Informatie

Resolutie van gelelektroforese


Mijn professor noemde de resolutie van de gel bij gelelektroforese. Hij verklaarde dat agarose grote poriën en dus een lage resolutie heeft, terwijl polyacrylamide het tegenovergestelde heeft. Ik begrijp niet wat resolutie hiermee te maken heeft. Kan iemand uitleggen?


Resolutiegrootte van de gel betekent eenvoudig het onderscheid dat kan worden gemaakt tussen moleculen die erg klein zijn.

Als u onderscheid wilt maken tussen een fragment van 100 bp en een fragment van 200 bp, dan geeft agarose u dat niveau van differentiatie.

Maar als u onderscheid wilt maken tussen een fragment van 190 bp en een fragment van 200 bp, dan wilt u waarschijnlijk polyacrylamide gebruiken. De PA-gel heeft een hogere resolutie omdat je kleinere verschillen op molecuullengte kunt onderscheiden.

Zie het in termen van een vereenvoudigd idee van een microscoop, bij 100X kun je waarschijnlijk onderscheid maken tussen cellen, misschien een goed gekleurde kern onderscheiden. waar je bij 1000X andere organellen kunt onderscheiden. Je ziet een fijnere mate van detail bij de hogere vergroting. Er zijn veel factoren die van invloed zijn op het oplossend vermogen van een microscoop en het voorbeeld op basis van vergroting is simplistisch en gaat niet echt over optische resolutie, maar het is een illustratief voorbeeld van resolutie in een gel. Je kunt agarose zien als de 100X en PA als de 1000x, als dat helpt.


