Informatie

13.7: Hemidesmosomen - Biologie


Hemidesmosomen, met name die welke epitheelcellen aan hun basaalmembraan hechten, zijn de nauwste adhesieve interacties in een dierlijk lichaam. Dit nauwe contact en de versterkte structuur van deze contacten is cruciaal voor de beschermende veerkracht van epitheellagen. Herinner je je de α6β4-integrine nog? Dat zou degene zijn die linkt met intermediaire filamenten in plaats van f-actine. Intermediaire filamenten zijn, zoals we al hebben opgemerkt, niet dynamisch, maar ongeveer zo stabiel als een cellulaire component kan zijn. Ze zijn ook erg sterk en worden gebruikt om de cellulaire integriteit te ondersteunen. Het is dus geen verrassing dat intermediaire filamenten en het α6β4-integrine een rol spelen in hemidesmosomen.

Het onderscheidende kenmerk van hemidesmosomen is echter de elektron-dichte plaque. Het kan worden gezien als versterking, zodat wanneer het epitheel wordt uitgerekt, de cel niet zomaar losschiet en een deel van zijn membraan achterlaat. De plaque bevat verschillende eiwitten, maar de primaire component zijn plectines, de linker-eiwitten die helpen om intermediaire filamenten te bundelen en ze met elkaar en met andere cytoskeletelementen te verbinden. Een ander belangrijk element van de plaques is BP230, dat de plaque met keratine verbindt. Aan de extracellulaire kant is er, naast het reeds genoemde integrine, ook een transmembraan glycoproteïne genaamd BP180, dat ook bindt aan laminine-elementen van het basaalmembraan.

BP230 en BP180 zijn genoemd naar bulleuze pemfigoïd, de subepidermale bulleuze aandoening die wordt gekenmerkt door chronische blaarvorming van de huid. Het is een auto-immuunziekte en de afwijkende antilichaamrespons is tegen deze twee hemidesmosomale eiwitten.


Vito Quaranta, MD

McKenna MT, Weis JA, Barnes SL, Tyson DR, Miga MI, Quaranta V, Yankeelov TE. Een voorspellende wiskundige modelleringsaanpak voor de studie van doxorubicinebehandeling bij triple negatieve borstkanker. Wetenschappelijk vertegenwoordiger. 2017 juli 7/18/2017 7(1): 5725. PMID: 28720897, PMCID: PMC5516013, PII: 10.1038/s41598-017-05902-z, DOI: 10.1038/s41598-017-05902-z, ISSN: 2045- 2322.

Wooten DJ, Quaranta V. Wiskundige modellen van celfenotyperegulatie en herprogrammering: maak kankercellen weer gevoelig!. Biochim. Biofysica. Acta [print-elektronisch]. 2017 april 1867 (2): 167-75. PMID: 28396217, PII: S0304-419X(17)30065-3, DOI: 10.1016/j.bbcan.2017.04.001, ISSN: 0006-3002.

Hormuth DA, Weis JA, Barnes SL, Miga MI, Rericha EC, Quaranta V, Yankeelov TE. Een mechanisch gekoppeld reactie-diffusiemodel dat intra-tumorale heterogeniteit omvat om in vivo glioomgroei te voorspellen. JR Soc-interface. 14 maart 2017 (128): PMID: 28330985, PMCID: PMC5378136, PII: rsif.2016.1010, DOI: 10.1098/rsif.2016.1010, ISSN: 1742-5662.

Udyavar AR, Wooten DJ, Hoeksema M, Bansal M, Califano A, Estrada L, Schnell S, Irish JM, Massion PP, Quaranta V. Nieuw hybride fenotype onthuld in kleincellige longkanker door een transcriptiefactornetwerkmodel dat tumorheterogeniteit kan verklaren. Cancer Res [print-elektronisch]. 2017 maart 3/1/2017 77(5): 1063-74. PMID: 27932399, PMCID: PMC5532541, PII: 0008-5472.CAN-16-1467, DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-16-1467, ISSN: 1538-7445.

Hardeman KN, Peng C, Paudel BB, Meyer CT, Luong T, Tyson DR, Young JD, Quaranta V, Fessel JP. Afhankelijkheid van glycolyse maakt BRAF-gemuteerde melanomen gevoelig voor een verhoogde respons op gerichte BRAF-remming. Wetenschappelijk vertegenwoordiger. 2017 Feb 2/16/2017 7: 42604. PMID: 28205616, PMCID: PMC5311997, PII: srep42604, DOI: 10.1038/srep42604, ISSN: 2045-2322.

Viquez OM, Yazlovitskaya EM, Tu T, Mernaugh G, Secades P, McKee KK, Georges-Labouesse E, De Arcangelis A, Quaranta V, Yurchenco P, Gewin LC, Sonnenberg A, Pozzi A, Zent R. Integrin alpha6 handhaaft de structurele integriteit van het nierverzamelsysteem. Matrix Biol [print-elektronisch]. 2017 jan. 57-58: 244-57. PMID: 28043890, PMCID: PMC5330664, PII: S0945-053X(16)30262-1, DOI: 10.1016/j.matbio.2016.12.003, ISSN: 1569-1802.

Franco OE, Tyson DR, Konvinse KC, Udyavar AR, Estrada L, Quaranta V, Crawford SE, Hayward SW. Veranderde TGF-a/ß-signalering stimuleert de samenwerking tussen borstkankercelpopulaties. FASEB J [print-elektronisch]. 2016 30 oktober (10): 3441-52. PMID: 27383183, PMCID: PMC5024699, PII: fj.201500187RR, DOI: 10.1096/fj.201500187RR, ISSN: 1530-6860.

Harris LA, Frick PL, Garbett SP, Hardeman KN, Paudel BB, Lopez CF, Quaranta V, Tyson DR. Een onbevooroordeelde metriek van het antiproliferatieve medicijneffect in vitro. nat. Methoden [print-elektronisch]. 2016 13 juni (6): 497-500. PMID: 27135974, PMCID: PMC4887341, PII: nmeth.3852, DOI: 10.1038/nmeth.3852, ISSN: 1548-7105.

Frick PL, Paudel BB, Tyson DR, Quaranta V. Het kwantificeren van heterogeniteit en dynamiek van klonale fitness als reactie op verstoring. J. cel. fysio. 2015 juli 230 (7): 1403-12. PMID: 25600161, DOI: 10.1002/jcp.24888, ISSN: 1097-4652.

Hormuth DA, Weis JA, Barnes SL, Miga MI, Rericha EC, Quaranta V, Yankeelov TE. Het voorspellen van in vivo glioomgroei met de reactiediffusievergelijking beperkt door kwantitatieve magnetische resonantiebeeldvormingsgegevens. Phys Biol. 2015 juni 6/4/2015 12(4): 46006. PMID: 26040472, PMCID: PMC4486062, DOI: 10.1088/1478-3975/12/4/046006, ISSN: 1478-3975.

Yazlovitskaya EM, Tseng HY, Viquez O, Tu T, Mernaugh G, McKee KK, Riggins K, Quaranta V, Pathak A, Carter BD, Yurchenco P, Sonnenberg A, Böttcher RT, Pozzi A, Zent R. Integrin a3ß1 reguleert de ontwikkeling van de nierverzamelbuis via TRAF6-afhankelijke K63-gekoppelde polyubiquitinatie van Akt. Mol. Biol. Cel [print-elektronisch]. 2015 mei 15/5/2015 26(10): 1857-74. PMID: 25808491, PMCID: PMC4436831, PII: mbc.E14-07-1203, DOI: 10.1091/mbc.E14-07-1203, ISSN: 1939-4586.

Yankeelov TE, Quaranta V, Evans KJ, Rericha EC. Op weg naar een wetenschap van tumorvoorspelling voor klinische oncologie. Cancer Res [print-elektronisch]. 2015 maart 15-03-2015 75(6): 918-23. PMID: 25592148, PMCID: PMC4359948, PII: 0008-5472.CAN-14-2233, DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-2233, ISSN: 1538-7445.

