Informatie

4.7.6: Virulente bacteriofagen en T4 - Biologie


T-4-bacteriofaag is een virulente bacteriofaag die E. coli-bacteriën infecteert; virulente bacteriofagen hebben een lytische levenscyclus.

leerdoelen

  • Vat samen hoe de T4-levenscyclus als model dient voor virale virulentie

Belangrijkste punten

  • Virulentie is de mate van pathogeniteit binnen een groep of soorten parasieten zoals aangegeven door sterftecijfers en/of het vermogen van het organisme om de weefsels van de gastheer binnen te dringen. De pathogeniteit van een organisme wordt bepaald door zijn virulentiefactoren.
  • Een belangrijk verschil tussen de lytische en lysogene faagcycli is dat in de lytische faag het virale DNA bestaat als een afzonderlijk molecuul in de bacteriële cel en afzonderlijk repliceert van het bacteriële DNA van de gastheer.
  • De staartvezels van de T-4 maken hechting aan een gastheercel mogelijk en de staart van de T4 is hol zodat het zijn nucleïnezuur kan doorgeven aan de cel die het tijdens de hechting infecteert. T4 kan alleen een lytische levenscyclus ondergaan en niet de lysogene levenscyclus.

Sleutelbegrippen

  • lytische cyclus: Het normale proces van virale reproductie waarbij penetratie van het celmembraan, nucleïnezuursynthese en lysis van de gastheercel betrokken is.
  • virulentie: de mate van pathogeniteit binnen een groep of soorten parasieten zoals aangegeven door sterftecijfers en/of het vermogen van het organisme om de weefsels van de gastheer binnen te dringen.

Virulentie is de mate van pathogeniteit binnen een groep of soorten parasieten zoals aangegeven door sterftecijfers en/of het vermogen van het organisme om de weefsels van de gastheer binnen te dringen. De pathogeniteit van een organisme wordt bepaald door zijn virulentiefactoren. Virusvirulentiefactoren bepalen of een infectie zal optreden en hoe ernstig de resulterende virale ziektesymptomen zijn. Virussen hebben vaak receptoreiwitten nodig op gastheercellen waaraan ze specifiek binden. Meestal worden deze gastheerceleiwitten aan endocytose onderworpen en gaat het gebonden virus vervolgens de gastheercel binnen. Virulente virussen zoals HIV, dat AIDS veroorzaakt, hebben mechanismen om de afweer van de gastheer te ontwijken.

Sommige virale virulentiefactoren verlenen het vermogen om te repliceren tijdens de defensieve ontstekingsreacties van de gastheer, zoals tijdens virus-geïnduceerde koorts. Veel virussen kunnen gedurende lange perioden in een gastheer aanwezig zijn en er wordt weinig schade aangericht. Extreem virulente stammen kunnen uiteindelijk evolueren door mutatie en natuurlijke selectie binnen de viruspopulatie in een gastheer. De term "neurovirulent" wordt gebruikt voor virussen zoals hondsdolheid en herpes simplex die het zenuwstelsel kunnen binnendringen en daar ziekten kunnen veroorzaken.

Modelorganismen van virulente virussen die uitgebreid zijn bestudeerd, omvatten virus T4 en andere T-even bacteriofagen die Escherichia coli en een aantal verwante bacteriën infecteren.

De lytische cyclus is een van de twee cycli van virale reproductie, de andere is de lysogene cyclus. De lytische cyclus wordt doorgaans beschouwd als de belangrijkste methode van virale replicatie, omdat deze resulteert in de vernietiging van de geïnfecteerde cel. Een belangrijk verschil tussen de lytische en lysogene faagcycli is dat in de lytische faag het virale DNA bestaat als een afzonderlijk molecuul in de bacteriële cel en afzonderlijk repliceert van het bacteriële DNA van de gastheer. De locatie van viraal DNA in de lysogene faagcyclus bevindt zich in het gastheer-DNA, daarom repliceert het virus/faag in beide gevallen met behulp van de gastheer-DNA-machinerie, maar in de lytische faagcyclus is de faag een vrij zwevend afzonderlijk molecuul voor het gastheer-DNA .

De lytische cyclus is een cyclus van zes fasen. In de eerste fase, 'penetratie' genaamd, injecteert het virus zijn eigen nucleïnezuren in een gastheercel. Dan vormen de virale zuren een cirkel in het midden van de cel. De cel kopieert dan per ongeluk de virale zuren in plaats van zijn eigen nucleïnezuren. Dan organiseert het virale DNA zichzelf als virussen in de cel. Wanneer het aantal virussen binnenin te groot wordt voor de cel, splitst het membraan en zijn de virussen vrij om andere cellen te infecteren. Sommige virussen ontsnappen aan de gastheercel zonder het celmembraan te laten barsten; in plaats daarvan ontkiemen ze ervan door een deel van het membraan mee te nemen. Omdat het anders kenmerkend is voor de lytische cyclus in andere stappen, behoort het nog steeds tot deze categorie, hoewel het soms de productieve cyclus wordt genoemd. HIV, influenza en andere virussen die eukaryote organismen infecteren, gebruiken deze methode over het algemeen.

T-4-bacteriofaag is een bacteriofaag die E. coli-bacteriën infecteert. Het dubbelstrengs DNA-genoom is ongeveer 169 kbp lang en wordt vastgehouden in een icosaëdrische kop, ook wel capside genoemd. T4 is een relatief grote faag, ongeveer 90 nm breed en 200 nm lang (de meeste fagen hebben een lengte van 25 tot 200 nm). De staartvezels maken hechting aan een gastheercel mogelijk, en de staart van de T4 is hol zodat het zijn nucleïnezuur kan doorgeven aan de cel die het tijdens de hechting infecteert. T4 kan alleen een lytische levenscyclus ondergaan en niet de lysogene levenscyclus.