Horizontale elektroforese

5,2 cm/uur<br /> (bij 200 V)</td> </tr> </tbody> </table> <p >* Mini ReadySub-Cell GT is een Mini-Sub-cel GT speciaal voor het uitvoeren van ReadyAgarose prefab gels, gelgrootte 7 x 10 cm monsterdoorvoer is 8, 12 of 2 x 8. Deze cel bevat geen gietpoorten, tray of kammen.<br /> ** Brede mini ReadySub-Cell GT is een brede Mini-Sub-cel GT die is bedoeld voor het uitvoeren van ReadyAgarose prefab gels, gelgrootte 15 x 10 cm monsterdoorvoer is 20, 32, 2 x 32 of 4 x 26. Deze cel bevat geen gietpoorten, bak of kammen.<br /> *** De monsterdoorvoerwaarde gaat uit van 1&ndash2 kammen per gel.<br /> &dagger Monsterdoorvoerwaarde gaat uit van 1&ndash4 kammen per gel.</p> <p>&nbsp</p> <p><strong> Optimaal resolutiebereik van ReadyAgarose Gels</strong></p> <table border="0"> <tbody> Gels<br /> 8-wells, 12-wells </strong></td> <td><s trong>Wide Mini Gels<br /> 20-well, 32-well, 2 x 32-well </strong></td> <td><strong>ReadyAgarose 96 Plus Gels<br /> 4 x 26-well</strong></td> </tr> <tr> bp & lt / td & gt & lttd en GT200 en ampndash10,000 bp & lt / td & gt & lttd en GT200 en ampndash10,000 bp & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & gt3% * & lt / td & gt & lttd en GT20 & ampndash2,000 bp & lt / td & gt & lttd en GT20 & ampndash2,000 bp & lt / td & gt & lttd en GT20 & ampndash2,000 bp & lt / td & gt & lt / tr & gt & lt / tbody & gt & lt /table> <p >* Een 3% ReadyAgarose-gel is gemakkelijker te hanteren en geeft dezelfde prestaties als een standaard 4% gel.</p> <p>&nbsp</p> <p><strong> Handcast Agarose Gels</strong><br /> Handcasting biedt opties voor verschillende gelgroottes. Er zijn twee accessoires beschikbaar voor het met de hand gieten van gels binnen de Sub-Cell-familie van elektroforesecellen. Gelgietmachines bieden de flexibiliteit om verschillende UV-transparante (UVTP) geltrays van verschillende afmetingen op te nemen en zijn beschikbaar voor de gehele Sub-Cell-productlijn. Gietpoorten bieden het gemak van rechtstreeks gieten in de elektroforesecellen en zijn verkrijgbaar in één specifieke maat voor elke cel (zie Gietgids hieronder).</p> <p><strong> Gietgids</strong></p> <table border="0"> <tbody> <tr > <td>hor<strong> Cell & lt / strong & gt & lt / td & gt & lttd & gt & ltstrong & gtTray Size & lt / strong & gt & lt / td & gt & lttd & gt & ltstrong & gtCasting Gates & lt / strong & gt & lt / td & gt & lttd & gt & ltstrong & gtGel Caster & lt / strong & gt & lt / td & gt & lttd & gt & ltstrong & gtElectrophoresis Cell & lt / strong & gt & lt / td & gt & lttd & gt & ltstrong & gtTray Size & lt / strong & gt & lt / td & gt & lttd & gt & ltstrong & gtCasting Gates & lt / strong & gt & lt / td & gt & lttd & gt & ltstrong & gtGel Caster & lt / strong & gt & lt / td & gt & lt / tr & gt <tr align="left"> <td align="left">Mini-Sub cel GT</td> <td>7 x 7 cm<br />7 x 10 cm</td> <td align="center">&bull</td> <td align="center">&bult/>bult td> <td>Subcelmodel 96</td> <td>25 x 10 cm&l tbr />25 x 15 cm</td> <td align="center">&bull</td> <td align="center">&bull<br />&bull</td> </tr> <tr align="left"> <td GTWit> <td GTWind="left"> /td> <td>15 x 7 cm<br />15 x 10 cm</td> <td align="center">&bull</td> <td align="center">&bull<br /<t&bull</td> <td>/tdell cm td> <td align="center"><br />&bull</td> <td align="center">&bull<br />&bull</td> </tr> <tr align="left"> <td align="left">/tdell GT td> <td align="center"><br />&bull</td> <td align="center">&bull<br />&bull</td> <td>&nbsp</td> <td>25 x 20 cm>ttdalign><t/ </tr> <tr align="left"> <td align="left">&nbsp</td> <td>15 x 20 cm<br /> 15 x 25 cm</td> <td align="center">&nbsp</td> <td align="center">&bull<br />&bull</td> <td>&nbsp</td></td> <td>/ampnbsp>/ampnbsp<= </tr> </tbody> </table> <p><img src="https://www.bio-rad.com/webroot/web/images/lsr/solutions/technologies/gene_expression/horizontal_electrophoresis/technology_detail/gxt5_img1.jpg" /></ p> <p ><strong>Handgietopties voor verschillende gelmaten</strong>. Er zijn twee accessoires beschikbaar voor handgieten met de Sub-Cell-familie van elektroforesecellen: gelgietmachines en gietpoorten. Gelgietmachines bieden de flexibiliteit om verschillende geltrays van verschillende afmetingen op te nemen. Deze zijn beschikbaar voor de gehele lijn van Sub-Cell systemen. Gietpoorten, verkrijgbaar in specifieke afmetingen voor elke cel, bieden het gemak van rechtstreeks gieten in de subcelcellen.</p> Elektroforese lopende buffers <p>Een elektroforesebuffer geleidt een elektrische stroom door de elektroforesekamer. De meest gebruikte buffers voor DNA-elektroforese zijn TAE of TBE. Zie onderstaande tabel voor volledige recepten.</p> <p> Lineair dubbelstrengs DNA wordt sneller gescheiden in TAE-buffer, maar deze buffer heeft een lagere buffercapaciteit dan TBE omdat het boraat in de TBE-buffer werkt als een enzymremmer en een negatieve invloed kan hebben op downstream-toepassingen. Daarom is TAE de voorkeursbuffer als het DNA zal worden gebruikt voor klonering of ligatie.</p> <p><strong> Selectiegids voor elektroforesebuffer</strong></p> <table border="0"> <tbody> <tr> <td><strong>Buffer</strong>> & lttd & gt & ltstrong & gtApplications & lt / strong & gt & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & gt & ltstrong & gtProtein elektroforese & lt / strong & gt & lt / td & gt & lttd & gt & ampnbsp & lt / td & gt & lttd & gt & ampnbsp & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & gt10x Tris / glycine / SDS & lt / td & gt & lttd en GT25 mM Tris, 192 mM glycine, en LTbR />0.1% SDS, pH 8.3</td> <td>Algemeen SDS-PAGE</td> </tr> <tr> <td>10x Tris/glycine</td> <td>25 mM Tris, 192 mM glycine,<br />pH 8.3</td>ative VIB</td> <td>100 mM Tris, 100 mM tricine,<br />0.1% VIB, pH 8,3</td> <td>Peptide VIB</td> </tr> &l ttr & gt & lttd & gt10x IEF anode buffer & lt / td & gt & lttd & GT7 mM fosforzuur & lt / td & gt & lttd & gtAnalytical isoelektrisch focusseren & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & gt10x IEF kathode-buffer & lt / td & gt & lttd en GT20 mM lysine, 20 mM arginine & lt / td & gt & lttd & gtAnalytical isoelektrisch focusseren & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & gt10x zymogram 2.5 %<br />renaturatiebuffer</td> <td>Triton X-100</td> <td>Protease-analyse renatureert enzymen na elektroforese</td> </tr> <tr > <td>10x zymogram<br /&Clbrd> <t/Clbr>> <t/ / sub & gt & LTbR / & gt 0,02% Brij-35 & lt / td & gt & lttd & gtProtease analyse activeert enzymen na elektroforese & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & gt & ltstrong & gtNucleic Acid elektroforese & lt / strong & gt & lt / td & gt & lttd & gt & ampnbsp & lt / td & gt & lttd & gt & ampnbsp & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & gt10x TBE & lt / td & gt & lttd & gt89 mM Tris , 89 mM boorzuur, 2 mM EDTA, pH 8,3</td> < td>Nucleïnezuurelektroforese/sequencing<br />polyacrylamide- of agarosegels</td> </tr> <tr> <td>10x TBE<br /&gextended range</td> <td>130 mM Tris, 45 mM boorzuur, 2,5 mM boorzuur, 2,5 mM boorzuur buffercapaciteit voor langere DNA-sequenties</td> </tr> <tr > <td>50x TAE</td> <td>40 mM Tris, 20 mM azijnzuur, 1 mM EDTA, pH 8,0</td>/a</td> <td>Nucleïnezuur />polyse< / tbody & gt & lt / table & gt & LTP & gt & ltstrong & gt vlekvormingsbuffer Selection Guide & lt / strong & gt & lt / p & gt & lttable border = "0" & ​​gt & lttbody & gt & lttr & gt & lttd & gt & ampnbsp & lt / td & gt & lttd & gt & ltstrong & gt1x Formuleren & lt / strong & gt & lt / td & gt & lttd & gt & ltstrong & gtApplications & lt / strong & gt & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & gt & ltstrong & gtTransfer Buffers * & lt / strong & gt & lt / td & gt & lttd & gt & ampnbsp & lt /td> <td>&nbsp</td> &l t/tr> <tr > <td>10x Tris/glycine</td> <td>25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8,3</td> <td>Western blotting</td> </tr> <tr>xTrtd/CAP , 15% methanol, pH 9,6<br />Kathodebuffer: 60 mM Tris,<br />40 mM CAPS, 0,1% (w/v) SDS, pH 9,6</td> <td>Een discontinu buffersysteem dat de overdrachtsefficiëntie verhoogt in