Informatie

Waarom veroorzaakt de remming van translatie-initiatie de accumulatie van 80S-ribosomale monosomen?


Zoals ik heb gelezen in (1), zal remming van translatie-initiatie het aantal 80S-ribosomen verhogen, terwijl de fractie polysomen als gevolg van de polysoom-afvoer afneemt. Het netto-effect is om de verhouding polysoom/monosoom (P/M) te verlagen en we observeren dit bijvoorbeeld door ER-stress te induceren door tunicamycine in (2).

Ik begrijp de vermindering van polysomen - aangezien we niet interfereren met verlenging, werken polysomen normaal, vallen ze uiteindelijk af, maar nieuwe monosomen kunnen niet doorgaan naar het polysomale stadium vanwege geremde initiatie.

Maar waarom hopen de 80S-ribosomen zich op? Ik heb altijd gedacht dat 80S-ribosoom altijd gebonden is aan mRNA, anders dissocieert het als afzonderlijke 40S- en 60S-subeenheden. Betekent dit effect dus dat de geaccumuleerde 80S-fractie mRNA-vrij is en dat er dus "lege 80S-ribosomen", zoals beschreven in (1), kunnen bestaan?

Heel erg bedankt!

  1. https://books.google.co.uk/books?id=6sEq1xLu_hcC&pg=PA130&lpg=PA130&dq=polysome+translation+initiation&source=bl&ots=Un6JjImBJX&sig=ln9mn0KoJDJaVOGK8LbrEmMz9XE&hl=cs&sa=X&ei=x2JiVci8N4jX7Ab02YLgBQ&ved=0CGQQ6AEwCw#v=onepage&q=polysome%20translation% 20initiatie&f=false

  2. http://jcs.biologists.org/content/115/11/2443/F4.large.jpg">


    Het hangt af van het medicijn dat u gebruikt. Er is een pad dat het translatie-initiatiecomplex vormt dat begint met het binden van de mRNA's cap, de kleine subeenheid scant om de AUG te vinden, dan bindt de grote subeenheid, enzovoort. De 80 S-pieken op de dichtheidsgradiënten zijn niet leeg, ze liggen klaar op mRNA's die wachten om te starten (als je de remmer hebt verwijderd).


    Werkingsmechanisme van streptomycine in E. coli: onderbreking van de ribosoomcyclus bij aanvang van eiwitsynthese

    WERKINGSMECHANISME VAN STREPTOMYOCINE IN E COLI: INTERAPTIE VAN DE RIBOSOME CYCLUS BIJ DE INITATIE VAN EIWITSYNTHESE.

    Er zijn verschillende soorten antibiotica met een ander antimicrobieel mechanisme die kunnen worden gebruikt tegen grampositieve en negatieve bacteriën. Er zijn ook veel soorten classificaties die kunnen worden gebruikt om de antibiotica te classificeren. Sommige van deze antibiotica hebben een breed-spectrum bacterieel effect, terwijl andere een smal-spectrum bacterieel effect hebben. Sommigen van hen hebben een bacteriedodend effect (ze doden de bacteriën) en andere hebben een bacteriostatisch effect (ze remmen de bacteriegroei of replicatie). Sommige antibiotica kunnen zowel bacteriedodend als bacteriostatisch zijn.

    Verschillende antibiotica hebben verschillende werkingsmechanismen en doelwitplaatsen in bacteriële cellen. Er zijn vijf basismechanismen van antibiotische werking tegen bacteriële cellen:

    • Remming van celwandsynthese
    • Remming van eiwitsynthese (vertaling)
    • Verandering van celmembranen
    • Remming van nucleïnezuursynthese
    • Antimetabolietactiviteit

    Remming van celwandsynthese is het meest voorkomende mechanisme van antibiotica. De op een na grootste klasse antibiotica laten hun antimicrobiële effect zien door het translatiemechanisme in de cel te remmen. In het artikel van Luzzatto en collega's bewezen ze het antimicrobiële mechanisme van streptomycine Escherichia coli door de krant gepubliceerd in 1968.

    Er zijn een aantal manieren waarop antibiotica de translatie in de cel remmen. Dit zijn

    1. tRNA-nabootsing
    2. Remmers van peptide-botvorming
    3. Remmers van binding van tRNA aan de A-site
    4. Remmers van translocatie
    5. Binding aan 23S-RNA
    6. Binding aan het 30S-ribosoom

    Streptomycine behoort tot het antibioticum van de aminoglycosideklasse en staat bekend als een eiwitsyntheseremmer.

    In 1964, in een studie genaamd "Streptomycin, Suppression and the Code", uitgevoerd door Julian Davies en Walter Gilbert, waren ze zich bewust van de eiwitsynthese die de kracht van streptomycine remde, maar het mechanisme was onbekend. Eerdere studies van deze studie hadden gesuggereerd dat streptomycine de eiwitsynthese blokkeerde door sterk te binden aan nucleïnezuren. Julian Davies had geconcludeerd dat streptomycine enkele wijzigingen in de coderende eigenschappen had aangebracht. Bovendien leverde het bewijs dat de ribosomen de nauwkeurigheid van de meting controleren en mogelijk een rol spelen bij onderdrukking. Na die studie verlichtte Luzzatto in 1968 het onbekende mechanisme van streptomycine dat de translatie remt door dit onderzoek.

    In de krant van Luzzatto vonden ze dat een bepaalde concentratie (dodelijke concentratie) van streptomycine de ophoping van 70S-ribosomen in E coli cellen. Deze ribosomen zijn niet in staat om translatie in de cel te doen. Deze 70S-ribosomale eenheden die zich ophoopten, werden "streptomycine-monosomen" genoemd. Bovendien ontdekten ze dat deze eenheden bestaan ​​uit een complex van 30S- en 50S-subeenheden, tRNA, mRNA en streptomycine. Ze merkten op dat de 70S-subeenheden die uit streptomycine bestaan, abnormale initiatiecomplexen hadden die niet kunnen verlengen en daarom accumuleren. Dus concluderen ze dat streptomycinemoleculen op de een of andere manier de eiwitinitiatie "bevriezen" in E coli.

    Volgens hun bevindingen blokkeert streptomycine de bacteriële eiwitsynthese bij aanvang. Nadat intacte bacteriën zijn blootgesteld aan streptomycine, raken polysomen snel uitgeput en 70S-deeltjes. "De streptomycine-monomeren" bouwen zich op. Hoewel de vorming van het initiatiecomplex niet wordt beïnvloed, kan het in aanwezigheid van streptomycine gevormde complex geen eiwit synthetiseren en blijft het op zijn plaats gefixeerd. Er wordt voorgesteld dat ribosoom voorbij het beginstadium in staat is om hun beweging en onthechting voort te zetten, zodat een 70S ribosomaal complex van mRNA en 50S en 30S-eenheden met gebonden streptomycine resulteert. In feite is het initiatiecomplex bevroren.

    In hun experiment gebruikten ze Escherichia coli mutant sud 24 en laat het in fragiele vorm groeien om tijdens de vertalingen te kunnen lyseren en analyseren. Om het RNA tijdens translaties op te sporen, gebruikten ze radioactief gelabelde RNA's. Ze maten de snelheid van de moleculen met behulp van sucrosegradiëntanalyse om de grootteverdeling te bepalen.

    Ze gebruikten een streptomycineresistent derivaat (N21) en een gevoelige AB301-stam, gelabeld ala-transfer tRNA, en gelabeld F-met tRNA, natuurlijk mRNA (f-met afhankelijk), synthetisch mRNA (poly AUG, f-met onafhankelijk) en ook zij gebruikte een faageiwit genaamd R17.

    Op het moment dat ze streptomycine toevoegen, was het ribosoom de 30S- en de 50S-vorm en ook gebonden aan mRNA. Na intervallen van 20 en 40 minuten gaven ze (a) een afname in grote polyribosomen en in vrije 30S- en 50S-deeltjes vrij. (b) Accumulatie van 70S-monomeren. (figuur 1)

    De door de faag R17 gestuurde eiwitsynthese werd alleen waargenomen met streptomycine en streptomycine werd alleen waargenomen zonder de faag R17. Hun bevinding had aangetoond dat streptomycine de functie van het natuurlijke mRNA blokkeerde (fig. 2)

    Streptomycine blokkeerde de RNA-synthese die werd gestuurd door natuurlijk mRNA, maar niet door het synthetische mRNA. Het natuurlijke mRNA initieert de eiwitsynthese met behulp van f-met, maar het synthetische mRNA heeft de f-met niet nodig om de translatie te starten. Daarbij gaven ze vrij dat de streptomycine op de een of andere manier de f-met-grens op de 30S-ribosomale subeenheid blokkeerde en de F-met blokkeerde om te komen en te hechten om het translatieproces te starten. Het synthetische RNA-experiment blokkeerde echter niet door de streptomycine toe te voegen. De hoeveelheid S35f-met-tRNA werd verminderd door streptomycine en H3-ala-tRNA gebonden aan ribosomen.

    Ze realiseerden zich dat de geïnitieerde eiwitsynthese met 70S-ribosomen niet werd geblokkeerd en ging door wanneer streptomycine werd toegevoegd, maar alleen nieuwe translatieprocessen kwamen niet op gang. Dus door gebruik te maken van het synthetische mRNA en natuurlijk en ook door een radioactief label te gebruiken met de kennis van de f-met-vereiste voor de translatie, konden ze begrijpen dat dit werkingsmechanisme van streptomycine aan het begin stond direct na de associatie van ribosomale subeenheden.


    Toegangsopties

    Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

    Alle prijzen zijn NET prijzen.
    De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
    De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

    Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

    Alle prijzen zijn NET prijzen.


    Referenties

    Hinnebusch, A.G. Het scanmechanisme van eukaryote translatie-initiatie. Ann. ds. Biochem. 83, 779–812 (2014).

    Hinnebusch, A.G. & Lorsch, J.R. Het mechanisme van eukaryote translatie-initiatie: nieuwe inzichten en uitdagingen. Koude Lente Harb. Perspectief. Biol. 4, a011544 (2012).

    Jackson, R. J., Hellen, C. U. & Pestova, T. V. Het mechanisme van eukaryote translatie-initiatie en principes van de regulatie ervan. nat. ds. Mol. Cel Biol. 11, 113–127 (2010).

    Sonenberg, N. & Hinnebusch, A. G. Regulering van translatie-initiatie bij eukaryoten: mechanismen en biologische doelen. Cel 136, 731–745 (2009).

    Carvalho, M.D., Carvalho, J.F. & Merrick, W.C. Biologische karakterisering van verschillende vormen van verlengingsfactor 1 van konijnenreticulocyten. Boog. Biochem. Biofysica. 234, 603–611 (1984).

    Fischer, N. et al. Structuur van de E coli ribosoom-EF-Tu-complex bij <3 A-resolutie door Cs-gecorrigeerde cryo-EM. Natuur 520, 567–570 (2015).

    Shao, S. et al. Decoderen van ribosoom-mRNA-toestanden van zoogdieren door translationele GTPase-complexen. Cel 167, 1229–1240 (2016). Studie die cryo-EM-structuren met hoge resolutie beschrijft van ribosomen van zoogdieren gebonden door factoren die betrokken zijn bij translatieverlenging, terminatie en ribosoomredding.

    Zaher, H. S. & Green, R. Fidelity op moleculair niveau: lessen uit eiwitsynthese. Cel 136, 746–762 (2009).

    Beringer, M. & Rodnina, M. V. Het ribosomale peptidyltransferase. Mol. Cel 26, 311–321 (2007).

    Behrmann, E. et al. Structurele snapshots van het actief vertalen van menselijke ribosomen. Cel 161, 845–857 (2015).

    Budkevich, T. et al. Structuur en dynamiek van het zoogdier ribosomale pretranslocatiecomplex. Mol. Cel 44, 214–224 (2011).

    Moazed, D. & Noller, H.F. Intermediaire staten in de beweging van transfer-RNA in het ribosoom. Natuur 342, 142–148 (1989).

    Ferguson, A. et al. Functionele dynamiek binnen het menselijke ribosoom regelt de snelheid van actieve eiwitsynthese. Mol. Cel 60, 475–486 (2015).

    Spahn, C.M. et al. Domeinbewegingen van elongatiefactor eEF2 en het eukaryote 80S-ribosoom vergemakkelijken tRNA-translocatie. EMBO J. 23, 1008–1019 (2004).

    Taylor, D.J. et al. Structuren van gemodificeerde eEF2 80S-ribosoomcomplexen onthullen de rol van GTP-hydrolyse bij translocatie. EMBO J. 26, 2421–2431 (2007).

    Ling, C. & Ermolenko, D. N. Structurele inzichten in ribosoomtranslocatie. Wiley Interdiscipel. Rev. RNA 7, 620–636 (2016).

    Shoji, S., Walker, S.E. & Fredrick, K. Ribosomale translocatie: een stap dichter bij het moleculaire mechanisme. ACS Chem. Biol. 4, 93–107 (2009).

    Ermolenko, D. N. & Noller, H. F. mRNA-translocatie vindt plaats tijdens de tweede stap van ribosomale intersubunit-rotatie. nat. structuur. Mol. Biol. 18, 457–462 (2011).

    Ramrath, D.J. et al. Visualisatie van twee transfer-RNA's die tijdens het transport zijn opgesloten tijdens rekfactor G-gemedieerde translocatie. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 110, 20964–20969 (2013).

    Ratje, A.H. et al. Head swivel op het ribosoom vergemakkelijkt translocatie door middel van intra-subunit tRNA hybride sites. Natuur 468, 713–716 (2010).

    Andersen, C.B. et al. Structuur van eEF3 en het mechanisme van overdracht van RNA-afgifte van de E-site. Natuur 443, 663–668 (2006).

    Triana-Alonso, F.J., Chakraburtty, K. & Nierhaus, K.H. De verlengingsfactor 3 die uniek is in hogere schimmels en essentieel is voor eiwitbiosynthese, is een E-plaatsfactor. J. Biol. Chem. 270, 20473–20478 (1995).

    Gamble, C.E., Brule, C.E., Dean, K.M., Fields, S. & Grayhack, E.J. Aangrenzende codons werken samen om de translatie-efficiëntie in gist te moduleren. Cel 166, 679–690 (2016). Studie vond dat de volgorde van bepaalde codonparen de translatie remt, wat duidt op mogelijke communicatie tussen tRNA's in het ribosoom tijdens verlenging.

    Juszkiewicz, S. & Hegde, R. S. Initiatie van kwaliteitscontrole tijdens poly (A) -translatie vereist plaatsspecifieke ribosoom-ubiquitinatie. Mol. Cel 65, 743-750.e4 (2017).

    Matsuo, Y. et al. Ubiquitinatie van vastgelopen ribosoom triggert ribosoom-geassocieerde kwaliteitscontrole. nat. gemeenschappelijk 8, 159 (2017).

    Sundaramoorthy, E. et al. ZNF598 en RACK1 reguleren de ribosoom-geassocieerde kwaliteitscontrolefunctie van zoogdieren door regulerende 40S-ribosomale ubiquitylation te mediëren. Mol. Cel 65, 751–760 (2017).

    Silva, G. M., Finley, D. & Vogel, C. K63 polyubiquitinatie is een nieuwe modulator van de oxidatieve stressrespons. nat. structuur. Mol. Biol. 22, 116–123 (2015).

    Pavlov, M.Y. et al. Langzame vorming van peptidebindingen door proline en andere N-alkylaminozuren in translatie. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 106, 50–54 (2009).