De T4-faag initieert een E. coli-infectie door celoppervlakreceptoren van de gastheer te herkennen met zijn lange staartvezels (LTF). Een herkenningssignaal wordt via de LTF's naar de grondplaat gestuurd. Dit ontrafelt de korte staartvezels (STF) die onomkeerbaar binden aan het celoppervlak van E. coli. De basisplaat verandert van conformatie en de staartschede trekt samen, waardoor GP5 aan het einde van de staartbuis het buitenmembraan van de cel doorboort. Het lysozymdomein van GP5 wordt geactiveerd en breekt de periplasmatische peptidoglycaanlaag af. Het resterende deel van het membraan wordt afgebroken en dan kan DNA van de kop van de faag door de staartbuis reizen en de E. coli binnendringen.

De lytische levenscyclus (van het binnendringen van een bacterie tot de vernietiging ervan) duurt ongeveer 30 minuten (bij 37 °C) en bestaat uit:

  • Adsorptie en penetratie (per direct starten)
  • Arrestatie van gastheergenexpressie (onmiddellijk startend)
  • Enzymsynthese (start na 5 minuten)
  • DNA-replicatie (start na 10 minuten)
  • Vorming van nieuwe virusdeeltjes (start na 12 minuten)

Nadat de levenscyclus is voltooid, barst de gastheercel open en werpt de nieuw gebouwde virussen de omgeving in, waarbij de gastheercel wordt vernietigd. T4 heeft een burst-grootte van ongeveer 100-150 virale deeltjes per geïnfecteerde gastheer. Complementatie-, deletie- en recombinatietests kunnen worden gebruikt om de rII-genlocus in kaart te brengen met behulp van T4. Deze bacteriofagen infecteren een gastheercel met hun informatie en blazen vervolgens de gastheercel op, waardoor ze zichzelf voortplanten.

De T4-faag heeft enkele unieke kenmerken, waaronder:

  • Eukaryote-achtige introns
  • High-speed DNA-kopieermechanisme, met slechts 1 fout op 300 kopieën
  • Speciale DNA-reparatiemechanismen
  • Het infecteert E. coli O157:H7

Bacteriofaag: inleiding, morfologie en levenscyclus

Bacteriofaag (Griekse faagine - om bacteriofaag te eten, bacteriën verzorgen) zijn virussen die bacteriën infecteren en parasiteren. Ze veroorzaken lysis van bacteriën. Ze worden afgekort als fagen.

Twart (1915) en d'8217Herelle (1917) observeerden een onzichtbare minuscule parasiet van bacteriën die lysis van de kweek van dysenteriebacillen (Sh. shiga) veroorzaakte en noemden het bacteriofaag.

Fagen komen veel voor in combinatie met bacteriën in de omgeving (feces, riolering).

Bacteriofagen zijn zeer gastheerspecifiek en op basis van fagen wordt de bacterie getypeerd.

Morfologie van bacteriofaag:

Coli-fagen, genaamd T-even fagen (T2, T4, T6… series) die E. coli aanvallen, worden uitgebreid bestudeerd. T-even faag is een prototype van bacteriële virussen.

De fagen hebben de vorm van een kikkervisje en hebben een kop en een staart:

Het is hexagonaal en bevat een dicht opeengepakte kern van nucleïnezuur (dubbelstrengs DNA) bedekt met een eiwitmantel (capside). Het hoofd van faag T4 heeft een diameter van 65 nm en is 100 nm lang.

De staart is cilindrisch en bestaat uit een centrale holle kern of buis (7 nm dik) omgeven door een samentrekkende omhulling (eiwit) en een eindplaat met staartvezels (meestal zes in aantal). Elke hoek van de grondplaat bevat een korte pin of spike en een 130 nm lange staartvezel. De staart van faag T4 is 100 nm lang en 25 nm in diameter.

Levenscyclus van bacteriofaag:

Er zijn twee categorieën bacteriofagen op basis van hun levenscyclus:

(a) Virulente of lytische faag produceert lysis van geïnfecteerde cellen, waarbij een groot aantal nageslachtvirussen vrijkomt.

(b) Gematigde of lysogene faag wordt geïntegreerd met bacterieel chromosoom en blijft in een slapende toestand (profaag). De profaag wordt synchroon met het bacteriële chromosoom gerepliceerd en tijdens de bacteriële deling naar de dochtercel gescheiden zonder de gastheercel te beschadigen. Fagen zijn meestal specifiek voor enkele bacteriestammen, vanwege de aanwezigheid van faagspecifieke receptoren.

De replicatiecyclus van virulente fagen is verdeeld in vijf opeenvolgende fasen:

3. Synthese van faagcomponenten,

4. Rijping en assemblage, en

5. Vrijkomen van nageslachtvirussen:

De faagdeeltjes komen in contact door willekeurige botsing en een faag hecht zich door middel van staartvezels aan een specifieke receptorplaats op het gastheercelmembraan.

Adsorptie vindt plaats binnen enkele minuten na contact.

Na adsorptie van faag aan bacteriën trekt de staartschede van faag samen en worden de basisplaat en staartvezels stevig tegen de bacteriële cel gehouden. Hierdoor wordt de holle kern naar beneden geduwd door het reeds verzwakte deel van de celwand veroorzaakt door een faag muramidase aanwezig op de basisplaat.

