Informatie

Wat is een in-frame activerende fusie?


In [1] staat dat:

Gehele genoom- en RNA-sequencing identificeerde terugkerende in-frame activerende FGFR3-TACC3-fusies

Wat is een terugkerende in-frame activerende fusie?

[1] Cancer Genome Atlas Research Network, "Uitgebreide moleculaire karakterisering van urotheelblaascarcinoom." Nature, vol. 507, nee. 7492, blz. 315-322, maart 2014.


Dit wordt uitgelegd in het gelinkte artikel.

We vonden verschillende terugkerende translocaties van waarschijnlijk pathogene betekenis, waaronder een intra-chromosomale translocatie op chromosoom 4 met FGFR3 en TACC3 (n=3). De breekpunten waren in intron 16 (2 gevallen) of exon 17 (1 geval) van FGFR3 en intron 10 van TACC3 (bevestigd door DNA-sequencing en RNA-seq). Alle drie leiden ze tot fusie-mRNA-producten waarvan de voorspelde eiwitten de N-terminale 758 aminozuren van FGFR3 omvatten, gefuseerd met de C-terminale 191 aminozuren van TACC3 (Fig. 2a). Op basis van de structuur van het FGFR3-TACC3-fusie-eiwit, voorspellen we dat het auto-dimeriseren kan, wat leidt tot constitutieve activering van het kinasedomein van FGFR3. FGFR3-TACC3-fusie, die onlangs werd beschreven in zowel glioblastoma21 als blaaskanker7,8, vertegenwoordigt een veelbelovend therapeutisch doelwit.

FGFR3 is een lid van de fibroblastgroeifactorreceptorfamilie. Het is een transmembraankinase dat normaal wordt geactiveerd na ligandbinding die dimerisatie veroorzaakt. TACC3 is een eiwit dat kan dimeriseren door een coiled-coil domein.

De FGFR3-TACC3-genfusie die wordt gegenereerd door de gerapporteerde intra-chromosomale translocaties genereert dus een versie van de receptor waarvan wordt voorspeld dat deze constitutief actief is omdat deze kan dimeriseren in afwezigheid van de groeifactor.

Terugkerende middelen vaak voorkomt.


Fusiegen

Invoering

Een fusiegen wordt gedefinieerd als twee genen die zijn samengevoegd zodat ze als een enkele eenheid worden getranscribeerd en vertaald. Genfusies kunnen optreden in vivo, zowel natuurlijk als als gevolg van genetische manipulaties, en kan worden geconstrueerd in vitro met behulp van recombinant-DNA-technieken. Ze komen in de natuur voor in de loop van de evolutie, bijvoorbeeld waar twee genen waarvan de producten deel uitmaken van een metabolische route samensmelten, waardoor een fusie-eiwit ontstaat dat beide stappen van de route uitvoert. Ze kunnen ook optreden als gevolg van chromosoomherschikkingen: het BCL-ABL-oncogen, dat chronische myeloïde leukemie veroorzaakt, is bijvoorbeeld het resultaat van een chromosomale transpositie die de BCL- en ABL-genen versmelt. Eindelijk kunnen genfusies worden gemaakt in vitro met behulp van recombinant-DNA-technieken, vaak om een ​​reportergen te fuseren met een gen dat wordt bestudeerd om de expressie ervan te volgen.


Achtergrond

Genfusies zijn een bekend mechanisme voor oncogenactivering bij leukemieën, lymfomen en sarcomen, met de BCR-ABL fusiegen bij chronische myeloïde leukemie als prototypevoorbeeld [1, 2]. De recente identificatie van recidiverende ETS-familie translocaties bij prostaatkanker [3] en EML4-ALK in longkanker [4] suggereert nu dat fusiegenen ook een belangrijke rol kunnen spelen bij de ontwikkeling van epitheliale kankers. De reden waarom ze niet eerder werden gedetecteerd, was het gebrek aan geschikte technieken om uitgebalanceerde terugkerende chromosomale aberraties in de vaak chaotische karyotypische profielen van solide tumoren te identificeren.

Massaal parallelle RNA-sequencing (RNA-seq) met behulp van next-generation sequencing-instrumenten maakt identificatie van genfusies in individuele kankermonsters mogelijk en vergemakkelijkt uitgebreide karakterisering van cellulaire transcriptomen [5-11]. In het bijzonder maken de nieuwe sequentietechnologieën de ontdekking mogelijk van chimere RNA-moleculen, waarbij hetzelfde RNA-molecuul bestaat uit sequenties die zijn afgeleid van twee fysiek gescheiden loci. RNA-seq met gepaarde uiteinden, waarbij 36 tot 100 bp wordt gesequenced vanaf beide uiteinden van 200 tot 500 bp lange DNA-moleculen, is in het bijzonder geschikt voor identificatie van dergelijke chimere mRNA-transcripten. Whole-genome DNA-sequencing (DNA-seq) kan ook worden gebruikt om potentiële fusie-gen-creërende herschikkingen te identificeren. Er wordt echter verwacht dat slechts een fractie van de voorspelde genfusies op basis van DNA-seq een tot expressie gebracht fusie-mRNA zal genereren, waardoor deze benadering vervelend is om geactiveerde, oncogene fusiegengebeurtenissen te ontdekken. Daarentegen identificeert RNA-seq rechtstreeks alleen die fusiegenen die tot expressie worden gebracht, wat een efficiënt hulpmiddel biedt om kandidaat-oncogene fusies te identificeren.

Bij borstkanker zijn terugkerende genfusies alleen geïdentificeerd in zeldzame subtypes, zoals: ETV6-NTRK3 bij secretoir borstcarcinoom [12] en MYB-NFIB bij adenoïd cystisch carcinoom van de borst [13]. Hier demonstreren we de effectiviteit van gepaarde RNA-seq bij de uitgebreide detectie van fusiegenen. Gecombineerd met een nieuwe bio-informatische strategie, die een bevestiging van >95% van de geïdentificeerde fusiegebeurtenissen mogelijk maakte, identificeren we verschillende nieuwe fusiegenen bij borstkanker vanaf slechts een enkele sequentiebepaling op een Illumina GA2x-instrument. We valideren de fusiegebeurtenissen en demonstreren hun potentiële biologische betekenis door RT-PCR, fluorescentie ter plaatse hybridisatie (FISH) en RNA-interferentie (RNAi), waardoor het belang van genfusies bij borstkanker wordt benadrukt.


Resultaten

Ontwerp van CICERO

Om de verschillende soorten driver-genfusies bij kanker te ontdekken, is het algemene ontwerp van CICERO om RNA-seq-mapping te integreren met genomische kenmerken. Dit werd geïmplementeerd via de drie belangrijkste stappen die worden beschreven in Fig. 2a: (1) fusiedetectie door de novo lokale assemblage op kandidaat-breekpunten en analyse van splitsingsjunctie-uitlezingen, (2) fusieannotatie inclusief een leeskadercontrole voor de fusiepartnergenen, en (3) rangschikking van kandidaat-fusies op basis van het ondersteunende bewijs in RNA-seq en overeenkomsten met bekende fusies. CICERO kan worden uitgevoerd vanuit een lokaal cluster of op St. Jude Cloud (https://platform.stjude.cloud/tools/rapid_rna-seq) die gemakkelijke toegang biedt via een interactieve point-and-click-interface of de opdrachtregel voor het indienen van batchtaken. Wat nog belangrijker is, de Cloud-pijplijn beheert effectief de burst van computergebruik die nodig is voor genoombrede mapping om de uniciteit van elke kandidaat-fusie te beoordelen. Hierdoor kan de volledige workflow in de cloud, van RNA-seq-mapping tot fusiedetectie, binnen enkele uren worden voltooid, zelfs voor gevallen met enorme aantallen herschikkingen. Voorspelde genfusies kunnen vervolgens worden geïmporteerd in FusionEditor voor handmatige curatie en het samengestelde bestand kan worden geëxporteerd als de uiteindelijke resultaten (Fig. 2b).

Fusiedetectie met CICERO. een Overzicht van CICERO-algoritme dat bestaat uit fusiedetectie door analyse van kandidaat-SV-breekpunten en splitsingsjunctie, fusie-annotatie en rangschikking van belangrijke gegevenssets die in elke stap worden gebruikt, zijn gelabeld. B Workflow van fusiedetectie. Een gebruiker kan een uitgelijnd BAM-bestand of een onbewerkt fastq-bestand indienen als invoer op een lokaal computercluster of op St. Jude Cloud. De onbewerkte uitvoer kan worden samengesteld met FusionEditor en de uiteindelijke resultaten kunnen worden geëxporteerd als een tekstbestand

Handmatig beheer met FusionEditor

FusionEditor, een uitbreiding van onze visualisatietool ProteinPaint [23], importeert CICERO-uitvoer die is gegenereerd uit een of meerdere monsters in een interactieve browser (https://proteinpaint.stjude.org/FusionEditor/) om handmatige curatie te ondersteunen. Binnen elk monster worden de voorspelde fusies gerangschikt op kwaliteitsklasse, inclusief hoge kwaliteit (HQ), lage kwaliteit (LQ) of doorlezen, en geannoteerd met in-frame/truncatiestatus, zodat een gebruiker prioriteit kan geven aan het beheer van oproepen met een hoge mate van vertrouwen met behoud van de mogelijkheid om alle voorspelde fusies te beoordelen (Fig. 3).