    Wohlgemuth, I., Brenner, S., Beringer, M. & Rodnina, M.V. Modulatie van de snelheid van peptidyloverdracht op het ribosoom door de aard van substraten. J. Biol. Chem. 283, 32229–32235 (2008).

    Doerfel, L.K. et al. EF-P is essentieel voor snelle synthese van eiwitten die opeenvolgende prolineresiduen bevatten. Wetenschap 339, 85–88 (2013).

    Gutiérrez, E. et al. eIF5A bevordert de vertaling van polyproline-motieven. Mol. Cel 51, 35–45 (2013).

    Ude, S. et al. Translatieverlengingsfactor EF-P verlicht ribosoomstalling bij polyproline-strekkingen. Wetenschap 339, 82–85 (2013).

    Woolstenhulme, C.J. et al. Ontluikende peptiden die de eiwitsynthese in bacteriën blokkeren. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 110, E878–E887 (2013).

    Woolstenhulme, C.J., Guydosh, N.R., Green, R. & Buskirk, A.R. Zeer nauwkeurige analyse van translationeel pauzeren door ribosoomprofilering in bacteriën zonder EFP. Cel vertegenwoordiger 11, 13–21 (2015).

    Kulak, N.A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N. & Mann, M. Minimale, ingekapselde proteomische-monsterverwerking toegepast op de schatting van het aantal kopieën in eukaryote cellen. nat. Methoden: 11, 319–324 (2014).

    Schnier, J., Schwelberger, H.G., Smit-McBride, Z., Kang, H.A. & Hershey, J.W. Translatie-initiatiefactor 5A en de hypusine-modificatie ervan zijn essentieel voor de levensvatbaarheid van de cellen in de gist Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cel. Biol. 11, 3105–3114 (1991).

    Park, M.H., Cooper, H.L. & Folk, J.E. Identificatie van hypusine, een ongewoon aminozuur, in een eiwit van menselijke lymfocyten en van spermidine als zijn biosynthetische voorloper. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 78, 2869–2873 (1981).

    Benne, R. & Hershey, J.W. Het werkingsmechanisme van eiwitsynthese-initiatiefactoren van konijnenreticulocyten. J. Biol. Chem. 253, 3078–3087 (1978).

    Kemper, W. M., Berry, K.W. & Merrick, W.C. Zuivering en eigenschappen van de initiatiefactoren M2Bα en M2Bβ van de eiwitsynthese van konijnenreticulocyten. J. Biol. Chem. 251, 5551–5557 (1976).

    Schreier, M.H., Erni, B. & Staehelin, T. Initiatie van eiwitsynthese bij zoogdieren. I. Zuivering en karakterisering van zeven initiatiefactoren. J. Mol. Biol. 116, 727–753 (1977).

    Gregio, A.P., Cano, V.P., Avaca, J.S., Valentini, S.R. & Zanelli, C.F. eIF5A heeft een functie in de verlengingsstap van translatie in gist. Biochem. Biofysica. Onderzoek gemeenschappelijk 380, 785–790 (2009).

    Henderson, A. & Hershey, J.W. Eukaryote translatie-initiatiefactor (eIF) 5A stimuleert de eiwitsynthese in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 108, 6415–6419 (2011).

    Saini, P., Eyler, D.E., Green, R. & Dever, T.E. Hypusine-bevattend eiwit eIF5A bevordert de verlenging van de translatie. Natuur 459, 118–121 (2009).

    Melnikov, S. et al. Kristalstructuur van hypusine-bevattende translatiefactor eIF5A gebonden aan een geroteerd eukaryoot ribosoom. J. Mol. Biol. 428, 3570–3576 (2016).

    Schmidt, C. et al. Structuur van de gehypusinyleerde eukaryote translatiefactor eIF-5A gebonden aan het ribosoom. Nucleïnezuren Res. 44, 1944–1951 (2016). Studie die cryo-EM-structuur met hoge resolutie beschrijft van gist 80S-ribosoom gebonden door eIF5A dat mechanistische informatie onthult met betrekking tot de relevantie van eIF5A bij verlenging en beëindiging van globale translatie.

    Schuller, A.P., Wu, C.C., Dever, T.E. & Buskirk, A.R. & Green, R. eIF5A functioneert wereldwijd bij het verlengen en beëindigen van vertalingen. Mol. Cel 66, 194–205 (2017). Studie die de karakterisering van eIF5A beschrijft als een algemene translatiefactor die betrokken is bij zowel verlenging als terminatie met behulp van een combinatie van ribosoomprofilering en in vitro gereconstitueerde biochemie.

    Pelechano, V. & Alepuz, P. eIF5A vergemakkelijkt de terminatie van de translatie wereldwijd en bevordert de verlenging van veel niet-polyproline-specifieke tripeptide-sequenties. Nucleïnezuren Res. 45, 7326–7338 (2017).

    von der Haar, T. Een kwantitatieve schatting van de globale translationele activiteit in logaritmisch groeiende gistcellen. BMC Syst. Biol. 2, 87 (2008).

    Rossi, D. et al. Bewijs voor een negatieve coöperativiteit tussen eIF5A en eEF2 bij binding aan het ribosoom. PLoS ONE 11, e0154205 (2016).

    Gnirke, A., Geigenmuller, U., Rheinberger, H.J. & Nierhaus, L.H. Het allosterische drie-site-model voor de ribosomale verlengingscyclus. Analyse met een heteropolymeer mRNA. J. Biol. Chem. 264, 7291–7301 (1989).

    Nierhaus, K.H. Het allosterische drie-site-model voor de ribosomale verlengingscyclus: kenmerken en toekomst. Biochemie 29, 4997–5008 (1990).

    Choi, J. & Puglisi, J.D. Drie tRNA's op de langzame translatieverlenging van het ribosoom. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 114, 13691–13696 (2017).

    Zaher, H. S. & Green, R. Kwaliteitscontrole door het ribosoom na vorming van peptidebindingen. Natuur 457, 161–166 (2009).

    Plotkin, J. B. & Kudla, G. Synoniem maar niet hetzelfde: de oorzaken en gevolgen van codonbias. nat. Rev. Genet. 12, 32–42 (2011).

    Quax, T.E., Claassens, N.J., Soll, D. & van der Oost, J. Codon-bias als middel om genexpressie te verfijnen. Mol. Cel 59, 149–161 (2015).

    Ikemura, T. & Ozeki, H. Codongebruik en overdracht RNA-inhoud: organisme-specifieke codon-keuzepatronen met betrekking tot de isoacceptor-inhoud. Koude Lente Harb. Symp. aantal. Biol. 47, 1087–1097 (1983).

    dos Reis, M., Savva, R. & Wernisch, L. Het raadsel van codongebruiksvoorkeuren oplossen: een test voor translationele selectie. Nucleïnezuren Res. 32, 5036–5044 (2004).

    Pechmann, S. & Frydman, J. Evolutionaire conservatie van codonoptimaliteit onthult verborgen handtekeningen van cotranslationele vouwing. Natuur structuur. Mol. Biol. 20, 237–243 (2013).

    Sharp, P. M. & amp Li, W. H. De Codon Adaptation Index - een maatstaf voor directionele synonieme codongebruiksbias en de mogelijke toepassingen ervan. Nucleïnezuren Res. 15, 1281–1295 (1987).

    Sabi, R. & Tuller, T. Modellering van de efficiëntie van codon-tRNA-interacties op basis van voorkeur voor codongebruik. DNA-onderzoek 21, 511–526 (2014).

    Sabi, R., Volvovitch Daniel, R. & Tuller, T. stAIcalc: tRNA-adaptatie-indexcalculator op basis van soortspecifieke gewichten. Bio-informatica 33, 589–591 (2017).

    Dana, A. & Tuller, T. Het effect van tRNA-niveaus op decoderingstijden van mRNA-codons. Nucleïnezuren Res. 42, 9171–9181 (2014).

    Hussmann, J.A., Patchett, S., Johnson, A., Sawyer, S. & Press, W.H. Het begrijpen van vooroordelen in ribosoomprofileringsexperimenten onthult handtekeningen van translatiedynamiek in gist. PLoS Genet. 11, e1005732 (2015).

    Yu, C.H. et al. Codongebruik beïnvloedt de lokale snelheid van translatieverlenging om co-translationele eiwitvouwing te reguleren. Mol. Cel 59, 744–754 (2015). Onderzoeksbevinding dat codonkeuze de kinetiek van translatieverlenging en co-translationele vouwing beïnvloedt met behulp van een combinatie van biochemie en ribosoomprofilering.

    Gardin, J. et al. Meting van gemiddelde decoderingssnelheden van de 61 sense-codons in vivo. eLife 3, e03735 (2014).

    Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T. & Ehrenberg, M. Selectief opladen van tRNA-isoacceptoren verklaart patronen van codongebruik. Wetenschap 300, 1718–1722 (2003).

    Gallant, J.A. & Lindsley, D. Ribosomen kunnen over en voorbij "hongerige" codons glijden, waardoor de verlenging van de eiwitketen vele nucleotiden stroomafwaarts wordt hervat. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 95, 13771–13776 (1998).

    Gurvich, O.L., Baranov, P.V., Gesteland, R.F. & Atkins, J.F. Expressieniveaus beïnvloeden ribosomale frameshifting op de tandem zeldzame argininecodons AGG_AGG en AGA_AGA in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 4023–4032 (2005).

    Kane, J.F. Effecten van zeldzame codonclusters op expressie op hoog niveau van heterologe eiwitten in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnologie. 6, 494–500 (1995).

    Temperley, R., Richter, R., Dennerlein, S., Lightowlers, R. N. & Chrzanowska-Lightowlers, Z. M. Hongerige codons bevorderen frameshifting in menselijke mitochondriale ribosomen. Wetenschap 327, 301 (2010).

    Graille, M. & Seraphin, B. Surveillance-routes die eukaryote ribosomen redden die verloren zijn gegaan bij translatie. nat. ds. Mol. Cel Biol. 13, 727–735 (2012).

    Hanson, G. & Coller, J. Codon-optimaliteit, vooringenomenheid en gebruik bij translatie en mRNA-verval. nat. ds. Mol. Cel Biol. 19, 20–30 (2018).

    Belew, A.T. et al. Ribosomale frameshifting in het CCR5-mRNA wordt gereguleerd door mi-RNA's en de NMD-route. Natuur 512, 265–269 (2014).

    Biswas, P., Jiang, X., Pacchia, A.L., Dougherty, J.P. & Peltz, S.W. De ribosomale frameshifting-site van het humaan immunodeficiëntievirus type 1 is een invariante sequentiedeterminant en een belangrijk doelwit voor antivirale therapie. J. Virol. 78, 2082–2087 (2004).

    Caliskan, N. et al. Voorwaardelijke omschakeling tussen frameshifting-regimes bij translatie van dnaX-mRNA. Mol. Cel 66, 558-567.e4 (2017).

    Namy, O., Moran, S.J., Stuart, D.I., Gilbert, R.J. & Brierley, I. Een mechanische verklaring van de RNA-pseudoknoopfunctie bij geprogrammeerde ribosomale frameshifting. Natuur 441, 244–247 (2006).

    Yan, S., Wen, J.D., Bustamante, C. & Tinoco, I. Jr. Ribosoomexcursies tijdens mRNA-translocatie bemiddelen brede vertakking van frameshift-routes. Cel 160, 870–881 (2015).

    Koutmou, K.S. et al. Ribosomen glijden op lysine-coderende homopolymere A-rekken. eLife 4, e05534 (2015).

    Dinman, J.D. Mechanismen en implicaties van geprogrammeerde translationele frameshifting. Wiley Interdiscipel. Rev. RNA 3, 661–673 (2012).

    Jacks, T. et al. Karakterisering van ribosomale frameshifting in HIV-1 gag-pol-expressie. Natuur 331, 280–283 (1988).

    Wilson, W. et al. HIV-expressiestrategieën: ribosomale frameshifting wordt gestuurd door een korte sequentie in zowel zoogdier- als gistsystemen. Cel 55, 1159–1169 (1988).

    Dever, T.E. & Green, R. De verlengings-, beëindigings- en recyclingfasen van translatie in eukaryoten. Koude Lente Harb. Perspectief. Biol. 4, a013706 (2012).

    Song, H. et al. De kristalstructuur van menselijke eukaryote afgiftefactor eRF1 - mechanisme van stopcodonherkenning en peptidyl-tRNA-hydrolyse. Cel 100, 311–321 (2000).

    Frolova, L. et al. Een sterk geconserveerde eukaryote eiwitfamilie die eigenschappen bezit van een polypeptideketenafgiftefactor. Natuur 372, 701–703 (1994).

    Brown, A., Shao, S., Murray, J., Hegde, R. S. & Ramakrishnan, V. Structurele basis voor stopcodonherkenning bij eukaryoten. Natuur 524, 493–496 (2015). Studie die de cryo-EM-structuur met hoge resolutie beschrijft van een zoogdier eindigend ribosoom dat de moleculaire basis van stopcodonherkenning door eRF1 en de rol van het +4-nucleotide onthult.

    Matheisl, S., Berninghausen, O., Becker, T. & Beckmann, R. Structuur van een terminatiecomplex voor menselijke vertalingen. Nucleïnezuren Res. 43, 8615–8626 (2015).

    des Georges, A. et al. Structuur van het zoogdier ribosomale preterminatiecomplex geassocieerd met eRF1.eRF3. BBPNP. Nucleïnezuren Res. 42, 3409–3418 (2014).

    Frolova, L.Y. et al. Mutaties in het sterk geconserveerde GGQ-motief van klasse 1-polypeptide-afgiftefactoren maken een einde aan het vermogen van humaan eRF1 om peptidyl-tRNA-hydrolyse te activeren. RNA 5, 1014–1020 (1999).

    Korostelev, A. A. Structurele aspecten van translatiebeëindiging op het ribosoom. RNA 17, 1409–1421 (2011).

    Frolova, L. et al. Eukaryote polypeptideketenafgiftefactor eRF3 is een eRF1- en ribosoomafhankelijke guanosinetrifosfatase. RNA 2, 334–341 (1996).

    Kong, C. et al. Kristalstructuur en functionele analyse van de eukaryote klasse II-afgiftefactor eRF3 van S. pombé. Mol. Cel 14, 233–245 (2004).

    Alkalaeva, E.Z., Pisarev, A.V., Frolova, L.Y., Kisselev, L.L. & Pestova, T.V. In vitro reconstitutie van eukaryote translatie onthult coöperativiteit tussen afgiftefactoren eRF1 en eRF3. Cel 125, 1125–1136 (2006).

    Eyler, D.E. & Green, R. Duidelijke reactie van gistribosomen op een foutieve codering tijdens translatie. RNA 17, 925–932 (2011).

    Salas-Marco, J. & Bedwell, D. M. GTP-hydrolyse door eRF3 vergemakkelijkt het decoderen van stopcodons tijdens eukaryote translatiebeëindiging. Mol. Cel. Biol. 24, 7769–7778 (2004).

    Eyler, D.E., Wehner, K.A. & Green, R. Eukaryote afgiftefactor 3 is vereist voor meerdere omzettingen van katalyse van peptideafgifte door eukaryote afgiftefactor 1. J. Biol. Chem. 288, 29530–29538 (2013).

    Khoshnevis, S. et al. De ijzer-zwavel-eiwit RNase L-remmer functioneert bij het beëindigen van de translatie. EMBO-rep. 11, 214–219 (2010).

