou verplaatsen. Het Grotthuss-mechanisme maakt een beter begrip mogelijk van de mogelijke manieren waarop protonen of daarvan afgeleide soorten in biologische systemen bewegen. T.E. DeCoursey publiceerde een recensie [68] die de protonoverdrachtsroutes in water en biologische membranen uitputtend analyseert [9], inclusief Hv1-kanalen die specifiek protonen in de waterige fase overbrengen, dus de werkelijke zuurgraad van de ene kant van het membraan naar de andere. Het mechanisme van het spanningsafhankelijke protonkanaal Hv1 is nog niet opgelost, zoals symbolisch wordt vermeld door de titel van het artikel: 'Het spanningsafhankelijke protonkanaal: een raadsel, verpakt in een mysterie, in een enigma' [69]. Voor Hv1 zijn twee mechanismen voorgesteld, zoals schematisch weergegeven in figuur 2. Aan de linkerkant van figuur 2 bevindt zich het zogenaamde 'bevroren water'-mechanisme, waarbij het kanaal een of meer watermoleculen opsluit waardoor protonen kunnen passeren met Grotthuss-stijl protonhoppen, zoals in het typische geval van Gramicidin [70]. Aan de rechterkant van figuur 2 is een passage van protonen met protonering/deprotonering van aminozuurzijketens, die de zogenaamde 'protondraad' zouden realiseren die al in het artikel van Nagle & Morowitz [71] werd voorgesteld. Het onderwerp werd achtereenvolgens geconsolideerd door Nagle & Tristram-Nagle [72]. T.E. DeCoursey in een recentelijk gepubliceerd debat in de Tijdschrift voor Fysiologie ondersteunt het mechanisme getoond in het rechter deel van figuur 2 (d.w.z. protondraden door het membraan [73]), terwijl Bennett & Ramsey [74] een mechanisme ondersteunen van doorgang door watermoleculen zoals schematisch is weergegeven in figuur 2, links. Interessant is dat beide mechanismen gebaseerd zijn op de Grotthuss-protonbeweging tussen (i) watermoleculen in het geval van het waterkanaal (links) en (ii) aminozuurzijketens in het geval van protonendraden (rechts).

Figuur 2. Mechanisme voor H+-overdracht door het membraan door HV1. Links is het waterkanaalmodel: de watermoleculen laten protonen door met Grotthuss-stijl H + hopping. Rechts is het protondraadmodel: er vindt een ladingsmigratie plaats (door met Grotthuss-stijl H + hopping) op polaire groepen van zijketens van aminozuren van HV1.

De protonbeweging in membranen (zowel biologisch als kunstmatig) is geanalyseerd door vele rigoureuze chemisch/fysische studies. Het artikel 'Protongaten' in protonenoverdrachtsreacties op lange afstand in oplossing en enzymen: een theoretische analyse' laat zien dat naast water ook andere verbindingen betrokken zijn bij het 'protonhoppen' [75], en het is interessant dat een kwantum- mechanische benadering wordt toegepast [76]. Het artikel 'Grotthuss-mechanismen: van protontransport in protondraden naar bioprotonische apparaten' presenteert apparaten zoals protondiodes, transistors, geheugens en transducers, elektronische halfgeleiderapparaten die gebruikmaken van het Grotthuss-mechanisme [77].

Met name laat Hv1 alleen de doorgang van protonen in de vorm van hydroniumionen toe, waarbij hun concentratie wordt gebalanceerd tussen twee waterige compartimenten die door een membraan worden gescheiden. Deze eigenschap is wel afhankelijk van de membraanpotentiaal ΔΨ, vergelijkbaar met andere ionenmembraanapparaten die overvloedig aanwezig zijn in biologische membranen (bijvoorbeeld de Na + en K + spanningsafhankelijke kanalen), die inwerken op de conformatie van Hv1. Het lijkt er dus op dat om protonen door het membraan te dragen, er AD hoc structuren die sterk verschillen van de ademhalingscomplexen, zowel wat betreft hun finaliteit als het moleculaire mechanisme. Uit dit en ander bewijs kan worden geconcludeerd dat de natieve protonbewegingen in de ademhalingsmembranen, wanneer er geen noodzaak is voor verzuring van het milieu aan één kant van een membraan, volledig binnen het membraan moet plaatsvinden [78]. Wat de ademhalingscomplexen betreft, wordt aan de andere kant getheoretiseerd dat de proton- en membraanpotentiaalbewegingen onderling afhankelijk zijn, in die zin dat het pompen van protonen genereren de membraanpotentiaal, wat onmogelijk is voor thermodynamische overwegingen die we later zullen uitwerken.