semi-droge toepassingen</ td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & gt20x SSC & lt / td & gt & lttd & gt150 mM natriumchloride, en LTbR / en GT15 mM natriumcitraat, pH 7,0 & lt / td & gt & lttd en gtCapillary overdracht van agarosegels & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & gt & ltstrong & gtProcessing Buffers & lt / strong & gt & lt / td & gt & lttd & gt & ampnbsp & lt / td & gt & lttd & gt & ampnbsp & lt / td & gt </tr> <tr> <td>10x PBS</td> <td>10 mM natriumfosfaat,<br />150 mM NaCl, pH 7,4</td> <td>Western blotting wasoplossing</td> </tr> <tr>10 <tds M NaCl, pH 7,4<br />150 mM NaCl, 1% (g/v) caseïne, pH 7,4</td> <td>Western blotting wasoplossing</td> </tr> <tr> <td>1x PBS met 1% caseïne</td>10 mt <md&fosfaat >150 mM NaCl, 1% (w/v) caseïne, pH 7,4</td> <td>Western blotting-blokkerende buffer (caseïneblokkers aanbevolen voor alle toepassingen, inclusief die met biotine-avidinecomplexen)</td> </tr> <tr > <td>1x TBS met 1 % caseïne</td> <td>20 mM Tris, 500 mM NaCl<br /> met 1% (w/v) caseïne, pH 7,4</td> <td>Western blotting-blokkerende buffer (caseïneblokkers aanbevolen voor alle toepassingen, inclusief die met biotine-avidinecomplexen)</td> </tr> <tr> <td>20x SSC</td> <td>150 mM natriumchloride,<br />15 mM natriumcitraat, pH 7,0</td> <td>Northern en Southern blotting prehybridisatie- en hybridisatieoplossingen<t/tdbody> </tdbody> worden gebruikt voor alle gel soorten en formuleringen.</p> Soorten agarose <p>Er is een verscheidenheid aan agarosepoeders beschikbaar. Bij het selecteren van het type agarose dat moet worden gebruikt, is de belangrijkste factor om te overwegen de grootte van de fragmenten die worden gescheiden. Bovendien kan, gezien het percentage agarose in de gel, de fragmenten van belang beter worden opgelost en een gel worden geproduceerd die een afbeelding van publicatiekwaliteit oplevert. Gels met een hoger percentage lossen kleinere DNA-fragmenten op, terwijl gels met een lager percentage grotere fragmenten oplossen. Elk type agarose in <a href="http://www.bio-rad.com/evportal/destination/commerce/product_detail?catID=23d49f42-1c89-46ba-b599-347f99fc114e">Bio-Rad's Certified Agarose</a> productlijn is getest op genetische kwaliteit (GQT) en kan worden gebruikt voor routinescheidingen en stroomafwaartse moleculaire biologietoepassingen.</p> <table border="0"> <tbody> <tr align="left"> <td>&nbsp</td> <td style="text-align: center "><a href="/nl-nl/sku/1613102-certified-molecular-biology-agarose-500-g?ID=1613102">Molecular Biology Agarose</a></td> <td style="text-align: center"><a href= "/en-us/sku/1613105-certified-pcr-agarose-500-g?ID=1613105">PCR Agarose</a></td> <td style="text-align: center"><a href="/en-us/sku /1613107-certified-low-range-ultra-agarose-125-g?ID=1613107">Low Range Ultra Agarose</a></td> <td style="text-align: center"><a href="/en-us/sku/ 1613110-certified-megabase-agarose?ID=1613110">Megabase Agarose</a>&l t/td> <td style="text-align: center"><a href="/nl-nl/sku/1613115-certified-pcr-low-melt-agarose-500g?ID=1613115">Low-Melt Agarose</a></td> <td style="text-align: center"><a href="/nl-nl/sku/1613115-certified-pcr-low-melt-agarose-500g?ID=1613115">PCR Low-melt agarose</a></td> <td style ="text-align: center"><a href="/nl-nl/product/pulsed-field-standards-agaroses?ID=99c9f1c3-c32a-4612-9e4c-a9f2158a0e7f">Pulsed Field Agarose</a></td> </tr> <tr align="left"> <td colspan="8"><strong>Analytische scheiding</strong></td> </tr> <tr align="left"> <td align="left">&ge1.000 bp</td> <td align="center">/ampd align="center">&nbsp</td> <td align="center">&nbsp</td> <td align="center"></td> <td align="center">&bull</td> <td align="center">/ampnb >&nbsp</td> </tr> <tr align="center"> <td align="left" >&le1,000 bp</td> <td align="center">&nbsp</td> <td align="center">&bull</td> <td align="center">&nbsp</td> <td align="center"></lttdcenter td> <td align="center">&bull</td> <td align="center">&nbsp</td> </tr> <tr align="left"> <td align="left">10&ndash800 bp</tdamp="gt <ttd>">n ="center">&nbsp</td> <td align="center">&bull</td> <td align="center"></td> <td align="center">&nbsp</td> <td&bull</td> <td align="center"></td> <td align="center">&nbsp</td> <td&bull</td> & /td> </tr> <tr align="left"> <td align="left">1 kb&ndash2 Mb</td> <td align="center">&nbsp</td> <tbd align="center">"&nbsp<td align> <t/tdamp> <td align="center"><span>&bull</span></td> <td align="center">&nbsp</td> <td align="center"></td > <td align="center">&bull</td> </tr> <tr align="left"> <td align="left">1 kb&ndash5 Mb</td> <td align="center">&nbsp</td> <td>>>>< align="center">&nbsp</td> <td align="center"><span>&bull</span></td> <td align="center">&nbsp</td> <td align="center">&nbsp</gtdcenter align="left"> <td colspan="8" align="left"><strong>Voorbereidende scheiding</strong></td> </tr> <tr align="left"> <td align="left">Quantum Prep Methods</td> <td align="center" >&bull</td> <td align="center">&bull</td> <td align="center">&bull</td> <td align="center"><span>&bull</span></td>center">amp> <td align="center">&bull</td> </tr> <tr align="left"> <td align="left">L ow-Melt-methoden</td> <td align="center">&nbsp</td> <td align="center">&nbsp</td> <td align="center">&nbsp</td> <td align="center"></ td> <td align="center">&bull</td> <td align="center">&nbsp</td> </tr> <tr align="left"> <td align="left">Agarose-methodes</td> <spdalign&n="center">>&="centre">>& ="center">&nbsp</td> <td align="center">&nbsp</td> <td align="center"></td> <td align="center">&bull</td> <td align="center"/gtt>bull& /td> </tr> <tr align="left"> <td align="left">In-Gel Applications</td> <td align="center">&nbsp</td> <td align="center">&nbsp</td> <td>< td> <td align="center"></td> <td align="center">&bull</td> <td align="center">&bull</td> <td align="center ">&nbsp</td> </tr> <tr align="left"> <td colspan="8" align="left"><strong>Andere toepassingen</strong></td> </tr> <tr align="left"> <td prealign="left">matisch /td> <td align="center">&bull</td> <td align="center">&bull</td> <td align="center">&bull</td> <td align="center"></td> <td/td> <td/gtb "center">&bull</td> <td align="center">&nbsp</td> </tr> <tr align="left"> <td align="left">Tissue/Cell Culture</td> <td align="center">/ampnbsp&=" center">&nbsp</td> <td align="center">&nbsp</td> <td align="center"><span>&bull</span></td> <td align="center">td align&nbsp<tdalign> >=" /td> </tr> <tr align="left"> <td align="left">Pulsed Field Sample Preparation</td&g t <td align="center">&nbsp</td> <td align="center">&nbsp</td> <td align="center">&nbsp</td> <td alignt<td align="center"><span>&bull</gtd> ="center"></td> <td align="center">&bull</td> </tr> <tr align="left"> <td align="left">Blotting</td> <td align="center">&bull</td> <td align="left" >&bull</td> <td align="center">&nbsp</td> <td align="center"><span>&bull</span></td> <td align="center">&nbsp</td="align"<td =" </tr> </tbody> </table> <p><img src="https://www.bio-rad.com/webroot/web/images/lsr/solutions/technologies/gene_expression/horizontal_electrophoresis/technology_detail/gxt5_img2.jpg" /></ p> Nucleic Acids Blotting <p><strong> Nucleic Acids Stains and Tracking Dyes</strong><br /> Nucleic zuurmoleculen zijn kleurloos en een volgkleurstof zoals broomfenolblauw of xyleencyanol wordt over het algemeen gebruikt om hun beweging in de gel te volgen. Na elektroforese worden nucleïnezuren gekleurd. De fluorescerende vlek <a href="http://www.bio-rad.com/evportal/destination/commerce/product_detail?catID=8d0a0ad9-9fb7-4a6a-b99f-719f87cdebd6">ethidiumbromide</a> is de meest gebruikte, maar andere vlekken zijn beschikbaar. Na het kleuren wordt de gel gevisualiseerd met behulp van een <a href="/evportal/destination/solutions?catID=LUSQCPKSY">gel imager</a>.</p> <p><strong> Routinescheidingen</strong><br /><a href="http://www.bio- rad.com/evportal/destination/commerce/product_detail?catID=23d49f42-1c89-46ba-b599-347f99fc114e">Gecertificeerde moleculair biologische agarose</a> wordt aanbevolen als agarose voor algemeen gebruik voor routinematige scheidingen van