Broussard JA, Diggins NL, Hummel S, Georgescu W, Quaranta V, Webb-dj. Geautomatiseerde analyse van cel-matrix verklevingen in 2D- en 3D-omgevingen. Wetenschappelijk vertegenwoordiger. 2015/01/29/2015 5: 8124. PMID: 25630460, PMCID: PMC4309964, PII: srep08124, DOI: 10.1038/srep08124, ISSN: 2045-2322.

Leander R, Allen EJ, Garbett SP, Tyson DR, Quaranta V. Afleiding en experimentele vergelijking van celdelingswaarschijnlijkheidsdichtheden. J. Theor. Biol [print-elektronisch]. 2014 21-10-2014 359: 129-35. PMID: 24931675, PMCID: PMC5488810, PII: S0022-5193(14)00341-5, DOI: 10.1016/j.jtbi.2014.06.004, ISSN: 1095-8541.

Quaranta V, Tyson DR. Wat eronder ligt: ​​verder kijken dan de tumorgenetica toont de complexiteit van signaalnetwerken die ten grondslag liggen aan de gevoeligheid van geneesmiddelen. Sci-signaal. 2013-09-24-2013 6 (294): pe32. PMID: 24065144, PII: 6/294/pe32, DOI: 10.1126/scisignal.2004715, ISSN: 1937-9145.

Yankeelov TE, Atuegwu N, Hormuth D, Weis JA, Barnes SL, Miga MI, Rericha EC, Quaranta V. Klinisch relevante modellering van tumorgroei en behandelingsrespons. Sci Transl Med. 2013 mei 5/29/2013 5(187): 187ps9. PMID: 23720579, PMCID: PMC3938952, PII: 5/187/187ps9, DOI: 10.1126/scitranslmed.3005686, ISSN: 1946-6242.

Tyson DR, Quaranta V. Voorbij genetica in gepersonaliseerde kankerbehandeling: beoordeling van de dynamiek en heterogeniteit van tumorreacties. Per Med. 2013 mei 5/1/2013 10(3): 221-5. PMID: 24696699, PMCID: PMC3970774, DOI: 10.2217/pme.13.6, ISSN: 1741-0541.

Tyson DR, Garbett SP, Frick PL, Quaranta V. Fractionele proliferatie: een methode om de celpopulatiedynamiek te deconvolueren uit eencellige gegevens. nat. Methoden [print-elektronisch]. 9 september 2012 (9): 923-8. PMID: 22886092, PMCID: PMC3459330, PII: nmeth.2138, DOI: 10.1038/nmeth.2138, ISSN: 1548-7105.

Takahashi K, Mernaugh RL, Friedman DB, Weller R, Tsuboi N, Yamashita H, Quaranta V, Takahashi T. Thrombospondin-1 werkt als een ligand voor CD148-tyrosinefosfatase. Proc. nat. Acad. Wetenschap. V.S. [print-elektronisch]. 2012 2/7/2012 109 (6): 1985-90. PMID: 22308318, PMCID: PMC3277540, PII: 1106171109, DOI: 10.1073/pnas.1106171109, ISSN: 1091-6490.

Georgescu W, Wikswo JP, Quaranta V. CellAnimation: een open source MATLAB-raamwerk voor microscopie-assays. Bioinformatica [print-elektronisch]. 2012 1/1/2012 28(1): 138-9. PMID: 22121157, PMCID: PMC3244774, PII: btr633, DOI: 10.1093/bioinformatics/btr633, ISSN: 1367-4811.

Hassanein M, Weidow B, Koehler E, Bakane N, Garbett S, Shyr Y, Quaranta V. Ontwikkeling van kwantitatieve testen met hoge doorvoer voor de opname van glucose in kankercellijnen. Mol Imaging Biol. 2011 okt 13 (5): 840-52. PMID: 20809209, PMCID: PMC3627351, DOI: 10.1007/s11307-010-0399-5, ISSN: 1860-2002.

Xu J, Xie J, Jourquin J, Colvin DC, MD, Quaranta V, Gore JC. Invloed van celcyclusfase op schijnbare diffusiecoëfficiënt in gesynchroniseerde cellen gedetecteerd met behulp van temporale diffusiespectroscopie. Magn Reson Med [print-elektronisch]. 2011 april 65 (4): 920-6. PMID: 21413058, PMCID: PMC3433804, DOI: 10.1002/mrm.22704, ISSN: 1522-2594.

Tripathi M, Potdar AA, Yamashita H, Weidow B, Cummings PT, Kirchhofer D, Quaranta V. Laminine-332-splitsing door matriptase verandert de motiliteitsparameters van prostaatkankercellen. Prostaat. 2011 februari 2/1/2011 71(2): 184-96. PMID: 20672321, PMCID: PMC3669684, DOI: 10.1002/pros.21233, ISSN: 1097-0045.

Ocak S, Yamashita H, Udyavar AR, Miller AN, Gonzalez AL, Zou Y, Jiang A, Yi Y, Shyr Y, Estrada L, Quaranta V, Massion PP. DNA-kopie-aantal aberraties bij kleincellige longkanker onthullen activering van de focale adhesieroute. Oncogene [print-elektronisch]. 2010 Dec 12/2/2010 29(48): 6331-42. PMID: 20802517, PMCID: PMC4637980, PII: onc2010362, DOI: 10.1038/onc.2010.362, ISSN: 1476-5594.

Riggins KS, Mernaugh G, Su Y, Quaranta V, Koshikawa N, Seiki M, Pozzi A, Zent R. MT1-MMP-gemedieerde hermodellering van het basaalmembraan moduleert de nierontwikkeling. Exp. Cell Res [print-elektronisch]. 2010 okt 10/15/2010 316 (17): 2993-3005. PMID: 20727881, PMCID: PMC2945451, PII: S0014-4827(10)00397-6, DOI: 10.1016/j.yexcr.2010.08.003, ISSN: 1090-2422.

Gruver JS, Potdar AA, Jeon J, Sai J, Anderson B, Webb D, Richmond A, Quaranta V, Cummings PT, Chung CY. Bimodale analyse onthult een algemene schaalwet die de niet-gerichte en chemotactische celmotiliteit regelt. Biofysica. J. 2010 juli 21-07-2010 99(2): 367-76. PMID: 20643054, PMCID: PMC2905119, PII: S0006-3495(10)00710-1, DOI: 10.1016/j.bpj.2010.03.073, ISSN: 1542-0086.

Yamashita H, Tripathi M, Harris MP, Liu S, Weidow B, Zent R, Quaranta V. De rol van een recombinant fragment van laminine-332 in integrine alfa3beta1-afhankelijke celbinding, verspreiding en migratie. Biomaterialen [print-elektronisch]. 31 juli 2010 (19): 5110-21. PMID: 20347131, PMCID: PMC2861493, PII: S0142-9612(10)00343-1, DOI: 10.1016/j.biomaterials.2010.03.003, ISSN: 1878-5905.

Yamashita H, Shang M, Tripathi M, Jourquin J, Georgescu W, Liu S, Weidow B, Quaranta V. Het in kaart brengen van epitoop van functieblokkerend monoklonaal antilichaam CM6 suggereert een "zwakke" integrinebindingsplaats op het laminine-332 LG2-domein. J. cel. fysio. 2010 juni 223 (3): 541-8. PMID: 20301201, PMCID: PMC2874318, DOI: 10.1002/jcp.22107, ISSN: 1097-4652.

Quaranta V, Garbett SP. Niet alle lawaai is afval. nat. Methoden:. 2010 april 7 (4): 269-72. PMID: 20354516, PII: nmeth0410-269, DOI: 10.1038/nmeth0410-269, ISSN: 1548-7105.