Bovendien werpt deze vergelijking tussen protonenbeweging ter ondersteuning van de OXPHOS en de werkelijke protonische beweging in de natuur licht op het feit dat wanneer protonen werkelijk door een membraan worden overgebracht (i) ze nooit in de vorm van vrije protonen zijn en (ii) ze zijn onderhevig aan de Grotthuss-stijl protonhoppen. Vandaar de noodzaak om de chemiosmotische theorie te actualiseren in het licht van dit alles.

7. Remming van ATP-hydrolyse: een open onderwerp

De inherente katalytische eigenschappen van ATP-synthase onderscheiden het van de overgrote meerderheid van andere enzymen/katalysatoren. In feite draagt ​​het energie over aan de reactie die het katalyseert, daarom beïnvloedt het het evenwicht van de reactie terwijl de andere enzymen er niet toe doen. Deze eigenaardige eigenschap vereist ook dat de activiteit van ATP-synthase aan een goede controle wordt onderworpen, aangezien zodra de koppeling met de oxide/reductiesystemen verloren gaat, de nanomotor zelf snel ATP hydrolyseert, wat fataal is voor de overleving van de cel. De significante afgifte van vrije energie (ΔG° = −7300 cal mol −1 ) betrokken bij ATP-hydrolyse geeft dus een duidelijke richting aan het proces van hydrolyse zelf. Benadrukt moet worden dat voor de meeste enzymen de richting van de reactie afhangt van de concentratie van de reactanten/substraten, wat uiteraard niet gebeurt voor ATP-synthase.

Om de omkering van ATP-synthase in niet-gekoppelde omstandigheden te remmen, is de werking van het remmer-eiwit IF1 (UniProtKB: P01096) essentieel, vooral in de hersenen [79], die relatief verstoken zijn van energiereserves (glycogeen, triglyceriden), waar anoxie zou leiden tot de tumultueuze ATP-hydrolyse. IF1 knock-down in HeLa-cellen [80] uitgerust met een FRET-sensor voor het meten van de intracellulaire ATP-concentratie, had verrassend genoeg geen invloed op de levensvatbaarheid van de cellen of de mitochondriale morfologie, hoewel de cellulaire ATP-concentratie met ongeveer een derde afnam. Bovendien werd onlangs gemeld dat het verwijderen van de IF1-achtige ζ subeenheid van Paracoccus denitrificans heeft weinig invloed op ATP-hydrolyse door ATP-synthase [81], wat bevestigt dat de remming van de hydrolyse van ATP door ontkoppelde ATP-synthase niet alleen afhangt van IF1 en dat het onderwerp verder onderzoek vereist. Ook in bacteriën, wanneer de concentratie van de ATP de fysiologische waarde bereikt, ɛ subeenheid remt ATP-synthase door te binden aan de c-ring, en het is voorgesteld als een doelwit voor het ontwerp van geneesmiddelen tegen tuberculose [82].

8. Lokale processen voor de koppeling in de ademhalingsmembranen

Nadat de duidelijke divergentie tussen de paden van het gesolvateerde proton en van het proton alleen is vastgesteld, zijn nu gedetailleerde moleculaire structurele gegevens beschikbaar over de ademhalingscomplexen die in staat zijn om protonen te verwerken (dwz complex I, III en IV) dankzij de vooruitgang van analyse en van cryomicroscopie [2-7]. Uitstekende onderzoeken zijn beschikbaar op complex I. Voor de eenvoud noemen we hier alleen de studies van L. Sazanov en medewerkers [2,3].