DNA-fragmenten van 500 bp tot 20 kb. Deze agarose biedt snelle migratiesnelheden, gemakkelijk te manipuleren gels en vertoont een hoge sterkte, zelfs bij lage agarosepercentages.</p> <p><strong> Invloed van gelpercentage op optimale resolutie van DNA-fragmenten</strong></p> <table border="0"> <tbody> <tr> & lttd & gt & ltstrong & gtGel Percentage & lt / strong & gt & lt / td & gt & lttd & gt & ltstrong & gtOptimal resolutie Range & lt / strong & gt & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & gt0.75% & lt / td & gt & lttd & GT500 bp & ampndash10 kb & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & gt1.00% & lt / td & gt & lttd & GT300 bp & ampndash9 kb & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & GT1 .25%</td> <td>100 bp&ndash8 kb</td> </tr> </tbody> </table> <p><strong> Scheidingen van kleine fragmenten</strong><br />Voor scheidingen met hoge resolutie van kleine fragmenten zoals PCR wordt aanbevolen Deze agarose scheidt DNA-fragmenten van 20 bp tot 1000 bp. De standaard geleringstemperatuur maakt het gemakkelijk te bereiden, en de gels zijn gemakkelijk te manipuleren en blijven flexibel, zelfs bij hoge gelpercentages. Deze agarose biedt een hogere resolutie van kleine fragmenten dan de gecertificeerde moleculaire biologie-agarose.</p> <p>&nbsp</p> <p><strong> Invloed van gelpercentage op optimale fragmentresolutie</strong></p> <table border="0"> <tbody> <tr><strong> & lttd & gt & ltstrong & gtOptimal resolutie Range & lt / strong & gt & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & gt2% & lt / td & gt & lttd & GT100 bp & ampndash2.5 kb & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & gt3% & lt / td & gt & lttd & gt40 bp & ampndash2 kb & lt / td & gt & lt / tr & gt & lttr & gt & lttd & GT4% & lt / td & gt & lttd & GT20 bp & ampndash1 kb & lt / td> </tr> </tbody> </table> <p>&nbsp</p> <p><strong> Scheidingen van zeer kleine fragmenten</strong><br />Voor de scheiding van extreem kleine PCR-fragmenten en primers (