Liu S, Yamashita H, Weidow B, Weaver AM, Quaranta V. Laminine-332-beta1-integrine-interacties reguleren invadopodia negatief. J. cel. fysio. 2010 april 223(1): 134-42. PMID: 20039268, PMCID: PMC3150482, DOI: 10.1002/jcp.22018, ISSN: 1097-4652.

Jeon J, Quaranta V, Cummings PT. Een off-rooster hybride discreet-continuümmodel van tumorgroei en -invasie. Biofysica. J. 2010 1/6/2010 98(1): 37-47. PMID: 20074513, PMCID: PMC2800960, PII: S0006-3495(09)01573-2, DOI: 10.1016/j.bpj.2009.10.002, ISSN: 1542-0086.

Potdar AA, Jeon J, Weaver AM, Quaranta V, Cummings PT. Menselijke borstepitheelcellen vertonen een bimodaal gecorreleerd willekeurig wandelpatroon. PLoS ONE. 2010 5(3): e9636. PMID: 20224792, PMCID: PMC2835765, DOI: 10.1371/journal.pone.0009636, ISSN: 1932-6203.

Yamashita H, Tripathi M, Jourquin J, Kam Y, Liu S, Weidow B, Quaranta V. Lysofosfatidinezuur reguleert de laminine-332-expressie tijdens de verspreiding van A431-celkolonies. J Oncol [print-elektronisch]. 2010 2010: PMID: 20862207, PMCID: PMC2938436, DOI: 10.1155/2010/107075, ISSN: 1687-8469.

Raad CM, Quaranta V. De rol van laminine-332 bij carcinoom definiëren. Matrix Biol [print-elektronisch]. 28 oktober 2009 (8): 445-55. PMID: 19686849, PMCID: PMC2875997, PII: S0945-053X(09)00103-6, DOI: 10.1016/j.matbio.2009.07.008, ISSN: 1569-1802.

Hinow P, Gerlee P, McCawley LJ, Quaranta V, Ciobanu M, Wang S, Graham JM, Ayati BP, Claridge J, Swanson KR, Loveless M, Anderson AR. Een ruimtelijk model van tumor-gastheerinteractie: toepassing van chemotherapie. Wiskunde Biosci Eng. 6 juli 2009 (3): 521-46. PMID: 19566124, PMCID: PMC2981353, ISSN: 1547-1063.

Guess CM, Lafleur BJ, Weidow BL, Quaranta V. Een verminderde verhouding van laminine-332 beta3 tot gamma2-subeenheid-mRNA is geassocieerd met een slechte prognose bij darmkanker. Kanker Epidemiol. Biomarkers Vorige [print-elektronisch]. 2009 mei 18 (5): 1584-1590. PMID: 19383890, PMCID: PMC2869450, PII: 1055-9965.EPI-08-1027, DOI: 10.1158/1055-9965.EPI-08-1027, ISSN: 1055-9965.

Anderson AR, Rejniak KA, Gerlee P, Quaranta V. Micro-omgevingsgedreven invasie: een multischaalonderzoek met meerdere modellen. J Math Biol [print-elektronisch]. 2009 april 58 (4-5): 579-624. PMID: 18839176, DOI: 10.1007/s00285-008-0210-2, ISSN: 0303-6812.

Wang SE, Xiang B, Zent R, Quaranta V, Pozzi A, Arteaga CL. Transformerende groeifactor bèta induceert clustering van HER2 en integrines door Src-focale adhesiekinase en receptorassociatie aan het cytoskelet te activeren. kankeronderzoek. 2009 1/15/2009 69(2): 475-82. PMID: 19147560, PMCID: PMC2629389, PII: 69/2/475, DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-08-2649, ISSN: 1538-7445.

Quaranta V, Tyson DR, Garbett SP, Weidow B, Harris MP, Georgescu W. Kenmerkende variabiliteit van kankercellen gekwantificeerd door geautomatiseerde microscopie met hoog gehalte van afzonderlijke cellen. meth. Enzymol. 2009 467: 23-57. PMID: 19897088, PMCID: PMC2915824, PII: S0076-6879(09)67002-6, DOI: 10.1016/S0076-6879(09)67002-6, ISSN: 1557-7988.

Tripathi M, Nandana S, Yamashita H, Ganesan R, Kirchhofer D, Quaranta V. Laminine-332 is een substraat voor hepsine, een protease dat in verband wordt gebracht met de progressie van prostaatkanker. J. Biol. Chem [print-elektronisch]. 2008-11-11-2008 283(45): 30576-84. PMID: 18784072, PMCID: PMC2576550, PII: M802312200, DOI: 10.1074/jbc.M802312200, ISSN: 0021-9258.

Quaranta V, Rejniak KA, Gerlee P, Anderson AR. Invasie komt voort uit de aanpassing van kankercellen aan competitieve micro-omgevingen: kwantitatieve voorspellingen van wiskundige modellen met meerdere schalen. Semin. Cancer Biol [print-elektronisch]. 18 oktober (5): 338-48. PMID: 18524624, PMCID: PMC3789515, PII: S1044-579X(08)00039-4, DOI: 10.1016/j.semcancer.2008.03.018, ISSN: 1096-3650.

Harris MP, Kim E, Weidow B, Wikswo JP, Quaranta V. Migratie van isogene cellijnen gekwantificeerd door dynamische multivariate analyse van eencellige motiliteit. Cel Adh Migra. 2 april 2008 (2): 127-36. PMID: 19271355, PMCID: PMC2634586, ISSN: 1933-6926.

Anderson AR, Quaranta V. Integratieve wiskundige oncologie. nat. Rev. Kanker. 8 maart 2008 (3): 227-34. PMID: 18273038, PII: nrc2329, DOI: 10.1038/nrc2329, ISSN: 1474-1768.

Georgescu W, Jourquin J, Estrada L, Anderson AR, Quaranta V, Wikswo JP. Modelgestuurde hydrodynamische focus om meerdere overlappende gradiënten van aan het oppervlak geïmmobiliseerde eiwitten in microfluïdische apparaten te genereren. Lab Chip [print-elektronisch]. 8 februari 2008 (2): 238-44. PMID: 18231661, PMCID: PMC4357342, DOI: 10.1039/b716203k, ISSN: 1473-0197.

Kam Y, Guess C, Estrada L, Weidow B, Quaranta V. Een nieuwe circulaire invasie-assay bootst in vivo invasief gedrag van kankercellijnen na en onderscheidt eencellige motiliteit in vitro. BMC kanker. 2008 8: 198. PMID: 18625060, PMCID: PMC2491634, PII: 1471-2407-8-198, DOI: 10.1186/1471-2407-8-198, ISSN: 1471-2407.

Knuffel, Quaranta V, Li D. Modellering van effecten van voedingsgradiënten op celproliferatie in microfluïdische bioreactor. Biotechnologie. Prog [print-elektronisch]. 2007 23 nov (6): 1347-54. PMID: 17935347, DOI: 10.1021/bp070234n, ISSN: 8756-7938.

Anderson AR, Weaver AM, Cummings PT, Quaranta V. Tumormorfologie en fenotypische evolutie gedreven door selectieve druk vanuit de micro-omgeving. Cel. 2006 dec 12/1/2006 127 (5): 905-15. PMID: 17129778, PII: S0092-8674(06)01348-1, DOI: 10.1016/j.cell.2006.09.042, ISSN: 0092-8674.

Jourquin J, Yang N, Kam Y, Guess C, Quaranta V. Verspreiding van epitheliale kankercelkolonies door lysofosfatidinezuur (LPA). J. cel. fysio. 2006 februari 206 (2): 337-46. PMID: 16110477, DOI: 10.1002/jcp.20470, ISSN: 0021-9541.

Quaranta V, Wever AM, Cummings PT, Anderson AR. Wiskundige modellering van kanker: de toekomst van prognose en behandeling. clin. Chim. Acta. 2005 juli 7/24/2005 357 (2): 173-9. PMID: 15907826, PII: S0009-8981(05)00194-4, DOI: 10.1016/j.cccn.2005.03.023, ISSN: 0009-8981.