Het virale nucleïnezuur gaat door de holle buis, vergelijkbaar met injectie door een injectiespuit. De buis dringt niet door de celwand en de lege kop (capside) en staart blijven buiten als schil of spook.

3. Synthese van faagcomponenten:

Na de afgifte van nucleïnezuur in de bacteriële cel, stuurt het virale genoom de biosynthetische machinerie van de gastheercel om het normale cellulaire metabolisme af te sluiten en componenten van nieuwe virusdeeltjes te produceren. Dit wordt bewerkstelligd door de synthese van specifieke enzymen (vroege eiwitten genoemd) die nodig zijn voor de synthese van faagcomponenten.

Vervolgens verschijnen late eiwitten, subeenheden van faagkop en staart. Sommige componenten verschijnen in de kern en andere in het cytoplasma van de gastheercel.

4. Rijping en montage:

Tijdens rijping is er spontane assemblage van faag-DNA-kopeiwit en staarteiwit van faag. Elke component van faagnucleïnezuur krijgt een eiwitmantel en tenslotte worden de staartstructuren toegevoegd om een ​​virion (infectieus virusdeeltje) te vormen.

De nakomelingenfagen worden snel vrijgegeven door de lysis van de geïnfecteerde bacterie. Faag-enzym (waarschijnlijk muramidase) verzwakt de celwand tijdens replicatie van fagen. Hierdoor neemt de geïnfecteerde bacterie een bolvorm aan. De muramidaseconcentratie stijgt in het late stadium van de groeicyclus, die inwerkt op de reeds beschadigde celwand en lysis van de cel veroorzaakt met afgifte van nageslachtfaag.

Het tijdsinterval tussen het binnendringen van faagnucleïnezuur in de bacteriële cel en het verschijnen van het eerste infectieuze intracellulaire faagdeeltje wordt '8220eclipse-fase'8221 genoemd, omdat virussen in deze periode niet in de gastheercel kunnen worden gedetecteerd. Het tijdsinterval tussen infectie van de gastheercel en plotselinge toename van extracellulair virus wordt de “latente periode” genoemd. De duur van de eclipsfase is ongeveer 15-30 minuten in fagen.

In de lysogene cyclus wordt de lytische (vegetatieve) faag geïntegreerd met de chro & shymosomen van de gastheercel en wordt omgezet in profaag zonder lysis van de bacteriële cel. De profaag kan spontaan of door fysische en chemische middelen (UV-stralen, H202, stikstofmosterd).

Profaag'8221 is een latente bacteriofaag die zijn DNA behoudt. Gastheerbacteriën die profaag dragen zonder erdoor te worden gelyseerd, worden ''8220' genoemdlysogene bacteriën“. Bacteriofaag die een gastheerbacterie parasiteert zonder deze te lyseren, wordt “ genoemdgematigde faag“. Profaag kan verloren gaan tijdens mul­tiplicatie van lysogene bacteriën door middel van excisie. De uitgesneden profaag kan andere bacteriële cellen infecteren die het lysogene maken.

Betekenis van bacteriofaag:

Op basis van de gevoeligheid van verschillende bacteriestammen voor verschillende bacteriofagen, kan het typeren van bacteriën worden gedaan voor identificatie en epidemiologisch onderzoek. Epidemieën van V. cholera, S. typhi, S. paratyphi en Staph, aureus kunnen worden gedetecteerd door faagtypering. Faagtypering is het meest bruikbaar bij het typeren van bacteriën binnen een soort, b.v. om V. cholera (klassiek) te onderscheiden van El tor biotype V. cholera.

Voor het testen van bacteriolyse worden faagpreparaten gestandaardiseerd door middel van titratie. Seriële verdunningen van faagpreparaten worden toegepast op een gazoncultuur van een gevoelige bacteriestam. De plaat wordt geïncubeerd en lysis van bacteriën wordt waargenomen. De “routine test dosis” (RTD) van faag wordt gedefinieerd als de hoogste verdunning van faagbereiding die nodig is om alleen confluente lysis te produceren.

Wanneer fagen worden toegepast op een gazoncultuur van gevoelige stam, verschijnen na incubatie heldere zones. Deze heldere zones staan ​​bekend als plaques. Een enkele faag produceert slechts één plaque. Faagtest is een bruikbare methode bij het titreren van het aantal levensvatbare fagen.

Profaaggenen kunnen de eigenschappen van de gastheerbacterie veranderen, b.v. toxines van C. diphtheriae en Clostridium worden bepaald door genen die in profaag-DNA worden gedragen. Bacteriofaaginfectie in S. typhi verleent de gastheer een nieuwe antigene oppervlaktestructuur. Een dergelijke verwerving van nieuwe eigenschappen door bacteriën na faaginfectie wordt ''8220' genoemdfaag conversie“.

Bij transductie fungeren fagen als dragers van genen van de ene bacterie naar de andere.