    Pisarev, A.V. et al. De rol van ABCE1 bij eukaryote ribosomale recycling na de terminatie. Mol. Cel 37, 196–210 (2010).

    Shoemaker, C. J. & Green, R. Kinetische analyse onthult de geordende koppeling van translatieterminatie en ribosoomrecycling in gist. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 108, E1392-1398 (2011).

    Preis, A. et al. Cryo-elektronenmicroscopische structuren van eukaryote translatieterminatiecomplexen die eRF1-eRF3 of eRF1-ABCE1 bevatten. Cel vertegenwoordiger 8, 59–65 (2014).

    Beznoskova, P. et al. Translatie-initiatiefactoren eIF3 en HCR1 regelen de translatiebeëindiging en stoppen het doorlezen van codons in gistcellen. PLoS Genet. 9, e1003962 (2013).

    Beznoskova, P., Wagner, S., Jansen, M.E., von der Haar, T. & Valasek, L.S. Translatie-initiatiefactor eIF3 bevordert het doorlezen van geprogrammeerde stopcodons. Nucleïnezuren Res. 43, 5099–5111 (2015).

    Ingolia, N.T., Lareau, L.F. & Weissman, J.S. Ribosoomprofilering van embryonale stamcellen van muizen onthult de complexiteit en dynamiek van zoogdierproteomen. Cel 147, 789–802 (2011).

    Brown, C.M., Stockwell, P.A., Trotman, C.N. & Tate, W.P. Sequentieanalyse suggereert dat tetra-nucleotiden de beëindiging van eiwitsynthese in eukaryoten signaleren. Nucleïnezuren Res. 18, 6339–6345 (1990).

    Bonetti, B., Fu, L., Moon, J. & Bedwell, D. M. De efficiëntie van translatiebeëindiging wordt bepaald door een synergetisch samenspel tussen stroomopwaartse en stroomafwaartse sequenties in Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Biol. 251, 334–345 (1995).

    Beznoskova, P., Gunisova, S. & Valasek, L. S. Regels voor UGA-N-decodering door bijna-verwante tRNA's en analyse van readthrough op korte uORF's in gist. RNA 22, 456–466 (2016).

    Floquet, C., Hatin, I., Rousset, J.P. & Bidou, L. Statistische analyse van readthrough-niveaus voor nonsense-mutaties in zoogdiercellen onthult een belangrijke bepalende factor voor de respons op gentamicine. PLoS Genet. 8, e1002608 (2012).

    Roy, B., Leszyk, J.D., Mangus, D.A. & Jacobson, A. Onzin-onderdrukking door bijna-verwante tRNA's maakt gebruik van alternatieve basenparing op codonposities 1 en 3. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 112, 3038–3043 (2015).

    Baranov, P.V., Atkins, J.F. & Yordanova, M.M. Augmented genetische decodering: globale, lokale en temporele veranderingen van decoderingsprocessen en codonbetekenis. nat. Rev. Genet. 16, 517–529 (2015).

    Dunn, J.G., Foo, C.K., Belletier, N.G., Gavis, E.R. & Weissman, J.S. Ribosoomprofilering onthult doordringende en gereguleerde stopcodon-readthrough in Drosophila melanogaster. eLife 2, e01179 (2013).

    Schueren, F. & Thoms, S. Functionele translationele readthrough: een systeembiologisch perspectief. PLoS Genet. 12, e1006196 (2016).

    Mottagui-Tabar, S., Tuite, M.F. & Isaksson, L.A. De invloed van 5'-codoncontext op translatiebeëindiging in Saccharomyces cerevisiae. EUR. J. Biochem. 257, 249–254 (1998).

    Harrell, L., Melcher, U. & Atkins, J.F. Overheersing van zes verschillende hexanucleotide-hercoderingssignalen 3' van doorgelezen stopcodons. Nucleïnezuren Res. 30, 2011–2017 (2002).

    Namy, O., Hatin, I. & Rousset, J.P. Impact van de zes nucleotiden stroomafwaarts van het stopcodon op translatiebeëindiging. EMBO-rep. 2, 787–793 (2001).

    Yordanova, M.M. et al. AMD1-mRNA maakt gebruik van ribosoomstalling als een mechanisme voor de vorming van moleculair geheugen. Natuur 553, 356–360 (2018).

    Janzen, D. M., Frolova, L. & Geballe, A.P. Remming van translatiebeëindiging gemedieerd door een interactie van eukaryote afgiftefactor 1 met een ontluikend peptidyl-tRNA. Mol. Cel. Biol. 22, 8562–8570 (2002).

    McClary, B. et al. Remming van eukaryote translatie door het natuurlijke antitumorproduct agelastatine A. Cel Chem. Biol. 24, 605-613.e5 (2017).

    Hoshino, S., Imai, M., Kobayashi, T., Uchida, N. & Katada, T. De eukaryote polypeptideketenafgevende factor (eRF3 / GSPT) die het translatieterminatiesignaal naar de 3'-Poly (A) -staart draagt van mRNA. Directe associatie van erf3/GSPT met polyadenylaat-bindend eiwit. J. Biol. Chem. 274, 16677–16680 (1999).

    Ivanov, P.V., Gehring, N.H., Kunz, J.B., Hentze, M.W. & Kulozik, A.E. Interacties tussen UPF1, eRF's, PABP en het exon-junctiecomplex suggereren een geïntegreerd model voor NMD-routes bij zoogdieren. EMBO J. 27, 736–747 (2008).

    Uchida, N., Hoshino, S., Imataka, H., Sonenberg, N. & Katada, T. Een nieuwe rol van het zoogdier GSPT/eRF3 dat associeert met poly(A)-bindend eiwit in Cap/Poly(A)- afhankelijke vertaling. J. Biol. Chem. 277, 50286–50292 (2002).

    Ivanov, A. et al. PABP verbetert de rekrutering van afgiftefactoren en stopt de herkenning van codons tijdens het beëindigen van de vertaling. Nucleïnezuren Res. 44, 7766–7776 (2016). Studie die de identificatie beschrijft van een directe rol voor PABP bij het stimuleren van translatiebeëindiging door de efficiëntie van rekrutering van eRF1-eRF3 naar het ribosoom in een gereconstitueerd biochemisch systeem te vergroten.

    Amrani, N. et al. Een faux 3'-UTR bevordert afwijkende beëindiging en triggert nonsens-gemedieerd mRNA-verval. Natuur 432, 112–118 (2004).

    Heaphy, S.M., Mariotti, M., Gladyshev, V.N., Atkins, J.F. & Baranov, P.V. Nieuwe ciliaire genetische codevarianten, waaronder de hertoewijzing van alle drie stopcodons om codons in Condylostoma magnum te detecteren. Mol. Biol. Evol. 33, 2885–2889 (2016).

    Swart, E.C., Serra, V., Petroni, G. & Nowacki, M. Genetische codes zonder speciaal stopcodon: contextafhankelijke vertalingsbeëindiging. Cel 166, 691–702 (2016). Onderzoek dat een verband legt tussen stopcodoncontext, PABP-nabijheid en de efficiëntie van translatieterminatie in organismen waar alle 64 codons kunnen coderen voor aminozuren.

    Zahonova, K., Kostygov, A. Y., Sevcikova, T., Yurchenko, V. & Elias, M. Een ongekende niet-canonieke nucleaire genetische code waarbij alle drie de terminatiecodons opnieuw zijn toegewezen als sense-codons. Curr. Biol. 26, 2364–2369 (2016).

    Capecchi, M.R., Hughes, S.H. & Wahl, G.M. Super-suppressors van gist zijn veranderde tRNA's die in staat zijn om een ​​nonsens-codon in vitro te vertalen. Cel 6, 269–277 (1975).

    Lobanov, A.V. et al. Positieafhankelijke beëindiging en wijdverbreide verplichte frameshifting in Euplotes-vertaling. nat. structuur. Mol. Biol. 24, 61–68 (2017).

    Castello, A. et al. Inzichten in RNA-biologie uit een atlas van zoogdier-mRNA-bindende eiwitten. Cel 149, 1393–1406 (2012).

    Eswarappa, S.M. et al. Geprogrammeerde translationele readthrough genereert anti-angiogene VEGF-Ax. Cel 157, 1605–1618 (2014).

    Gonzalez, C.I., Ruiz-Echevarria, M.J., Vasudevan, S., Henry, M.F. & Peltz, S.W. Het gist-hnRNP-achtige eiwit Hrp1/Nab4 markeert een transcript voor door onzin gemedieerd mRNA-verval. Mol. Cel 5, 489–499 (2000).

    Ruiz-Echevarria, M.J. & Peltz, S.W. Het RNA-bindende eiwit Pub1 moduleert de stabiliteit van transcripten die stroomopwaartse open leesramen bevatten. Cel 101, 741–751 (2000).

    Chester, A. et al. Het mRNA-bewerkingscomplex van apolipoproteïne B voert een multifunctionele cyclus uit en onderdrukt door onzin gemedieerd verval. EMBO J. 22, 3971–3982 (2003).

    Ge, Z., Quek, B.L., Beemon, K.L. & Hogg, J.R. Polypyrimidine-kanaalbindend eiwit 1 beschermt mRNA's tegen herkenning door de nonsense-gemedieerde mRNA-vervalroute. eLife 5, e11155 (2016). Onderzoek naar de rol van PTBP1 bij het beschermen van mRNA's tegen door nonsens gemedieerd verval, mogelijk door de terminatie van de translatie te beïnvloeden.

    Karcher, A., Schele, A. & Hopfner, K.P. X-Ray-structuur van het complete ABC-enzym ABCE1 van Pyrococcus abyssi. J. Biol. Chem. 283, 7962–7971 (2008).

    Barthelme, D. et al. Ribosoomrecycling hangt af van een mechanistische link tussen het FeS-clusterdomein en een conformationele schakelaar van de twin-ATPase ABCE1. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 108, 3228–3233 (2011).

    Pisarev, A.V., Hellen, C.U. & Pestova, T.V. Recycling van eukaryote posttermination ribosomale complexen. Cel 131, 286–299 (2007).

    Dmitriev, S.E. et al. GTP-onafhankelijke tRNA-afgifte aan de ribosomale P-site door een nieuwe eukaryote translatiefactor. J. Biol. Chem. 285, 26779–26787 (2010).

    Skabkin, M.A. et al. Activiteiten van Ligatin en MCT-1/DENR in eukaryote translatie-initiatie en ribosomale recycling. Genen Dev. 24, 1787–1801 (2010).

    Young, D.J., Guydosh, N.R., Zhang, F., Hinnebusch, A.G. & Green, R. Rli1 / ABCE1 recycleert terminerende ribosomen en regelt de herinitiatie van translatie in 3'UTR's in vivo. Cel 162, 872–884 (2015). Onderzoek naar de in vivo rol van ABCE1 bij ribosoomrecycling en de rol van Dom34 bij het redden van inefficiënt gerecycleerde ribosomen.

    Andersen, D. S. & Leevers, S. J. The essential Drosophila ATP-bindend cassettedomeineiwit, pixie, bindt het 40S-ribosoom op een ATP-afhankelijke manier en is vereist voor het initiëren van translatie. J. Biol. Chem. 282, 14752–14760 (2007).

    Chen, Z.Q. et al. Het essentiële ABCE1-eiwit van gewervelde dieren interageert met eukaryote initiatiefactoren. J. Biol. Chem. 281, 7452–7457 (2006).

    Dong, J. et al. Het essentiële ATP-bindende cassette-eiwit RLI1 functioneert bij translatie door de pre-initiatiecomplexassemblage te bevorderen. J. Biol. Chem. 279, 42157–42168 (2004).

    Heuer, A. et al. Structuur van het 40S-ABCE1 post-splitsingscomplex in ribosoomrecycling en translatie-initiatie. nat. structuur. Mol. Biol. 24, 453–460 (2017). Studie die de cryo-EM-structuur met hoge resolutie van het 40S-ABCE1-complex beschrijft dat mechanistische details biedt in een mogelijke dubbele rol voor ABCE1 bij zowel ribosoomrecycling als translatie-initiatie.

    Simonetti, A. et al. Herschikking van eIF3-perifere subeenheden na mRNA-binding en start-codonherkenning. Mol. Cel 63, 206–217 (2016).

    Mancera-Martinez, E., Brito Querido, J., Valasek, L.S., Simonetti, A. & Hashem, Y. ABCE1: Een speciale factor die de vertaling orkestreert op het kruispunt tussen recycling en initiatie. RNA Biol. 14, 1279–1285 (2017).

    Schuller, A. P. & Green, R. Het ABC (E1) van ribosoomrecycling en herinitiatie. Mol. Cel 66, 578–580 (2017).

    Brandman, O. & Hegde, R. S. Ribosoom-geassocieerde eiwitkwaliteitscontrole. Natuur structuur. Mol. Biol. 23, 7–15 (2016).

    Joazeiro, C. A. P. Ribosomale stilstand tijdens translatie: substraten leveren voor ribosoom-geassocieerde eiwitkwaliteitscontrole. Ann. ds. Cell Dev. Biol. 33, 343–368 (2017).

    Doma, M. K. & Parker, R. Endonucleolytische splitsing van eukaryotische mRNA's met stallen in translatie-verlenging. Natuur 440, 561–564 (2006).

    Graille, M., Chaillet, M. & van Tilbeurgh, H. Structuur van gist Dom34: een eiwit gerelateerd aan translatieterminatiefactor Erf1 en betrokken bij No-Go-verval. J. Biol. Chem. 283, 7145–7154 (2008).

    Lee, H.H. et al. Structurele en functionele inzichten in Dom34, een belangrijk onderdeel van no-go mRNA-verval. Mol. Cel 27, 938–950 (2007).

    Carr-Schmid, A., Pfund, C., Craig, E.A. & Kinzy, T.G. Nieuw G-eiwitcomplex waarvan de vereiste is gekoppeld aan de translationele status van de cel. Mol. Cel. Biol. 22, 2564–2574 (2002).

    Chen, L. et al. Structuur van het Dom34-Hbs1-complex en implicaties voor no-go-verval. nat. structuur. Mol. Biol. 17, 1233–1240 (2010).

    Kalisiak, K. et al. Een korte splicing-isovorm van HBS1L verbindt het cytoplasmatische exosoom en SKI-complexen bij mensen. Nucleïnezuren Res. 45, 2068–2080 (2017).

    Kowalinski, E. et al. Structuur van een cytoplasmatisch 11-subeenheid RNA exosoomcomplex. Mol. Cel 63, 125–134 (2016).

    Ishimura, R. et al. RNA-functie. Ribosoomstalling veroorzaakt door mutatie van een CNS-specifiek tRNA veroorzaakt neurodegeneratie. Wetenschap 345, 455–459 (2014).

    Shoemaker, C.J., Eyler, D.E. & Green, R. Dom34:Hbs1 bevordert subeenheiddissociatie en peptidyl-tRNA-drop-off om no-go-verval te initiëren. Wetenschap 330, 369–372 (2010).

    Pisareva, V.P., Skabkin, M.A., Hellen, C.U., Pestova, T.V. & Pisarev, A.V. Dissociatie door Pelota, Hbs1 en ABCE1 van lege 80S-ribosomen van zoogdieren en vastgelopen elongatiecomplexen. EMBO J. 30, 1804–1817 (2011).

    Guydosh, N.R. & Green, R. Dom34 redt ribosomen in 3′ onvertaalde regio's. Cel 156, 950–962 (2014).