Hintermann E, Yang N, O'Sullivan D, Higgins JM, Quaranta V. Integrine-alfa6beta4-erbB2-complex remt haptotaxis door E-cadherine-cel-celverbindingen in keratinocyten op te heffen. J. Biol. Chem [print-elektronisch]. 2005 3 maart 2005 280 (9): 8004-15. PMID: 15579904, PII: M406301200, DOI: 10.1074/jbc.M406301200, ISSN: 0021-9258.

Hintermann E, Quaranta V. Epitheliale celmotiliteit op laminine-5: regulatie door matrixassemblage, proteolyse, integrines en erbB-receptoren. Matrix Biol. 2004 23 mei (2): 75-85. PMID: 15246107, PII: S0945053X04000289, DOI: 10.1016/j.matbio.2004.03.001, ISSN: 0945-053X.

Bilban M, Ghaffari-Tabrizi N, Hintermann E, Bauer S, Molzer S, Zoratti C, Malli R, Sharabi A, Hiden U, Graier W, Knöfler M, Andreae F, Wagner O, Quaranta V, Desoye G. Kisspeptin-10, een KiSS-1/metastine-afgeleid decapeptide, is een fysiologische invasieremmer van primaire menselijke trofoblasten. J. cel. wetenschap. 2004 15-3-2004 117 (Pt 8): 1319-28. PMID: 15020672, PII: 117/8/1319, DOI: 10.1242/jcs.00971, ISSN: 0021-9533.

Wang, H., Fu, W., Im, JH, Zhou, Z., Santoro, SA, Iyer, V., Dipersio, CM, Yu, QC, Quaranta, V.. Tumorcel alpha3beta 1-integrine en vasculaire laminine- 5 bemiddelen longstilstand en metastase. J Cell Bio. 2004 164: 935-41.

Schenk S, Quaranta V. Verhalen van de crypte [ic] sites van de extracellulaire matrix. Trends Cell Biol. 13 juli 2003 (7): 366-75. PMID: 12837607, PII: S0962892403001296, ISSN: 0962-8924.

Hendrix MJ, Seftor EA, Kirschmann DA, Quaranta V, Seftor RE. Hermodellering van de micro-omgeving door agressieve melanoomtumorcellen. Ann. N.Y. Acad. wetenschap. 2003 mei 995: 151-61. PMID: 12814947, ISSN: 0077-8923.

Pirilä E, Sharabi A, Salo T, Quaranta V, Tu H, Heljasvaara R, Koshikawa N, Sorsa T, Maisi P. Matrixmetalloproteïnasen verwerken de laminine-5 gamma 2-keten en reguleren epitheelcelmigratie. Biochem. Biofysica. Onderzoek gemeenschappelijk. 2003 18-4-2003 303(4): 1012-7. PMID: 12684035, PII: S0006291X03004522, ISSN: 0006-291X.

Schenk S, Hintermann E, Bilban M, Koshikawa N, Hojilla C, Khokha R, Quaranta V. Binding aan EGF-receptor van een laminine-5 EGF-achtig fragment dat vrijkomt tijdens MMP-afhankelijke borstklierinvolutie. J. Cell Biol. 2003 14-04-2003 161(1): 197-209. PMID: 12695504, PMCID: PMC2172889, PII: jcb.200208145, DOI: 10.1083/jcb.200208145, ISSN: 0021-9525.

Gao C, Mao S, Ronca F, Zhuang S, Quaranta V, Wirsching P, Janda KD. De novo identificatie van tumorspecifieke internaliserende paren van menselijke antilichaam-receptoren door middel van faag-display-methoden. J. Immunol. Methoden:. 2003 3-1-2003 274 (1-2): 185-97. PMID: 12609544, PII: S0022175902005227, ISSN: 0022-1759.

Quaranta, V., Giannelli, G.. Kankerinvasie: let op je buurt. Tumor. 2003 89: 343-8.

Schenk, S., Quaranta, V.. Verhalen uit de crypte [ic] plaatsen van de extracellulaire matrix. Trends Cell Biol. 2003 13: 366-75.

Quaranta V. Motiliteitssignalen in de micro-omgeving van de tumor. Differentiatie. 2002 december 70 (9-10): 590-8. PMID: 12492500, PII: S0301-4681(09)60468-0, DOI: 10.1046/j.1432-0436.2002.700912.x, ISSN: 0301-4681.

Quaranta, V. Motiliteitssignalen in de micro-omgeving van de tumor. Differentiatie. 2002 590-8.

Giannelli, G., Bergamini, C., Fransvea, E., Marinosci, F., Quaranta, V., en Antonaci, S.. Menselijke hepatocellulaire carcinoomcellen (HCC) vereisen zowel alfa3beta1-integrine als matrixmetalloproteïnasen-activiteit voor migratie en invasie . Lab Invest. 2001 81: 613-27.

Hintermann, E., Bilban, M., Sharabi, A., en Quaranta, V.. Remmende rol van alfa6beta 4-geassocieerde erbB-2 en fosfoinositide 3-kinase in keratinocyt-haptotactische migratie afhankelijk van alfa3beta1-integrine. J Cell Bio. 2001 153: 465-75.

Kiosses, W.B., Hahn, KM, Giannelli, G., en Quaranta, V.. Karakterisering van morfologische en cytoskeletale veranderingen in MCF10A-borstepitheelcellen uitgeplaat op laminine-5: vergelijking met borstkankercellijn MCF7. Cel hecht zich aan de gemeenschap. 2001 8: 29-44.

Seftor, RE, Seftor, EA, Koshikawa, N., Meltzer, PS, Gardner, LM, Bilban, M., Stetler-Stevenson, WG, Quaranta, V., en Hendrix, MJ Coöperatieve interacties van laminine 5 gamma2-keten, matrix metalloproteinase-2 en membraan type-1-matrix/metalloproteinase zijn vereist voor het nabootsen van embryonale vasculogenese door agressief melanoom. kankeronderzoek. 2001 61: 6322-7.

Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., en Quaranta, V.. De LG3-module van laminine-5 herbergt een bindingsplaats voor integrine alfa3beta1 die celadhesie, verspreiding en migratie bevordert. J Biol Chem. 2001 276: 33045-53.

Zent, ​​R., Bush, KT, Pohl, ML, Quaranta, V., Koshikawa, N., Wang, Z., Kreidberg, JA, Sakurai, H., Stuart, RO en Nigam, SK Betrokkenheid van lamininebinding integrines en laminine-5 in vertakkende morfogenese van de ureterknop tijdens nierontwikkeling. Dev Biol. 2001 238: 289-302.

Quaranta, V.. Celmigratie door metalloproteïnasen van het extracellulaire matrixmembraantype maken de weg vrij. J Cell Bio. 2000 ((149)): 1167-79.

Plopper, GE, Huff, JL, Rust, WL, Schwartz, MA, Quaranta, V.. Door antilichaam geïnduceerde activering van bèta-integrinereceptoren stimuleert cAMP-afhankelijke migratie van borstcellen op laminine-5. Mol. Cell Biol Res Commun. 2000 4: 129-35.

Mullen, L.M., Richards, D.W., Quaranta, V.. Bewijs dat laminine-5 een onderdeel is van de interne basale lamina van het tandoppervlak en de adhesie van epitheelcellen ondersteunt. J. Parodontale res. 1999 34: 16-24.

Falk-Marzillier, J., Domanico, SZ, Pelletier, A, Mullen, L., Quaranta, V.. Karakterisering van een strak moleculair complex tussen integrine alpha6beta4 en laminine-5 extracellulaire matrix. Biochem Biophys Res Commun. 1998 251: 49-55.

Giannelli, G., Falk-Marzillier, J., Schiraldi, O., Stetler-Stevenson, WG, Quaranta, V.. Inductie van celmigratie door matrix metalloprotease-2 splitsing van laminine-5. Wetenschap. 1997 277: 225-8.