Visualisatie-interface van FusionEditor voor het samenstellen van fusies die zijn voorspeld op basis van één monster. een Tabelweergave die de vijf "HQ" (hoge kwaliteit) in-frame fusies toont die voorspeld zijn bij een baby ALL (SJINF011_D). Een fusie van 3 genen waarbij AFF1-RAD51B-KMT2A betrokken is, wordt automatisch herkend en gemarkeerd door een vak met het label 'multi-seg'. De wederzijdse KMT2A-AFF1-fusie werd ook geïdentificeerd als een HQ in-frame fusie. Inter- en intra-chromosomale fusies zijn respectievelijk gelabeld met rode en zwarte tekst. Bekende fusies zijn gelabeld met paarse tekst (bijvoorbeeld KMT2A-AFF1 en FLT3 ITD in dit geval). B Grafische weergave van de breekpunten op de eiwitdomeinen van de drie partnergenen. Aanvullende informatie, zoals de chimere afleesratio voor elk fusiebreekpunt, wordt getoond ter ondersteuning van de beoordeling van de validiteit van elke voorspelde fusie

Elke fusie kan grafisch worden bekeken (Fig. 3, Aanvullend bestand 1: Figuur S1) die de exon- en aminozuurpositie van het breekpunt op elk partnergen of locus toont met betrekking tot het referentiegenmodel. Dit zorgt voor handmatige beoordeling van eiwitdomeinen die in het fusie-eiwit worden vastgehouden. FusionEditor kan ook breekpunten binnen UTR-regio's weergeven (aanvullend bestand 1: afbeelding S2), evenals promotor- of intergene fusies voor het beoordelen van versterkerkapingen (aanvullend bestand 1: afbeelding S3). Complexe fusies waarbij ≥ 3 partners betrokken zijn, kunnen ook worden geïdentificeerd en gevisualiseerd (bijv. AFF1-RAD51B-KMT2A-fusie in Fig. 3). Een gebruiker kan fusieattributen bewerken door de kwaliteitsklasse en het fusietype te wijzigen en door meerdere breekpunten samen te voegen tot een fusie met meerdere segmenten, of vice versa. De uiteindelijke samengestelde resultaten kunnen worden geëxporteerd als een plat bestand voor downstream-analyse.

De interface voor het onderzoeken van CICERO-uitgangen van meerdere monsters maakt snelle identificatie van terugkerende genfusies in een kankercohort mogelijk (aanvullend bestand 1: figuur S1). In het bijzonder wordt de herhaling van elke genfusie samengevat in een tabel (aanvullend bestand 1: figuur S1b) samen met de toegewezen kwaliteitsgraad. Een gebruiker kan ook zoeken naar fusies waarbij een specifiek gen betrokken is, bijvoorbeeld alle fusies waarbij: TERT (zoals weergegeven in aanvullend bestand 1: figuur S1c). Om verdere evaluatie van versterkerkapinggebeurtenissen te ondersteunen, kunnen gebruikers genexpressiewaarden (bijv. FPKM) van een cohort uploaden voor inspectie van afwijkend hoge expressie in het geselecteerde fusie-positieve monster (aanvullend bestand 1: figuur S1d). Via een point-and-click-interface heeft de gebruiker toegang tot aanvullende details, zoals de positie van het breekpunt, domeininformatie, het aantal soft-clipped reads en het genexpressieniveau in het cohort (aanvullend bestand 1: figuur S1d en e).

Vergelijking van CICERO met andere methoden voor het detecteren van somatische genfusies

De benchmarkgegevensset bestaat uit 184 genfusies van bestuurders die zijn ontdekt in 170 monsters van leukemie (N = 119), solide tumor (N = 13), en hersentumor (N = 38) (Fig. 4a, Extra bestand 2: Tabel S1 en S2) [3, 15, 21]. Deze 184 genfusies, die goed gekarakteriseerde oncogenen bij pediatrische kanker beïnvloeden (Fig. 4b), werden orthogonaal gevalideerd door gepaarde tumor-normale WGS, capture-sequencing, RT-PCR en/of FISH. Ze dienen daarom als een goede benchmark voor detectie van driverfusies, de meest voorkomende use case voor fusiedetectie met behulp van RNA-seq. De driverfusies kunnen worden ingedeeld in 4 categorieën op basis van genomische kenmerken en expressiestatus: (1) sterk tot expressie gebrachte chimere exon-naar-exon-fusies met FPKM > 5 voor het N-terminuspartnergen (N = 112) (2) laag tot expressie gebrachte chimere fusies (N = 18) (3) niet-canonieke fusies (N = 36), gedefinieerd door een van de fusie-onderbrekingspunten die zich in een niet-coderend gebied bevindt en die voornamelijk versterkerkapinggebeurtenissen vertegenwoordigt en (4) ITD's (N = 18).

Vergelijking van CICERO met andere methoden voor detectie van driverfusie. een Verdeling van leukemie, solide tumor en hersentumor in de 170 RNA-seq gebruikt voor benchmarktest. B Prevalentie van terugkerende (≥ 3) genfusies in de benchmarkdatasets gestratificeerd volgens de volgende vier klassen: chimeer transcript veroorzaakt door exon-naar-exon fusie uitgedrukt op hoog (> 5 FPKM) of laag niveau, interne tandemduplicatie (ITD), en andere niet-canonieke fusies waarbij intronische of intergene regio's betrokken zijn. C Vergelijking van de gevoeligheid (bovenste paneel) en rangschikking van de driverfusies tussen alle voorspelde fusies (onderste paneel) door CICERO en vijf andere methoden (ChimeraScan, deFuse, FusionCatcher, STAR-Fusion en Arriba) in de vier categorieën van driverfusie. De rangschikking door CICERO, gelabeld CICERO_raw, is alleen gebaseerd op de fusiescore zonder overeenkomsten met bekende fusiestatus op te nemen. Foutbalken die de standaarddeviatie van detectiegevoeligheid aan het bovenste paneel vertegenwoordigen, werden berekend door het bootstrappen van monsters met 100 iteraties. NS True positives (donkerblauw) en false positives (lichtblauw) van voorspelde somatische fusies geïdentificeerd door CICERO en andere fusiedetectieprogramma's. Het exacte aantal gebeurtenissen is gemarkeerd als (true positieve/totale voorspelling) onder de naam van elke methode. De hoogwaardige voorspellingen van CICERO worden vergeleken met die van STAR-fusion en Arriba (linkerpaneel), terwijl alle CICERO-voorspellingen worden vergeleken met die van FusionCatcher, deFuse en ChimeraScan (rechterpaneel)

We vergeleken de prestaties van CICERO met vijf populaire fusiedetectiemethoden: ChimeraScan [17], deFuse [16], FusionCatcher [18], STAR-Fusion [19] en Arriba [24]. Al deze methoden produceren grote aantallen voorspellingen die echte genfusies omvatten, evenals valse positieven veroorzaakt door het in kaart brengen van ambiguïteit in repetitieve regio's, transcriptionele read-through [25, 26] en andere artefacten. Daarom hebben we de prestaties geëvalueerd op basis van de detectiegevoeligheid, de rangschikking van driverfusies onder alle voorspellingen per algoritme (aanvullend bestand 2: tabel S2) en de fout-positieve snelheid van alle voorspelde fusies. Om een ​​eerlijke vergelijking te garanderen, hebben we de CICERO-ranglijst gebruikt die alleen is gebaseerd op de fusiescore (aangeduid als CICERO_raw), die geen op kennis gebaseerde kwaliteitsgraad omvat. Gebeurtenissen die zijn getagd als read-through worden beschouwd als artefacten en dus uitgesloten in alle methoden behalve voor Arriba, aangezien read-through-gebeurtenissen die zijn getagd door Arriba sterk tot expressie gebrachte oncogene fusies bevatten (bijv. PR2Y8-CRLF2).

CICERO detecteerde 95% van de driverfusies met een gemiddelde ranking van 1,9, terwijl ChimeraScan, deFuse, FusionCatcher, STAR-Fusion en Arriba slechts 63%, 66%, 77%, 63% en 78% detecteerden met een gemiddelde ranking van 37.0, 9.0, 18.1, 4.4 en 2.9, respectievelijk (Extra bestand 2: Tabel S2). In de categorie van canonieke exon-naar-exon chimere fusie is de detectiesnelheid over het algemeen hoog bij alle methoden voor sterk tot expressie gebrachte fusies (variërend van 88-100%, figuur 4c) maar laag voor de laag tot expressie gebrachte chimere fusies (variërend van 22-56). %, afb. 4c). In de categorie van niet-canonieke fusies detecteerde CICERO alle 36 gebeurtenissen, terwijl de andere methoden (ChimeraScan, deFuse, FusionCatcher, STAR-Fusion, Arriba) respectievelijk 6, 13, 23, 4 en 22 detecteerden (Fig. 4c) . In drie gevallen werden driverfusies zoals IGH-EPOR en IGH-CRLF2 exclusief gedetecteerd door CICERO (Aanvullend bestand 2: Tabel S2). Van de 18 ITD-gebeurtenissen in FLT3 of FGFR1 kon CICERO er 17 detecteren (figuur 4c). Geen van de andere vijf methoden ondersteunt ITD-detectie.

Om de fout-positieve snelheid van alle voorspelde fusies te evalueren, beschouwden we RNA-fusies die overeenkomen met somatische structurele variaties die zijn afgeleid van gepaarde tumor-normale DNA WGS-gegevens, beschikbaar voor 80 monsters, als echte positieven (methoden). De gedetecteerde driverfusies zijn door CICERO allemaal geclassificeerd als van hoge kwaliteit. Daarom hebben we hoogwaardige voorspellingen door CICERO vergeleken met oproepen van STAR-Fusion en Arriba, omdat deze methoden relatief weinig genfusies voorspelden. Fusievoorspellingen van ChimeraScan, deFuse en FusionCatcher werden vergeleken met alle CICERO-aanroepen. Voor voorspellingen van hoge kwaliteit is het percentage valse positieven van CICERO, STAR-fusion en Arriba respectievelijk 78%, 91% en 82% (Fig. 4d, linkerpaneel Aanvullend bestand 3). Wanneer zowel voorspellingen van hoge als lage kwaliteit in aanmerking worden genomen, is het percentage valse positieven van CICERO, FusionCatcher, deFuse en ChimeraScan respectievelijk 95%, 97%, 95%, 99% (Fig. 4d, rechterpaneel Aanvullend bestand 3).