10 tot 200 bp), wordt gecertificeerde ultra-agarose met een laag bereik aanbevolen. Deze agarose biedt een uitzonderlijk hogere resolutie dan standaardgels bij lagere concentraties, waardoor visualisatie van verschillen van

19-12-27 13:32 AR,BO,BR,CA,CL,CO,CR,DO,EC,SV,GU,GT,HT,HN,JM,MX,NI,PA,PY,PE,PR ,TT,US,UY,VE,AU,BD,BN,KH,CN,HK,IN,ID,JP,KR,MO,MY,FM,NP,NZ,PW,PG,PH,SG,SB,LK ,TW,TH,TO,VU,AL,DZ,AI,AM,AT,AZ,BH,BE,BA,BW,BG,BF,CM,HR,CY,CZ,DK,EG,ER,EE,ET ,FO,FI,FR,GF,PF,GA,GE,DE,GH,GR,GP,HU,IS,IE,IL,IT,JO,KZ,KE,XK,KW,LV,LB,LI,LT ,LU,MK,MG,ML,MT,MQ,MU,MD,MS,MA,NL,NG,NO,OM,PK,PS,PL,PT,QA,RO,RU,ST,SA,SN,RS ,SK,SI,ZA,ES,SE,CH,TZ,TG,TN,TR,UG,UA,AE,UK,UZ,VA,EH,YE LSR /LSR/Technologies/Horizontal_Electrophoresis N 0

Pagina-inhoud

Methoden in extracellulaire matrixbiologie

Ronald J. Midura, . Vincent C. Hascall, in methoden in celbiologie, 2018

5.6 Acrylamide-geloplossing

FACE-gels bestaan ​​uit 20% acrylamide (37,5:1) in een 40 mM Tris-Acetate pH 7,0-buffer die 2,5% glycerol bevat. Bereid deze geloplossing in een erlenmeyer van 1 liter door 500 ml 40% acrylamide (37,5:1), 100 ml tris-acetaat (400 mM, pH 7,0), 375 ml gedestilleerd water en 25 ml glycerol toe te voegen. Merk op dat kleine variaties in het glycerolgehalte in de acrylamidegeloplossing wanneer gegoten in gels kunnen resulteren in grote variaties in de migratieposities van AMAC-gelabelde glycanbanden. Dus, vanwege de hoge viscositeit van glycerol, moet ervoor worden gezorgd dat de volledige 25 ml glycerol in de acrylamide-voorraadoplossing wordt gedoseerd. Plaats na grondig mengen aliquots van 10 ml in centrifugebuizen van 15 ml en bewaar deze voor onbepaalde tijd bij 4 °C. Elke aliquot van 10 ml maakt twee standaard minigels met behulp van afstandhouders van 0,75 mm. Deze voorraadoplossing van 1 L levert voldoende acrylamide op voor 200 gels.


Scheiding met hoge resolutie en nauwkeurige groottebepaling van gepulseerde veldgelelektroforese van DNA. 4. Invloed van DNA-topologie

Artikelweergaven zijn de COUNTER-conforme som van full-text artikeldownloads sinds november 2008 (zowel PDF als HTML) bij alle instellingen en individuen. Deze statistieken worden regelmatig bijgewerkt om het gebruik in de aanloop naar de afgelopen dagen weer te geven.

Citaties zijn het aantal andere artikelen waarin dit artikel wordt geciteerd, berekend door Crossref en dagelijks bijgewerkt. Vind meer informatie over Crossref citatietellingen.

De Altmetric Attention Score is een kwantitatieve maat voor de aandacht die een onderzoeksartikel online heeft gekregen. Als u op het donutpictogram klikt, wordt een pagina op altmetric.com geladen met aanvullende details over de score en de aanwezigheid op sociale media voor het betreffende artikel. Vind meer informatie over de Altmetric Attention Score en hoe de score wordt berekend.

Opmerking: In plaats van een samenvatting is dit de eerste pagina van het artikel.


Een vergelijking van de resolutie van DNA-fragmenten tussen agarosegel en capillaire zone-elektroforese in agarose-oplossingen

Het oplossend vermogen van capillaire zone-elektroforese (CZE) wordt vergeleken met dat van gelelektroforese (GE) onder vergelijkbare omstandigheden (agarose, vergelijkbare lengte van DNA-fragmenten, identieke buffer) maar met verschillen in temperatuur en veldsterkte. De vergelijking is gebaseerd op de tijd die nodig is om met elk van de twee methoden een gewenste resolutie te bereiken. Er wordt een resolutieparameter ontwikkeld die evenzeer van toepassing is op CZE, met relatief diffuse beginvoorwaarden bij afwezigheid van stapeling en metingen uitgedrukt in tijd, als op GE, waarin metingen worden uitgedrukt in termen van ruimtelijke parameters. De resolutietijd in CZE met behulp van agarose-oplossingen bij 40°C bleek minstens één orde van grootte groter te zijn dan die in GE met behulp van agarosegels. De verhoogde migratiesnelheid als gevolg van de hoge veldsterkte in CZE weegt dus aanzienlijk zwaarder dan de lagere dispersie in GE.