    Guydosh, N.R. & Green, R. Translatie van poly(A)-staarten leidt tot precieze mRNA-splitsing. RNA 23, 749–761 (2017).

    Tsuboi, T. et al. Dom34:hbs1 speelt een algemene rol in kwaliteitscontrolesystemen door dissociatie van een vastgelopen ribosoom aan het 3'-uiteinde van afwijkend mRNA. Mol. Cel 46, 518–529 (2012).

    Guydosh, N.R., Kimmig, P., Walter, P. & Green, R. Gereguleerd Ire1-afhankelijk mRNA-verval vereist no-go mRNA-degradatie om endoplasmatisch reticulumhomeostase in S. pombé. eLife 6, e29216 (2017). Studie die een rol definieert voor Dom34-Hbs1 in de Ire1-gemedieerde ongevouwen eiwitrespons met behulp van gistgenetica en ribosoomprofilering.

    Brandman, O. et al. Een ribosoomgebonden kwaliteitscontrolecomplex veroorzaakt degradatie van ontluikende peptiden en signaleert translatiestress. Cel 151, 1042–1054 (2012).

    Bhattacharya, A., McIntosh, K.B., Willis, I.M. & Warner, J.R. Waarom Dom34 de groei van cellen stimuleert met defecten van de biosynthese van de 40S ribosomale subeenheid. Mol. Cel. Biol. 30, 5562–5571 (2010).

    van den Elzen, A.M., Schuller, A., Green, R. & Seraphin, B. Dom34-Hbs1-gemedieerde dissociatie van inactieve 80S-ribosomen bevordert herstart van translatie na stress. EMBO J. 33, 265–276 (2014).

    Balagopal, V. & Parker, R. Stm1 moduleert translatie na 80S-vorming in Saccharomyces cerevisiae. RNA 17, 835–842 (2011).

    Van Dyke, N., Baby, J. & Van Dyke, M.W. Stm1p, een ribosoom-geassocieerd eiwit, is belangrijk voor de eiwitsynthese in Saccharomyces cerevisiae onder voedingsstress. J. Mol. Biol. 358, 1023–1031 (2006).

    Van Dyke, N., Chanchorn, E. & Van Dyke, MW The Saccharomyces cerevisiae eiwit Stm1p vergemakkelijkt het behoud van ribosoom tijdens rust. Biochem. Biofysica. Onderzoek gemeenschappelijk 430, 745–750 (2013).

    Ben Shem, A. et al. De structuur van het eukaryote ribosoom met een resolutie van 3,0 A. Wetenschap 334, 1524–1529 (2011).

    Mills, E.W., Green, R. & Ingolia, N.T. Vertraagd verval van mRNA's verbetert de bloedplaatjesspecifieke translatie. Bloed 129, e38-e48 (2017).

    Mills, E.W., Wangen, J., Green, R. & Ingolia, N.T. Dynamische regulatie van een ribosoomreddingsroute in erytroïde cellen en bloedplaatjes. Cel vertegenwoordiger 17, 1–10 (2016). Studie die de identificatie beschrijft van ongebruikelijke ribosoomverdelingen op 3'-UTR's in erytroïde cellen en bloedplaatjes en een link naar defecten in ribosoomrecycling en redding in deze weefsels.

    Mills, E. W. & Green, R. Ribosomopathieën: er is kracht in aantallen. Wetenschap 358, eaan2755 (2017).

    Popp, M.W. & Maquat, L.E. Organiseren van principes van door zoogdieren gemedieerd mRNA-verval. Ann. Rev. Genet. 47, 139–165 (2013).

    Kervestin, S. & Jacobson, A. NMD: een veelzijdige reactie op voortijdige translationele beëindiging. nat. ds. Mol. Cel Biol. 13, 700–712 (2012).

    Holbrook, J.A., Neu-Yilik, G., Hentze, M.W. & Kulozik, A.E. Onzin-gemedieerd verval nadert de kliniek. nat. Genet. 36, 801–808 (2004).

    He, F., Peltz, S.W., Donahue, J.L., Rosbash, M. & Jacobson, A. Stabilisatie en ribosoomassociatie van niet-gesplitste pre-mRNA's in een upf1-mutant van gist. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 90, 7034–7038 (1993).

    Mitrovich, Q. M. & Anderson, P. Onproductief gesplitste ribosomale eiwit-mRNA's zijn natuurlijke doelen van mRNA-surveillance in C. elegans. Genen Dev. 14, 2173–2184 (2000).

    Mendell, J.T., Sharifi, N.A., Meyers, J.L., Martinez-Murillo, F. & Dietz, H.C.Onzinsurveillance reguleert de expressie van verschillende klassen van zoogdiertranscripten en dempt genomische ruis. nat. Genet. 36, 1073–1078 (2004).

    Welch, E. M. & Jacobson, A. Een intern open leeskader veroorzaakt door onzin gemedieerd verval van het gist SPT10-mRNA. EMBO J. 18, 6134–6145 (1999).

    Marquardt, S., Hazelbaker, D. Z. & Buratowski, S. Verschillende RNA-afbraakroutes en 3'-extensies van niet-coderende RNA-soorten van gist. Transcriptie 2, 145–154 (2011).

    Smith, J.E. et al. Vertaling van kleine open leeskaders binnen niet-geannoteerde RNA-transcripten in Saccharomyces cerevisiae. Cel vertegenwoordiger 7, 1858–1866 (2014).

    Le Hir, H., Gatfield, D., Izaurralde, E. & Moore, M.J. Het exon-exon-junctiecomplex biedt een bindingsplatform voor factoren die betrokken zijn bij mRNA-export en door onzin gemedieerd mRNA-verval. EMBO J. 20, 4987–4997 (2001).

    Melero, R. et al. De cryo-EM-structuur van het UPF-EJC-complex toont dat UPF1 klaar is voor het RNA 3'-uiteinde. nat. structuur. Mol. Biol. 19, 498–505 (2012).

    Peltz, S.W., Brown, A.H. & Jacobson, A. mRNA-destabilisatie veroorzaakt door voortijdige translationele beëindiging hangt af van ten minste drie cis-werkende sequentie-elementen en een trans-werkende factor. Genen Dev. 7, 1737–1754 (1993).

    Narla, A. & Ebert, B. L. Ribosomopathieën: menselijke aandoeningen van ribosoomdisfunctie. Bloed 115, 3196–3205 (2010).

    Draptchinskaia, N. et al. Het gen dat codeert voor ribosomaal eiwit S19 is gemuteerd in Diamond-Blackfan-anemie. nat. Genet. 21, 169–175 (1999).


    MATERIALEN EN METHODES

    Affiniteitsverknoping van s4U-bevattende mRNA-analogen aan menselijke ribosomen

    Menselijke ribosomale 40S- en 60S-subeenheden werden geïsoleerd uit de voldragen placenta, zoals beschreven in (23). Gezuiverd tRNA Phe (∼80%) en tRNA Val (∼70%) van Escherichia coli waren de vriendelijke geschenken van Dr V.I. Katunin (St. Petersburg Nuclear Physics Institute genoemd door BP Konstantinov van National Research Center 'Kurchatov Institute', Gatchina, Rusland). Gist-tRNA Asp-transcript werd verkregen door T7-transcriptie in vitro, zoals beschreven ( 24). DNA-templates voor de synthese van mRNA-analogen met willekeurig verdeelde s 4 U-residuen door T7-transcriptie in vitro werden verkregen door hybridisatie van de volgende oligodeoxyribonucleotide-paren: F-Asp, 5'-aaattaatacgactcactatagggaagaaagaagataaagaaaaagaa-3' en R-Asp, 5'-ttctttttctttatcttctttcttccctatagtgagtcgtattaattt-3′ F-PheagAsp, 5′ '-tttttctttatcgaattctttcttccctatagtgagtcgtattaattt-3' F-PheVal, 5'-aaattaatacgactcactatagggaagaaagaattcgtaaaagaaaaa-3 'en R-PheVal, 5'-tttttcttttacgaattctttcttccctatagtgagtcgtattaattt-3' F-PheVal (C-rijk), 5'-cgattaatacgactcactatagggaagccaccattcgtacaccaccac-3 'en R-PheVal ( C-rijk), 5′-gtggtggtgtacgaatggtggcttccctatagtgagtcgtattaatcg-3′. De T7-transcriptiereactie werd uitgevoerd zoals beschreven (25) de concentraties UTP en s4 UTP in het reactiemengsel waren 0,5 mM. Na de reactie werden de gesynthetiseerde RNA's gezuiverd door 12% denaturerende PAGE en gebruikt als mRNA-analogen. Er waren 5′-GGGAAGAAAGAAGAs 4 UAAAGAAAAAGAA-3′, 5′-GGGAAGAAAGAAs 4 Us 4 UCGs 4 UAAAAGAAAAA-3′, 5′-GGGAAGAAAGAAs 4 Us 4 UCGAs 4 UAAAGAAAAA-3′ en 5′-GGGAAGCCACCAs 4 Us 4 UCGs 4 UACACCACCAC -3′ hierna aangeduid als respectievelijk mRNA I, II, III en IV. Indien nodig werden de mRNA's en tRNA's 5'-uiteinde gedefosforyleerd met FastAP alkalische fosfatase (Thermo Scientific) en vervolgens 5'-uiteinde 32P-gelabeld in reactie met [γ-32P]ATP en T4-polynucleotidekinase. Complexen van 80S-ribosomen met mRNA's en tRNA's met codon-anticodon-interacties ofwel op de P-plaats of tegelijkertijd op de P- en A-plaatsen, werden verkregen volgens (12). De niveaus van binding aan 80S-ribosomen van 32P-gelabeld tRNA Asp of tRNA Phe zijn verwant aan een mRNA-triplet gericht op de P-site om een ​​ternair complex te vormen of aan de A-site om de laatste om te zetten in een quaternaire, en van de respectieve met 32P gemerkte mRNA's werden gemeten door middel van nitrocellulosefiltratieassay zoals beschreven (12). Voor verknoping in de ternaire complexen met mRNA's I-IV, omvatten de reactiemengsels 80S-ribosomen (0,83 M), 32P-gelabeld mRNA (2 M) en het tRNA (7 M) in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 ) met 100 mM KCl, 13 mM MgCl2 en 0,5 mM EDTA (buffer A). Voor verknoping in de quaternaire complexen met mRNA's II en III werden de respectieve reactieve mengsels aangevuld met het juiste tRNA tot een concentratie van 13 M. Na incubatie onder bindingsomstandigheden (12) werden de bovenstaande mengsels bestraald met mild UV-licht (λ > 300 nm) (26), gevolgd door analyse van verknoopte ribosomale eiwitten in 12% SDS PAGE zoals beschreven (12). De identificatie van de verknoopte ribosomale eiwitten werd uitgevoerd op basis van het vertragingseffect van de verknoopte RNA-fragmenten op de elektroforetische mobiliteit van ribosomale eiwitten die bekend zijn uit onze eerdere werken (zie bijvoorbeeld (7-9, 12, 14)).

    Cellen kweken en transfectie

    Het minigen van FLAG uS19 geamplificeerd met het gebruik van HEK293 cDNA en primers F (5′-acgtgaattcatggtggactacaaagacgatgacgacaaggcagaagtagagcagaag-3′) en R (5′-acgtgaattcttacttgagagggatgaagc-3′) werd ingevoegd in pAG-1-vector (26) op EcoRI-plaats in de voorwaartse richting. Het resulterende plasmide pAG-1 (FLAG uS19) werd gelineariseerd door BamHI en vervolgens gebruikt om HEK293-cellen (ATCC CRL-1573) te transfecteren met behulp van Lipofectamine LTX (Invitrogen). De selectie van celklonen die stabiel het doeleiwit produceerden, werd uitgevoerd zoals beschreven (26). Stabiele klonen werden getest op hun vermogen om FLAG uS19 te produceren na inductie van doxycycline (DOX) door western blotting met behulp van anti-FLAG M5 (Sigma, #F4042) zoals beschreven (26).

    PAR-CLIP-analyse van een stabiele cellijn die FLAG uS19 . produceert

    De PAR-CLIP-procedure werd uitgevoerd volgens (22) met enkele modificaties in drie biologische replica's. Gewoonlijk werden hechtende pAG-1(FLAG uS19)-afgeleide HEK293-cellen in vier petrischalen van 15 cm gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) dat 10% FBS en 100 U/ml penicilline-streptomycine bevat (allemaal van Thermo Fisher Scientific ) in CO2-broedstoof (5% CO2) bij 37°C. Bij 60-70% confluentie werd de productie van FLAG uS19 in cellen geïnduceerd met DOX (2 g / ml) en na 44 uur werd s 4 U toegevoegd tot 250 M. Na 6 uur werd cycloheximide toegevoegd tot een concentratie van 100 g/ml en werden de cellen 10 min op ijs gehouden, gevolgd door wassen met ijskoude PBS. Verknoping werd uitgevoerd door bestraling van de cellen met UV-licht bij 365 nm (0,5 J/cm2) in Bio-Link (Vilber Lourmat) op ijs. In het controle-experiment werd geen s4U aan het celmedium toegevoegd en werden de cellen niet met UV bestraald. Tenslotte werden de cellen geoogst met ijskoude PBS en gecentrifugeerd bij 1000 g.

    De celpellet werd gelyseerd in drie volumes lysisbuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton-X100, 100 g/ml cycloheximide en 0,02 U/μl Turbo DNase I (Ambion)) gedurende 10 minuten op ijs en vervolgens 10 keer fijngewreven door een naald van 29 G. Het cellysaat werd geklaard door 15 minuten bij 4°C te centrifugeren bij 20.000 g en het supernatant werd overgebracht naar een nieuwe Eppendorf-buis. RNase I (Ambion) werd toegevoegd tot 1,3 U/μl en het reactiemengsel werd gedurende 45 minuten bij omgevingstemperatuur geïncubeerd, gevolgd door de toevoeging van SUPERase In RNase-remmer (Thermo Fisher Scientific) tot 0,35 U/μl. Het mengsel werd vervolgens geklaard zoals hierboven beschreven en het supernatant (-750 l) werd in lagen aangebracht op 1 ml 30% sucrosekussen (met 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton-X100, 100 g/ml cycloheximide en 0,02 U/μl SUPERase In) in een SW60-rotorcentrifugebuis. Het vrije buisvolume werd aangevuld met 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) buffer met 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2 en 1 mM DTT, en de buis werd 16 uur bij 4°C gecentrifugeerd in SW60 Ti-rotor bij 25.000 rpm. De pellet werd opgelost in 10 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) dat 1% SDS bevat, 30 min bij 37°C geïncubeerd en vervolgens 20-voudig verdund met IP-buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1 % Nonidet P40 en proteaseremmercocktail (Sigma)). Het mengsel werd geklaard zoals hierboven beschreven, en anti-FLAG M2-antilichamen (Sigma, #F1804) gebonden aan magnetische Proteïne G-korrels (Dynabeads, Life Technologies) werden aan het supernatant toegevoegd. Gewoonlijk werd 10 g antilichamen in één experiment gebonden aan 40 μl Dynabeads zoals beschreven (26). Immunoprecipitatie werd uitgevoerd gedurende 3 uur bij 4°C op een roterend platform en het supernatant werd vervolgens verwijderd. De kralen werden driemaal gewassen met 1 ml IP-buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 0,05% Nonidet P40 en 0,5 mM DTT), driemaal met 1 ml HS-buffer (50 mM Tris-HCl ( pH 7,5), 500 mM NaCl, 0,05% Nonidet P40 en 0,5 mM DTT) en tweemaal met 1 ml Defos-buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 en 1 mM DTT). De overige procedures, waaronder de defosforilatie van RNA-fragmenten gecrosslinkt aan FLAG uS19, hun 5'-uiteinde labeling met [γ-32P]ATP en fosforylering met ATP evenals cross-link scheiding door SDS-PAGE gevolgd door overdracht op het nitrocellulosemembraan en de isolatie van verknoopte RNA-fragmenten werden uitgevoerd zoals beschreven (26).