Talrijke structurele röntgenonderzoeken werden uitgevoerd op complex I van Escherichia coli [4], Thermus thermophilus [2] en zoogdierschaap (Ovis Ram) mitochondriën [5], en met cryomicroscopie op complex I van Bos Stier [6,7]. De complexiteit van de macromoleculaire aggregatie van complex I is indrukwekkend: bij zoogdieren wordt het gevormd door maar liefst 45 polypeptiden en de assemblage ervan heeft een onbekend aantal begeleiders nodig, zo onmisbaar dat de verslechtering van slechts één van hen (B17.2 L) veroorzaakt een progressieve encefalopathie [83]. Ogilvie et al. [83, blz. 2784] stellen dat 'resultaten aantonen dat B17.2 L een bonafide moleculaire chaperonne is die essentieel is voor de assemblage van complex I en voor de normale functie van het zenuwstelsel.'

We kunnen op zoek gaan naar de proton-aannemelijke paden in het ademhalingsmembraan, zelfs als het een plasmamembraan is. Aangezien er slechts vijf alfa-helices zijn gevonden in de complexe I-structuur, was het, om protontranslocatie mogelijk te maken, noodzakelijk om het bestaan ​​van twee hemikanalen te postuleren: één van de matrix (n) kant naar het midden van het ademhalingscomplex , hier aangeduid als het 'protoneningang hemikanaal', en de andere van het centrum naar de periplasmatische (p) zijde, hier aangeduid als 'protonuitgangs hemikanaal'. Alleen de laatste was echter goed herkenbaar in complex I [4]. In plaats daarvan is de ingangsroute niet met zekerheid geïdentificeerd, dus we kunnen alleen praten over vermeende routes die zijn gemarkeerd met '?' [4]. Verder blijkt uit de röntgenonderzoeken duidelijk dat er een duidelijke protontunneling is in het centrum van complex I. Uitgebreide studies over de protonische beweging binnen complex I zijn uitgevoerd door de Helsinki Bio-energetic Group van M. Wikström, die benadrukte onzekerheidsmarges op de stoichiometrie van protonische extrusie die dichter bij 3 H + /2e − [84] lijken in plaats van de klassieke 4 H + /2e − . Ook in de recensie van Verkhovskaya & Bloch [85] (van Helsinki Bioenergetic Group), worden vier mechanismen voor protontranslocatie voorgesteld en wordt het 'protonentree-halfkanaal' niet met zekerheid geïdentificeerd, terwijl het 'proton-exit-halfkanaal' duidelijk is herkenbaar. Symbolisch staat op de website van de Helsinki Bioenergetic Group (www.biocenter.helsinki.fi/bi/hbg/cl/complex_I_main.html) dat ‘het mechanisme van protonenoverdracht in complex I volledig raadselachtig blijft’.

Voor zover complex IV (cytochroom C oxidase) betreft, is de protontranslocatie van diepgaand bestudeerd [86]. In hun recente recensie spreken M. Wikström & V. Sharma over een ‘jubileum’: ‘Protonpompen door cytochroom C oxidase - Een 40-jarig jubileum' [87]. Onder de vele werken die in deze recensie worden aangehaald, is de Chemische beoordeling artikel van de M. Wikström-groep valt op [8]. Het gaat in op de details van de mogelijke moleculaire processen die worden uitgevoerd door complex IV [8], inclusief protontranslocatie. Het onderwerp is complex en een meer vermeende route van protonen is goed ontwikkeld in de review, die we hier niet kunnen beschrijven. Voor het 'protonentree-halfkanaal' hebben ze voor elk molecuul zuurstof dat tot water is gereduceerd 4 H + nodig, en er wordt verondersteld dat nog eens 4 H + (voor een totaal van 8) via dit kanaal binnenkomen. Het lijkt onwaarschijnlijk dat er equivalentie bestaat tussen protonen die bestaan ​​als deeltjes en die zijn gekoppeld aan watermoleculen en protonen die als een lading zouden moeten bewegen, volgens het Grotthuss-mechanisme.