CICERO-analyse van RNA-seq bij volwassen kanker

We hebben CICERO uitgevoerd, gevolgd door handmatige curatie met behulp van FusionEditor op RNA-seq-gegevens van The Cancer Genome Atlas Glioblastoma Multiforme (TCGA-GBM), waaronder 167 volwassen GBM-patiëntenmonsters (aanvullend bestand 2: tabel S3) en vergeleken de resultaten met de gerapporteerde genfusies door het TCGA Research Network [27]. We concentreerden ons op de genfusies waarbij ten minste één partnergen was opgenomen in COSMIC's kankergentelling [28]. Van de 40 kankergen-gerelateerde fusies gerapporteerd door TCGA, detecteerde CICERO er 33, waaronder EGFR-SEPT14, FGFR3-TACC3 en NAA30-TERT (aanvullend bestand 2: tabel S4).

Nog eens 141 kankergengerelateerde fusies die door CICERO werden gedetecteerd, werden niet gerapporteerd door het TCGA Research Network, waarvan 60 betrekking hadden op EGFR, een van de meest gemuteerde genen in GBM [27]. De extra EGFR-fusies omvatten één ITD (TCGA-27-2523) die het tyrosinekinasedomein (TKD) dupliceert dat wordt gecodeerd door exons 18-25, overeenkomend met een eerder gerapporteerde TKD-duplicatie in twee glioomcellijnen [29]. De resterende EGFR-fusies komen voort uit intra-chromosomale herschikkingen in regio's van 70 Kb tot 30 Mb verwijderd van EGFR of inter-chromosomale translocaties (aanvullend bestand 2: tabel S5). De meest voorkomende gebeurtenis, in totaal 39 fusies in 21 monsters, veroorzaakt afknotting van het C-terminale autofosforyleringsdomein dat wordt gecodeerd door exons 25-28 (figuur 5a). C-terminaal verlies is ook de meest voorkomende EGFR-fusie die is gerapporteerd door TCGA, al deze werden ook gedetecteerd door CICERO. In sommige gevallen kunnen meerdere fusietranscripten die leiden tot EGFR C-terminale afknotting worden gedetecteerd in hetzelfde tumormonster, wat wijst op mogelijke klonale heterogeniteit [30]. Er werden bijvoorbeeld vijf fusietranscripten die EGFR C-terminale afknotting veroorzaakten voorspeld door CICERO in monster TCGA-06-2557 (aanvullend bestand 1: figuur S4). Terwijl een van deze vijf fusies, een in-frame EGFR-SEPT14 [27] fusie met 8 ondersteunende uitlezingen, eerder werd gerapporteerd door TCGA Research Network, werden de resterende vier fusies, waaronder de overheersende out-of-frame EGFR-SDK1-fusie met een totaal van 357 fusie-positieve uitlezingen, werden niet gerapporteerd. In totaal herbergt 13% van de TCGA-monsters fusies die C-terminale afknottingen kunnen veroorzaken, een veel hogere snelheid dan de 4% (7 gevallen) die is gedetecteerd door het TCGA Research Network [27].

Voorbeelden van aanvullende fusies geïdentificeerd door CICERO uit het TCGA-GBM-cohort. Het eiwitdomein van het kankergen dat bij een fusie betrokken is, wordt gelabeld door een gekleurde legende. een Vergelijking van genfusies die leiden tot inkorting van het EGFR C-terminale autofosforyleringsdomein dat alleen door CICERO is ontdekt met die welke zijn gerapporteerd door zowel CICERO als het TCGA Research Network. Sites gemarkeerd als "Closs" verwijzen naar out-of-frame C-terminale truncatiefusies, terwijl die gemarkeerd met een gensymbool verwijzen naar in-frame fusies. B Genfusies die waarschijnlijk kinase-activering veroorzaken. Voor de KLHL7-BRAF-fusie hebben we het eiwit geselecteerd dat wordt gecodeerd door de KLHL7 korte isovorm NM_001172428 omdat het fusiebreekpunt optrad bij het laatste exon dat uniek is voor dit transcript. C CCDC127-TERT-fusie in TCGA-06-2564 leidt tot overexpressie van TERT. Rechterpaneel toont de FPKM-waarde van CCDC127 en TERT van het gehele GBM-cohort met de rode stip die het fusiemonster TCGA-06-2564 markeert

Opmerkelijke voorbeelden van niet-EGFR-fusies die niet door TCGA zijn gerapporteerd, zijn onder meer drie in-frame kinasefusies, dwz KLHL7-BRAF, CEP85L-ROS1 en TMEM165-PDGFRA (Fig. 5b), en een CCDC127-TERT-fusie (Fig. 5c) . De drie kinasefusies behouden allemaal het kinasedomein (Fig. 5b). Hoewel KLHL7-BRAF niet eerder in GBM is gemeld, werd het wel gedetecteerd in papillair schildkliercarcinoom [31]. CEP85L-ROS1 en TMEM165-PDGFRA werden gerapporteerd door een eerdere studie die het landschap van kinasefusies bij kanker definieert [32]. De CCDC127-TERT-fusie leidde tot activering van TERT-expressie aangezien het fusie-positieve monster (TCGA-06-2564) de op één na hoogste TERT-expressie heeft van het gehele TCGA-cohort (figuur 5c). Deze fusie werd ook gerapporteerd in een eerdere studie die het landschap van met kanker geassocieerde transcriptfusies onderzocht [10].


Referenties

Palade, G.E. Een elektronenmicroscoopstudie van de mitochondriale structuur. J. Histochem. Cytochem. 1, 188–211 (1953).

Bereiter-Hahn, J. Gedrag van mitochondriën in de levende cel. Int. Rev. Cytol. 122, 1–63 (1990).

Skulachev, V. P. Mitochondriale filamenten en clusters als intracellulaire stroomoverdragende kabels. TrendsBiochem. Wetenschap. 26, 23–29 (2001).

Collins, T.J., Berridge, M.J., Lipp, P. & Bootman, M.D. Mitochondria zijn morfologisch en functioneel heterogeen in cellen. EMBO J. 21, 1616–1627 (2002).

Detmer, S.A. & Chan, D.C. Functies en disfuncties van mitochondriale dynamiek. Natuur Ds. Mol. Cel Biol. 8, 870–879 (2007).

Hoppins, S., Lackner, L. & Nunnari, J. De machines die mitochondriën verdelen en samensmelten. Ann. ds. Biochem. 76, 751–780 (2007).

Okamoto, K. & Shaw, J. M. Mitochondriale morfologie en dynamiek in gist en meercellige eukaryoten. Ann. Rev. Genet. 39, 503–536 (2005).

Martens, S. & McMahon, H. T. Mechanismen van membraanfusie: ongelijksoortige spelers en gemeenschappelijke principes. Natuur Ds. Mol. Cel Biol. 9, 543–556 (2008).

Hales, K.G. & Fuller, M.T. Ontwikkelingsgereguleerde mitochondriale fusie gemedieerd door een geconserveerde, nieuwe, voorspelde GTPase. Cel 90, 121–129 (1997). Rapporteert de identificatie van de eerste bekende mediator van mitochondriale fusie en beschrijft tegelijkertijd de rol van fusie bij het hermodelleren van mitochondriën tijdens spermatogenese.

Rapaport, D., Brunner, M., Neupert, W. & Westermann, B. Fzo1p is een mitochondriaal buitenmembraaneiwit dat essentieel is voor de biogenese van functionele mitochondriën in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 273, 20150–20155 (1998).

Hermann, G.J. et al. Mitochondriale fusie in gist vereist de transmembraan GTPase Fzo1p. J. Cell Biol. 143, 359–373 (1998).

Kanazawa, T. et al. De C. elegans Opa1 homoloog EAT-3 is essentieel voor resistentie tegen vrije radicalen. PLoS Genet. 4, e1000022 (2008).

Santel, A. & Fuller, M. T. Controle van mitochondriale morfologie door een humaan mitofusine. J. Cel Wetenschap. 114, 867–874 (2001).

Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W. & Westermann, B. Verbinding van de mitochondriale buiten- en binnenmembranen door Fzo1 is van cruciaal belang voor organellaire fusie. J. Cell Biol. 152, 683–692 (2001).

Rojo, M., Legros, F., Chateau, D. & Lombes, A. Membraantopologie en mitochondriale targeting van mitofusinen, alomtegenwoordige zoogdierhomologen van de transmembraan GTPase Fzo. J. Cel Wetenschap. 115, 1663–1674 (2002).

Meeusen, S. et al. Mitochondriale fusie van het binnenmembraan en crista-onderhoud vereist het dynamin-gerelateerde GTPase Mgm1. Cel 127, 383–395 (2006).

Herlan, M., Vogel, F., Bornhövd, C., Neupert, W. & Reichert, A. S. Verwerking van Mgm1 door het rhomboid-type protease Pcp1 is vereist voor het onderhoud van de mitochondriale morfologie en van mitochondriaal DNA. J. Biol. Chem. 278, 27781–27788 (2003).

McQuibban, G.A., Saurya, S. & Freeman, M. Mitochondriale membraanremodellering gereguleerd door een geconserveerd ruitvormig protease. Natuur 423, 537–541 (2003).

Cipolat, S., Martins de Brito, O., Dal Zilio, B. & Scorrano, L. OPA1 vereist mitofusine 1 om mitochondriale fusie te bevorderen. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 101, 15927–15932 (2004).

Yarosh, W. et al. De moleculaire mechanismen van OPA1-gemedieerde optische atrofie in Drosophila model en vooruitzichten voor behandeling met antioxidanten. PLoS Genet. 4, e6 (2008).

Cipolat, S. et al. Mitochondriale ruitvormige PARL reguleert cytochroom C afgifte tijdens apoptose via OPA1-afhankelijke cristae-remodellering. Cel 126, 163–175 (2006).

Griparic, L., Kanazawa, T. & van der Bliek, A. M. Regulatie van het mitochondriale dynamin-achtige eiwit Opa1 door proteolytische splitsing. J. Cell Biol. 178, 757–764 (2007).

Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T. & Mihara, K. Regulatie van mitochondriale morfologie door proteolytische splitsing van OPA1. EMBO J. 25, 2966–2977 (2006).

Ehses, S. et al. Regulatie van OPA1-verwerking en mitochondriale fusie door m-AAA-protease-iso-enzymen en OMA1. J. Cell Biol. 187, 1023–1036 (2009).

Song, Z., Chen, H., Fiket, M., Alexander, C. & Chan, D.C. OPA1-verwerking regelt mitochondriale fusie en wordt gereguleerd door mRNA-splitsing, membraanpotentiaal en Yme1L. J. Cell Biol. 178, 749–755 (2007).

Head, B., Griparic, L., Amiri, M., Gandre-Babbe, S. & van der Bliek, A. M. Induceerbare proteolytische inactivatie van OPA1 gemedieerd door de OMA1-protease in zoogdiercellen. J. Cell Biol. 187, 959–966 (2009).

Wong, E.D. et al. De dynamin-gerelateerde GTPase, Mgm1p, is een intermembraan ruimte-eiwit dat nodig is voor het onderhoud van fusie-competente mitochondriën. J. Cell Biol. 151, 341–352 (2000).

Chen, H. et al. Mitofusins ​​Mfn1 en Mfn2 reguleren de mitochondriale fusie gecoördineerd en zijn essentieel voor de embryonale ontwikkeling. J. Cell Biol. 160, 189–200 (2003). Toont aan dat beide mitofusine-isovormen van zoogdieren nodig zijn om mitochondriale fusie te bevorderen en essentiële onderdelen te spelen in de ontwikkeling.

Olichon, A. et al. Verlies van OPA1 verstoort de mitochondriale binnenmembraanstructuur en integriteit, wat leidt tot cytochroom C afgifte en apoptose. J. Biol. Chem. 278, 7743–7746 (2003).

Meeusen, S., McCaffery, J. M. & Nunnari, J. Mitochondriale fusie-tussenproducten onthuld in vitro. Wetenschap 305, 1747–1752 (2004). beschrijft een in vitro test die werd gebruikt om verschillende stappen van mitochondriale dubbelmembraanfusie te ontleden.

Koshiba, T. et al. Structurele basis van mitochondriale tethering door mitofusinecomplexen. Wetenschap 305, 858–862 (2004).

DeVay, R.M. et al. Coassemblage van Mgm1-isovormen vereist cardiolipine en bemiddelt mitochondriale binnenmembraanfusie. J. Cell Biol. 186, 793–803 (2009).

Malka, F. et al. Afzonderlijke fusie van buitenste en binnenste mitochondriale membranen. EMBO-rep. 6, 853–859 (2005).

Sesaki, H. & Jensen, R.E. UGO1 codeert voor een buitenmembraaneiwit dat nodig is voor mitochondriale fusie. J. Cell Biol. 152, 1123–1134 (2001).

Hoppins, S., Horner, J., Song, C., McCaffery, J.M. & Nunnari, J. Mitochondriale buiten- en binnenmembraanfusie vereist een gemodificeerd dragereiwit. J. Cell Biol. 184, 569–581 (2009).

Sesaki, H. & Jensen, R. E. Ugo1p verbindt de Fzo1p en Mgm1p GTPases voor mitochondriale fusie. J. Biol. Chem. 279, 28298–28303 (2004).

Praefcke, G. J. & McMahon, H. T. De dynamin-superfamilie: universele membraantubulatie en splijtingsmoleculen? Natuur Ds. Mol. Cel Biol. 5, 133–147 (2004).

Smirnowa, E., Shurland, D.L., Ryazantsev, S.N. & van der Bliek, A.M. Een menselijk dynamin-gerelateerd eiwit regelt de distributie van mitochondriën. J. Cell Biol. 143, 351–358 (1998).

Otsuga, D. et al. De dynamin-gerelateerde GTPase, Dnm1p, regelt de mitochondriale morfologie in gist. J. Cell Biol. 143, 333–349 (1998).

Mozdy, A., McCaffery, J.M. & Shaw, J.M. Dnm1p GTPase-gemedieerde mitochondriale fusie is een meerstapsproces dat de nieuwe integrale membraancomponent Fis1p vereist. J. Cell Biol. 151, 367–379 (2000).

Tieu, Q. & Nunnari, J. Mdv1p is een WD-herhalingseiwit dat interageert met het dynamin-gerelateerde GTPase, Dnm1p, om mitochondriale deling te activeren. J. Cell Biol. 151, 353–365 (2000).

Zhang, Y. & Chan, D.C. Structurele basis voor rekrutering van mitochondriale splijtingscomplexen door Fis1. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 104, 18526–18530 (2007).

Tieu, Q., Okreglak, V., Naylor, K. & Nunnari, J. Het WD-repeat-eiwit, Mdv1p, functioneert als een moleculaire adapter door interactie met Dnm1p en Fis1p tijdens mitochondriale splitsing. J. Cell Biol. 158, 445–452 (2002).

Lackner, L.L., Horner, J.S. & Nunnari, J. Mechanistische analyse van een dynamin-effector. Wetenschap 325, 874–877 (2009).

Ingerman, E. et al. Dnm1 vormt spiralen die structureel zijn afgestemd op mitochondriën. J. Cell Biol. 170, 1021–1027 (2005). Referenties 44 en 45 rapporteren in vitro studies die mechanistische inzichten bieden in de zelfassemblage van Dnm1 in spiraalvormige structuren waarvan wordt gedacht dat ze membraansplitsing veroorzaken.

Griffin, E.E., Graumann, J. & Chan, D.C. Het WD40-eiwit Caf4p is een onderdeel van de mitochondriale splijtingsmachinerie en rekruteert Dnm1p naar mitochondriën. J. Cell Biol. 170, 237–248 (2005).

Schauss, A.C., Bewersdorf, J. & Jakobs, S. Fis1p en Caf4p, maar niet Mdv1p, bepalen de polaire lokalisatie van Dnm1p-clusters op het mitochondriale oppervlak. J. Cel Wetenschap. 119, 3098–3106 (2006).

Dimmer, K.S. et al. Genetische basis van mitochondriale functie en morfologie in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cel 13, 847–853 (2002). Beschrijft een systematisch, genoombreed scherm in gist dat leidde tot de ontdekking van verschillende genen die de mitochondriale dynamiek beïnvloeden, waaronder MDM30, MDM33, MDM36, NUM1 en PCP1.

Cerveny, K.L., Studer, S.L., Jensen, R.E. & Sesaki, H. De mitochondriale verdeling en distributie van gist vereisen het corticale Num1-eiwit. ontwikkelaar Cel 12, 363–375 (2007).

Hammermeister, M., Schödel, K. & Westermann, B. Mdm36 is een mitochondriaal splijtingsbevorderend eiwit in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cel 21, 2443–2452 (2010).

Roux, A., Uyhazi, K., Frost, A. & De Camilli, P. GTP-afhankelijke verdraaiing van dynamine impliceert vernauwing en spanning bij membraansplitsing. Natuur 441, 528–531 (2006).

Yoon, Y., Krueger, E.W., Oswald, B.J. & McNiven, M.A. Het mitochondriale eiwit hFis1 reguleert mitochondriale splijting in zoogdiercellen door een interactie met het dynamin-achtige eiwit DLP1. Mol. Cel. Biol. 23, 5409–5420 (2003).

James, D.I., Parone, P.A., Mattenberger, Y. & Martinou, J.C. hFis1, een nieuw onderdeel van de mitochondriale splijtingsmachinerie van zoogdieren. J. Biol. Chem. 278, 36373–36379 (2003).

Lee, Y.J., Jeong, S.Y., Karbowski, M., Smith, C.L. & Youle, R.J. Rollen van de mitochondriale splijting en fusiemediatoren Fis1, Drp1 en Opa1 bij apoptose bij zoogdieren. Mol. Biol. Cel 15, 5001–5011 (2004).

Breckenridge, D.G. et al. Caenorhabditis elegans drp-1 en fis-2 reguleren verschillende celdood-uitvoeringsroutes stroomafwaarts van ced-3 en onafhankelijk van ced-9. Mol. Cel 31, 586–597 (2008).

Gandre-Babbe, S. & van der Bliek, A. M. Het nieuwe aan de staart verankerde membraaneiwit Mff regelt mitochondriale en peroxisomale splijting in zoogdiercellen. Mol. Biol. Cel 19, 2402–2412 (2008).

Labrousse, A.M., Zappaterra, M.D., Rube, D.A. & van der Bliek, A.M. C. elegans dynamine-gerelateerd eiwit DRP-1 regelt het doorsnijden van het mitochondriale buitenmembraan. Mol. Cel 4, 815–826 (1999).

Legesse-Miller, A., Massol, R.H. & Kirchhausen, T. Constrictie en Dnm1p-rekrutering zijn verschillende processen bij mitochondriale splijting. Mol. Biol. Cel 14, 1953–1963 (2003).

Jakobs, S. et al. Ruimtelijke en temporele dynamiek van ontluikende gist-mitochondriën zonder de delingscomponent Fis1p. J. Cel Wetenschap. 116, 2005–2014 (2003).

Messerschmitt, M. et al. Het binnenmembraaneiwit Mdm33 regelt de mitochondriale morfologie in gist. J. Cell Biol. 160, 553–564 (2003).

Tondera, D. et al. Het mitochondriale eiwit MTP18 draagt ​​bij aan mitochondriale splijting in zoogdiercellen. J. Cel Wetenschap. 118, 3049–3059 (2005).

Sesaki, H. & Jensen, R.E. Divisie versus fusie: Dnm1p en Fzo1p reguleren antagonistisch de mitochondriale vorm. J. Cell Biol. 147, 699–706 (1999).