    NGS-sequencing, gegevensverwerking en bio-informatica-analyse

    DNA-bibliotheken werden bereid volgens (27) en de sequentie ervan werd bepaald met 2 x 75 bp gepaarde reagentia op MiSeq (Illumina) in SB RAS Genomics Core Facility (Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk, Rusland). Lezingen waren demultiplexing door CEL-Seq-script (28). Adapter en sequenties van lage kwaliteit werden verwijderd met behulp van TrimGalore v.0.5.0-software (//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore). Read mapping werd uitgevoerd tegen het door Ensembl geannoteerde menselijke genoom (GRCh38.93) met STAR v.2.6.1-software (29). BAM-deduplicatie door unieke moleculaire indexen werd uitgevoerd met 'dedup'-script van UMI-tools (30). Overgangen werden gevonden door Basic Variant Detection in CLC GW v.12.0-software (Qiagen) en gefilterd door aangepaste python-scripts. De in dit onderzoek gerapporteerde uitgelezen gegevens zijn onder het toegangsnummer GSE128265 ingediend bij de GEO.

    De uS19-verknopingsplaatsen werden gedetecteerd door het verschijnen van karakteristieke T/C (voor plus DNA-stands) en A/G (voor minus DNA-strengen) overgangen in de sequencing-uitlezingen, die werden gevonden zoals hierboven beschreven, met parameters: minimale dekking , 5 minimum aantal, 1 minimum frequentie, 1%. De resulterende VCF-bestanden (Valant Call Format) werden gebruikt voor daaropvolgende downstream-analyse die werd uitgevoerd met behulp van R Bioconductor-platformpakketten. Genomische posities van VCF-bestanden werden gebruikt als coördinaten van verknopingssites en werden geannoteerd door ensembl-transcript-ID's en HGNC-gensymbolen met behulp van 'biomaRt'-pakket (31) en Ensembl-annotatie GRCh38.93. Coördinaten van overgangen die overeenkwamen met het niet-eiwit coderende deel van het genoom en het mitochondriale genoom, werden verwijderd uit het grootste deel van de daaropvolgende analyse. Genomische posities werden getransformeerd naar interne CDS-coördinaten volgens Ensembl-annotatie GRCh38.93. De resulterende pieken werden geïdentificeerd met behulp van de 'chipseq'- en 'coverage view'-pakketten en werden gematcht met de posities van de bovengenoemde overgangen. Alleen pieken die overlappen met overgangsposities en een dekking boven de drempel hebben, werden als leesclusters beschouwd. Van de overgangsposities die overeenkwamen met een bepaalde cluster, werd waar van toepassing alleen de positie met de hoogste T/C-overgangsdekking beschouwd als de belangrijkste verknopingssite.

    CDS-sequenties werden gedownload van Ensembl (www.ensembl.org/info/data/ftp/Homo_sapiens.GRCh38.cds.all.fa) en subsequenties van -19 triplet stroomopwaarts tot +19 triplet stroomafwaarts van de interne CDS-coördinaat van de overgang werden geëxtraheerd. Gezien de open leeskaders werden de resulterende sequenties vertaald in aminozuursequenties die werden gebruikt voor de LOGO-analyse met behulp van de Weblogo-tool (https://weblogo.berkeley.edu/). De leesclusters zijn gesorteerd op basis van de totale leesdekking van het cluster en de LOGO's voor de overgangscontext zijn gemaakt voor alle gevonden clusters, inclusief de 100 meest afgedekte ('top100'). Histogrammen en afbeeldingen werden gebouwd met behulp van geïntegreerde R-tools.

    De correlatie tussen PAR-CLIP-replica's werd gemeten met behulp van de standaard R-functie (cor), en de resulterende plots werden gegenereerd met behulp van het ggplot2-pakket. Om de onbewerkte meetwaarden met elkaar te vergelijken, werden correlatietabellen voor het aantal leesaantallen gegenereerd met behulp van de functie summaryOverlaps met de standaardparameters uit het GenomicAlignment-pakket ( 32). Voor alle geïdentificeerde clusters werd de totale dekking geschat met behulp van het CoverageView-pakket en vervolgens toegepast op correlatiemetingen.

    Eiwitten vinden met (E/K)12 motieven werd een set van alle menselijke eiwitsequenties teruggevonden van Ensembl (//www.ensembl.org/info/data/ftp/). De aminozuursequenties werden gescand op de aanwezigheid van een van de 2 12 (E/K)12 motieven met behulp van het Bioconductor Biostrings-pakket met de vcount-Pattern-functie met de max.mismatch-parameter gelijk aan 4 en andere standaardparameters.

    Ribosoomprofilering met cellen die FLAG uS19 produceren en cellen gekweekt in een medium dat s 4 U . bevat

    Voor ribosoomprofilering met HEK293-cellen die FLAG uS19 produceren, werden pAG-1(FLAG uS19)-afgeleide HEK293-cellen gekweekt in drie biologische replica's zoals in het PAR-CLIP-experiment. Voor dezelfde taak met HEK293-cellen gekweekt in aanwezigheid van s 4 U, werden de cellen gekweekt in petrischalen van 10 cm zoals hierboven beschreven in drie biologische replica's tot 60% confluentie, en vervolgens werd s 4 U toegevoegd aan de helft van de petrischalen tot 250 M, gevolgd door incubatie gedurende 16 uur en de cellenverzameling. Daaropvolgende manipulaties, waaronder cellyse, RNase I-behandeling van het lysaat en de centrifugatie ervan door een sucrosekussen waren dezelfde als hierboven beschreven. Met HEK293-cellen die FLAG uS19 produceerden, werd de resulterende pellet opgelost in 200 l buffer A en geïncubeerd met 15 μl Proteïne G-korrels die vooraf waren gebonden met anti-FLAG M2-antilichamen gedurende 3 uur bij 4 ° C gevolgd door scheiding van het supernatant van de kralen. Totaal RNA werd geïsoleerd uit de supernatantfractie die ribosomen met endogeen uS19 bevatte en uit ribosomen die op korrels achterbleven en uS19 FLAG bevatten met behulp van TRIzol (Ambion) volgens het protocol van de fabrikant. Totaal RNA van ribosomale pellet verkregen na centrifugatie van het cellysaat door een sucrosekussen in het experiment met HEK293-cellen gekweekt in aanwezigheid van s4U, werd op dezelfde manier geïsoleerd. Daaropvolgende procedures, waaronder selectie op grootte van RNA-fragmenten en zuivering, werden uitgevoerd volgens (33). DNA-bibliotheken werden bereid en gesequenced zoals hierboven. De overeenkomstige Ribo-seq-gegevens werden ingediend bij de GenBank onder de onderzoekstoelating PRJNA563539 en de steekproeftoetreding SRP220276.


    Abstract

    Genexpressie is zeer nauwkeurig en genereert zelden defecte eiwitten. Verschillende mechanismen zorgen voor deze betrouwbaarheid, waaronder gespecialiseerde bewakingsroutes die de cel ontdoen van mRNA's die onvolledig zijn verwerkt of die geen volledige open leeskaders hebben. Eén zo'n mechanisme, nonsense-gemedieerd mRNA-verval, wordt geactiveerd wanneer ribosomen een voortijdig translatie-beëindigings- of onzin-codon tegenkomen. Nieuw bewijs geeft aan dat de gespecialiseerde factoren die voor dit proces worden aangeworven, niet alleen een snelle afbraak van mRNA bevorderen, maar ook nodig zijn om een ​​slecht dissocieerbaar terminatiecomplex op te lossen.


    MATERIALEN EN METHODES

    Overzicht van het protocol

    Polysoomprofilering scheidt vertaalde mRNA's op een sucrosegradiënt volgens het aantal gebonden ribosomen. Eerst worden cellen gelyseerd en geladen bovenop een 15-40% sucrosegradiënt. Na ultracentrifugatie wordt de gradiënt gevolgd bij A254 met behulp van een stroomcel gekoppeld aan een spectrofotometer en vervolgens gefractioneerd in gelijke fracties: niet-vertaalde mRNA's (bovenste fracties) worden gescheiden van polysoom-geassocieerde mRNA's (onderste fracties). Fracties worden vervolgens verwerkt voor RNA-extractie, hetzij handmatig door zuurfenol-chloroform-extractie of in een 96-wells-formaat met behulp van een geautomatiseerde RNA-zuiveringsprocessor, waarbij tegelijkertijd verschillende gradiënten worden verwerkt. De translationele status van een bepaalde mRNA-soort wordt geanalyseerd door RT-PCR-amplificatie en de relatieve kwantificering ervan in elke fractie. Als alternatief kan de inhoud van de polysomale fracties worden geïdentificeerd met behulp van een globale analyse (zoals high-throughput sequencing), waardoor toegang wordt verleend tot het celtranslatoom. Een schematisch overzicht van de methode wordt weergegeven in figuur 1.

    Overzicht van het polysoomprofileringsprotocol om de vertaalactiviteit te analyseren. De verschillende stappen van het protocol omvatten (1) cellysis, (2) sucrose-gradiënt centrifugatie en (3) fractionering, (4) RNA-extractie en RNA-integriteitscontrole, (5) analyse van de translationele status van mRNA's. Zie de tekst voor details.

    Overzicht van het polysoomprofileringsprotocol om de vertaalactiviteit te analyseren. De verschillende stappen van het protocol omvatten (1) cellysis, (2) sucrose-gradiënt centrifugatie en (3) fractionering, (4) RNA-extractie en RNA-integriteitscontrole, (5) analyse van de translationele status van mRNA's. Zie de tekst voor details.

    Gedetailleerd protocol

    Sample collectie

    Experimenten werden uitgevoerd met behulp van Paracentrotus lividus of Sphaerechinus granularis zee-egels de hierin getoonde experimenten komen overeen met: P. lividus monsters. Zee-egels werden verzameld in de baaien van Crozon of Concarneau (Bretagne, Frankrijk). Gameten werden verkregen door intracoelomische injectie van 1 ml 0,1 M acetylcholine. Eieren werden verzameld in gefilterd zeewater (FSW), gefiltreerd op hydrofiel gaas en tweemaal gewassen in FSW door 2 minuten te centrifugeren bij 2000 rpm (Heraeus, Labofuge 400 met zwaaiende emmers). Eieren werden 40 seconden geïncubeerd in FSW aangevuld met 0,7 mM citroenzuur om de gelei-coating te verwijderen, en opnieuw gespoeld in FSW. Voor bevruchting werden eieren gesuspendeerd in FSW als een 5% suspensie. Sperma werd verzameld in een petrischaal en tot gebruik bewaard bij 4°C. Extemporane verdunning in FSW (10 l sperma in 1 ml FSW) activeert sperma voor bevruchting en 10 μl van dit verdunde sperma werd toegevoegd per ml eiersuspensie. Embryo's werden onder constant roeren bij 16°C gekweekt. Alleen partijen embryo's met een bevruchtings- en delingspercentage van meer dan 95% werden gebruikt.

    Cel lysis

    Eieren of embryo's werden verzameld in FSW door korte centrifugatie (1 min bij 1000 rpm, Heraeus, Labofuge 400 met zwaaiende emmers), en de pellet werd opnieuw gesuspendeerd in vier volumes koude lysisbuffer (10 mM Tris pH 7,4 250 mM KCl 10 mM MgCl2 25 mM ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetra-azijnzuur (EGTA) 0,4% Igepal 5% sucrose RNase-vrij water en geïmproviseerd 1 mM 1,4-dithiothreitol (DTT) 10 g/ml aprotinine 2 g/ml leupeptine 100 M emetine 40 E/ml RNase-remmer). Lysis werd uitgevoerd in een Dounce-homogenisator met 10 slagen van de strakke B-stamper. Alle stappen werden uitgevoerd bij 4°C, op ijs of in de koude kamer.Het lysaat werd vervolgens gedurende 10 minuten bij 13000 rpm in een tafelcentrifuge gecentrifugeerd om kernen en celresten te verwijderen. Het supernatant werd voorzichtig overgebracht in een nieuw microbuisje. Monsters kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof en bij -80°C worden bewaard tot verder gebruik voor polysoomfractionering.

    De concentratie van nucleïnezuur in het lysaat werd gemeten door absorptie bij A260nm van een monster van 5 l lysaat verdund in 1 ml water met behulp van een spectrofotometer. Uitgaande van 106 eieren of embryo's in een pellet van 250 l lag de typische opbrengst voor zee-egelmonsters gewoonlijk tussen 20 en 40 ODA260.

    Kritieke stappen voor de voorbereiding van lysaat

    Het hierboven beschreven protocol werd gedefinieerd na optimalisatie van verschillende parameters zoals uitgangsmateriaal (bevroren of verse eieren), samenstelling van de lysisbuffer en volume- en lysistechnieken. Optimalisatie van het protocol voor eicellen en embryo's van zee-egels wordt hieronder beschreven en de kwaliteit van het RNA in het lysaat werd getest voor elke variant van het protocol met behulp van zure fenol-chloroform-extractie en elektroforese. We bieden ook suggesties voor het aanpassen van dit protocol aan andere modellen en organismen.

    We hebben vastgesteld dat de RNA-kwaliteit verbeterde wanneer de lysaten werden bereid met verse eieren in plaats van met een bevroren eierpellet die bij -80 ° C werd bewaard (Figuur 2, lanen A en B). Als alternatief werkt bevriezen en malen onder vloeibare stikstof voorafgaand aan lysis voor organismen met celwanden of voor vaste weefsels (12, 25). Lysaten kunnen tot gebruik ingevroren worden bewaard bij -80°C, zonder aantoonbaar verlies van RNA-integriteit.

    RNA-kwaliteit met verschillende voorwaarden voor lysis van zee-egels. Lysis werd gedaan met een 25G naald (A–E) of een Dounce-homogenisator (F–J), op bevroren eieren (A) of verse eieren (B-J). Hetzelfde volume (V) eieren werd gelyseerd in toenemende volumes lysisbuffer variërend van 2: 1 tot 1: 4 (B-E). Een extra wassing met gefilterd zeewater FSW (G) of Ca2+-vrij SW (H) werd getest vóór lysis. Lysisbuffer bevatte ofwel 1 mM EDTA (F) of 25 mM EGTA (I en J). Twee RNA-hoeveelheden bereid met behulp van het geoptimaliseerde protocol toonden alleen het 28S- en 18S-RNA zonder afbraakproducten (baan I: 250 ng baan J: 1 g). RNA's van elk lysaat werden verkregen na een zure fenol-chloroform-extractie en gescheiden op een 2% agarose-TBE-gel om te controleren op integriteit.