Quaranta, V., Plopper, GE. Integrines en laminines bij weefselremodellering. Nier Int. 1997 51: 1441-6.

Baker, SE, Hopkinson, SB, Fitchmun, M., Andreason, GL, Frasier, F., Plopper, G., Quaranta, V., Jones, JC Laminin-5 en hemidesmosomen: rol van de alfa3-ketensubeenheid in hemidesmosome stabiliteit en montage. J Cell Science. 1996 109: 2509-20.

Baker, SE, Hopkinson, SB, Fitchmun, M., Andereason, GL, Frasier, F., Plopper, G., Quaranta, V., Jones, JC Laminin-5 en hemidesmosomen: rol van de alfa3-ketensubeenheid in hemidesmosome stabiliteit en montage. J Cell Science. 1996 2509-20.

Baker, SE, DiPasquale, AP, Stock, EL, Quaranta, V., Fitchmum, M., Jones, JC. Morfogenetische effecten van oplosbaar laminine-5 op gekweekte epitheelcellen en weefselexplantaten. Exp. Cel res. 1996 228: 262-70.

Plopper, G., Falker-Marzillier, J., Glaser, S., Fitchmum, M., Giannelli, G., Romano, T., Jones, JC, Quaranta, V.. Veranderingen in expressie van monoklonale antilichaamepitopen op laminine -5r geïnduceerd door celcontact. J Cell Science. 1996.

Hormia, M., Falk-Marzillier, J., Plopper, G. Tamura, RN, Jones, JC, Quaranta, V.. Snelle verspreiding en rijpe hemidesmosoomvorming in HaCaT-keratinocyten geïnduceerd door incubatie met oplosbaar laminine-5r. J Invest Dermatol. 1995 557-61.

Gaietta, G., Redelmeier, T.E., Jackson, M.R., Tamura, R.N. Quaranta, V.. Kwantitatieve meting van alfa6beta 1 en alfa6beta 4 integrine-internalisatie onder verknopingsomstandigheden: een mogelijke rol voor alfa6-cytoplasmatische domeinen. J Cell Science. 1994 107: 3339-49.

Quaranta, V., Tamura, RN. Collo, G., Cooper, HM, Hormia, M., Rozzo, C. Gaietta, G., Starr, L.. Onderscheidende functies van alpha6beta4 en andere integrines in epitheelcellen. Intergrins. 1994 141-61.

Quaranta, V., Collo, G., Rozzo, C., Starr, L., Gaietta, G., Tamura, RN. De integrine alpha6beta4 in epitheel- en carcinoomcellen. de integrines. 1994 147-76.

Collo, G., Starr, L., Quaranta, V.. Een nieuwe isovorm van de lamininereceptor integrine alfa 7 beta 1 wordt in de ontwikkeling gereguleerd in skeletspieren. J. Biol. Chemo. 1993 268: 19019-24.

Quaranta, V.. Integrine-expressie en epitheelceldifferentiatie. L. Celadhesiemoleculen. 1993 13-27.

Hormia, M., Virtanen, I., Quaranta, V.. Immunolokalisatie van intergrin alfa 6 beta 4 in junctioneel epitheel van de muis suggereert een verankeringsfunctie voor zowel de interne als de externe basale lamina. J Deuk Res. 1992 71: 1503-8.

Quaranta, V., Jones, JC. De interne aangelegenheden van een integrine. Trends in celbiologie. 1991 1: 2-4.

Tamura, RN, Cooper, H.M., Collo, G., Quaranta, V.. Celtype-specifieke integrinevarianten met alternatieve cytoplasmatische domeinen van de alfaketen. Proc Natl. Acad. Wetenschap US. 1991 A 88: 10183-7.

Copyright & kopie 2021 Vanderbilt University. Heeft u een probleem?
Vanderbilt University zet zich in voor principes van gelijke kansen en positieve actie.


Abstract

Om minerale transportroutes voor shell-secretie te begrijpen en om verschillen in cellulaire activiteit tijdens mineralisatie te beoordelen, hebben we ons voorzien van TEM- en FE-SEM-ultrastructurele kenmerken van buitenste mantelepitheelcellen (OME). Beeldvorming werd uitgevoerd op Magellania venosa schelpen ingebed/geëtst, chemisch gefixeerd/ontkalkt en onder hoge druk ingevroren/vriesgesubstitueerde monsters van de commissuur, centrale schelpgedeelten en van puncta. Beeldvormingsresultaten worden aangevuld met morfometrische evaluaties van volumefracties van membraangebonden organellen.

Bij de commissuur bestaat de OME uit verschillende lagen cellen. Deze cellen vormen schuine uitlopers die in dwarsdoorsnede rond zijn onder de primaire laag en vlak onder de vezels. Bij de commissuur is de OME gelaagd met meerdere cellen, in centrale schilgebieden is het gelaagd met één cel. Bij actieve schilafscheiding ontbreekt extrapalliale ruimte, omdat OME-cellen in direct contact staan ​​met het calciet van de vormende vezels. Na beëindiging van de secretie hechten OME-cellen zich via apicale hemidesmosomen aan extracellulaire matrixmembranen die het proximale oppervlak van vezels bekleden. Bij de commissuur zijn de volumefracties voor blaasjes, mitochondriën en lysosomen hoger in vergelijking met gelaagde eencellige gebieden, terwijl er voor het endoplasmatisch reticulum en het Golgi-apparaat geen verschil is.

FE-SEM, TEM-beeldvorming onthult het gebrek aan extrapalliale ruimte tussen OME-cellen en zich ontwikkelende vezels. Bovendien is er geen indicatie voor een amorfe voorloper in vezels wanneer deze zich in de actieve secretiemodus bevinden. Dienovereenkomstig ondersteunen onze resultaten het transport van mineralen door blaasjes van cellen naar plaatsen van mineralisatie niet, maar eerder door overdracht van carbonaationen via transportmechanismen geassocieerd met OME-celmembranen.


Gericht op de biosynthese van S-adenosylmethionine met een nieuwe allosterische remmer van Mat2A

S-Adenosyl-L-methionine (SAM) is een enzym-cofactor die wordt gebruikt bij methyloverdrachtsreacties en polyaminebiosynthese. De biosynthese van SAM uit ATP en L-methionine wordt uitgevoerd door de methionine-adenosyltransferase-enzymfamilie (Mat EC 2.5.1.6). Humaan methionine-adenosyltransferase 2A (Mat2A), de extrahepatische isovorm, wordt vaak gedereguleerd bij kanker. We identificeerden een Mat2A-remmer, PF-9366, die een allosterische plaats op Mat2A bindt die overlapt met de bindingsplaats voor de Mat2A-regulator, Mat2B. Studies die gebruik maakten van PF-9366 suggereerden een algemene modus van Mat2A allosterische regulatie. Allosterische binding van PF-9366 of Mat2B veranderde de actieve plaats van Mat2A, wat resulteerde in verhoogde substraataffiniteit en verminderde enzymturnover. Deze gegevens ondersteunen een model waarbij Mat2B functioneert als een remmer van Mat2A-activiteit wanneer methionine- of SAM-niveaus hoog zijn, maar functioneert als een activator van Mat2A wanneer methionine- of SAM-niveaus laag zijn. De vertakking van Mat2A-activiteitsmodulatie in kankercellen wordt ook beschreven.