Sectie II: 5 manieren om een ​​hogere resolutie in agarosegels te bereiken

1. Wat is de juiste buffer voor uw agarosegelelektroforese?

Het type buffer dat wordt gebruikt om DNA in agarosegelelektroforese uit te voeren, hangt voornamelijk af van de grootte van het DNA-fragment en de toepassing na elektroforese. De twee meest populaire soorten buffers voor het uitvoeren van agarosegels zijn Tris-acetaat met EDTA (TAE) en Tris-boraat met EDTA (TBE). Omdat beide buffers een bijna neutrale pH hebben, heeft het DNA in de buffers een netto negatieve lading en migreert het naar het anode (+) uiteinde van het gelapparaat.

Voor klein DNA (<1000 bp) en als er geen plan is om het DNA te extraheren, wordt 1x TBE-buffer aanbevolen. TBE buffer heeft een hoge ionsterkte en buffercapaciteit. TAE-buffer, samen met een lage veldsterkte (1-2 V/cm), heeft de voorkeur voor het scheiden van groot DNA (12-15 kb). TAE-buffer interageert met agarose, wat resulteert in lagere elektro-endosmose, grotere schijnbare poriegrootte en lagere veldsterkte in vergelijking met agarosegels in TBE-buffer, die allemaal de neiging van groot DNA om uit te smeren verminderen.

2. Hoeveel DNA moet je laden om de beste resolutie te krijgen?

De hoeveelheid DNA-monster kan worden gevarieerd, wat belangrijk is, is de hoeveelheid DNA in de band(en) die u scheidt. De minimale hoeveelheid DNA die kan worden gedetecteerd, is afhankelijk van de gebruikte kleuring (bijv. 3 ng DNA in een band kan worden gedetecteerd met behulp van SYBR® Safe DNA-gelkleuring. De maximale hoeveelheid DNA in een band die nog helder en goed is -gedefinieerd is ongeveer 100 ng.

3. Hoe beïnvloedt gelgieten de bandresolutie?

De aanbevolen dikte voor agarosegel is 3-4 mm. Een gel dikker dan 5 mm zal resulteren in vage banden en een sterkere kleuring op de achtergrond. Evenzo is de hoeveelheid loopbuffer om de gel in een elektroforese-apparaat te bedekken 3-5 mm. Te veel buffer zal de DNA-mobiliteit verminderen en bandvervorming veroorzaken.

De dikte van de kam is ook belangrijk en beïnvloedt de resolutie aanzienlijk. Een dunne kam (1 mm) geeft zeer goed gedefinieerde banden, terwijl een dikke kam dikke banden geeft, wat leidt tot een verminderde resolutie. De kam moet goed worden schoongemaakt om mogelijke resten te verwijderen die golvende lijnen in de banen kunnen veroorzaken. Voeg bovendien buffer toe voordat u de kam verwijdert om het scheuren van een deel van de agarose in de buurt van de put te minimaliseren.

4. Heeft het type gel invloed op de bandresolutie?

  • UltraPure™ Agarose is een multifunctionele agarose met standaard smelttemperatuur, ontworpen voor routinematige scheidingsanalyse. UltraPure™ Agarose lost DNA- en RNA-fragmenten op in het bereik van 500 bp tot 23.000 bp.
  • UltraPure™ Agarose 1000 is een gespecialiseerde agarose die zorgt voor een hogere resolutie van PCR-fragmenten en andere korte DNA-fragmenten. Agarose 1000 is gemakkelijker te hanteren omdat het een sterkere gelstructuur heeft: gelsterkte is meer dan 1.400 g/cm 2 .
  • Voor agarose met een lage smelt-/geleringstemperatuur wordt UltraPure™ Low Melting Point Agarose aanbevolen voor snelle DNA-gelextractieprotocollen. Het resolutiebereik voor deze agarose is 50 bp tot 1.000 bp.

5. Hoe kiest u de werkomstandigheden voor agarosegelelektroforese?

De aanbevolen spanning is 4-10 V/cm (afstand tussen anode en kathode, niet de lengte van de gel) in de gelelektroforese-eenheid. Is de spanning te laag, dan neemt de mobiliteit af en treedt door diffusie bandverbreding op. Als de spanning te hoog is, wordt de bandresolutie verminderd, voornamelijk door oververhitting van de gel.


Dit is een veelgebruikte methode om DNA- en RNA-fragmenten op grootte te scheiden. Nucleïnezuren zijn negatief geladen, dus met behulp van een elektrische stroom migreren de nucleïnezuurfragmenten sneller of langzamer door de gelmatrix, afhankelijk van hun grootte.

Leuk weetje: Ethidium Bromide migreert de andere kant op.

TBE- of TAE-buffer

De functie van de buffer is om de ionen te leveren om de stroom te dragen en de nucleïnezuurmoleculen te laten migreren.

Tris-boraatbuffer is beter in het oplossen van kleinere DNA-fragmenten tot 2kb in agarosegels. TAE daarentegen is beter in het oplossen van grotere DNA-fragmenten. Dit alles wordt hier beschreven. Het extra voordeel van het gebruik van TAE-buffer is dat u een hogere voorraadoplossing kunt maken en deze langer meegaat. TAE is ook goedkoper.