Invoering

Bacteriofagen werden ongeveer 100 jaar geleden ontdekt 1 . Deze virussen hebben een geweldige rol gespeeld in de ontwikkeling van de moleculaire biologie en biotechnologie 2 . Om hun belang in het begrijpen van moleculaire bases van biologische processen te begrijpen, kan men zich herinneren dat studies over bacteriofagen hebben geleid tot (onder andere) de ontdekking dat DNA een genetisch materiaal is, dat de genetische code is gebaseerd op nucleotide-tripletten en dat genexpressie verliep via mRNA-moleculen 3,4. Bacteriofagen hebben ook een cruciale rol gespeeld bij de ontwikkeling van genetische manipulatie en biotechnologie. In feite waren de eerste kloneringsvectoren gebaseerd op bacteriofagen, en veelgebruikte systemen voor gecontroleerde genexpressie en genetische recombinatie bevatten genen en regulerende sequenties die zijn afgeleid van bacteriofaaggenomen 5 . Het is de moeite waard om te benadrukken dat twee baanbrekende ontdekkingen in de biotechnologie - identificatie van restrictie-enzymen en CRISPR's - strikt verband houden met interactiemechanismen tussen bacteriofagen en hun gastheren 6 . Toch werd er tot voor enkele jaren onvoldoende aandacht besteed aan de rol van bacteriofagen in de natuurlijke omgeving of aan de biodiversiteit van deze virussen. In moleculair-biologische studies en biotechnologische toepassingen werden namelijk slechts een zeer beperkt aantal bacteriofagen gebruikt, wat gezien de keuze van modelorganismen redelijk was. Het weerspiegelde echter niet de diversiteit van bacteriofagen. Momenteel lijkt deze diversiteit extreem hoog. Bacteriofagen zijn de meest voorkomende vorm van leven, aangezien het aantal faagentiteiten op aarde wordt geschat op 1031, d.w.z. 10 keer meer dan het aantal bacteriële cellen7. In dit licht is onze relatief slechte kennis van de biodiversiteit van bacteriofagen verrassend. Hoewel 1.910 volledige genoomsequenties van bacteriofaag (en 77 genomen van virussen die archaea infecteren) zijn gedeponeerd in de NCBI-database, is dit aantal laag vergeleken met 67.806 volledige genoomsequenties van bacteriën (vanaf 17 april 2016 http://www.ncbi .nlm.nih.gov/genoom/). Desalniettemin kan men uit de beschikbare gegevens een enorme diversiteit aan bacteriofagen afleiden, die slechts in een klein fragment bekend is, zoals aangegeven in de nieuwste artikelen over dit probleem 6,8,9.

Een overgrote meerderheid van de huidige onderzoeken naar bacteriofaagdiversiteit richten zich op: in silico analyses van nucleotidesequenties van hun genomen. Dergelijke studies leveren buitengewoon interessante informatie op over de genetische variabiliteit van faaggenomen, maar ze geven ook aan dat er een groot aantal faaggenen is waarvan de functie niet kan worden voorspeld vanwege een zeer lage gelijkenis, of het ontbreken daarvan, met reeds bekende genen 9 . In dit licht kan men concluderen dat studies over nieuw geïsoleerde bacteriofagen die interessante fenotypen onthullen, van bijzonder belang zouden moeten zijn. Vanwege de enorme biodiversiteit van bacteriofagen, die moeilijk in zijn geheel in te schatten is, suggereerde G.F. Hatfull dat studies op dit gebied kunnen leiden tot ontdekkingen die nieuwe mijlpalen in de biotechnologie blijken te zijn 6 . Recente artikelen rapporteren zelfs de start van grootschalige onderzoeken gericht op het ontdekken van bacteriofagen in omgevingsmonsters en analyses van hun genomen 9,10.

In ons huidige project hebben we een andere strategie toegepast, wat een nieuwe benadering is gezien de eerder gepubliceerde werken over brede analyses van bacteriofagen. Terwijl de grootschalige genomische projecten gebaseerd zijn op isolatie van grote aantallen bacteriofagen, sequencing van hun genomen en geavanceerde in silico analyses richten we ons in onze studies op de biodiversiteit van fagen, d.w.z. het onderzoeken van de biologische en fysiologische variëteit van deze virussen. Dergelijke analyses zouden het niveau van biologische diversiteit van bacteriofaag-eigenschappen moeten aangeven in de zin van hun ontwikkelingskenmerken onder verschillende omstandigheden. Afgezien van het bepalen van het niveau van variabiliteit van de kenmerken van bacteriofagen, zou dit ook het startpunt kunnen vormen voor verder onderzoek naar moleculaire mechanismen van vermeende ongewone eigenschappen van fagen. Bovendien kan dit soort onderzoek een basis bieden voor het bepalen van nieuw ontdekte eigenschappen van bacteriofagen die nuttig kunnen zijn in biotechnologische en medische toepassingen. Onder hen lijken de constructie van nieuwe vectoren en de ontwikkeling van bacteriofaagtherapie de meest waarschijnlijke toepasbare nieuwe aspecten van dergelijke studies, aangezien deze gebieden van bacteriofaagonderzoek zich tegenwoordig bijzonder snel ontwikkelen 11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20 . In dit werk is bijzondere aandacht besteed aan de morfologische en biologische karakterisering van een grote groep bacteriofagen geïsoleerd uit stedelijk afvalwater, waarvan werd aangenomen dat het een rijke bron van deze virussen was. Zo'n innovatief soort onderzoek leverde een voorbeeld op van het biodiversiteitsniveau van bacteriofagen die op één plek zijn geïsoleerd. Bovendien zijn er potentiële biotechnologische en medische toepassingen van de resultaten van deze onderzoeken naar voren gekomen, waardoor het mogelijk is om deze bacteriofagen te gebruiken bij het construeren van nieuwe hulpmiddelen voor genetische manipulatie en bacteriofaagtherapie.