    RNA-kwaliteit met verschillende voorwaarden voor lysis van zee-egels. Lysis werd gedaan met een 25G naald (A–E) of een Dounce-homogenisator (F–J), op bevroren eieren (A) of verse eieren (B-J). Hetzelfde volume (V) eieren werd gelyseerd in toenemende volumes lysisbuffer variërend van 2: 1 tot 1: 4 (B-E). Een extra wassing met gefilterd zeewater FSW (G) of Ca2+-vrij SW (H) werd getest vóór lysis. Lysisbuffer bevatte ofwel 1 mM EDTA (F) of 25 mM EGTA (I en J). Twee RNA-hoeveelheden bereid met behulp van het geoptimaliseerde protocol toonden alleen het 28S- en 18S-RNA zonder afbraakproducten (baan I: 250 ng baan J: 1 g). RNA's van elk lysaat werden verkregen na een zure fenol-chloroform-extractie en gescheiden op een 2% agarose-TBE-gel om te controleren op integriteit.

    De verhouding van het volume van de eierpellet tot lysisbuffer werd geoptimaliseerd in onze omstandigheden om een ​​lysaat te verkrijgen dat voldoende geconcentreerd was voor daaropvolgende polysoomzuivering, zonder afbreuk te doen aan de RNA-kwaliteit (Figuur 2, banen B-E). De optimale verhouding was één volume eierpellet tot vier volumes lysisbuffer (1:4 Figuur 2, baan E). De externe lagere banden die worden waargenomen in lanen A, B, C en D komen overeen met 18S- en 28S-ribosomale RNA-afbraakproducten.

    Er werden twee lysistechnieken getest: mechanisch scheren door een 25G-naald (routinematig gebruikt voor eiwitlysaten in ons laboratorium) en Dounce-homogenisatie. In onze experimenten verbeterde het gebruik van een Dounce-weefselmolen de RNA-kwaliteit (Figuur 2, banen E en F). Met behulp van een Dounce van 7 ml met de strakke B-stamper, die een afstand van 20-55 m tussen stamper en cilinder laat, waren we in staat om cellen te lyseren zonder de kern te breken om cytoplasmatisch RNA te isoleren: de diameter van zee-egeleieren is 100 m, terwijl de diameter van de kern is minder dan 20 m. De juiste lysis van de eieren werd gecontroleerd onder een lichtmicroscoop en er waren 10 slagen nodig om 100% van de gelyseerde cellen te verkrijgen.

    Eicellen en embryo's van zee-egels bevatten een hoge nuclease-activiteit die afhankelijk is van Ca2+-ionen (26, 27). Een rapport suggereert om ze vóór de lysisstap in Ca2+-vrij zeewater te spoelen om de RNA-integriteit te verbeteren (27). In onze handen en in de egelsoort die we gebruikten, verbeterde deze stap de RNA-kwaliteit niet significant (Figuur 2, banen F-H). De opname van EGTA in de lysisbuffer (27) verbeterde echter de RNA-kwaliteit en de reproduceerbaarheid ervan in de lysaten (Figuur 2, zie lanen F, I en J). We merkten ook dat de buffer met hoog zoutgehalte de RNA-integriteit bewaarde, daarom werd 250 mM KCl ook opgenomen in onze lysisbuffer voor zee-egels.

    Om polysomen te genereren die de translatiestatus van de cel nauwkeurig weerspiegelen, moet de ribosoombeweging op het mRNA tijdens de monstervoorbereiding worden geminimaliseerd om effectief te voorkomen dat ribosomen van het mRNA aflopen. Daarom hebben we een translatie-elongatieremmer toegevoegd. Cycloheximide is de meest gebruikte remmer in protocollen voor polysoomprofilering die zijn beschreven voor zoogdiercellen (12). In zee-egelembryo's werkt cycloheximide niet, maar emetine is een zeer efficiënte remmer van eiwitsynthese (28). We hebben daarom emetine (100 M) opgenomen in eiersuspensies of embryoculturen 5 minuten vóór het verzamelen van monsters en in de lysisbuffer.

    Een combinatie van anti-proteasen (bijvoorbeeld aprotinine en leupeptine) of een in de handel verkrijgbare anti-proteasecocktail is nodig om eiwitafbraak te voorkomen en de kwaliteit van het polysoom te verbeteren. Extra detergentia kunnen in de lysaatbuffer worden opgenomen, zoals Triton X-100 en natriumdeoxycholaat om membraangebonden polysomen in zoogdierweefsel of kweekcellen te extraheren (12, 29) of cetyltrimethylammoniumbromide in polysacharidebevattende organismen (30). Verschillende RNase-remmers kunnen in combinatie worden gebruikt om de RNase-activiteit volledig te remmen, zoals heparine of vanadyl ribonucleosidecomplex (12, 29). Heparine, waarvan bekend is dat het een remmer is van de RT-PCR-reactie, kan worden verwijderd door de RNA-monsters te behandelen met heparinase I (31). In onze experimenten gebruikten we alleen een commerciële RNase-remmer (van Promega), met een bevredigende output van het gezuiverde RNA van zee-egellysaten.

    We raden aan een cytoplasmatische RNA-integriteitscontrole uit te voeren voordat u doorgaat met polysoomfractionering. RNA werd gezuiverd uit een aliquot van het lysaat door extractie met zure fenol-chloroform en opgelost op een agarose-Tris/Borate/EDTA (TBE)-gel om te verifiëren dat er geen afbraak was: ribosomale RNA-banden verschenen als twee scherpe banden op een agarosegel (zie figuur 2, lanen I en J). Op een Bioanalyzer kan de kwaliteit verder worden bepaald. Het RNA-integriteitsnummer, dat een meting geeft van de mate van afbraak, zou idealiter dicht bij 10 moeten liggen, wat overeenkomt met intact RNA (aanvullende gegevens).

    Polysoomfractionering

    Vorming van sucrosedichtheidsgradiënt

    Lysaten verkregen zoals hierboven beschreven werden geladen op een lineaire sucrosedichtheidsgradiënt van 15-40%. Twee 15 en 40% sucrosebuffers werden bereid in 10 mM Tris pH 7,4 10 mM MgCl2 250 mM KCl 25 mM EGTA 1 mM DTT. Om een ​​lineaire gradiënt te verkrijgen, hebben we het Gradient Master-apparaat (BioComp) gebruikt dat is uitgerust met buizen die zijn aangepast voor een SW41-rotor. We gebruikten 6 ml van elke sucrosebuffer in elke gradiëntbuis. In de ultracentrifugebuis werd de lichte sucrose-oplossing onderlaag gebracht met de zware sucrose-oplossing met behulp van een canule die was bevestigd aan een injectiespuit van 10 ml. De introductie van luchtbellen of het mengen van de twee oplossingen moet tijdens deze stap zorgvuldig worden vermeden. Het programma 'SW41 Short Gradient' met het overeenkomstige bereik van sucrosepercentage werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Dit programma duurt enkele minuten (2 min. 21 s voor een hellingspercentage van 15-40%) en produceert in één keer tot zes reproduceerbare lineaire hellingen. De hellingen moeten met zorg worden behandeld om verstoring te voorkomen en gedurende ten minste 1 uur bij 4 ° C worden bewaard. Het percentage sucrose dat wordt gebruikt voor lineaire gradiënten kan worden aangepast om de scheiding van polysomale fracties te optimaliseren volgens het biologische monster of experiment.

    Monster laden en ultracentrifugatie

    Bij het vergelijken van twee biologische omstandigheden, dezelfde hoeveelheid lysaat (equivalente ODA260) moet bovenop elke helling worden geladen. Het maximale volume lysaat dat op het verloop kan worden afgezet is 500 l, met een maximum van 25 ODA260. In onze handen werd een betere scheiding van de 40S, 60S en ribosoompieken verkregen wanneer 10 ODA260 werd op de gradiënt geladen, typisch overeenkomend met 350 l lysaat. Het laden werd uitgevoerd door het lysaat voorzichtig op de bovenkant van de gradiënt te pipetteren. Vervolgens werden de gradiëntbuizen zorgvuldig uitgebalanceerd voordat de ultracentrifugatierun werd gestart bij 38000 rpm gedurende 2,5 uur in een Beckman SW41 Ti-rotor bij 4°C. De versnelling werd op de maximale waarde ingesteld en om elke storing te voorkomen, werd de vertraging op de minimale waarde ingesteld. Zodra de ultracentrifugatie-run was voltooid, werden de gradiënten op 4°C gehouden voor onmiddellijke fractionering.

    Polysoomgradiëntprofiel en verzameling van breuken

    Tijdens ultracentrifugatie werd het Isco Density Gradient Fractionation System opgezet volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Dit dichtheidsgradiëntsysteem is uitgerust met een spectrofotometer met een 254 nm filter (UA-6 UV/VIS-detector, Isco) en produceert een continu absorptieprofiel wanneer de gradiënt wordt verzameld. Fractionering werd uitgevoerd door de bodem van de gecentrifugeerde buis te doorboren om een ​​dichte chase-oplossing te introduceren en de intacte gradiënt te verhogen door bulkstroom. Voor elk experiment werd het gehele systeem eerst gewassen met 0,1 M NaOH en daarna grondig met met DEPC behandeld water. In onze experimenten werd de peristaltische pomp ingesteld op een snelheid die overeenkomt met 0,9 ml/min.

    Na centrifugatie werd de centrifugebuis verbonden met een stroomcel en het doorprikapparaat. De 50% sucrose-chase-oplossing werd geïnjecteerd door de buis vanaf de onderkant te doorboren, waardoor de gradiënt op een continue manier in de stroomcel werd geduwd. Fracties werden tijdens het verzamelen op ijs bewaard om RNA-degradatie te voorkomen. Het inbrengen van luchtbellen in het systeem moet worden vermeden, omdat luchtbellen het verloop verstoren. Een typisch polysoomprofiel (Figuur 3A) toonde eerst een piek van A254 absorberend materiaal, dat de niet-vertaalde mRNA's bevat, vervolgens de twee pieken van de kleine en grote ribosomale subeenheden, de monosoompiek en tenslotte de polysomale pieken. Polysoomprofielen kunnen variëren afhankelijk van de algemene vertaalactiviteit. In onbevruchte zee-egeleieren is bijvoorbeeld <2% van de ribosomen betrokken bij polysomen en zijn polysoompieken nauwelijks waarneembaar ((19) Figuur 3A). Na bevruchting neemt de activiteit van de eiwitsynthese toe en neemt het aandeel ribosomen in polysomen toe naarmate de ontwikkeling vordert (Figuur 3A).

    (EEN) Polysoomgradiëntprofiel tijdens vroege ontwikkeling. Optische dichtheidsprofielen (ODA254) van polysoomgradiëntprofielen worden getoond, overeenkomend met onbevruchte eieren (UnF), 1 uur na bevruchting embryo's (F) en late-blastula-stadium embryo's 30 uur na bevruchting (Blastula). De gebieden onder de curve (AUC) van polysomen en monosomen werden gemeten en de polysoom: monosoomverhouding werd vervolgens berekend voor de drie ontwikkelingsstadia foutbalken vertegenwoordigen SEM en statistieken werden gedaan met behulp van Student's t-toets (P-waarde < 0,01). (ZIJN) Polysoomgradiëntprofielen en overeenkomstige RNA-profielen na behandeling met polysoomverstoorders. Optische dichtheidsprofielen en geëxtraheerde RNA's van polysoomgradiënten van bevruchte eieren (B), behandeld met 30 mM EDTA (C), 2 mM puromycine in vitro (D) en 0,6 mM puromycine in vivo (E) worden getoond. De RNA's van elke fractie van de polysoomgradiënt werden gescheiden op 2% agarose-TBE-gels.

    (EEN) Polysoomgradiëntprofiel tijdens vroege ontwikkeling. Optische dichtheidsprofielen (ODA254) van polysoomgradiëntprofielen worden getoond, overeenkomend met onbevruchte eieren (UnF), 1 uur na bevruchting embryo's (F) en late-blastula-stadium embryo's 30 uur na bevruchting (Blastula). De gebieden onder de curve (AUC) van polysomen en monosomen werden gemeten en de polysoom: monosoomverhouding werd vervolgens berekend voor de drie ontwikkelingsstadia foutbalken vertegenwoordigen SEM en statistieken werden gedaan met behulp van Student's t-toets (P-waarde < 0,01). (ZIJN) Polysoomgradiëntprofielen en overeenkomstige RNA-profielen na behandeling met polysoomverstoorders. Optische dichtheidsprofielen en geëxtraheerde RNA's van polysoomgradiënten van bevruchte eieren (B), behandeld met 30 mM EDTA (C), 2 mM puromycine in vitro (D) en 0,6 mM puromycine in vivo (E) worden getoond. De RNA's van elke fractie van de polysoomgradiënt werden gescheiden op 2% agarose-TBE-gels.

    RNA-zuivering en profielen

    De RNA's van elke fractie werden geëxtraheerd met één volume zuur fenol-chloroform (vol:vol) en geprecipiteerd met één volume isopropanol. Ethanol-natriumacetaatprecipitatie kan niet worden gebruikt vanwege de hoge sucroseconcentratie in de laatste fracties. RNA's werden gepelleteerd in een tafelcentrifuge bij 13000 rpm gedurende 10 minuten bij 4°C, gewassen met 70% ethanol, opnieuw gepelleteerd en 20 minuten aan de lucht gedroogd. RNA's van elke fractie werden opnieuw gesuspendeerd in hetzelfde volume RNase-vrij water (een twintigste van het oorspronkelijke fractievolume). Een aliquot van elke fractie werd gebruikt om de RNA-kwaliteit op een agarosegel te controleren. Het polysoomprofiel van bevruchte embryo's en het overeenkomstige RNA-profiel van de 15-40% sucrosegradiënt gescheiden op een agarosegel worden weergegeven in figuur 3B. In de eerste fracties waren alleen RNA's met een laag molecuulgewicht zichtbaar, vervolgens werden fracties die alleen 40S-subeenheden bevatten geïsoleerd, zoals blijkt uit de aanwezigheid van de 18S-rRNA-band, gevolgd door de 60S-piek, zoals blijkt uit de 28S-rRNA-band. In het midden van de gradiënt waren de banden intenser vanwege het hoge aandeel monosomen. Vanaf fractie 13 waren 28S en 18S RNA's aanwezig met een 28S:18S-verhouding gelijk aan 2:1, wat staat voor polysomale fracties. Gemiddeld vanaf 10 ODA260 geladen op de gradiënt, waren de typische RNA-opbrengsten 750 ng per polysoomfractie.

    Protocollen bevelen vaak aan om een ​​proteïnase K-behandeling te gebruiken vóór RNA-extractie (10 mM Tris pH 8, 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 0,5% natriumdodecylsulfaat en 200 μg/ml proteïnase K, gedurende 25 min bij 50°C) om het herstel van RNA's van polysoomgradiënten (32). Hoewel het voor specifieke monsters kan helpen, heeft de proteïnase K-behandeling in onze handen de kwaliteit of kwantiteit van RNA niet significant verbeterd (gegevens niet getoond).