9. Voorstel voor een gelokaliseerde complexe I-ATP-synthasekoppeling

Rekening houdend met wat hierboven is gerapporteerd, is het mogelijk om een ​​plausibele protonroute binnen het ademhalingsmembraan te traceren. In 2006 werd een directe protonoverdracht voorgesteld om de ademhalingsroute van complexen I, III, IV te koppelen met ATP-synthase [88]. In een recent overzicht [21] wordt het concept van transmembraan protonmotorkracht om het ATP-synthase te verplaatsen echter versterkt, hoewel wordt opgemerkt dat veel aspecten van koppeling nog niet zijn opgehelderd. Enkele jaren geleden (1991) werd een duidelijke overweging voorgesteld door Akeson & Deamer [89] over de snelheid van protontranslocatie door een vermeend protonkanaal als een beperkende stap voor ATP-synthese door ATP-synthase. Voor de eenvoud onderzoeken we alleen de koppeling tussen het ademhalingscomplex I en het ATP-synthase. Het bestaan ​​van een protonpad in het centrum van complex I is vrij duidelijk, en we kunnen veronderstellen dat de protonen naar het goed geïdentificeerde 'exit half channel' worden gestuurd, zoals weergegeven in figuur 3. De protondonor in het centrum van complex I is al voorlopig geïdentificeerd in het fosfolipide cardiolipine (CL) [78], essentieel voor OXPHOS. Fosfatidylethanolamine (PE) kan bijvoorbeeld de werking van OXPHOS [90] effectief ondersteunen. Gegevens van de groep van C. von Ballmoos [91,92] verduidelijken op onconventionele wijze een dergelijke rol van fosfolipiden. In feite is pure fosfatidylcholine (PC) uitstekend voor de koppeling, en neemt toe wanneer het membraan wordt gevormd door PC + PE. Daarentegen wordt koppeling dramatisch geremd als het membraan wordt gevormd door PC + CL, ongelooflijk afwijkend van de traditionele rol die aan CL wordt toegewezen.Dit onderzoek is ook van belang omdat er wordt geëxperimenteerd met een gereconstrueerd systeem, meer vasthoudend aan de ‘H+/ATP-koppeling’ of ‘tweede koppeling’ (figuur 1). Hier was de drijvende kracht die ATP-synthase voedt niet de snelle overdracht van K+ gegenereerd door valinomycine, een veel gebruikte methode, maar de bo3 oxidase van Escherichia coli, analoog aan het ademhalingscomplex I van gewervelde dieren. Het blijkt dat alle membraanfosfolipiden kunnen fungeren als mobiele protontransporters, waardoor de verplaatsing van protonen in het bijna-waterige medium wordt belemmerd, zodat deze nooit vrij zijn. Het exergonische proces van protonsolvatatie zou een indrukwekkende hoeveelheid energie vrijgeven (262 400 Cal mol −1 ) [62], die, indien niet overgebracht op een generieke acceptor, hitte zou genereren die niet alleen het membraan maar ook de celintegriteit verwoest. Complex I zou protonen naar de p-kant van het membraan overbrengen, maar deze zouden niet in de waterige massa worden gedispergeerd. In feite is goed gedocumenteerd dat er een barrière bestaat van watermoleculen die aan het membraan zijn bevestigd, die de laterale verplaatsing van protonen op de fosfaatkoppen van fosfolipiden [68,93,94] bepaalt om te voldoen aan een put die de ATP-synthase-subeenheid is die, door een protondraad [95,96], zou het proton naar de rotor leiden (figuur 3), die plaats biedt aan het centrale glutamine- of asparagineresidu (afhankelijk van de soort) van de c-subeenheid, die in variabele aantallen van 8 tot 15 de rotor omhoog FO [97]. als FO roteert is het denkbaar dat het proton terugkeert naar het centrum van complex I, een zeer hydrofobe omgeving, waardoor het protonische circuit wordt gesloten. Deze laatste passage, van de rotoruitgang naar het centrum van het ademhalingscomplex, lijkt plausibel voor de werking van de Brownse beweging (diffusie) van deeltjes in een sterk anisotrope omgeving die efficiënt kan plaatsvinden [45,98] en voor een theoretisch mogelijke directe passage van het proton dat de subeenheid verlaat bij de ingang van de complexen. Bovendien hebben de onderzoeken van de C. von Ballmoos-groep uitgebreide studies opgeleverd met gereconstrueerde systemen [91,92,99], waarin een directe overdracht van proton aan de p-kant van het membraan van complex I naar ATP-synthase duidelijk is. Hun recente artikel toont ook aan dat nabijheid van het membraan tussen het ademhalingscomplex en ATP-synthase vereist is voor de 'protonkoppeling' [92]. Het feit blijft echter dat het laatste deel van de protonische schakeling (d.w.z. van FO deel van ATP-synthase aan ademhalingscomplexen) is slechts hypothetisch.