Gemuteerde en bacteriofaag T4-nanodeeltjes gerangschikte F1-V-immunogenen van Yersinia pestis als plaagvaccins van de volgende generatie

Longpest is een zeer virulente infectieziekte met een sterftecijfer van 100%, en het veroorzakende organisme Yersinia pestis vormt een ernstige bedreiging voor opzettelijk gebruik als bioterreur-agens. Momenteel is er geen door de FDA goedgekeurd vaccin tegen de pest. Het polymere bacteriële kapseleiwit F1, een sleutelcomponent van het momenteel geteste bivalente subeenheidvaccin dat bovendien bestaat uit een laag calciumrespons V-antigeen, heeft een hoge neiging tot aggregatie, waardoor de zuivering en de werkzaamheid van het vaccin worden beïnvloed. We gebruikten twee basisbenaderingen, op structuur gebaseerd immunogeenontwerp en faag T4-nanodeeltjesafgifte, om nieuwe pestvaccins te construeren die volledige bescherming boden tegen longpest. De NH₂-terminale β-streng van F1 werd getransplanteerd naar de COOH-terminus en de sequentie die de β-streng flankeerde werd gedupliceerd om polymerisatie te elimineren maar om de T-celepitopen te behouden. De gemuteerde F1 was gefuseerd met het V-antigeen, een belangrijke virulentiefactor die de punt vormt van het type drie secretiesysteem (T3SS). Het F1mut-V-eiwit vertoonde een dramatische verandering in oplosbaarheid, waardoor een volledig oplosbaar monomeer werd geproduceerd. De F1mut-V werd vervolgens gerangschikt op faag T4-nanodeeltje via het kleine buitenste capside-eiwit, Soc. Het F1mut-V-monomeer was robuust immunogeen en het met T4 versierde F1mut-V zonder enig adjuvans induceerde evenwichtige TH1- en TH2-responsen bij muizen. Opname van een oligomerisatie-deficiënt YscF, een andere component van de T3SS, toonde een lichte verbetering van de potentie van het F1-V-vaccin, terwijl de deletie van de vermeende immunomodulerende sequentie van het V-antigeen de werkzaamheid van het vaccin niet verbeterde. Zowel de oplosbare (gezuiverde F1mut-V gemengd met alhydrogel) als de met T4 gedecoreerde F1mut-V (geen adjuvans) boden 100% bescherming aan muizen en ratten tegen longpest veroorzaakt door hoge doses Y. pestis CO92. Deze nieuwe platforms kunnen leiden tot effectieve en gemakkelijk te produceren plaagvaccins van de volgende generatie.

Belangenconflict verklaring

De auteurs hebben verklaard dat er geen concurrerende belangen bestaan.

Figuren

Figuur 1. Nieuwe ontwerpen voor pest-immunogeen.

Figuur 1. Nieuwe ontwerpen voor pest-immunogeen.

Schema van verschillende benaderingen die worden gebruikt om pestimmunogenen te ontwerpen.…

Figuur 2. Het ontwerpen van monomere F1-mutanten.

Figuur 2. Het ontwerpen van monomere F1-mutanten.

( EEN ) Schema van native F1, F1mut1 en...

Figuur 3. Constructie van gemuteerde F1-V-immunogenen.

Figuur 3. Constructie van gemuteerde F1-V-immunogenen.

( EEN ) Schema van native F1-V, F1mut-V...

Figuur 4. Een oligomerisatie-deficiënte YscF-mutant.

Figuur 4. Een oligomerisatie-deficiënte YscF-mutant.

( EEN ) Schema van native YscF en...

Figuur 5. Engineering van F1, V en...

Figuur 5. Engineering van F1-, V- en YscF-antigenen en weergave op faag T4-nanodeeltjes.

Figuur 6. De oplosbare monomere F1-mutant...

Figuur 6. Het oplosbare monomere F1-mutante eiwit wekt robuuste antilichaamtiters op en zorgt voor complete...

Figuur 7. Het T4-nanodeeltje vertoonde pest...

Figuur 7. Het T4-nanodeeltje vertoonde pestimmunogenen die een robuuste immunogeniciteit en beschermende werkzaamheid induceerden tegen...

Figuur 8. De T4 vertoonde pestimmunogenen...

Figuur 8. De T4 vertoonde pestimmunogenen genereerden een evenwichtige T H 1

Figuur 9. De F1mut-V- en F1mut-V10-mutanten...

Figuur 9. De F1mut-V- en F1mut-V10-mutanten vertonen vergelijkbare immunogeniciteit en bescherming tegen longpest.

Figuur 10. Inductie van pro-inflammatoire cytokines door...

Figuur 10. Inductie van pro-inflammatoire cytokinen door F1mut-V- en F1mut-V10-immunogenen.

Afbeelding 11. De gemuteerde en T4 weergegeven...

Figuur 11. De gemuteerde en T4 vertoonde pestantigenen boden volledige bescherming tegen: Y. pest…


Bacteriofagen kunnen bacteriën schadelijk maken voor mensen

Bacteriofagen spelen een rol bij menselijke ziekten door sommige onschadelijke bacteriën in ziekteverwekkers te veranderen. Sommige bacteriesoorten, waaronder: E coli, Streptococcus pyogenes (veroorzaakt vleesetende ziekte), Vibrio cholerae (veroorzaakt cholera), en Shigella (veroorzaakt dysenterie) schadelijk worden wanneer genen die giftige stoffen produceren via bacteriofagen naar hen worden overgebracht. Deze bacteriën kunnen vervolgens mensen infecteren en voedselvergiftiging en andere dodelijke ziekten veroorzaken.