    Analyse van de translationele status van mRNA's

    Een cruciaal punt van translatieanalyses is om te verifiëren dat mRNA's die aanwezig zijn in polysoomfracties geassocieerd zijn met het vertalen van polysomen en niet alleen samen met hen bezinken. In de cel worden niet-vertaalde mRNA's geassocieerd met RNA-bindende eiwitten in zogenaamde messenger ribonucleoparticles (mRNP's) of met vastgelopen polysomen, die in dezelfde fracties als polysomen kunnen sedimenteren wanneer ze worden gezuiverd op sucrosegradiënten (19, 33). Om onderscheid te maken tussen actieve polysomen en co-sedimenterende mRNP's of vastgelopen polysomen, hebben we onze monsters behandeld met een polysoomverstoorder voorafgaand aan polysoomzuivering. De twee veelgebruikte disrupters zijn EDTA en puromycine. EDTA cheleert Mg2+-ionen en dissocieert de subeenheden van het ribosoom. EDTA (30 mM uiteindelijk) werd toegevoegd na lysaatbereiding, voorafgaand aan gradiëntbelading. Gradiënten moeten ook worden aangevuld met 10 mM EDTA en bereid zonder Mg2+. Aangezien EDTA mogelijk invloed kan hebben op mRNP's, waarvan de vorming kan afhangen van Mg2+ , heeft het antibioticum puromycine gewoonlijk de voorkeur. Puromycine veroorzaakt de dissociatie van de ribosomen in de verlengingsstap van translatie en beïnvloedt alleen actieve polysomen (34). Puromycine kan worden toegevoegd in vivo vóór lysis (0,6 mM in ei-suspensie van zee-egels of embryocultuur) of in vitro na lysaatbereiding (2 mM in lysaat), wanneer monsters niet gemakkelijk beschikbaar zijn voor puromycine in vivo incubatie (23, 35). In beide gevallen wordt het lysaat aangevuld met 500 mM KCl, geïncubeerd gedurende 15 minuten bij 4°C en vervolgens gedurende 15 minuten bij 37°C voordat het op de sucrosegradiënt wordt geladen (35).

    EDTA-behandeling verstoorde het gradiëntprofiel, met een hoog verlies van RNA-integriteit (Figuur 3C). Het toevoegen van meer RNase-remmer aan lysaten en in de sucrosegradiënt verbeterde de RNA-kwaliteit (gegevens niet getoond). Daarentegen is het gebruik van puromycine ofwel in vitro of in vivo had geen invloed op de RNA-kwaliteit na zuivering. RNA's van polysoomfracties verschoven naar lichtere fracties in met puromycine behandelde lysaten (Figuur 3D en E). We gebruikten daarom de puromycine-behandeling voor het beoordelen van de vertaling van een specifiek mRNA.

    Na polysoomprofilering en parallel gebruik van de puromycine-controles, kan de translationele status van een specifiek mRNA worden beoordeeld met Northern-blot of RT-PCR. De aanwezigheid van het mRNA kan in elke fractie worden gedetecteerd en na kwantificering van het signaal werd de specifieke mRNA-verdeling uitgedrukt als een percentage van het totale signaal. Een illustratie van deze benadering wordt hieronder gegeven, door de translationele status van mRNA's voor en na bevruchting in zee-egels te analyseren.


    Discussie

    Hier onderzoeken we de translationele regulatie van APC-afhankelijke RNA's die zijn gericht op celuitsteeksels. We vinden dat de cytoplasmatische positie van APC-afhankelijke RNA's hun translatie niet beïnvloedt, omdat ze op dezelfde manier kunnen worden vertaald in zowel interne als perifere locaties. In plaats daarvan wordt de translatie van APC-afhankelijke RNA's gecoördineerd met specifieke perifere cellulaire processen, die worden geactiveerd bij het uitbreiden van uitsteeksels/lamellipodia en onderdrukt bij het terugtrekken van het uitsteeksel. Silencing is gekoppeld aan een verandering in de fysieke toestand van de RNA's die zich manifesteren als enkele RNA's die clusteren in heterogene korrels aan de uiteinden van uitsteeksels.

    Deze wijze van regulatie verschilt van degene die wordt voorgesteld voor verschillende andere gelokaliseerde transcripten, waarbij RNA's in een tot zwijgen gebrachte toestand worden getransporteerd en alleen translationeel worden geactiveerd bij het bereiken van de eindbestemming of bij ontvangst van specifieke signalen (Besse en Ephrussi, 2008 Buxbaum et al. , 2015 Jung et al., 2014). Een reden voor dit laatste type regulering is de noodzaak om het verschijnen van eiwitten te voorkomen op plaatsen of tijden waar het schadelijk zou kunnen zijn. Voortijdig verschijnen van de transcriptionele repressor Ash1p in de moedercel tijdens het ontluiken onderdrukt inderdaad transcriptionele programma's in zowel moeder- als dochtercellen en voorkomt het wisselen van het paringstype (Long et al., 1997). Evenzo kan het verstoren van de timing van translationele activering binnen neuronale axonen of dendrieten leiden tot afwijkende axonale pathfinding of synaptische reacties (Colak et al., 2013 Holt en Schuman, 2013 Jung et al., 2012).

    Onze observatie van translatie ongeacht de cytoplasmatische locatie suggereert dat de eiwitten die worden gecodeerd door APC-afhankelijke RNA's in interne regio's kunnen worden geproduceerd zonder schadelijke effecten. We stellen voor dat deze wijze van regulatie bovendien functionele implicaties kan hebben voor de gecodeerde eiwitten. In het bijzonder kan translatie in lokale omgevingen eiwitten met verschillende eigenschappen toeschrijven. Dit kan het gevolg zijn van differentiële eiwitmodificaties of door de nabijheid van eiwitpartners, die tijdens co-translationele assemblage het type of de efficiëntie van multimere complexvorming kunnen beïnvloeden (Basu et al., 2011 Jung et al., 2014 Shiber et al., 2018 Shieh et al., 2015). In het licht van deze ideeën stellen we voor dat een enkel mRNA, aangezien het continu wordt vertaald in verschillende stadia tijdens het transport naar de periferie, aanleiding kan geven tot eiwitkopieën met verschillende eigenschappen, en dus functioneel potentieel, afhankelijk van de lokale micro- -omgeving waarin ze worden vertaald.

    We laten bovendien zien dat translatie van APC-afhankelijke RNA's specifiek wordt onderdrukt bij het terugtrekken van uitsteeksels en deze silencing is geassocieerd met de vorming van multimere heterogene clusters. De vorming van deze clusters wordt verminderd door behandelingen die RNA-transport naar de periferie voorkomen en wordt verhoogd bij globale translatieremming, wat suggereert dat silencing een beperkende stap is in hun vorming. Desalniettemin kan silencing optreden buiten clusters, aangezien een groot deel van de RNA's wordt waargenomen als afzonderlijke deeltjes in terugtrekkende, translationeel stille uitsteeksels. Het uiterlijk van deze heterogene RNA-clusters aan de uiteinden van uitsteeksels, en hun relatie tot translatie, doet denken aan andere soorten RNA-korrels gevormd door vloeistof-vloeistoffasescheiding (Courchaine et al., 2016 Weber en Brangwynne, 2012). Stresskorrels (SG's) en verwerkingslichamen (PB's) zijn bijvoorbeeld plaatsen van dynamische concentratie van RNA-moleculen, maar in beide gevallen kan translatie-uitschakeling of -verval optreden ongeacht de RNA-lokalisatie binnen korrels (Halstead et al., 2015 Panas et al. , 2016 Perez-Pepe et al., 2018). SG's en PB's vormen zich door het cytoplasma onder normale omstandigheden of als reactie op stress. Een interessant onderscheid van de hier beschreven clusters is dat hun vorming wordt geïnduceerd in bepaalde subcellulaire regio's die verband houden met terugtrekking van uitsteeksels, wat suggereert dat hun montage/demontage wordt gecontroleerd door ruimtelijke signalen.

    Het tot zwijgen brengen van Rab13, en waarschijnlijk van andere APC-afhankelijke RNA's, bij het terugtrekken van uitsteeksels staat in contrast met hun translationele activering bij het uitbreiden van lamellipodia. Aangezien lokalisatie van APC-afhankelijke RNA's naar de periferie belangrijk is voor celmigratie (Wang et al., 2017), zouden deze gegevens kunnen wijzen op een functionele rol voor ruimtelijk segregerende translatie, zodat lokale eiwitproductie plaatsvindt in actief uitbreidende regio's, terwijl ze worden onderdrukt in terugtrekkende gebieden. Dit zou het bestaan ​​van een dynamisch regulerend mechanisme impliceren dat APC-afhankelijke RNA-translatie coördineert met de continue uitsteeksel- en terugtrekkingscycli die cellulaire migratie kenmerken (Ji et al., 2008 Tkachenko et al., 2011).

    Een mogelijk onderliggend mechanisme voor lokale silencing en granulevorming zou kunnen berusten op ruimtelijk beperkte fosforylering/defosforylering, waarvan is aangetoond dat ze de neiging van RNA-bindende eiwitten beïnvloeden om fasegescheiden granules te vormen of te binden aan RNA's (Monahan et al., 2017 Murray et al., 2017 Thapar, 2015). In dit opzicht is het interessant dat eiwitten die associëren met APC-afhankelijke RNA's de translationele regulator FMRP en het RNA-bindende eiwit FUS omvatten, een van de paradigma-eiwitten die worden gebruikt om faseovergangen te begrijpen (Mili et al., 2008 Yasuda et al., 2017 Yasuda et al., 2013). Lokale wijzigingen van FMRP of FUS kunnen ten grondslag liggen aan de waargenomen regelgeving. Aanvullende lokale evenementen, waaronder lokale rijping van miRNA's, kunnen worden overwogen (Sambandan et al., 2017).

    Met betrekking tot de dynamiek van de montage/demontage van perifere clusters en het lot van de gesekwestreerde RNA's, laten beperkingen in de duur van live-beeldvorming die we kunnen bereiken geen concrete conclusies toe. Onze huidige gegevens geven echter aan dat de mate van clustervorming kan worden beïnvloed door de mate van terugtrekking. Specifiek, in NIH/3T3-cellen, worden de meeste perifere clusters gekenmerkt door een zichtbare accumulatie van polyA-signaal, wat wijst op een hoge concentratie heterogene RNA-soorten. Daarentegen vertoont een aanzienlijk deel van de terugtrekkende MDA-MB-231-uitsteeksels geen duidelijke polyA-accumulatie (Figuur 9). Een opvallend verschil tussen de twee celtypen is de snelheid waarmee uitsteeksels terugtrekken. Contractiele uitsteeksels van NIH/3T3-cellen kunnen lange tijd aanhouden, terwijl MDA-MB-231-uitsteeksels binnen een paar minuten snel worden teruggetrokken (vergelijk video's 11 en 12 met video 13). Hoewel we andere interpretaties niet kunnen uitsluiten, zoals het bestaan ​​van gededenyleerde transcripten, geven we de voorkeur aan het idee dat langzaam terugtrekkende uitsteeksels de opbouw van grote heterogene korrels mogelijk maken, terwijl bij sneller terugtrekkende uitsteeksels de perifere korrels van voorbijgaande aard zijn en snel uiteenvallen door ofwel RNA-afbraak of afgifte in het cytosol.

    Het bestaan ​​van translationeel stille multimere RNA-clusters biedt ook een mogelijke verklaring voor de lichte afname van APC-afhankelijke RNA's die worden aangetroffen in de zware RNP-fractie onder omstandigheden die het transport naar de periferie verstoren (figuren 1D en 2B). Translationeel stille RNP-complexen van een hogere orde kunnen sedimenteren bij sucrosedichtheidsgradiëntfracties die zwaarder zijn dan hun vertaalde tegenhangers (Chekulaeva et al., 2006). Naar analogie zijn de perifere clusters van APC-afhankelijke RNA's waarschijnlijk verantwoordelijk voor een deel van het RNA dat wordt aangetroffen op zwaardere fracties van de gradiënt. Vermindering van hun vorming na behandeling met parthenolide (Figuur 10) zou waarschijnlijk de schijnbare verschuiving van APC-afhankelijke RNA's naar de lichtere polysoomfractie van de gradiënt kunnen verklaren (Figuur 1D en 2B).

    We hadden eerder gemeld dat APC-afhankelijke RNA's ook kunnen worden gevonden in interne cytoplasmatische korrels die worden geïnduceerd door expressie van FUS-mutanten die ALS-geassocieerde mutaties dragen. Intrigerend is dat in deze FUS-korrels APC-afhankelijke RNA's translationeel actief zijn (Yasuda et al., 2013). Alles bij elkaar werpen deze waarnemingen de mogelijkheid op dat, althans voor APC-afhankelijke RNA's, hun fysieke verdeling in korrels niet de enige bepalende factor is, maar in combinatie met de specifieke lokale omgeving werkt om de uiteindelijke impact op hun translatiestatus te bepalen. Het zou interessant zijn om verder te onderzoeken hoe de samenstelling van perifere polyA-korrels verschilt van andere interne cytoplasmatische RNA-korrels met betrekking tot zowel RNA- als eiwitbestanddelen.

    We merken op dat de bovenstaande studie de regulatie van APC-afhankelijke RNA's in migrerende mesenchymale cellen beschrijft. Het zou interessant zijn om te onderzoeken hoe translatie en transport van deze RNA-groep wordt uitgevoerd in grotere en stabieler gepolariseerde cellen zoals neuronen.

    Over het algemeen beschrijven we hier een verschillende wijze van translationele regulatie van gelokaliseerde RNA's. Deze bevindingen bieden een ander perspectief om te begrijpen hoe lokale translatie eiwitactiviteiten kan beïnvloeden en hoe deze regulerende mechanismen kunnen worden geïntegreerd met dynamisch cellulair gedrag.


    Resultaten

    Zeer weinig ribosoomvoetafdrukken op niet-gesplitste HAC1 mRNA

    We hebben onlangs verbeterde ribosoom-voetafdrukprofielen gerapporteerd (Ingolia et al., 2009) en mRNA-overvloedsmetingen van exponentieel groeiende S. cerevisiae (Weinberg et al., 2016). Onder deze groeiomstandigheden HAC1 mRNA is bijna volledig ongesplitst (Figuur 1 - figuur supplement 1A) en is verdeeld over een sucrosegradiënt met

    50% in de niet-vertalende breuken en de overige

    50% strekt zich uit over alle vertalingen (d.w.z. 80S en grotere) fracties zonder substantiële verrijking in een bepaalde fractie (Figuur 1A), vergelijkbaar met eerdere waarnemingen (Arava et al., 2003 Chapman en Walter, 1997 Cox en Walter, 1996 Kuhn et al., 2001 Mori et al., 2010 Park et al., 2011 Payne et al., 2008 Rüegsegger et al., 2001 Sathe et al., 2015). Daarentegen is de goed vertaalde actine (ACT1) mRNA is in wezen afwezig in de niet-vertalende fracties en wordt meestal gevonden in grote polysomen. Op basis van de sedimentatie van HAC1 mRNP's, voorspelden we dat het mRNA een groot aantal door ribosoom beschermde fragmenten zou genereren, in een hoeveelheid van slechts

    2-voudig minder dan vergelijkbare overvloedige mRNA's (gebaseerd op de fractie van HAC1 mRNA in de niet-vertaalde fracties). Opvallend is echter dat na normalisatie voor mRNA-abundantie HAC1 genereert de minste door ribosoom beschermde fragmenten van alle tot expressie gebrachte gistgenen (Figuur 1B) - en

    50 keer minder dan verwacht op basis van het polysoomprofiel. In plaats van bewijs te leveren voor vastgelopen ribosomen op HAC1 u mRNA, in plaats daarvan suggereren deze waarnemingen dat beide ribosomen op het mRNA zijn vastgelopen in een dicht opeengepakte configuratie die nucleasesplitsing tussen ribosomen voorkomt, wat de

    28-nucleotide fragmenten waarvan de sequentie is bepaald in de ribosoom-profileringsmethode (Figuur 1C, midden) of dat er geen vastgelopen ribosomen zijn op HAC1 u mRNA (Figuur 1C, onder).