Toegang tot document

  • APA
  • Auteur
  • BIBTEX
  • Harvard
  • Standaard
  • RIS
  • Vancouver

Onderzoeksoutput : Bijdrage aan tijdschrift › Artikel › peer-review

T1 - Dramatische veranderingen in genexpressie in verschillende vormen van Crithidia fasciculata onthullen mogelijke mechanismen voor insectspecifieke adhesie in kinetoplastideparasieten

N1 - Financieringsinformatie: dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation onder subsidienummer MCB-1651517 aan MLP. https://www.nsf.gov. De PennVet Imaging Core (GR) wordt ondersteund door een National Institutes of Health Shared Instrument Grant S10 OD021633-01 aan Bruce Freedman. Deze studie werd gedeeltelijk financieel ondersteund door NIH-subsidie ​​AI29646 aan SMB, NIH-NHGRI-subsidie ​​5U54HG00307907 aan Richard K. Wilson, directeur van het Genome Institute aan de Washington University, en NIH-NIAID-subsidie ​​AI103858 aan PJM. De financiers hadden geen rol bij het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om het manuscript te publiceren of de voorbereiding van het manuscript. De auteurs danken Emmanual Tetaud voor het verstrekken van de pNUS-plasmiden. We erkennen Natalia S. Akopyants en George Lye, die DNA-kwaliteitscontrole (Washington University, St. Louis) voor genoomsequencing hebben voorbereid en uitgevoerd. We danken Gowthaman Ramasamy en Sacha Steinbiss voor de annotatie van het C. fasciculata-genoom. We danken Ana Misic voor hulp bij bibliotheekvoorbereiding voor RNAseq, Daniel Beiting en het Center for Host-Microbial Interactions voor hulp bij het genereren en analyseren van RNAseq-gegevens, en Henry Neeb voor hulp bij R. We danken David S. Roos voor input over het project . We danken Omar S. Harb voor hulp bij het verkrijgen van de KEGG-gensets van TriTrypDB. Met dank aan Madeline Malfara, John DiMaio en Michael Yoder voor nuttige opmerkingen over het manuscript. We danken Elizabeth B. Edgerton voor hulp bij het kweken en onderhouden van muggen. Uitgever Copyright: © 2019 Filosa et al.

N2 - Kinetoplastiden zijn een groep parasieten die verschillende medisch belangrijke soorten omvat. Deze voor de mens besmettelijke soorten worden overgedragen door insectenvectoren waarin de parasieten specifieke ontwikkelingstransformaties ondergaan. Dit omvat voor elke soort een stadium waarin parasieten zich via een hemidesmosoomachtige structuur aan insectenweefsel hechten. Hoewel deze structuur morfologisch is beschreven, is deze nooit moleculair gekarakteriseerd. We gebruiken Crithidia fasciculata, een insectenparasiet die grote aantallen hechtende parasieten produceert in zijn muggengastheer, als een model kinetoplastide om zowel het mechanisme van therapietrouw als de signalen die nodig zijn voor differentiatie naar een hechtende vorm te onderzoeken. Een voordeel van C. fasciculata is dat aanhangende parasieten zowel in vitro kunnen worden gegenereerd, waardoor een directe vergelijking met gekweekte zwemvormen als in vivo in de mug mogelijk is. Met behulp van RNAseq identificeren we genen die geassocieerd zijn met therapietrouw in C. fasciculata. Aangezien bijna al deze genen orthologen hebben in andere kinetoplastide soorten, kunnen onze bevindingen gedeelde mechanismen van therapietrouw aan het licht brengen, waardoor onderzoek kan worden gedaan naar een cruciale stap in de ontwikkeling van parasieten en de overdracht van ziekten. Bovendien stelde dual-RNAseq ons in staat om de interactie tussen de parasieten en de mug te onderzoeken. Hoewel de infectie goed wordt verdragen, worden antimicrobiële peptiden en andere componenten van het aangeboren immuunsysteem van muggen opgereguleerd. Onze bevindingen geven aan dat C. fasciculata een krachtig modelsysteem is voor het onderzoeken van kinetoplastide-insect-interacties.

AB - Kinetoplastiden zijn een groep parasieten die verschillende medisch belangrijke soorten omvat. Deze voor de mens besmettelijke soorten worden overgedragen door insectenvectoren waarin de parasieten specifieke ontwikkelingstransformaties ondergaan. Dit omvat voor elke soort een stadium waarin parasieten zich via een hemidesmosoomachtige structuur aan insectenweefsel hechten. Hoewel deze structuur morfologisch is beschreven, is deze nooit moleculair gekarakteriseerd. We gebruiken Crithidia fasciculata, een insectenparasiet die grote aantallen hechtende parasieten produceert in zijn muggengastheer, als een model kinetoplastide om zowel het mechanisme van therapietrouw te onderzoeken als de signalen die nodig zijn voor differentiatie naar een hechtende vorm. An advantage of C. fasciculata is that adherent parasites can be generated both in vitro, allowing a direct comparison to cultured swimming forms, as well as in vivo within the mosquito. Using RNAseq, we identify genes associated with adherence in C. fasciculata. As almost all of these genes have orthologs in other kinetoplastid species, our findings may reveal shared mechanisms of adherence, allowing investigation of a crucial step in parasite development and disease transmission. In addition, dual-RNAseq allowed us to explore the interaction between the parasites and the mosquito. Although the infection is well-tolerated, anti-microbial peptides and other components of the mosquito innate immune system are upregulated. Our findings indicate that C. fasciculata is a powerful model system for probing kinetoplastid-insect interactions.


Phylum Chordata

Animals in the phylum Chordata share five key features that appear at some stage of their development: a notochord, a dorsal hollow nerve cord, pharyngeal slits, a post-anal tail, and an endostyle/thyroid gland that secretes iodinated hormones. In some groups, some of these traits are present only during embryonic development. In addition to containing vertebrate classes, the phylum Chordata contains two clades of “invertebrates”: Urochordata (tunicates, salps, and larvaceans) and Cephalochordata (lancelets). De meeste manteldieren leven op de oceaanbodem en zijn suspensievoeders. Lancelets zijn suspensievoeders die zich voeden met fytoplankton en andere micro-organismen. The invertebrate chordates will be discussed more extensively in the following chapter.


Promiscuous Males And Choosy Females? Challenging A Classic Experiment

Of the 100 "top science stories for 2012" chosen by Discover Magazine, I am most fascinated by #42: "The Myth of Choosy Women, Promiscuous Men." It reports a serious challenge to an experiment that has remained a touchstone in evolutionary biology for over 50 years.

The study, on fruitfly mating, was done in 1948 by geneticist A.J. Bateman. Bateman showed that the male insects' strategy was to mate with many females, whereas the females' strategy was to be discriminating in their choice of partners. Male reproductive success, in other words, correlated positively with number of mates, but female reproductive success did not.

Now, ecologist and evolutionary biologist Patricia Gowaty and her colleagues Yong-Kyu Kim and Wyatt Anderson have repeated that study. They conclude something startling: Bateman blew it.

Before I explain where they say Bateman went wrong, I need to show how Bateman's conclusions rippled far beyond the scholarly world of fruitfly sex. His findings — promiscuous males, choosy females — seemed to strike a cultural chord. After biologist Robert Trivers cited it in a key 1972 paper on parental investment, the "Bateman principle" turned up everywhere. In my own field of primate behavior, for instance, field researchers expected to see (and thus often did) male primates with highly active sex lives and females who were coy, verging on sexual passivity.

And don't think that humans were left out of this picture. We've all heard it, right? When some big-name male public figure sleeps around, and cheats on his wife, isn't there always someone ready with an evolutionary explanation about vigorous male seed-sowing?

It's not that these Bateman-powered expectations have gone completely uncontested. Anthropologist Sarah Hrdy's 1981 book The Woman That Never Evolved pounded away, with careful field data, at the inaccuracy and sexism of assumptions about coy or passive primate females. As recently as 2009, though, scientists were still at work overturning the idea that Bateman's findings apply universally to humans.

Then along came Gowaty's team to take on the Bateman experiment itself.

In 1948, Bateman created isolated fruitfly populations and allowed free mating to occur within each. His goal was to count up the number of mates that males had, versus females. DNA-analyse was toen nog niet voorhanden, dus hij kon op die manier geen nakomelingen koppelen aan specifieke ouders. Instead, he reasoned that by using adult flies with mutations, he could trace an offspring back to a specific pair of parents. As Gowaty et al. wrote in their 2012 paper, he used "heritable, dramatic, and phenotypically obvious genetic mutations to identify the parents of offspring in small, replicated trial populations." The mutations included things like curly wings, thick bristles and deformed eyes.