Bacteriofaag – Lytische en lysogene faag

Virussen die de bacteriën parasiteren, worden bacteriofagen genoemd. De meest bestudeerde bacteriofagen zijn T2, T4 en T6. Bacteriofagen hebben in het algemeen twee symmetrieën die kubisch en spiraalvormig zijn. Kubische bacteriofagen zijn regelmatig of icosahedraal met 20 gezichten. Spiraalvormige bacteriofagen zijn staafvormig. De kop van bacteriofaag heeft een zeshoekige, prismavormige structuur. In het hoofd is dubbelstrengs DNA aanwezig. De staart is een omhulsel dat uit eiwit bestaat. De lytische cyclus bestaat uit 1) hechting: hechten aan receptorplaats op bacteriële celwand door zwakke koppeling 2) penetratie: staartafgifte-enzym lysozyme om bacteriële celwand op te lossen. Faag injecteert zijn DNA in celwand 3) replicatie: viraal DNA neemt de controle over de biosynthetische machinerie van gastheren 4) lysis: bacteriën ondergaan lysis. De faag die de lytische cyclus veroorzaakt, wordt lytische of virulente faag genoemd. De faag die lysogenie veroorzaakt, wordt gematigde of lysogene faag genoemd.

Wat zijn bacteriofagen?

Een bacteriofaag, ook gewoon a . genoemd faag, is een type virusinfectie die bacteriën besmet. In feite betekent het woord "bacteriofaag" letterlijk "bacteriëneter", vanwege het feit dat bacteriofagen hun gastheercellen vernietigen.

Structuur van bacteriofaag

Alle bacteriofagen zijn samengesteld uit een nucleïnezuurmolecuul dat is omgeven door een eiwitstructuur. Bacteriofagen komen voor in 2 structurele typen met kubische of spiraalvormige symmetrie. In het algemeen lijken kubische fagen regelmatig vast of icosahedraal (met 20 vlakken), en spiraalvormige fagen zijn staafvormig. Veel fagen bestaan ​​uit kop en staart. In die gevallen zijn de koppen veelvlakkig, maar de staarten zijn staafvormig.

De T-faag

Eerdere onderzoeken naar bacteriofagen waren vooral gericht op een beperkt aantal fagen die Escherichia coli infecteren. Van deze zijn de meest bekende fagen T-fagen (T voor type).

Onder T-fagen, de T2 en T4 fagen worden voornamelijk gebruikt in faagstudies.

Structuur van T-faag

De algemene structuur van T4, bestudeerd met elektronenmicroscopie, lijkt op die van een kikkervisje, bestaande uit kop en staart. De kop is een verlengde piramidale (met twee driehoekige structuren met een typische basis), zeshoekige, prismavormige structuur, waaraan een rechte staart is verbonden. Binnen de kop is een dubbelstrengs DNA-molecuul aanwezig.

De structuur van de faagstaart is ingewikkelder dan de kop. Een laag van verschillende eiwitten vormt de binnenste buis of kern, die is opgesloten in een omhulsel dat bestaat uit een ander type eiwit. Aan de ene kant van de schede zit de kraag en aan de andere kant de eindplaat. Aan de eindplaat zijn zes staartvezels verbonden, dit zijn de structuren voor bevestiging. Het volume van de faag is ongeveer 1/1000 van de bacteriën (gastheer).

Levensproces van T-bacteriofaag

De bacteriofaag dupliceert alleen in de bacteriecel. De eerste stap in de replicatie van een bacteriofaag is de aanhechting (adsorptie) naar de gastheercellen op de receptorplaats op de celwand van de bacterie. Tijdens hechting vindt de week chemische unie tussen virion en receptor plaats.

In de volgende stap, penetratie, geeft de staart het enzym lysozym af om een ​​deel van de bacteriële celwand op te lossen. De staartschede trekt samen en de staartkern wordt door de celwand en het celmembraan in de cel geduwd. De bacteriofaag injecteert zijn DNA in de cel, net zoals de spuit wordt gebruikt om het vaccin te injecteren. De eiwitmantel, die de faagkop- en staartstructuur van het virus vormt, blijft buiten de cel. Veel dierlijke virussen komen echter als geheel in de gastheercel terecht.

Lytische of virulente faag

Onmiddellijk nadat het de gastheercel is binnengegaan, neemt het virale nucleïnezuur de controle over de biosynthetische apparatuur van de gastheer en stimuleert het de gastheercel om de noodzakelijke virale componenten (DNA, eiwitten) te synthetiseren en begint het zich te vermenigvuldigen. Ongeveer 25 minuten na de voorlopige infectie worden ongeveer 200 gloednieuwe bacteriofagen gevormd, bacteriële celbursts, d.w.z. het gaat door lysis. Vers gevormde fagen worden vrijgegeven om de bacteriën te infecteren en een andere cyclus, de lytische cyclus begint. De faag die lysis van de gastheercel veroorzaakt, wordt genoemd lytische of virulente faag.

Lysogene of gematigde faag

Alle infecties van bacteriële cellen door fagen leiden niet tot lysis. In sommige gevallen wordt viraal DNA, in plaats van de controle over de apparatuur van de gastheer over te nemen, uiteindelijk geïntegreerd in het bacteriële chromosoom. Faag in deze toestand wordt profaag genoemd en deze procedure wordt genoemd lysogenie. In deze toestand blijven de bacteriën normaal leven en repliceren.