Ervan uitgaande dat u niet de enige in het lab bent die gels gebruikt, raad ik u aan een mandfles te kopen om de buffer in op te slaan. Het is ook mogelijk om de lopende buffer opnieuw te gebruiken, dus het kan logisch zijn om een ​​andere mandfles te kopen voor de gebruikte loopbuffer.

Ethidiumbromide of iets anders?

Tot ongeveer een jaar geleden gebruikte ik alleen ethidiumbromide. Maar er is veel energie gestoken in het vinden van alternatieven die minder schadelijk zijn voor mensen. Het afgelopen jaar gebruik ik Midori Green in plaats van EthBr. Hoewel ik geen directe vergelijking tussen de twee heb gemaakt, lijkt de Midori Green goed te werken.

De gelmatrix werkt als een gaas, waardoor grotere nucleïnezuurmoleculen langzamer migreren dan kleinere.

Ik heb geen merk dat mijn voorkeur heeft. Normale agarose die bedoeld is voor moleculaire biologie en nucleïnezuurgelelektroforese zou moeten werken.

Gelkamers

Van de bedrijven die gelsystemen produceren, zijn Bio Rad en Thermo Fisher twee van de meest voorkomende merken. BioRad maakt ook goede voedingen en geldocumentatiesystemen.

De afbeelding toont alle noodzakelijke elementen van een gelkamer.

Er zijn een paar dingen waar u rekening mee moet houden voordat u een gelkamer kiest.

Dit zou de grootte van de te gebruiken geltank bepalen.

Afhankelijk van het monstervolume dat u op de gel wilt laden, moet u de grootte van de putjes dienovereenkomstig maken. Dit zou de kammaat bepalen. Also, regarding the comb thickness, the thinner the comb is, the better the resolution of the band is going to be.

Preparing the gel

  • First you need to decide what percentage gel (w/v) you need. The smaller the nucleic acid molecules the higher the gel percentage should be. For fragments between 300bp and 3kb I would prepare a 1% gel (1g Agarose in 100ml buffer). Anything below 300bp requires at least a 2% gel. Above 3kb you can go down to 0.8% gels. I would not go any lower then that, because then it becomes difficult to handle the gel.
  • Once you have decided, weigh the agarose and transfer the powder into a glass container (usually an erlenmeyer flask). The volume of the flask should be 5 times the volume of the gel that you want to prepare. In a smaller container the gel would probably spill out, when it is heated in the microwave.
  • Add the correct amount of buffer. Do not heat the buffer before adding the agarose, otherwise the powder will clump and it won’t dissolve.
  • Be careful while handling the liquid. Always wear gloves and use a hot hand protector when handling the container. Even if it does not look like the solution is “bubbling” when you take the flask out of the microwave. Swirl the flask gently.
  • After boiling, the buffer-agarose mix should be clear/homogenous.
  • Cool the gel down before poring it. This is necessary, because the dyes used for labeling the DNA are not heat resistant and additionally the gel trays develop cracks if the gel is pored too hot. For cooling I swirl the flask under running cold water, making sure no water gets into the flask. Once it has reached around 60˚C proceed with the next step.
  • Add the appropriate amount of nucleic acid stain.
  • Pore the gel into the container. Avoid creating bubbles. But if there are bubbles just move them, with a pipette tip, to the side or the bottom of the gel, where they do not interfere with running the gel.
  • Let the gel solidify.
  • Add the buffer until it covers the surface of the gel.
  • Add loading dye to your samples (I prefer OrangeG) the gel.
  • Sluit het deksel. Make sure the cable cords are attached correctly.
  • Run the gel. Usually I only change the e voltage and keep the ampere constant. The voltage depends on the size of the gel and it is difficult to describe. If the voltage is too high though the buffer heats up and can potentially melt the gel.

The bubbles rising from the cathode and the anode are an indicator, that the gel is running.

The gel picture above shows RNA samples of a transcription reactions. I wanted to see how efficient the reaction was and if the RNA is degraded.

If you want to determine the size of your RNA fragments you would have to perform a denaturing gel though and use a specific RNA ladder.

Thermo Fisher compiled a trouble shooting guide for Nucleic Acid Electrophoresis.


How does gel electrophoresis separate molecules?

Rest of the detail can be read here. Also question is, how does agarose gel electrophoresis separate molecules?

Tot verschillend DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecuul is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode.

what are some of the ways electrophoresis can separate fragments? Gel electrophoresis is used to verschillend macromolecules like DNA, RNA and proteins. DNA fragments are separated according to their size. Eiwitten can be separated according to their size and their charge (different proteins have different charges).

Also Know, what factor does gel electrophoresis use to separate DNA molecules?

Gel electrophoresis en DNA Elektroforese enables you to distinguish DNA fragments of different lengths. DNA is negatively charged, therefore, when an electric current is applied to the gel, DNA will migrate towards the positively charged electrode.

Why is agar an appropriate medium to use for separating molecules?

Agar is usually used in microbiology to provide a solid surface containing medium for the growth of bacteria and fungi. Moreover, agarose is frequently used in molecular biology for the scheiding of large molecules, especially DNA, by electrophoresis.


What is the purpose of a “ladder” in molecular biology?

One tool that is frequently used in molecular biology is called gel electrophoresis. Using gel electrophoresis, large molecules such as DNA, RNA, or proteins can be separated out from one another by running on an agarose gel, driven by electrical current. Generally, it is used for DNA. Ladders are sometimes called also called “molecular weight size markers.”

Normally, a small sample of the genetic material is loaded into a well, a small indentation built into the top of the gel. It is important to load either a ladder or a marker into one of the wells.