Bleazard, W. et al. De dynamin-gerelateerde GTPase Dnm1 reguleert mitochondriale splijting in gist. Natuur Cel Biol. 1, 298–304 (1999). Referenties 62 en 63 laten in gist zien dat fusie en splijting antagonistische en evenwichtige activiteiten zijn die beide nodig zijn voor het in stand houden van de mitochondriale morfologie.

Fritz, S., Weinbach, N. & Westermann, B. Mdm30 is een F-box-eiwit dat nodig is voor het onderhoud van fusie-competente mitochondriën in gist. Mol. Biol. Cel 14, 2303–2313 (2003).

Cohen, M.M., Leboucher, G.P., Livnat-Levanon, N., Glickman, M.H. & Weissman, A.M. Ubiquitine-proteasoom-afhankelijke afbraak van een mitofusine, een kritische regulator van mitochondriale fusie. Mol. Biol. Cel 19, 2457–2464 (2008).

Amiott, E.A., Cohen, M.M., Saint-Georges, Y., Weissman, A.M. & Shaw, J.M. Een mutatie geassocieerd met CMT2A-neuropathie veroorzaakt defecten in Fzo1 GTP-hydrolyse, ubiquitylering en eiwitomzetting. Mol. Biol. Cel 20, 5026–5035 (2009).

Herlan, M., Bornhövd, C., Hell, K., Neupert, W. & Reichert, A. S. Alternatieve topogenese van Mgm1 en mitochondriale morfologie zijn afhankelijk van ATP en een functionele importmotor. J. Cell Biol. 165, 167–173 (2004). Formulering van een aantrekkelijke hypothese die suggereert dat alternatieve verwerking van Mgm1 mitochondriale fusiesnelheden zou kunnen aanpassen aan matrix ATP-niveaus.

Baricault, L. et al. OPA1-splitsing hangt af van verlaagd mitochondriaal ATP-niveau en bivalente metalen. Exp. Cel res. 313, 3800–3808 (2007).

Nakamura, N., Kimura, Y., Tokuda, M., Honda, S. & Hirose, S. MARCH-V is een nieuw mitofusine 2- en Drp1-bindend eiwit dat de mitochondriale morfologie kan veranderen. EMBO-rep. 7, 1019–1022 (2006).

Karbowski, M., Neutzner, A. & Youle, R.J. Het mitochondriale E3-ubiquitine-ligase MARCH5 is vereist voor Drp1-afhankelijke mitochondriale deling. J. Cell Biol. 178, 71–84 (2007).

Yonashiro, R. et al. Een nieuw mitochondriaal ubiquitine-ligase speelt een cruciale rol in de mitochondriale dynamiek. EMBO J. 25, 3618–3626 (2006).

Park, Y. Y. et al. Verlies van MARCH5 mitochondriaal E3 ubiquitine ligase induceert cellulaire veroudering door dynamine-gerelateerd eiwit 1 en mitofusine 1. J. Cel Wetenschap. 123, 619–626 (2010).

Braschi, E., Zunino, R. & McBride, H. M. MAPL is een nieuwe mitochondriale SUMO E3-ligase die mitochondriale splijting reguleert. EMBO-rep. 10, 748–754 (2009).

Zunino, R., Schauss, A., Rippstein, P., Andrade-Navarro, M. & McBride, H. M. De SUMO-protease SENP5 is vereist om de mitochondriale morfologie en functie te behouden. J. Cel Wetenschap. 120, 1178–1188 (2007).

Taguchi, N., Ishihara, N., Jofuku, A., Oka, T. & Mihara, K. Mitotische fosforylering van dynamin-gerelateerde GTPase Drp1 neemt deel aan mitochondriale splijting. J. Biol. Chem. 282, 11521–11529 (2007).

Cribbs, J. T. & Strack, S. Omkeerbare fosforylering van Drp1 door cyclisch AMP-afhankelijk proteïnekinase en calcineurine reguleert mitochondriale splijting en celdood. EMBO-rep. 8, 939–944 (2007).

Han, X.J. et al. CaM-kinase I α-geïnduceerde fosforylering van Drp1 reguleert de mitochondriale morfologie. J. Cell Biol. 182, 573–585 (2008).

Cereghetti, G.M. et al. Defosforylatie door calcineurine reguleert de translocatie van Drp1 naar mitochondriën. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 105, 15803–15808 (2008).

Eura, Y., Ishihara, N., Oka, T. & Mihara, K. Identificatie van een nieuw eiwit dat mitochondriale fusie reguleert door de eiwitfunctie van mitofusine (Mfn) te moduleren. J. Cel Wetenschap. 119, 4913–4925 (2006).

Liesa, M. et al. Mitochondriale fusie wordt verhoogd door de nucleaire co-activator PGC-1β. PLoS One 3, e3613 (2008).

Karbowski, M., Norris, K.L., Cleland, M.M., Jeong, S.Y. & Youle, R.J. De rol van Bax en Bak in mitochondriale morfogenese. Natuur 443, 658–662 (2006).

Chen, X. J. & Butow, R. A. De organisatie en overerving van het mitochondriale genoom. Natuur Rev. Genet. 6, 815–825 (2005).

Pfanner, N. & Geissler, A. Veelzijdigheid van de mitochondriale eiwitimportmachines. Natuur Ds. Mol. Cel. Biol. 2, 339–349 (2001).

Neupert, W. & Herrmann, J. M. Translocatie van eiwitten naar mitochondriën. Ann. ds. Biochem. 76, 723–749 (2007).

Ishihara, N. et al. Mitochondriale splijtingsfactor Drp1 is essentieel voor de embryonale ontwikkeling en synapsvorming bij muizen. Natuur Cel Biol. 11, 958–966 (2009).

Altmann, K., Frank, M., Neumann, D., Jakobs, S. & Westermann, B. Het klasse V-myosinemotoreiwit, Myo2, speelt een belangrijke rol bij de mitochondriale motiliteit in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 181, 119–130 (2008).

Wakabayashi, J. et al. De dynamin-gerelateerde GTPase Drp1 is vereist voor de embryonale en hersenontwikkeling bij muizen. J. Cell Biol. 186, 805–816 (2009). Referenties 85 en 87 laten zien dat DRP1-afhankelijke splijting en distributie van mitochondriën essentieel is in de embryonale en hersenontwikkeling bij muizen.

Merz, S. & Westermann, B. Genoombrede deletiemutantanalyse onthult genen die nodig zijn voor ademhalingsgroei, mitochondriaal genoomonderhoud en mitochondriale eiwitsynthese in Saccharomyces cerevisiae. Genoom Biol. 10, R95 (2009).

Chen, H., Chomyn, A. & Chan, D.C. Verstoring van fusie resulteert in mitochondriale heterogeniteit en disfunctie. J. Biol. Chem. 280, 26185–26192 (2005).

Chen, H., McCaffery, J.M. & Chan, D.C. Mitochondriale fusie beschermt tegen neurodegeneratie in het cerebellum. Cel 130, 548–562 (2007).

Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y. & Sheng, M. Het belang van dendritische mitochondriën in de morfogenese en plasticiteit van stekels en synapsen. Cel 119, 873–887 (2004). Referenties 90 en 91 laten zien dat mitochondriale dynamiek cruciaal is voor neuronale ontwikkeling en functie.

Amchenkova, A.A., Bakeeva, L.E., Chentsov, Y.S., Skulachev, V.P. & Zorov, D.B. Koppelingsmembranen als energieoverdragende kabels. I. Filamenteuze mitochondriën in fibroblasten en mitochondriale clusters in cardiomyocyten. J. Cell Biol. 107, 481–495 (1988).

Tondera, D. et al. SLP-2 is vereist voor door stress geïnduceerde mitochondriale hyperfusie. EMBO J. 28, 1589–1600 (2009).

Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G. & Lippincott-Schwartz, J. Een hyperfused mitochondriale toestand bereikt op G1-S reguleert de opbouw van cycline E en binnenkomst in de S-fase. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 106, 11960–11965 (2009).

Balaban, R. S., Nemoto, S. & Finkel, T. Mitochondria, oxidanten en veroudering. Cel 120, 483–495 (2005).

Ono, T., Isobe, K., Nakada, K. & Hayashi, J.I. Menselijke cellen worden beschermd tegen mitochondriale disfunctie door complementatie van DNA-producten in gefuseerde mitochondriën. Natuur Genet. 28, 272–275 (2001). Toont aan dat complementatie van genproducten in gefuseerde mitochondriën de ademhalingsactiviteit in heteroplasmatische cellen herstelt.

Nakada, K. et al. Inter-mitochondriale complementatie: mitochondria-specifiek systeem dat voorkomt dat muizen ziektefenotypen tot expressie brengen door mutant mtDNA. Natuur Med. 7, 934–940 (2001).

Chen, H. et al. Mitochondriale fusie is vereist voor mtDNA-stabiliteit in skeletspieren en tolerantie voor mtDNA-mutaties. Cel 141, 280–289 (2010). Toont aan dat mitochondriale fusie nodig is voor het behoud van functionele mitochondriën in spiercellen.

He, C. & Klionsky, D. J. Regulatiemechanismen en signaalroutes van autofagie. Ann. Rev. Genet. 43, 67–93 (2009).

Takje, G. et al. Fissie en selectieve fusie regelen mitochondriale segregatie en eliminatie door autofagie. EMBO J. 27, 433–446 (2008). Suggereert een functioneel verband tussen mitochondriale dynamiek en de verwijdering van aangetaste mitochondriën door mitofagie.

Youle, R. J. & Karbowski, M. Mitochondriale splijting bij apoptose. Natuur Ds. Mol. Cel Biol. 6, 657–663 (2005).

Suen, D.F., Norris, K.L. & Youle, R.J. Mitochondriale dynamiek en apoptose. Genen Dev. 22, 1577–1590 (2008).

Fannjiang, Y. et al. Mitochondriale splijtingseiwitten reguleren geprogrammeerde celdood in gist. Genen Dev. 18, 2785–2797 (2004).