Figuur 3. Een mogelijk H+ circuit in het ademhalingsmembraan. De fosfaatgroepen van fosfolipiden aan beide zijden van het membraan worden weergegeven door bruine ellipsoïden. De afbeelding stelt voor dat de H + (rode stippellijn) wordt overgebracht naar de Glu 58 (E58) in het midden van subeenheid c via subeenheid a van ATP-synthase door protontunneling. H+ zou van de periplasmatische zijde stromen, altijd gebonden aan fosfolipidekoppen. Dit kan in elke laag van het membraan worden aangebracht.

In dit controversiële scenario is een beslissende bijdrage ongetwijfeld het geavanceerde bio-engineering-experiment dat zowel complexe IV- als ATP-synthase labelde met eiwitten van de GFP-familie, om experimenteel een lokale ΔpH te observeren die wordt veroorzaakt door het ademhalingssubstraat galactose [41]. Waarnemingen werden uitgevoerd in gekweekte HeLa-cellen. De auteurs concludeerden [41, p. 1]: 'de waargenomen laterale variatie in de proton-aandrijvende kracht vereist een wijziging van het chemiosmotische voorstel van Peter Mitchell'. Met andere woorden, de experimenteel bewezen laterale protonaandrijfkracht is in lijn met de hypothese van gelokaliseerde koppeling.

10. Extramitochondriale oxidatieve fosforylering

De chemiosmotische theorie [1] zoals deze is geformuleerd, stelt een proces voor dat alleen kan plaatsvinden in organellen met dubbele membraansystemen die gesloten compartimenten vormen om protonen in te sluiten, zoals mitochondriale cristae, bacteriën en thylakoïden (hier hebben we voor de eenvoud beschouwd als het mitochondriale binnenmembraan). In de afgelopen jaren hebben verschillende auteurs echter een functionele expressie van OXPHOS-machines beschreven in cellulaire districten zonder mitochondriën [100,101], wat een mogelijke opbouw suggereert van een transversale protongradiënt over het membraan, uit mitochondriën. In het bijzonder is een extramitochondriaal OXPHOS beschreven in schijfjes van het buitenste segment van de staaf (OS) [102-105], myeline-omhulsel [79,106-110], celplasmamembraan [111-119], bloedplaatjes [120] en extracellulaire blaasjes die uitscheiden van cellen zoals exosomen en microvesikels [121,122], die een onvermoede metabolische signatuur lijken te dragen [121,123]. Met name, aangezien het plasmamembraanpotentieel positief is aan de buitenkant en negatief aan de binnenkant, zou het ATP-hydrolyse begunstigen in plaats van de synthese ervan. De extramitochondriale ATP-synthese is in lijn met de veronderstelde onafhankelijkheid van ATP-synthaseactiviteit van de membraanpotentiaal, en daarom is het aannemelijk dat deze synthese van ATP afhangt van de intramembraneuze protonkoppeling.

11. Conclusie

De indrukwekkende hoeveelheid aangehaalde experimentele gegevens lijkt globaal in contrast met de bovengenoemde drie veronderstellingen die ten grondslag liggen aan de chemiosmotische theorie. Allereerst sluit het uit dat de protonen zich kunnen ophopen op het oppervlak van het koppelingsmembraan, waarvan de hoge permeabiliteit zou verdwijnen, omdat dit zou overeenkomen met een extreme zuurgraad die onverenigbaar is met elk vitaal proces. Ten tweede, aangezien protondiffusie optreedt, is het duidelijk dat de membraanpotentiaal niet relevant is voor protontranslocatie. Ten derde kan worden uitgesloten dat de ademhalingscomplexen werken als transmembraan protonoverdracht vanuit de waterige bulk, waar het proton zou bestaan ​​als hydroxyoniumion. Dit lijkt de feitelijke mogelijkheid uit te sluiten dat ATP-synthase de energiebarrière kan overwinnen, hoger dan 500 meV [61], die nodig is om het proton uit water te extraheren, waardoor er ruimte overblijft voor de gelokaliseerde koppelingshypothese [63,64], als een uitdroging– hydratatiereactie van hydroxoniumion tot vrije protonen zou 262 400 Cal mol -1 [62] vereisen. Welke processen werken op het ATP-synthase? Er is geen zekerheid, zoals blijkt uit de emblematische titel van een artikel van J. Walker: ‘The ATP synthase: the covered, the onzeker and the unknown’ [124].