Offspring, then, could have a single-dose mutation from either mother or father, or a double-dose, from both parents. (If they had no mutation, their parentage could not be traced.)

But here's where things went awry, as Gowaty et al. discovered when they ran the experiment using Bateman's methods. For one thing, the double-dose mutations seriously impacted offspring survival. "The crucial assumption of Bateman's method," Gowaty et al. wrote, "is that there is no reduction of offspring viability from inheritance of parental markers." But this turned out to be untrue — and because the non-surviving offspring weren't counted in the results, the data was skewed.

Also, Bateman's methods violated Gregor Mendel's laws of genetics. As Gowaty explained in an email message, sent to me on Monday:

Bateman's method over-counted the number of offspring for fathers, because there were more single-mutant offspring that had dad's mutation than mom's mutation. It's elementary, and essential in sexual species, that the number of offspring having Dads must equal the number with Moms.

The upshot? For both these reasons, Bateman didn't, in fact, show in any convincing way that fruitfly males are promiscuous and females are choosy.

The Gowaty et al. paper offers enough technical details to warm a geneticist's heart. For me, the best part is their study's broad implications. As Gowaty told me:

If we failed as a discipline to notice flaws [in the Bateman study], it makes one wonder, do we notice the flaws in other, more modern studies that also have results consistent with status-quo expectations?

Here, then, is a direct link between science and society. Because it made intuitive sense to many people that males would be promiscuous and females choosy, they were "dazzled" (Gowaty et al.'s word) by Bateman's central conclusion. But now, Gowaty told me:

The most important experimental data for the evolutionary justification for the double standard in humans is in question.

You can keep up with more of what Barbara is thinking on Twitter: @bjkingape


Invoering

An estimated 10 million people worldwide suffer from vision loss caused by corneal damage or disease [1]. For the worst cases, the only available treatment is transplantation with human donor corneal tissue. However, there is a severe shortage of safe, good quality corneal tissue, particularly in the Third World and developing countries, leading to various efforts to develop tissue substitutes. Although numerous fully synthetic materials have been developed as corneal prostheses, it has been shown that materials based upon naturally occurring extracellular matrix macromolecules have enhanced biocompatibility [2]. As an example, we have shown previously that crosslinked collagen matrices made from porcine or bovine collagen, apart from being fully biocompatible, were able to promote regeneration of corneal cells and nerves when implanted into rabbit and pig models [3], [4], [5].

Animal-extracted collagen is both abundant and inexpensive, making it historically the material of choice for numerous biomaterial applications [6]. However, the majority of these extracted proteins is not highly purified and have the potential to cause immune reactions [7]. Collagen extracted from animals also has the potential to transmit infectious agents. The development of recombinant human collagens provides the promise of a safe, predictable and chemically defined source of collagen for biomedical applications [8], [9]. The triple helical recombinant collagens contain the same amino acid sequences and an equivalent extent of proline hydroxylation as naturally occurring human collagens. Hence, these recombinant human collagens have similar properties and a similar degree of stability as natural human collagens. Recombinant type I and type III collagens are now commercially available, and their use has the potential to reduce immune reactions seen when using collagen extracted from animals. For example, when porcine collagen corneal constructs were implanted in mice, a low grade immune reaction was observed [10]. Recombinant collagens would also potentially mitigate the risk of transmission of animal-related infectious agents, especially those of viral or prion origin, and would significantly reduce the lot-to-lot variability that is typically experienced with animal-extracted collagen.

Recombinant collagens can be produced by transfected mammalian cells, insect cells, yeast, Escherichia coli, transgenic tobacco, mice or silk worms [8]. Recombinant collagen, mostly type I, has recently been studied for drug delivery applications [8] and has shown great potential in bone, skin, cartilage and periodontal ligament tissue engineering applications [9].

Type I and type III collagens are believed to be co-distributed in most tissues and probably co-exist in collagen fibrils [11]. Type I collagen forms large-diameter collagen fibrils, e.g. 30–300 nm in human skin [12], while type III collagen forms fine fibrils constituting reticular networks that often surround the larger fibers containing type I molecules [13]. In adult skin, immuno-scanning electron microscopy revealed that small-diameter collagen fibrils (20–40 nm) are labeled with antibodies specific for both type I and type III collagens, but that larger collagen fibrils (≥60 nm) are only labeled with antibodies specific for type I collagen [14].

In our previous work [5], we postulated that recombinant human collagen might be a suitable scaffold for the fabrication of corneal substitutes to be used in the clinical setting. The objectives of this study were to construct and evaluate the in vitro properties and in vivo performance of corneal substitutes engineered with crosslinked recombinant fibrillar human collagens type I and type III.


Materiaal en methoden

Cell line and maintenance

The BxPC-3 human pancreatic cancer cell and human embryonic kidney cells (HEK) 293 human embryonic kidney cell lines were obtained from the American Type Culture Collection and were maintained in Roswell Park Memorial Institute culture media (RPMI) and Dulbecco's modified eagles medium (DMEM) high-glucose medium, respectively. The fast growing (FG) human pancreatic cancer cell line has been previously described and was provided by Dr. David Cheresh (University of California, San Diego) and maintained in DMEM high-glucose medium. 9 , 10 All media were supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 2% penicillin–streptomycin unless otherwise noted. All cells were grown in a humidified incubator at 37°C and 5% CO2.

Liquid chromatography—multidimensional protein identification

BxPC3 cells were serum starved overnight, treated with 200 ng/ml of MSP or vehicle for 15 min and protein lysates collected. Fifteen microgram of RON C-20 antibody (Santa Cruz) was conjugated to 75 μl of A/G Ultralink Beads (Pierce) using the Seize X IP Kit (Pierce). Five milligram of each sample was Immunoprecipitated (IP) with the conjugated beads. Precipitated proteins were loaded onto a biphasic capillary column for multidimensional protein identification (MudPIT) then separated and analyzed by 2D-LC separation in combination with tandem MS as described. 11

Generation of mass spectrometry data

RAW files were generated from mass spectra using XCalibur version 1.4, and ms 2 spectra data extracted using RAW Xtractor (version 1.9.1—available at: http://fields.scripps.edu/?q=content/download). Ms 2 spectral data were searched using the SEQUEST algorithm (version 3.0) against the human IPI database (v3.65) database containing 86,382 sequences concatenated to a decoy database in which the sequences for each entry in the original database was reversed. The resulting ms 2 spectra matches were assembled and filtered using DTASelect (version 1.9). Peptides with cross-correlation scores greater than 2.0 (+1), 2.5 (+2), 4.0 (+3), delta CN scores greater than 0.09 and percent ion match greater than 49% were included in the final dataset. This resulted in a false positive rate of 1.3% at the peptide level. To eliminate decoy database hits, a minimum peptide length of seven amino acids was imposed and protein identification required the matching of at least two peptides per protein.

Cell transfection

To generate stable plectin knockdown cell lines and corresponding green fluorescent protein (GFP) tagged-missense controls, HEK 293-T cells were plated on a p150 plate to a confluency of ∼70% at the time of transfection. On the day of transfection, media was aspirated and replaced with 16 ml of prewarmed Optimem (Invitrogen). Five hundred microliters of prewarmed Optimem without antibiotics was pipetted into two sterile eppendorf tubes. To Tube 1, 80 μl of Lipofectamine 2000 (Invitrogen) was added. To Tube 2, 7 μg of pLKO1 Plec1-SH plasmid, 4.55 μg of rev response element (RRE) plasmid, 1.75 μg of REV plasmid and 2.45 μg of vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) plasmid was added. The tubes were inverted five times to mix and then incubated at room temperature for 3 min. The contents in Tube 1 were then added to Tube 2, inverted ten times to mix and then incubated at room temperature for 20 min. This solution was then added dropwise to the HEK 293-T cells. Sixteen hours later, the media was aspirated from the HEK 293-T cells and replaced with 16 ml of fresh complete media. The cells were then incubated at 37° (5% CO2) for 48 hr. Following this period of incubation, the virus-containing media was pipetted into a 50-mL conical vial, centrifuged at 350G and passed through a 0.45 μm filter. The filtered, virus-containing media was then added directly to FG and BxPC-3 cell lines which had been grown to 60% confluency on P100 dishes. After a 6-hr incubation period, the media was changed. FG and BxPC-3 cells which had been successfully transfected were selected in puromycin-containing growth media over 1–2 weeks.