Jagasia, R., Grote, P., Westermann, B. & Conradt, B. DRP-1-gemedieerde mitochondriale fragmentatie tijdens EGL-1-geïnduceerde celdood in C. elegans. Natuur 433, 754–760 (2005).

Goyal, G., Fell, B., Sarin, A., Youle, R.J. & Sriram, V. De rol van mitochondriale hermodellering bij geprogrammeerde celdood in Drosophila melanogaster. ontwikkelaar Cel 12, 807–816 (2007).

Frank, S. et al. De rol van dynamine-gerelateerd eiwit 1, een bemiddelaar van mitochondriale splijting, bij apoptose. ontwikkelaar Cel 1, 515–525 (2001). Eerste rapport dat een rol voor DRP1 bij apoptose aantoont.

Brooks, C. et al. Bak reguleert de mitochondriale morfologie en pathologie tijdens apoptose door interactie met mitofusinen. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 104, 11649–11654 (2007).

Karbowski, M. et al. Ruimtelijke en temporele associatie van Bax met mitochondriale splijtingsplaatsen, Drp1 en Mfn2 tijdens apoptose. J. Cell Biol. 159, 931–938 (2002).

Wasiak, S., Zunino, R. & McBride, H. M. Bax / Bak bevorderen sumoylatie van DRP1 en de stabiele associatie met mitochondriën tijdens apoptotische celdood. J. Cell Biol. 177, 439–450 (2007).

Knott, A. B., Perkins, G., Schwarzenbacher, R. & Bossy-Wetzel, E. Mitochondriale fragmentatie bij neurodegeneratie. Natuur Rev. Neurosci. 9, 505–518 (2008).

Alexander, C. et al. OPA1, dat codeert voor een dynamin-gerelateerde GTPase, is gemuteerd in autosomaal dominante atrofie gekoppeld aan chromosoom 3q28. Natuur Genet. 26, 211–215 (2000).

Delettre, C. et al. nucleair gen OPA1, dat codeert voor een mitochondriaal dynamin-gerelateerd eiwit, is gemuteerd in dominante optische atrofie. Natuur Genet. 26, 207–210 (2000).

Zuchner, S. et al. Mutaties in het mitochondriale GTPase mitofusine 2 veroorzaken Charcot-Marie-Tooth neuropathie type 2A. Natuur Genet. 36, 449–451 (2004).

Waterham, H.R. et al. Een dodelijk defect van mitochondriale en peroxisomale splijting. N. Engl. J. Med. 356, 1736–1741 (2007).

Narendra, D.P. et al. PINK1 wordt selectief gestabiliseerd op aangetaste mitochondriën om Parkine te activeren. PLoS Biol. 8, e1000298 (2010).

Matsuda, N. et al. PINK1 gestabiliseerd door mitochondriale depolarisatie werft Parkine aan voor beschadigde mitochondriën en activeert latente Parkine voor mitofagie. J. Cell Biol. 189, 211–221 (2010).

Deng, H., Dodson, M.W., Huang, H. & Guo, M. De genen voor de ziekte van Parkinson roze1 en parkin bevorderen mitochondriale splijting en/of remmen fusie in Drosophila. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 105, 14503–14508 (2008).

Yang, Y. et al. Pink1 reguleert de mitochondriale dynamiek door interactie met de splitsings- / fusiemachines. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 105, 7070–7075 (2008).

Ziviani, E., Tao, R.N. & Whitworth, A.J. Drosophila parkin vereist PINK1 voor mitochondriale translocatie en ubiquitineert mitofusine. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 107, 5018–5023 (2010).

Lutz, A.K. et al. Verlies van parkine- of PINK1-functie verhoogt de Drp1-afhankelijke mitochondriale fragmentatie. J. Biol. Chem. 284, 22938–22951 (2009).

Kuravi, K. et al. Dynamin-gerelateerde eiwitten Vps1p en Dnm1p controleren de overvloed aan peroxisoom in Saccharomyces cerevisiae. J. Cel Wetenschap. 119, 3994–4001 (2006).

Koch, A. et al. Dynamin-achtig eiwit 1 is betrokken bij peroxisomale splijting. J. Biol. Chem. 278, 8597–8605 (2003).

Koch, A., Yoon, Y., Bonekamp, ​​N.A., McNiven, M.A. & Schrader, M. Een rol voor Fis1 in zowel mitochondriale als peroxisomale splijting in zoogdiercellen. Mol. Biol. Cel 16, 5077–5086 (2005).

Neuspiel, M. et al. Vrachtgeselecteerd transport van de mitochondriën naar peroxisomen wordt gemedieerd door vesiculaire dragers. Curr. Biol. 18, 102–108 (2008).

Martins de Brito, O. & Scorrano, L. Mitofusin 2 bindt endoplasmatisch reticulum aan mitochondriën. Natuur 456, 605–610 (2008).

Hailey, D.W. et al. Mitochondriën leveren membranen voor autofagosoombiogenese tijdens uithongering. Cel 141, 656–667 (2010).

Altmann, K. & Westermann, B. De rol van essentiële genen in mitochondriale morfogenese in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cel 16, 5410–5417 (2005).

Arimura, S., Yamamoto, J., Aida, G.P., Nakazono, M. & Tsutsumi, N. Frequente fusie en splitsing van mitochondriën van planten met ongelijke nucleoïde distributie. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 101, 7805–7808 (2004).

Arimura, S. & Tsutsumi, N. Een dynamin-achtig eiwit (ADL2b), in plaats van FtsZ, is betrokken bij Arabidopsis mitochondriale deling. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 99, 5727–5731 (2002).

Logan, D.C., Scott, I. & Tobin, A.K. ADL2a is, net als ADL2b, betrokken bij de controle van de mitochondriale morfologie van hogere planten. J. Exp. Bot. 55, 783–785 (2004).

Scott, I., Tobin, A.K. & Logan, D.C. BIGYIN, een ortholoog van mens en gist FIS1 genen functies in de controle van mitochondriale grootte en aantal in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 57, 1275–1280 (2006).

Arimura, S. et al. Arabidopsis langwerpige mitochondria1 is vereist voor de lokalisatie van dynamine-gerelateerd eiwit 3a naar mitochondriale splijtingsplaatsen. Plantaardige cel 20, 1555–1566 (2008).

Beech, P.L. et al. Mitochondriale FtsZ in een chromofytische alg. Wetenschap 287, 1276–1279 (2000).

Takahara, M. et al. Een vermeende mitochondriale ftsZ gen is aanwezig in de eencellige primitieve rode alg Cyanidioschyzon merolae. Mol. Gen. Genet. 264, 452–460 (2000).


Verhoogde kinase-signalering

Interleukine 7 (IL7)-signalering is essentieel voor de normale ontwikkeling van T-cellen en wordt veroorzaakt door de interactie van IL7 met de heterodimere IL7-receptor (IL7R). Deze interactie induceert wederzijdse JAK1- en JAK3-fosforylering en daaropvolgende rekrutering en activering van STAT5. Na fosforylering dimeriseert STAT5 en verplaatst het zich naar de kern waar het de transcriptie van veel doelwitgenen reguleert, waaronder de anti-apoptotische B-cellymfoom 2 (BCL-2) familielideiwitten. 19,20 Naast de JAK/STAT-route worden de RAS-MAPK- en fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K)-routes ook geactiveerd door IL2, IL7 en stamcelfactor (SCF) die inwerken op de zich ontwikkelende T-cellen (Figuur 1 ).

Deregulering van de JAK-STAT-signaleringscascade in T-ALL. Vertegenwoordiging van de verschillende oncogene mechanismen die leiden tot afwijkende activering van de IL7-signalering in T-ALL. Interactie van IL7 met het heterodimere IL7R induceert wederzijdse JAK1- en JAK3-fosforylering en daaropvolgende rekrutering van STAT5. STAT5 dimeriseert en verplaatst zich naar de kern waar het transcriptie van de pro-overlevingsfactor BCL2 induceert. IL7 activeert ook de RAS-MAPK- en PI3K-kinaseroutes. IL7-signalering kan indirect worden versterkt door abnormale NOTCH1-signalering, constitutieve expressie van ZEB2 of door verhoogde presentatie van IL7R op het celoppervlak van thymocyten als gevolg van gestoorde clathrine-afhankelijke endocytose veroorzaakt door DNM2-mutaties. Veelbelovende therapeutische middelen die zich richten op de oncogene IL7-JAK-STAT-cascade zijn in rood aangegeven. * Eiwitten die zijn gemuteerd in T-ALL.

Deregulering van de JAK-STAT-signaleringscascade in T-ALL. Vertegenwoordiging van de verschillende oncogene mechanismen die leiden tot afwijkende activering van de IL7-signalering in T-ALL. Interactie van IL7 met het heterodimere IL7R induceert wederzijdse JAK1- en JAK3-fosforylering en daaropvolgende rekrutering van STAT5. STAT5 dimeriseert en verplaatst zich naar de kern waar het transcriptie van de pro-overlevingsfactor BCL2 induceert. IL7 activeert ook de RAS-MAPK- en PI3K-kinaseroutes. IL7-signalering kan indirect worden versterkt door abnormale NOTCH1-signalering, constitutieve expressie van ZEB2 of door verhoogde presentatie van IL7R op het celoppervlak van thymocyten als gevolg van gestoorde clathrine-afhankelijke endocytose veroorzaakt door DNM2-mutaties. Veelbelovende therapeutische middelen die zich richten op de oncogene IL7-JAK-STAT-cascade zijn in rood aangegeven. * Eiwitten die zijn gemuteerd in T-ALL.