Viraal DNA, dat het deel is van het bacteriële chromosoom, gaat naar elke dochtercel in alle volgende generaties. Soms raakt het virale DNA echter los van het chromosoom van de gastheer en begint de lytische cyclus. Dit proces heet inductie. Lysogene bacteriën zijn resistent tegen infectie door dezelfde of geassocieerde fagen. De faag die lysogenie veroorzaakt, wordt genoemd gematigde (lysogene) faag.


5. Verbetering van de activiteit van bacteriofagen

Een punt van zorg over de commerciële ontwikkeling van bacteriofagen als bestrijdingsmiddelen was historisch gezien de mening dat het niet mogelijk was om natuurlijke bacteriofagen te patenteren. Dit is onjuist, zoals blijkt uit octrooien die zijn toegekend aan meerdere groepen die dergelijke bacteriofagen beschermen, gebaseerd, zoals voor alle octrooien, op nieuwheid en verrassende activiteit [14,28,29]. Een aantal bedrijven heeft echter geprobeerd gemanipuleerde bacteriofagen te gebruiken, wat het effect heeft dat de nieuwheid die inherent is aan hun intellectuele eigendomspositie wordt versterkt.

Een benadering hiervoor is de toevoeging van virulentieverhogende factoren aan het bacteriofaaggenoom. Dit was de benadering van Lu en Collins [30], die een gen voor Dispersin B (een glycosidehydrolase waarvan bekend is dat het biofilm-dispergerende activiteit heeft) invoegden in Escherichia coli bacteriofaag T7. Dit werd vervolgens tijdens infectie in hoge niveaus tot expressie gebracht en werd door gelyseerde cellen in de extracellulaire matrix afgegeven. Lu en Collins [30] ontdekten dat deze biofilmverwijdering aanzienlijk verbeterde in vergelijking met de ouder T7 (die zelf een recombinant was en een gen van bacteriofaag T3 bevat om replicatie in dit systeem mogelijk te maken). T7 produceert van nature een endopeptidase, maar produceert geen polysacharide-depolymerase. Dit lijkt een experimenteel systeem te zijn dat is geselecteerd om het effect van het tot expressie gebrachte enzym te benadrukken, aangezien Lu en Collins [30] opmerkten dat: E. coli, die de K1-polysaccharidecapsule produceert, is normaal gesproken resistent tegen infectie door T7-faag”, maar dit in tegenstelling tot Escherichia coli-bacteriofaag T4, die in Escherichia coli-biofilms kan infecteren en repliceren en de biofilmmorfologie kan verstoren door bacteriële cellen te doden& #x0201d. Deze aanpak werd vervolgens in commerciële ontwikkeling ingevoerd, gericht op gebruik bij het verwijderen van biofilm in industriële processen.

De waarde van dit soort benadering, met de aanvullende regelgeving die inherent is aan het gebruik van genetisch gemodificeerde organismen (GGO's), moet natuurlijk worden overwogen naast het aangetoonde vermogen van ten minste enkele natuurlijke bacteriofagen om biofilms effectief te bestrijden. Het is duidelijk dat het op deze manier genereren van nieuwe recombinante bacteriofagen de octrooieerbaarheid verbetert, maar dit moet worden beschouwd naast het potentieel voor het ontwikkelen van natuurlijke bacteriofagen voor dit doel.

Opgemerkt moet worden dat Lu en Collins [30] een oplosbaar enzym gebruikten, dat door lysis uit de geïnfecteerde cel werd afgegeven. Dit is relatief eenvoudig in vergelijking met technische expressie binnen het virusdeeltje, waar er veel meer beperkingen zijn op activiteit, tenzij meer permissieve methoden, zoals faagdisplay, worden gebruikt.

De alternatieve benadering van gelijktijdige toediening van bacteriofagen met biofilmdispergeermiddelen, zoals alginaatlyasen of zelfs DNase-enzymen (zoals het commerciële product Pulmozyme), is ook gesuggereerd [14]. Dit zou echter niet toestaan ​​dat dergelijke middelen aanwezig zijn voor volgende generaties bacteriofaag, in tegenstelling tot die welke tot expressie worden gebracht vanuit het bacteriofaaggenoom.


DNA-topoisomerasen: biochemie en moleculaire biologie

IV T-zelfs bacteriofaag topoisomerase genen

Escherichia coli bacteriofagen T2, T4 en T6 coderen voor een DNA topo II dat verschilt van de gastheerenzymen. Deze enzymen ontspannen superhelisch DNA in een ATP-afhankelijke reactie, en ze zijn niet in staat om superhelische bochten in het DNA te introduceren. Bovendien zijn de cumarine- en F-chinolonengeneesmiddelen geen effectieve remmers van de faag-enzymen. De subeenheidstructuren van de T4- en T2/T6-enzymen zijn niet hetzelfde. (T2 and T6 are nearly identical.) They represent a striking example of partitioning the encoding peptide into separate genes which clearly define the domains of the larger peptide. In T4 the enzyme is encoded by three genes, namely, 39, 60, and 52. The T4 39 protein has an ATPase activity, 52 is the cutting–rejoining unit, and 60 is required for tight complex formation between the 39 and 52 proteins ( Huang, 1990 ). The derived amino acid sequences of the T4 genes can be aligned with those of the bacterial gyrB en gyrA genes: The T4 39 protein sequence (519 amino acids) can be aligned with the N-terminal portion of the GyrB protein and the T4 60 protein (160 amino acids) can be aligned with the C-terminal of the GyrB protein. The T4 52 protein (421 amino acids) is homologous to the N-terminal portion of the GyrA protein, which includes the region encompassing the reactive tyrosine residue where the transient protein–DNA bridge is formed during the DNA strand passage reaction. The topoisomerase genes are highly conserved among the three phages (higher than 85%), and the subunits are freely interchangeable. In T2 genes 39 and 60 are fused into one gene (605 amino acids), and it is equivalent to gyrB ( Huang, 1990 ). The T2 39 gene, along with the 52 gene, encode the smallest topo II. These prokaryotic phage proteins share significant homology with the bacterial gyrase and the ParE and ParC proteins. However, like the ParE and ParC proteins, not all of the consensus amino acids identified in the gyrase alignment are found in the phage genes. Because the phage topo II activity is more akin to the eukaryotic enzymes, the sequence alignment is displayed in Fig. 3 .