Tegenwoordig leidt een constellatie van aanwijzingen ons ertoe om het bestaan ​​​​van protonische stromen in het membraan te veronderstellen, met de vorming van mogelijke circuits die worden afgelegd door de positieve elementaire lading, waardoor een gelokaliseerde koppeling wordt gerealiseerd die een osmotische aard van het proces uitsluit. Om dit circuit te traceren, althans voor de mogelijke koppeling tussen ademhalingscomplex I en ATP-synthase, lijkt het realistisch dat complex I protonen van het centrale deel naar de periplasmatische kant kan overbrengen, waardoor ze op het membraanoppervlak kunnen reizen dankzij de koppen van fosfolipiden [93,94] tunnelen uiteindelijk in de a-subeenheid van ATP-synthase [95,125] (figuur 3). Bovendien tonen verschillende onderzoeken aan dat het membraan is geïsoleerd van de waterige massa dankzij een laag watermoleculen aan beide zijden van het membraan, wat het idee versterkt dat het membraan radicaal verschillend is en geïsoleerd is van de vloeibare fase [59]. Gezien de twee geïsoleerde fasen, was de enige manier waarop evolutie kon streven naar het koppelen van protonenbeweging aan ATP-synthese een nanomachine die de protonenbeweging in het membraan verbindt met de vervormingsmechanica van de F1 bol ondergedompeld in de waterige fase. We kunnen redelijkerwijs aannemen dat de protonenbeweging in de membranen plaatsvindt als een lading, volgens het proton-hopping Grotthuss-mechanisme, met de vestiging van 'protonische stromen' in het membraan [126]. Op niet-biologisch gebied vinden we een opmerkelijke aanhankelijkheid aan deze theorie voor de ontwikkeling van protonische apparaten (zoals protondiodes, transistors, geheugens en transducers) [77]. Het is verrassend dat het biologische en het fysisch-chemische gebied elkaar hebben genegeerd. Aangezien in de geschiedenis van de biologie de toepassing van fysisch-chemische methodologieën heeft geleid tot dramatische vooruitgang in de biologie (we mogen de lezer eraan herinneren dat de resolutie van de DNA-structuur [127] werd verkregen met de fundamentele toepassing van röntgenkristallografie, ontwikkeld in 1913 door Williams Henry Bragg en zijn zoon Lawrence voor de studie van anorganische kristallen), is het wenselijk dat deze fusie van kennis in de komende jaren kan worden gerealiseerd.

Bovendien kan de klassieke mechanische benadering niet worden gebruikt om deze stromen te benaderen. In feite moet elke keer dat er een ladingsbeweging is gebonden aan een massa, het dualisme dat niet kan worden beoordeeld door klassieke mechanica, maar kwantummechanica worden toegepast, en in dit perspectief liggen de veelbelovende recente kwantummechanische benaderingen van Riccardi et al. [76] en Ivontsin et al. [125]. Er moet rekening worden gehouden met het onbepaaldheidsprincipe van Heisenberg, zoals Philip Hunter al benadrukte in de titel van een paper uit 2006: 'A quantum leap in biologie: one inscrutable field helpt another, as quantum physics unravels awareness' [128].