Mutaties activeren in IL7R, JAK1, JAK3, en/of STAT5 zijn aanwezig in 20% tot 30% van de T-ALL-gevallen (Tabel 1), 4,21,22 met een hogere vertegenwoordiging binnen TLX+-, HOXA+- en ETP-ALL-patiëntensubgroepen (Figuur 2). 4,23 Een klein percentage van de gevallen vertoont ook afwijkingen in fosfatasen zoals PTPN2 en PTPRC, die onder andere JAK-kinasen defosforyleren en inactiveren. 24,25 Interessant is dat de IL7R-signaalcascade ook kan worden gehyperactiveerd bij patiënten die geen genetische afwijkingen hebben in de IL7R, JAKO, of STAT5 genen, wat aangeeft dat er nog andere mechanismen bestaan ​​om deze route te activeren. 26,27 Inderdaad, pas onlangs werd ontdekt dat functieverliesmutaties in DNM2 leiden tot een verhoogde presentatie van IL7R op het celoppervlak van thymocyten als gevolg van verminderde clathrine-afhankelijke endocytose. 26 Bovendien is recentelijk een zeldzame translocatie beschreven die gericht is op de zinkvinger E-box-bindende homeobox 2-locus (ZEB2) in T-ALL, en werd aangetoond dat overexpressie van Zeb2 de Il7r-expressie en Stat5-activering verhoogt, wat de overleving van T-ALL-cellen bevordert. in een muismodel. Hoewel de meeste mutaties lijken te resulteren in activering van JAK1 en JAK3, zijn er ook zeldzame fusietranscripten beschreven waarbij JAK2 betrokken is, en wildtype TYK2 kan een belangrijke rol spelen bij het activeren van overlevingsroutes van T-ALL-cellen. 28,29

Vertegenwoordiging van de samenwerking van oncogene gebeurtenissen. De belangrijkste subklassen van T-ALL worden weergegeven op basis van de expressie van de transcriptiefactoren TAL1, TLX1, TLX3, HOXA genen, NKX2-1, of LMO2/LYL1. Voor elke subklasse worden extra genen getoond die het vaakst gemuteerd zijn in die subklasse. Het PRC2-complex bevat EZH2, SUZ12 en EED.

Vertegenwoordiging van de samenwerking van oncogene gebeurtenissen. De belangrijkste subklassen van T-ALL worden weergegeven op basis van de expressie van de transcriptiefactoren TAL1, TLX1, TLX3, HOXA genen, NKX2-1, of LMO2/LYL1. Voor elke subklasse worden extra genen getoond die het vaakst gemuteerd zijn in die subklasse. Het PRC2-complex bevat EZH2, SUZ12 en EED.

Afwijkende activering van de PI3K-AKT-route resulteert in een verbeterd celmetabolisme, proliferatie en verminderde apoptose. 30,31 Hyperactivering van de oncogene PI3K-AKT-route in T-ALL wordt voornamelijk veroorzaakt door inactiverende mutaties of deleties van de fosfatase- en tensine-homoloog (PTEN), de belangrijkste negatieve regulator van de route. 22,32-36 Bovendien vertonen sommige T-ALL-gevallen gain-of-function-mutaties in respectievelijk de regulerende en katalytische subeenheden van PI3K, p85 en p110, of in de stroomafwaartse effectoren van de cascade zoals AKT en mechanistisch doelwit van rapamycine (mTOR) (Tabel 1). 22,35,37 PI3K-AKT-signaleringsactivering wordt ook bereikt door IL7-stimulatie of RAS-activering. 22,31,38 Een recent onderzoek naar 146 pediatrische T-ALL-gevallen beschreef dat bijna 50% van de patiënten ten minste 1 mutatie in de JAK-STAT-, PI3K-AKT- of RAS-MAPK-routes had, wat het belang van activering van die cascades voor de leukemische cellen. 22

Naast de activering van de JAK-kinasen of de PI3K-route, wordt activering van de ABL1-kinase waargenomen in maximaal 8% van de T-ALL-gevallen, waarbij 6% van de patiënten het NUP214-ABL1-fusie-eiwit tot expressie brengt. 39 NUP214-ABL1 is een constitutief actieve tyrosinekinase die STAT5 en de RAS-MAPK-route activeert, maar veel zwakker is in vergelijking met BCR-ABL1. 39,40 Interessant is dat de kinase-activiteit van NUP214-ABL1 afhankelijk is van de locatie in de kernporie 39,41 en dat de oncogene eigenschappen ervan afhangen van de interactie met MAD2L1, NUP155 en SMC4 en van de activiteit van de LCK, een lid van de SRC-familie kinase. 42 Alle gegevens die tot nu toe zijn verzameld, suggereren dat het NUP214-ABL1-fusiekinase een zwak oncogen is dat samenwerkt met aanvullende oncogene gebeurtenissen om de ontwikkeling van leukemie te stimuleren. In die zin is het van belang op te merken dat de NUP214-ABL1-fusie altijd samen met TLX1- of TLX3-expressie wordt gevonden en vaak wordt geassocieerd met verlies van PTPN2, een negatieve regulator van NUP214-ABL1. 25,39

RAS-activerende mutaties werden onlangs beschreven in 44% van de diagnose-recidief-monsterparen, wat wijst op een oververtegenwoordiging van deze defecten bij ALL met een hoog risico. Interessant is dat KRAS-mutaties lymfoblasten resistent maakten tegen methotrexaat, terwijl ze gevoelig werden voor vincristine. 43


Toegangsopties

Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

Alle prijzen zijn NET prijzen.
De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

Alle prijzen zijn NET prijzen.


INVOERING

Endocytose is het proces dat zoogdiercellen gebruiken voor de opname van essentiële moleculen uit hun externe omgeving. Dit materiaal wordt in de cellen opgenomen door vliezige blaasjes die afkomstig zijn van het plasmamembraan (endocytische blaasjes) en eenmaal geïnternaliseerd wordt het naar een systeem van interne blaasjes geleid dat endosomen wordt genoemd [1]. In endosomen wordt een aantal belangrijke sorteergebeurtenissen uitgevoerd, waaronder de scheiding en segregatie van het materiaal dat in de cel wordt opgenomen van de componenten van het endocytische blaasje. De laatstgenoemde componenten worden teruggevoerd (gerecycleerd) naar het plasmamembraan voor gebruik in volgende ronden van endocytose, terwijl het van endocytose voorziene materiaal meestal wordt gesorteerd in lysosomen. Het endosomale systeem is samengesteld uit een reeks afzonderlijke elementen, waarvan men denkt dat sommige sorteren (rab5-positieve endosomen) of recycling (rab11-positieve endosomen) activiteiten uitvoeren [2]. Late endosomen (rab7-positieve endosomen) lijken deel te nemen aan het routeren van materiaal dat bestemd is voor afbraak van het rab5-positieve sorteercompartiment naar het lysosomale compartiment.

Rab5 is een belangrijke regulator van vroege gebeurtenissen in endocytose en fagocytose [3, 4]. Overexpressie van wildtype rab5a of een constitutief geactiveerde rab5a-mutant die deficiënt is in GTP-hydrolyse (rab5a:Q79L) stimuleert maximaal endocytose in fibroblasten [5]. This stimulation is in part a result of increased endosome fusion because rab5 is rate limiting for in vitro endosome-endosome [6 ] as well as in vitro endosome-phagosome fusion [7 ]. Rab5 activation and endosome fusion are further linked by the observation that cells expressing rab5a:Q79L develop giant rab5a-positive endosomal vesicles [5, 8 ]. Time-lapse recordings of cells expressing rab5a:Q79L have shown that the giant vesicles arise primarily by fusion of smaller rab5a-positive endosomal vesicles [8 ]. These observations support the idea that the stimulation of endocytosis caused by rab5 activation is dependent upon an increase in the size of the endosomal compartment.

It is becoming clear that rab5a activity is linked to the activation of an H-ras-linked signal transduction pathway. It has long been known that expression of oncogenic H-ras stimulates endocytosis in cells [9 ] but only recently has this been directly linked to rab5 activation [11, 12 ]. Previous work in our laboratory has shown that fluid-phase endocytosis is stimulated after activation of a signal transduction cascade that includes H-ras, phosphoinositide-3-kinase and protein kinase B [101112 ]. Furthermore, the stimulation of endocytosis by this signal transduction pathway requires rab5 activation, since a dominant-negative rab5a mutant deficient in GTP binding (rab5a:S34N) blocks the stimulation of endocytosis by this signaling pathway. In fibroblasts expressing H-ras:G12V [12 ] in epidermal growth factor (EGF)-stimulated fibroblasts [13 ], the increase in endocytosis is similar to that observed after overexpression of rab5a:Q79L. The mechanisms by which H-ras:G12V or EGF stimulation result in stimulation of endocytosis are currently unknown. Furthermore, whether H-ras:G12V or EGF activation of rab5a in living cells is sufficient to result in the formation of giant GFP-rab5a:wt-positive endosomes is also not known. Further work is required to determine the identity of the molecules that link receptor activation and giant endosome formation.

In this report we have explored the dynamic changes in the structure and activity of the rab5a-positive endosomal and phagosomal compartments in living cells after activation by either expression of H-ras:G12V (or exposure to EGF) and rhodamine-Escherichia coli, respectievelijk. We used green fluorescent protein (GFP) tagged rab5a:wt and time-lapse confocal microscopy of living cells to examine the regulation of rab5a activation by H-ras:G12V and EGF. Rab5a activation by these agents results in the formation of giant GFP-rab5a:wt-positive vesicles and links stimulated endocytosis with enlargement of the early endosomal compartment. Furthermore, this approach has allowed real-time visualization of the changes in membrane dynamics that have been suggested by previous studies. In addition, the giant vesicles appeared to form by two distinct processes that include vesicle fusion and new vesicle (macropinosome) formation. These data illustrate the importance of rab5a:wt-mediated endosome fusion in stimulated endocytosis.


Discussie

It has been shown previously that functional yeast t-SNAREs marking the Golgi compartment, the plasma membrane, and the vacuole are each composed of a distinct heavy chain from the syntaxin family and, depending on the particular membrane, one or two nonsyntaxin light chains (Fukuda et al., 2000 McNew et al., 2000a Parlati et al., 2000). The architecture of the endosomal t-SNARE further establishes the generality of this concept with Tlg2p as the heavy chain and Tlg1p and Vti1p as its two light chains, respectively, functioning exclusively with Snc2p as its v-SNARE. Moreover, only one topological arrangement of these four proteins between two membranes results in a fusogenic complex, establishing their roles as t-SNARE and v-SNARE, and extending the concept of topological restriction (Parlati et al., 2000).