Cell lysates and immunoblot analysis

Cells were lysed in radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) containing complete protease inhibitors and PhosSTOP phosphatase inhibitors (Roche Applied Science). The lysates were left on ice for 30 min followed by centrifugation at 15,000G for 15 min, and then supernatants were collected. Protein concentration was determined using the Micro bicinchoninic acid assay (BCA) Protein Assay kit (Pierce). Immunoblotting was performed using between 5 and 30 μg of lysate. Samples were analyzed on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by immunoblotting. For immunoprecipitations, 500 μg of cell lysates were incubated with 1 μg of antibody for 30 min on ice followed by the addition of Protein A/G UltraLink Resin (Pierce) for 1 hr at 4°C with rotation. The beads were washed two quick times followed by two 15-min washes in RIPA buffer at 4°C with rotation. After the removal of the final wash, the beads were resuspended in 1× NuPAGE lithium dodecyl sulfate (LDS) sample buffer (Invitrogen) containing 1× NuPAGE sample reducing agent (Invitrogen) and were incubated at 60°C for 30 min to elute the protein from the beads. Samples were analyzed by SDS-PAGE and transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Millipore) for analysis of proteins at 4°C overnight. At this time, the membrane was blocked in blocking buffer (1× tris buffered saline (TBS) + 0.05% Tween + 5% milk) for at least 1 hr. The membrane was then probed with primary antibody. Detection of β-actin (1:10,000 Sigma) served as loading control. Goat anti-mouse–horseradish peroxidase (HRP Chemicon/Millipore) and goat anti-rabbit-HRP (Santa Cruz Biotechnology) were used as secondary antibodies at 1:5,000 dilution. The reaction was developed with Enhanced Chemiluminescence Plus reagent (GE Healthcare). When appropriate, membranes were stripped with Restore Western blot Stripping Buffer (Pierce) according to the manufacturer's specifications and reprobed with primary antibody.

Antilichamen

For immunoprecipitation, 1 μg of rabbit anti-RON C-20 (Santa Cruz Biotechnology) or 1 μg of mouse monoclonal anti-hemagglutinin (Santa Cruz Biotechnology) antibody was used. For immunoblotting, the following primary antibodies were used: rabbit anti-RON C-20 (1:500 Santa Cruz Biotechnologies), mouse anti-phospho-Akt (1:500), rabbit anti-Akt (1:1,000), rabbit anti-phospho-Erk (1:1,000), rabbit anti-Erk (1:1,000 Cell Signaling) and mouse anti-plectin (1:1000) (Abcam).

Proximity ligation assay

BxPC3 cells were grown to ∼50% confluence on eight chamber slides (Nunc Lab Tek). Cells were serum starved overnight, then treated with 100 ng/ml of MSP for 15 min. Cells were fixed with paraformaldehyde for 10 min, then permeablized with phosphate buffered saline (PBS) + 0.1% TritonX-100 (PBS-T). Primary antibody labeling was performed using RON C-20 (Santa Cruz Biotechnology) at 1:1,000 dilution and mouse anti-Plectin (Abcam) at 1 μg/ml in PBS-T overnight at 4°C. The proximity ligation assay (PLA) was then performed as previously described. 12 For the RON-Met kinase inhibitor (bristol myers squibb (BMS) 777607, Bristol Myers Squib), serum starved cells were treated with 100 nM of the inhibitor for 1 hr before MSP treatment with BMS being present during MSP stimulation. The phosphoinositide-3 (PI3) kinase inhibitor (LY294002, Cell Signaling) was used on serum starved cells at 50 μM for 1 hr before MSP treatment with the LY294002 compound being present during MSP stimulation. The mitogen-activated protein kinase (MEK) inhibitor U0126 (25 μM) was added to serum starved cells for 1 hr before MSP stimulation (100 ng/ml) with U0126 being present during MSP stimulation.

Immunofluorescentie

Cells were plated onto chamber slides (Nunc Lab Tek) to achieve ∼80% confluence. The next day cells were serum starved the overnight followed by treatment with 200 ng/ml of MSP for 15 min for BxPC3s and 30 min for FGs. Chambers were washed with PBS and fixed with 3.7% paraformaldehyde for 10 min. Cells were permeablized with PBS + 0.1% TritonX-100 (PBS-T). Primary antibody labeling was performed using rabbit anti RON C-20 (Santa Cruz Biotechnology) at 1:1,000 dilution and mouse anti-plectin (BD Biosciences) at 1:500 dilution in PBS-T overnight at 4°C. Negative control was comprised of normal mouse and rabbit IgG. Secondary antibodies Alexa goat anti Rabbit 594 and goat anti mouse 488 were used at 1:500 dilution for 1 hr at room temperature. The nucleus was labeled with DAPI. Labeling was visualized using a confocal microscope.

Cell proliferation assay

To determine the effect of RON stimulation on cell proliferation, 5 × 10 3 cells were plated per well in a 96-well plate in 200 μL of appropriate growth medium supplemented with 10% FBS and incubated overnight. The cells were then washed twice with PBS and then appropriate serum free growth media was added. The cells were incubated under these conditions for various time points (0, 24, 48, and 72 hr). Two hours before the designated time point, Alamar Blue (Biosource) was added to a final v/v concentration of 10% and allowed to incubate for 2 hr. An automated fluorescent plate reader at an excitation/emission of 530/590 nm was used to measure the proliferating cell population. For the 0-hr time point, Alamar Blue was added when the complete media was replaced with serum-free media. Cells stimulated with media + 10% FBS served as a positive control for proliferation, whereas media with Alamar Blue alone served as the blank, which was averaged and subtracted from the fluorescent value obtained for each well. Each experiment was done in triplicate and repeated as three independent experiments.

Scratch wound assays

BxPC3 and FG parental or plectin deficient cells were grown in six-well dishes to confluence in complete media. Cells were washed, placed in media containing 0.5% FBS and incubated overnight. The next day, four scratches were made in a plus shape with the end of a p200 barrier pipette tip. Fresh media containing 0.5% FBS was then added to each plate plus either PBS or 100 ng/ml of MSP. Dishes were photographed under ×10 magnification using a Nikon inverted microscope at t = 0 and, 18 hr for BxPC3 and 16 hr for FG cells. The wound area was calculated using the region setting in SPOT imaging software (SPOT Imaging Solutions). Percent wound coverage was calculated as follows: (1 – (area (μm 2 ) at t = final hour/area (μm 2 ) at t = 0)) × 100.


Acknowledgements

We thank J. Lewis for isolating e1036, S. George and R. Harrington for initial characterization of e1036, Y. Kohara for vab-19cDNAs, the Kazusa DNA Research Institute for the KIAA0172 cDNA clone, the C. elegans genome consortium for the sequences and cosmid DNAs, A. Fire for GFP vectors, and V. Praitis for her phalloidin staining protocol and SMA-1 antisera. We thank X. Huang, W.-M. Woo and N. Brown for discussions and comments on the manuscript. Some strains used here were obtained from the Caenorhabditis Genetics Center, which is supported by the NIH. YJ is an Assistant Investigator of the HHMI. This work was supported by a grant to ADC from the NIH (GM54657). The GenBank Accession Number for the vab-19 cDNA sequence is AY273823


Bekijk de video: Type of Cell Junctions - Desmosome, Hemidesmosomes and Gap Junctions (Januari- 2022).