Actief transport

Figuur 5. Vier verschillende mechanismen van actief transport. Actief transport wordt gedefinieerd als het transport van opgeloste stof tegen een elektrochemische gradiënt, dus energie is vereist. De ATP-afhankelijke pomp gebruikt de energie die is afgeleid van ATP-hydrolyse tot ADP en anorganisch fosfaat (Pi) om het transport van een opgeloste stof (groene cirkel) tegen zijn elektrochemische gradiënt aan te drijven. De door licht aangedreven pomp gebruikt de energie van geabsorbeerde fotonen van licht om een ​​opgeloste stof (blauwe cirkel) tegen zijn elektrochemische gradiënt te transporteren. De symporter transporteert twee verschillende opgeloste stoffen (oranje cirkel en vierkant) in dezelfde richting over een membraan. Een van de opgeloste stoffen (bijvoorbeeld de oranje cirkel) wordt tegen zijn elektrochemische gradiënt getransporteerd, vandaar dat dit actief transport is. Dit transport vereist de vrije energie die vrijkomt bij de beweging van een tweede opgeloste stof (bijvoorbeeld het oranje vierkant) langs de elektrochemische gradiënt. De antiporter transporteert twee opgeloste stoffen (paarse cirkel en vierkant) in tegengestelde richtingen over een membraan. Het transport van een opgeloste stof is tegen zijn elektrochemische gradiënt (bijvoorbeeld de paarse cirkel). Dit wordt aangedreven door het gekoppelde transport van een tweede opgeloste stof (bijvoorbeeld het paarse vierkant) in de tegenovergestelde richting, langs de elektrochemische gradiënt.

Actief transport wordt gedefinieerd als de beweging van opgeloste stof tegen een elektrochemische gradiënt en daarom is het per definitie een endergonisch proces dat de gekoppelde invoer van energie vereist. Actief transport is kostbaar voor de cel in termen van energie, maar het stelt een cel in staat veel essentiële processen uit te voeren. Veel voedingsstoffen worden bijvoorbeeld via actief transport naar een cel getransporteerd, waardoor de efficiëntie van de opname van voedingsstoffen door de cel aanzienlijk wordt verhoogd, zelfs wanneer de intracellulaire concentratie groter is dan de extracellulaire concentratie. Actief transport (zoals eerder vermeld) wordt gemedieerd door dragereiwitten die conformationele veranderingen ondergaan om opgeloste stoffen over membranen te verplaatsen. Veel van de dragereiwitten die betrokken zijn bij actief transport worden aangeduid als: pompen want analoog aan een waterpomp (die energie nodig heeft om de hendel op en neer te draaien om het water te laten stromen), hebben transportpompen energie nodig om opgeloste stoffen over membranen te verplaatsen. Er zijn verschillende mechanismen van actief transport, gemedieerd door een verscheidenheid aan dragers, waaronder ATP-afhankelijke pompen, door licht aangedreven pompen, symporters en antiporters (geïllustreerd in figuur 5). In alle gevallen is een vorm van energie (bijvoorbeeld ATP-hydrolyse, licht of de energie van een elektrochemische gradiënt) vereist om het transport van opgeloste stoffen aan te drijven. De vrijgekomen vrije energie moet groter zijn dan de vrije energie die nodig is om een ​​opgeloste stof tegen zijn elektrochemische gradiënt in te bewegen.


Andere voorbeelden van hydrolyse

Een ester is een organische verbinding, typisch afgeleid van carbonzuren, die alcohol of verschillende andere zuren maakt door hydrolyse. De combinatie van water, esters en alkaliën veroorzaakt een soort hydrolyse die verzeping wordt genoemd, waardoor zeep uit oliën en vetten kan worden gemaakt. Esters zorgen ook voor de geur van bloemen en zoetheid van fruit. Ze worden ook industrieel gebruikt als oplosmiddelen voor verf en vernis. Hydrolyse vindt ook plaats met niet-organische, ionische verbindingen. De introductie van natriumacetaat, een zout, in water zorgt er bijvoorbeeld voor dat het zout wordt afgebroken tot azijnzuur.

Douglas Matus is de schrijver van reisverhalen voor het tijdschrift 'West Fort Worth Lifestyle'34 en was vier jaar directeur Geesteswetenschappen van een voorbereidende school in Austin. Sinds 2005 publiceert hij artikelen over onderwijs, reizen en cultuur in publicaties als "Nexus, " "People's World" en "USA Today." Matus ontving in 2010 een Education Pioneers fellowship en een MFA van CalArts in 2011.