In yeast, the 21 SNARE proteins have been grouped into four different categories defined by the sequence homology in the SNARE motif: the syntaxins (Ufe1p, Sso1p, Sso2p, Sed5p, Pep12p, Tlg2p, and Vam3p), the Bet1p group (Sec9p-C, Spo20p-C, Vam7p, Bet1p, Sft1p, and Tlg1p), the Bos1p group (Sec9p-N, Spo20p-N, Vti1p, Bos1p, Gos1p, and Sec20p), and a fourth group termed R-SNAREs (Snc1p, Snc2p, Nyv1p, Sec22p, and Ykt6p) (Pelham, 2001 note Sec9p and Spo20p, like their animal homologue SNAP-25, have two SNARE motifs, C and N). All results to date indicate that fusogenic SNARE pins must contain one subunit from each group: t-Sso1p/Sec9p and v-Snc1p or v-Snc2p at the plasma membrane (McNew et al., 2000a) t-Sed5p/Sec22p,Bos1p and v-Bet1p at the Golgi compartment (Parlati et al., 2000) and t-Vam3p/Vam7p,Vti1p and v-Nyv1p at the vacuole (Fukuda et al., 2000). The endosomal t-SNARE also fits this rule, suggesting that it has a concrete structural basis which can be used to predict additional fusogenic SNARE complexes. However, the unique v-SNARE within a particular complex (i.e., based on topological restriction) can be drawn either from the R-SNARE group (Snc1p or Snc2p, Nyv1p) or from the Bet1p group (Bet1p, Sft1p) and potentially (given the limited number of results to date) from the Bos1p group.

Certainly, Tlg2p, Tlg1p, and Snc2p function in endocytosis, but there is also some evidence showing that they are involved in the retrieval of proteins to the TGN from the cell surface or endosomes (Abeliovich et al., 1998 Holthuis et al., 1998b Seron et al., 1998 Gurunathan et al., 2000 Lewis et al., 2000). These functions are of course related in that endosomes play an important role in maintaining the steady-state distribution of late Golgi membrane proteins (Conibear and Stevens, 1998). Therefore, it is possible that the fusogenic SNARE complex we have identified here, t-Tlg2p/Tlg1p,Vti1p and v-Snc1p or Snc2p, is involved in more than just one trafficking step. Indeed, this complex is also required in TGN homotypic fusion (Brickner et al., 2001, this issue).

Our results imply that the fusion activity of this endomal t-SNARE is intrinsically switched “off” due to auto-inhibition. Its fusion activity can be unleashed by binding a peptide corresponding to the COOH-terminal part of the cognate v-SNARE. The capacity to switch the endosomal t-SNARE “on” is specific for peptide derived from its cognate v-SNARE, and when activated the endosomal t-SNARE will only fuse with its cognate v-SNARE Snc1/2p and no other potential v-SNARE encoded in the genome of yeast. Most likely peptide binding conformationally switches the endosomal t-SNARE from “off” to “on” states when it binds, as it does for the neuronal exocytic t-SNARE (unpublished data).

The intrinsic inactivity of the endosomal t-SNARE is a significant finding because it implies that cells must possess mechanisms to activate it for fusion. Presumably, peptide binding throws the switch by tapping into a mechanism that is physiologically reserved for certain regulatory proteins. Indeed, a very recent study showed that Tlg2p is locked in an inactive state, unable to bind its light chains Tlg1p and Vti1p, unless Vps45p is present (Bryant and James, 2001). Interestingly, none of the other t-SNAREs tested to date show a strict requirement for peptides to be functional in the in vitro fusion assay (Fukuda et al., 2000 McNew et al., 2000a Parlati et al., 2000), suggesting that the endosomal t-SNARE might be auto-inhibited to a greater extent.

Of course, regulatory proteins in the cell could tip the balance further toward (or against) the “off” state. Snc1/2p is the sole example to date of a multifunctional v-SNARE. Snc2p is required in the endocytic pathway (in association with t-Tlg2p/Tlg1p,Vti1p) as well as for fusion of secretory vesicles with the plasma membrane (in association with t-Sso1p/Sec9p [McNew et al., 2000a]). Thus, a single v-SNARE suffices for fusion with the plasma membrane and with the two compartments with which the cell surface interfaces for endocytosis and secretion, early endosomes and late Golgi compartment. This neatly solves the problem of how the v-SNAREs are recycled among these compartments. If the only source of specificity for vesicle targeting in these pathways were SNARE pairings, this would imply that the pattern of transport among these compartments could be relatively random. Interestingly, this pattern is extremely complex (Pelham, 1999) and since, in contrast to the genes and organelles in the secretory pathway which are essential, the entire pathway is not essential in yeast (Holthuis et al., 1998b), it is not inconceivable that even a random pattern in these pathways might suffice and would certainly cause no harm. Therefore, it is unclear whether the large number of transport links among endocytic compartments (Pelham, 1999) is due to an equal number of uniquely specific fusion steps, or whether movement could be more random than that. The latter would require a smaller genetic load, but would also result in less overall efficiency in endocytosis.

If the transport pattern were precise, how could the cell direct Snc2p-containing v-SNARE vesicles to one versus another of its potential target membranes? The tight autoregulation of the endosomal t-SNARE, so that its fusion activity is intrinsically locked-up, would be important in this connection. If there is a lock then there is presumably a key, and a simple possibility is that Snc2p-containing vesicles in the cell have additional proteins encoding their origin that act as keys to preferentially unlock one or another different t-SNARE at one or another different target membrane, adding a further level of specificity. Such a “key–lock” system could certainly include such Sec1 family proteins as Vps45p, but also rab GTPase switch proteins or cognate tether proteins (Mellman and Warren, 2000 Zerial and McBride, 2001). Each of the two different t-SNAREs so far known to be fusogenic with v-Snc2p (or Snc1p) has a distinct Sec1 family member: t-Sso1p/Sec9p functions with Sec1p (Carr et al., 1999) and t-Tlg2p/Tlg1p,Vti1p with Vps45p (Nichols et al., 1998). Additional elements, such as cytoskeletal structures, may also play a less direct role in directing Snc2p-containing v-SNARE vesicles to different target membranes. Further studies are needed to establish the extent to which the plasma membrane–endosomal compartments–TGN network operates according to stochastic or deterministic principles.


Afdeling Biologie

Proper transcriptional regulation is essential for the establishment and maintenance of cellular identity. Consistent with its central role in cellular function, transcription is dysregulated in numerous human disorders, including cancer. We use genetic and genomic approaches to study the control of initiation, a critical step in transcription where numerous regulatory inputs are integrated. As many basic transcriptional mechanisms are conserved throughout evolution, we use the budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model system.

We use genome-wide methodologies to study transcriptional regulation. We develoed chromatin endogenous cleavage followed by high-throughput sequencing (ChEC-seq) as a method to map the genome-wide binding of proteins with high spatiotemporal resolution. ChEC-seq involves fusion of micrococcal nuclease (MNase), a calcium-dependent exo-/endonuclease to a chromatin-associated protein of interest. Upon addition of exogenous calcium to cells, MNase cleaves DNA in proximity to binding sites for the factor of interest. Total DNA is then purified and small fragments are sequenced to reveal genomic loci bound by the fusion protein. ChEC-seq has numerous advantages relative to ChIP-based methods: it avoids artifacts associated with crosslinking, sonication, and poor antibody quality, is controlled by calcium, and provides high spatial resolution. We leveraged the inducible nature of MNase to characterize two classes of transcription factor binding sites in budding yeast. We found that sites displaying rapid cleavage displayed robust matches to known DNA motifs, while sites that were cleaved more slowly had no such sequences. We are currently testing ChEC-seq with additional classes of chromatin-binding proteins in budding yeast and are developing the method in metazoan systems.

We are particularly interested in the functions of the Mediator complex, a conserved, essential coactivator generally required for transcription by RNA Polymerase II (RNAPII). Studies of Mediator function in budding yeast have been complicated by conflicting data regarding its genome-wide localization as determined by ChIP-seq. We used ChEC-seq to map the binding of Mediator to the budding yeast genome and confirmed that, under normal growth conditions, it is confined to upstream activating sequences (UASs). We also found that its binding to UASs is generally uncoupled from transcriptional output and that its binding to chromatin is cooperative with that of TFIID, another coactivator complex that is part of the RNAPII pre-initiation complex (PIC). We are using a combination of budding yeast genetics and ChEC-seq to furthur elucidate the role of Mediator in PIC recruitment.

In addition to addressing questions related to basic transcription mechanisms, we are interested in the function of CCCTC-binding factor (CTCF), well known for its function in chromatin insulation. While CTCF is ubiquitously expressed, it has a paralog, brother of the regulator of imprinted sites (BORIS), that is expressed in germ and cancer cells and is comparatively poorly understood. Recent work has demonstrated the existence of clustered CTCF target sites (2xCTSes) that are occupied by CTCF homodimers in BORIS-negative cells but are occupied by CTCF/BORIS heterodimers or BORIS homodimers in BORIS-positive cells. In contrast to single CTCF target sites (1xCTSes), which are though to be involved in chromatin insulation, 2xCTSes are associated with active gene regulatory elements. We are investigating the mechanisms by which CTCF and BORIS influence transcription and chromatin architecture through these two classes of sites and are also exploring novel functions for CTCF and BORIS through mapping their protein-protein interaction landscapes.

Publicaties

Tourigny JP, Saleh MM, Schumacher K, Devys D, Zentner GE (2018). Mediator is essential for small nuclear and nucleolar RNA transcription in yeast. Mol Cell Biol 38(24):e00296-18.


Bekijk de video: Memaksimalkan Fungsi Google Photos! (Januari- 2022).