A ladder is a solution that contains a series of well-defined DNA fragments of particular lengths. Some ladders may contain DNA fragments of sizes such as 100 base pairs all the way up to 10,000 base pairs (10 kbp). The appropriate ladder to use depends on the molecular weight of the target you are interested in studying. You can use a ladder to identify the approximate number of base pairs in the band that you are interested in.

Besides measuring base pair length, ladders serve another purpose. If the gels were not poured correctly, there may be differences in the thickness of the gel across the width of the gel. This may happen in larger gels. If this is the case, the DNA may not electrophorese at the same rates. Running a ladder on both ends of the gels ensure that a good comparison can be made across the entire width of the gel.


Gelelektroforese

Agarose gels provide a simple method for analyzing preparations of DNA. DNA molecules share the same charge/mass ratio, which imparts similar electrophoretic properties to linear DNA molecules of widely varying lengths. We will use “molecule” to refer to a linear piece of DNA, but keep in mind that a single DNA “molecule” may contain the sequences of multiple genes or parts of genes.

Agarose gels are porous matrices

Agarose is a polysaccharide purified from red algae, or seaweed. Agarose is more highly purified (and significantly more expensive!) than agar, which is obtained from the same seaweed. Agarose molecules are long, linear polymers of a repeating disaccharide D-galactose and 3,6-anhydro-α-L-galactopyranose (right). A typical agarose molecule contains over one hundred subunits. The agarose used for electrophoresis has been highly purified. The purification process removes contaminants that would interfere with the enzymes used in molecular cloning, such as restriction
endonucleases. The process also generates an agarose preparation with desirable electrophoretic properties and minimal background fluorescence, which is important for visualizing DNA molecules.

Agarose molecules are able to form gels with relatively defined pore sizes because of the chemical properties of agarose molecules. Agarose demonstrates hysteresis – its melting temperature is higher than its gelling temperature. Agarose molecules dissolve at about 90°C, forming random coils in solution. Gels form when the temperature falls to approximately 40°C. As the gel forms, the agarose molecules first assemble into helical fibers, which then further aggregate to form networks of supercoiled helices stabilized by hydrogen bonds. The sizes of the pores, which typically range from 50 to 200 nm, depend on the concentration of agarose. As the agarose concentration increases, the average diameter of the pore decreases.

Several factors affect the migration of DNA through agarose gels

Because of the negative charge of the phosphate residues in the DNA backbone, DNA molecules move toward the positive pole (anode) of the electrophoresis apparatus. The actual migration rate of DNA molecules in a particular experiment is affected by multiple factors. Some of these factors are intrinsic to the DNA molecules, while other factors relate to the electrophoretic conditions. Intrinsic factors include both the length and conformation of the DNA molecules that are being analyzed. Within a certain size range dictated by the gel conditions, the migration rate of linear DNA molecules is inversely proportional to the log10 (number of base pairs). The migration of more structured DNA molecules, such as supercoiled plasmids, is much less predictable. The migration rates of these more highly structured DNAs are influenced by the density of coils, the presence of nicks, and other structural features.

The migration rates of DNA molecules in agarose gels are also affected by the composition of the gel. The migration rate of a DNA molecule decreases as the concentration of agarose in the gel increases. Researchers commonly adjust the agarose concentration to optimize the resolution of DNA molecules within a particular size range. The two buffers commonly used in labs, TAE (Tris: acetate: EDTA) and TBE (Tris: borate: EDTA), also affect electrophoresis rates.

Because of this inherent variability, researchers ALWAYS include a lane of DNA standards with known sizes on the same gel as the samples being analyzed. Importantly, these standards need to have a similar structure (e.g. linear or supercoiled) and to be subjected to the same chemical modifications as the DNA samples being analyzed.

Fluorescent intercalating agents are used to visualize DNA molecules in gels

Nucleic acids are visualized by fluorescent dyes that bind strongly to DNA. The dyes are intercalating agents that insert into the DNA helix and into structured regions of single-stranded nucleic acids. The fluorescence of these dyes increases by an order of magnitude when they bind nucleic acids, so the background fluoresence on agarose gels is usually low. In this class, we will use ethidium bromide (EtBr) to visualize DNA fragments. EtBr absorbs light in the ultraviolet (UV) range and emits orange light. Gels are viewed with special transilluminators containing UV lights. EtBr is a light-sensitive compound, so stocks are stored in the dark.

Standards are used to estimate the sizes of DNA molecules

The figure on the right shows a lane from an EtBr-stained 1% agarose gel containing DNA size standards. The 1 kb ladder shown in this student gel is a proprietary mixture of linear DNA fragments ranging in size from 0.5 to 10 kilobases (kb). The staining intensity of bands on agarose gels reflects the quantity of DNA in the band, because EtBr intercalates fairly evenly along the length of linear DNA molecules. As you can see, this particular mixture contains similar quantities of each DNA fragment, with the exception of the />3 kb fragment, which has

2.5 more DNA than the other fragments. The greater intensity of the 3 kb fragment serves as a useful orientation marker in situations where smaller fragments might have run off the end of the gel or when some markers are not well resolved from one another. (These are common occurrences!)

Note that the shortest molecules on the gel are more well separated from one another than the longer molecules. The PCR products that you will be analyzing in this lab are mostly in the 400-1000 bp range. To increase the resolution of these molecules, we will use 1.25% agarose gels. (This will reduce the resolution of larger DNA molecules). Note also that smaller bands appear fuzzier on the stained gel, because they have been more affected by random diffusion as they have migrated through the network of agarose polymers.


Bekijk de video: What Is Capillary Electrophoresis? (November 2021).