Fig. 3 . Alignment of the topo II proteins. Sequences were from the GenBank data base. Critfa, Crithida fasiculata ( Pasion et al., 1992 ) Trybru, Trypanosome brucei ( Strauss and Wang, 1990 ) HuIIA, human Top2α ( Tsai-Pflugfelder et al., 1988 ) HuIIB, human Top2β (C. A. Austin, J. H. Sng, S. Patel, and L. M. Fisher, personal communication) Dros2, Drosophila melanogaster ( Wyckoff et al., 1989 ) Ytsc2, Saccharomyces cerevisiae ( Giaever et al., 1986 ) Pomb2, Schizosaccharomyces pombe ( Uemura et al., 1986 ) T2topo, bacteriophage T2 topoisomerase, which combines the 39 and 52 proteins ( Huang, 1990 ) cons, consensus sequence for the cellular and T2 topo II proteins [does not include ASFV (African swine fever virus), which is shown below the cons line] ( Garcia-Beato et al., 1992 ) * (in the 910 block), reactive tyrosine with which a covalent protein–DNA bridge is formed during the topoisomerization reaction + (in the 610 block), junction where the T4 39 and 60 proteins fused to form the T2 39 protein and + (in the 730–740 blocks), space between the T2 39 and 52 proteins.

It is interesting to note that the amino acid residues of GyrA proteins which are most important for F-quinolone sensitivity ( Section II,D,2 ), namely, the S83 and D87 residues, are different in the T-phage proteins. The critical residue, R136, which is responsible for coumarin sensitivity ( Section II,D,1 ), is also different in the phage protein. These assignments are consistent with the observation that the phage topoisomerases are not sensitive to the gyrase-targeted antibiotics but are inhibited by antitumor drugs such as m-AMSA ( Huang, 1990 Huff et al., 1989 ). When the T-phage proteins are correlated with the three-dimensional structure of the corresponding E coli GyrB protein fragment, among the residues that are proposed to contact the triphosphate moiety, N46, Q335, and K337 are conserved and K103 is not among those that contact the adenine ring, D73 is conserved and Y109 is not. The extensive sequence homology in the N-terminal 400 amino acids of the T2 39 protein with the gyrases seems to imply that the ATP-binding pocket may be similar, yet the fine details with which the phage protein interacts with ATP are not the same. This is also consistent with the known enzymatic properties of the enzymes, in that the phage proteins require ATP for DNA relaxation, whereas gyrases do not.


Question : What are the differences between virulent and temperate bacteriophages? Select all that apply Prophages that encode virulence factors are always temperate bacteriophages. Temperate bacteriophages respond differently to healthy and unhealthy host cells. Only temperate bacteriophage genomes are inherited by bacterial cell division. Only temperate

Prophages that encode virulence factors are always temperate bacteriophages.

Temperate bacteriophages respond differently to healthy and unhealthy host cells.

Only temperate bacteriophage genomes are inherited by bacterial cell division.

Only temperate bacteriophages are capable of lysogeny.

Virulent bacteriophages infect humans as well as bacteria.

Specialized transduction is only performed by temperate bacteriophages.

Generalized transduction is only performed by virulent bacteriophages.

Prophages that encode virulence factors are always virulent bacteriophages.

Only virulent bacteriophages are capable of the lytic cycle.

A representative virulent bacteriophage is T4 a representative temperate bacteriophage is λ.


Conclusie

Details given above give a glimpse of the large range of applications of phages in the field of biotechnology and medical science. The applications of phages range from the diagnosis of the disease, through phage typing, and its prevention (phage vaccine), to the treatment (phage therapy). There is the hope that phages could be useful to humans in many ways. By making a cock tail of phages it would become easy to treat a wide variety of bacterial infections that are otherwise resistant to the latest generations of antibiotics. A phage can be used individually to treat a bacterial infection by lysing the bacterial cell as it is having the lytic potential. At the same time the versatility of phages would allow us to use the antibodies against the bacteria that have been displayed on the phage surface. Similarly a protective antigen could be delivered as a DNA or phage display vaccine. So a mixture of phages that are modified genetically would be more helpful in addressing all these problems. Phages have also been good to cope with the food spoilage problem, and to treat the bacterial infection of plants and fruits.

There are some concerns about the use of phages. It includes the safety and efficacy issues, as well as immune response to the administered phages. Growth optimization and purification strategies of phages are also some issues needed to be addressed. Due to the rapid progress in the fields of biotechnology and molecular biology it is hoped that these entities (phages) which are present abundantly in the biosphere could answer many questions human beings are having.


Bekijk de video: Techniques de biologie moléculaire u0026 biochimie - ELDécode ep5 (Januari- 2022).