    Ribosoomdichtheid op niet-gesplitste HAC1 mRNA.

    (EEN) Polysoomanalyse van HAC1 en ACT1 mRNA's. Extracten bereid uit exponentieel groeiende gistcellen werden gefractioneerd op 10-50% sucrosegradiënten, waarbij de absorptie bij 260 nm werd gevolgd (bovenaan). De relatieve verdelingen van HAC1 en ACT1 mRNA's over fracties werden bepaald door qRT-PCR (onder). Getoond zijn de gemiddelde ± SEM met N = 2 (d.w.z. het bereik), uitgedrukt als een fractie van het totale gedetecteerde mRNA. (B) Histogram van ribosoomdichtheden gemeten door ribosoomprofilering en RNA-seq. De verhouding van het aantal door ribosoom beschermde fragmenten (RPF's) tot het aantal RNA-seq-lezingen (mRNA-tellingen) werd berekend voor elk van 4838 tot expressie gebrachte gistgenen (gegevens van Weinberg et al., 2016). Getoond wordt de verdeling van log-getransformeerde verhoudingen in bakken van 0,05, met de positie van HAC1 aangegeven. (C) Mogelijke scenario's om een ​​gebrek aan RPF's te verklaren. Terwijl een mRNA met een gemiddelde ribosoomdichtheid veel

    28 nucleotide (nt) RPF's (boven), de dichte pakking van gestapelde ribosomen zou de RNase-digestie tussen ribosomen kunnen remmen die nodig zijn om te genereren

    28 nt RPF's (midden). Als alternatief zou een mRNA dat geen vertalende ribosomen bevat, geen RPF's genereren (onder). (NS) Polysoomanalyse van HAC1 mRNA-varianten met verkorte ORF's. G-naar-T-puntmutaties werden geïntroduceerd in het eerste exon van HAC1 om voortijdige stopcodons te genereren, waarbij de resulterende ORF's worden weergegeven als dikke gekleurde vakken (constitutieve 5'- en 3'-UTR's die zich respectievelijk in exons 1 en 2 bevinden, worden weergegeven als dunne zwarte lijnen, andere niet-vertaalde gebieden worden weergegeven als dunne gekleurde vakken en de coderende gebieden van exons 1 (blauwgroen) en 2 (paars) zijn gelabeld als 'HAC1 exon1' en 'exon2', respectievelijk). Het maximale aantal ribosomen dat kon worden ondergebracht, werd berekend op basis van elk ribosoom dat 28 nt in beslag nam. Polysoomanalyse werd uitgevoerd zoals in (EEN), met gegevens voor wildtype HAC1 van (EEN) gedupliceerd ter vergelijking. (E) Effecten van heparine op polysoomanalyse. Gezuiverd zonder limiet luciferase (luc) RNA werd toegevoegd aan ofwel lysaat- of lysisbuffer in afwezigheid (-) of aanwezigheid (+) van 0,2 mg/ml heparine. Polysoomanalyse werd uitgevoerd zoals in (EEN) met absorptie bij 260 nm gecontroleerd (boven), en de relatieve verdelingen van exogeen luc RNA (midden) en endogeen HAC1 en ACT1 mRNA's (alleen bodem in lysaat) werden bepaald. (F) Verfijnde polysoomanalyse van HAC1 mRNA's. Extracten werden bereid in heparine-bevattende lysisbuffer van stammen getoond in (NS). Polysoomanalyse werd uitgevoerd zoals in (EEN). (G) Polysoomanalyse van HAC1 mRNA's tijdens de UPR. Stammen weergegeven in (NS) werden gekweekt tot mid-log fase en behandeld met 8 mM DTT gedurende 20 minuten voor het oogsten. Extracten werden bereid in heparine-bevattende lysisbuffer en polysoomanalyse werd uitgevoerd zoals in (EEN). Gestippelde lijnen geven de fracties aan waarna de overeenkomstige kleurgecodeerde mutante mRNA's naar verwachting niet zullen sedimenteren op basis van ORF-lengte.

    Geremde translatie-initiatie onthuld door polysoomanalyses

    Hoewel de polysoomachtige sedimentatie van HAC1 u mRNA geeft ribosoomassociatie aan, het onthult niet of de ribosomen die met het mRNA zijn geassocieerd ooit betrokken waren bij de translatie ervan. Als alternatief kunnen de geassocieerde ribosomen gebonden zijn in een conformatie die geen verband houdt met translatie van HAC1 u mRNA. Daarom bedachten we een experiment om definitief vast te stellen of de ribosomen gebonden zijn aan HAC1 u mRNA weerspiegelt ribosomen die betrokken waren bij de translatie ervan. Om dit te doen, hebben we gebruik gemaakt van de observatie dat: HAC1 mRNA is verdeeld over alle vertalende fracties van een sucrosegradiënt (Figuur 1A). Als de diepe sedimentatie te wijten is aan het feit dat meerdere vertalende ribosomen vastlopen op een enkel mRNA, dan zou het verminderen van het aantal vertalende ribosomen dat op het mRNA kan passen, het sedimentatiepatroon naar lichtere fracties moeten verschuiven. We ontwierpen een reeks constructies met puntmutaties in het eerste exon van HAC1 die voortijdige beëindigingscodons creëerden, die de grootte van de ORF verminderen en daardoor het aantal vertalende ribosomen beperken (Figuur 1D, bovenaan). Om ervoor te zorgen dat de mutante allelen tot expressie werden gebracht op bijna wildtype-niveaus, hebben we de endogene HAC1 allel zonder flankerende regulerende regio's te verstoren. Opmerkelijk was dat elk van de mutante mRNA's een sedimentatiepatroon had dat niet te onderscheiden was van het wildtype mRNA (Figuur 1D, onderaan). In het meest extreme geval is het mRNA dat een ORF van 21 nucleotiden bevat dat slechts een enkel vertalend ribosoom kan herbergen, nog steeds samen gesedimenteerd met polysomen die meer dan 10 ribosomen bevatten (fractie 14 van de gradiënt). Deze gegevens leveren direct bewijs dat de polysoomachtige sedimentatie van HAC1 u mRNA is niet te wijten aan vastgelopen ribosomen op het mRNA.

    We veronderstelden dat de ribosoomassociatie van HAC1 u mRNA was in plaats daarvan het gevolg van niet-specifieke interacties tussen het mRNA en bonafide polysomen gevormd op andere mRNA's. Om de omvang van dergelijke niet-specifieke interacties te evalueren, hebben we een exogeen controle-RNA geïntroduceerd dat niet mag worden vertaald: een niet-afgetopt luciferase-coderend RNA dat is gezuiverd uit een in vitro transcriptiereactie. We analyseerden het sedimentatiegedrag van dit controle-RNA wanneer het werd toegevoegd aan lysisbuffer in vergelijking met wanneer het werd toegevoegd aan het gistlysaat voorafgaand aan centrifugatie. Verrassend genoeg werd een deel van het exogene RNA gevonden in de vertalende fracties van het lysaat - een gedrag dat niet alleen in lysisbuffer wordt waargenomen (Figuur 1E, midden). Door uitgebreide optimalisatie vonden we dat de toevoeging van heparine aan de lysisbuffer (in een concentratie van 0,2 mg/ml) voldoende was om de diepe sedimentatie van exogeen RNA grotendeels te voorkomen. De toevoeging van heparine had ook een groot effect op de sedimentatie van HAC1 mRNA, zoals de meeste (83%) nu gesedimenteerd in de niet-vertalende fracties van de gradiënt (Figuur 1E, onder). Daarentegen is de sedimentatie van ACT1 mRNA (Figuur 1E, onder) en het algemene polysoomprofiel (Figuur 1E, boven) waren grotendeels onveranderd, wat suggereert dat heparine niet-specifieke interacties wegnam zonder bonafide polysomen te verstoren.

    Op basis van deze resultaten hebben we de HAC1 mutanten met verkorte ORF's met behulp van heparine-bevattende lysisbuffer. Onder deze omstandigheden was de polysoom co-sedimentatie van elk van de mRNA's sterk verminderd (van

    50% tot < 20%) maar er was nog steeds geen verschil tussen de constructen (Figuur 1F), wat verder bewijs levert tegen vastgelopen ribosomen op HAC1 u mRNA. Belangrijk is dat wanneer we cellen behandelden met het reductiemiddel dithiothreitol (DTT) om de UPR en gelijktijdige splicing van HAC1 mRNA (Figuur 1 - figuursupplement 1C) en herhaalden het experiment, de variant-mRNA's vertoonden nu de verwachte differentiële sedimentatie op basis van ORF-lengte (Figuur 1G), wat ons experimentele ontwerp valideerde. Samen laten deze resultaten zien dat bij steady state HAC1 u mRNA wordt niet geassocieerd met actief verlengende of vastgelopen ribosomen. Dit geeft aan dat het primaire blok voor de productie van Hac1 u p zich in het stadium van translatie-initiatie bevindt, niet in de translatieverlenging zoals eerder werd voorgesteld (Chapman en Walter, 1997 Richter en Coller, 2015 Rüegsegger et al., 2001).

    Een extra dempingsmechanisme stroomafwaarts van de initiatie van de vertaling

    De afwezigheid van ribosomen op HAC1 u mRNA suggereert dat de initiatie van translatie wordt geremd. Om het mechanisme van deze remming beter te begrijpen, hebben we een groen fluorescerend eiwit (GFP)-reportersysteem gebruikt waarvan eerder is aangetoond dat het post-transcriptionele silencing door de HAC1 intron (Chapman en Walter, 1997 Rüegsegger et al., 2001). We hebben de eerste exon van vervangen HAC1 waarbij de GFP ORF zijn eigen stopcodon mist (Figuur 2B), waardoor we post-transcriptionele silencing van GFP kwantitatief konden analyseren met behulp van een combinatie van flowcytometrie (eiwitovervloed), kwantitatieve RT-PCR (mRNA-overvloed) en sucrosegradiëntfractionering (ribosoomdichtheid). Wanneer GFP was ingebed in een anders wild-type HAC1 context sedimenteerde het mRNA bijna volledig in de niet-vertalende fracties (Figuur 2A), en er was geen detecteerbare fluorescentie boven de achtergrond (Figuur 2C). Daarentegen vertoonden cellen die een reporterconstructie uitdrukken die het gehele intron mist, een sterk fluorescentiesignaal (Figuur 2C), en het grootste deel van het mRNA werd gevonden in de vertalende fracties (Figuur 2A). Zo heeft de verslaggever GFP mRNA gedraagt ​​zich op dezelfde manier als endogeen HAC1 mRNA.

    Bijdrage van basenparing op lange afstand aan intron-afhankelijke silencing.

    (EEN) Polysoomanalyse van reporter-mRNA's. Extracten werden bereid in heparine-bevattende lysisbuffer van stammen die de GFP reporter-mRNA's afgebeeld in (B). Polysoomanalyse werd uitgevoerd zoals in figuur 1A, met gegevens voor wildtype HAC1 uit figuur 1F gedupliceerd ter vergelijking. (B) Ontwerp van reporter-mRNA's. Constructen worden weergegeven zoals in figuur 1D, waarbij de stippellijn een verwijderd gebied aangeeft. Gekleurde sterren geven mutaties aan in het basenparingsgebied, met specifieke nucleotideveranderingen hieronder in rood weergegeven. (C) Flowcytometrie-analyse van reporterstammen. Stammen die de . uitdrukken GFP reporter-mRNA's afgebeeld in (B) werden gekweekt tot mid-log-fase en geanalyseerd door middel van flowcytometrie.Uitgezet is de mediane GFP-intensiteit (genormaliseerd naar celgrootte) van de celpopulatie ten opzichte van achtergrondfluorescentie in de wildtype (geen GFP) stam met foutbalken die kwartielen van de celpopulatie aangeven, allemaal gemiddeld over replica's (N = 2–7).

    Om te bepalen of 5'-UTR-intron basenparing vereist is om ribosoomlading op het reporter-mRNA te voorkomen, hebben we constructies ontworpen waarin de sequentie die betrokken is bij basenparinginteracties in ofwel de 5'-UTR of het intron was gemuteerd tot zijn complement om de interactie te verstoren (Figuur 2B, onder), zoals eerder werd gedaan (Rüegsegger et al., 2001). Beide mutante mRNA's sedimenteerden meestal in de vertalende fracties op een manier die vergelijkbaar was met het intronloze construct (Figuur 2A). Toen we de 5'-UTR- en intron-mutaties combineerden en daardoor de basenparing herstelden, werd het mRNA nu bijna uitsluitend in de niet-vertalende fracties gevonden en leek het op het oorspronkelijke reporter-mRNA. Deze resultaten tonen aan dat basenparing tussen de 5'-UTR en intron vereist is om ribosoombelading te voorkomen door de binding of voortgang van het scannende ribosoom direct te belemmeren.

    Aangezien de basenparende mutante mRNA's waren geladen met ribosomen op dezelfde manier als het intronloze mRNA (Figuur 2A), verwachtten we GFP-expressie van de mutante mRNA's te observeren die vergelijkbaar was met die van het intronloze construct. Opmerkelijk was echter dat geen van de stammen die een mRNA voor basenparing tot expressie brachten, enige GFP had die detecteerbaar was door ofwel flowcytometrie (Figuur 2C) of immunoblotting (Figuur 2 - figuursupplement 1). Het ontbreken van GFP-signaal ondanks polysoomsedimentatie was niet te wijten aan lage mRNA-abundantie, aangezien de mutante mRNA's op vergelijkbare niveaus aanwezig waren in vergelijking met het intronloze mRNA (Figuur 2-figuursupplement 1A, vergelijk construct 3 met constructen 5-6). Deze resultaten suggereren dat een extra silencing-mechanisme dat stroomafwaarts van de translatie-initiatie werkt, de accumulatie van GFP voorkomt wanneer de basenparing wordt verstoord.

    Post-translationele silencing door de intron-gecodeerde C-terminale staart

    Naast het verwijderen van het introngedeelte van de basenparingsinteractie, splicing van HAC1 mRNA verandert ook de C-terminale staart van het gecodeerde eiwit: de ORF in HAC1 u mRNA heeft een staart van 10 aminozuren die wordt gecodeerd door het intron, HAC1 i mRNA wordt vervangen door een staart van 18 aminozuren die wordt gecodeerd door het tweede exon (Figuur 3A). Het feit dat de polypeptidestaarten die worden gecodeerd door de HAC1 u en HAC1 i mRNA's zijn verschillend suggereert dat de staart van 10 aminozuren die uniek is voor Hacl up functioneel belangrijk kan zijn. We veronderstelden daarom dat de intron-gecodeerde C-terminale staart mogelijk betrokken is bij het extra silencing-mechanisme dat wordt onthuld door onze basenparende mutante reporters (Figuur 2).

    Post-translationele silencing gemedieerd door de intron-gecodeerde C-terminale staart.

    (EEN) Schema van HAC1 mRNA-splitsing. De eiwitten die worden gecodeerd door HAC1 u en HAC1 i mRNA's verschillen in hun C-terminale staarten, waarbij de aminozuursequenties zijn aangegeven. (B) Ontwerp van reporter-mRNA's. Zwarte arcering geeft hercodering aan, met de originele en gehercodeerde sequenties hieronder afgebeeld (mutaties in rood). Niet-vertaalde roodgekleurde gebieden komen overeen met die van de TMA7 mRNA, met het reportergen geïntegreerd aan de TMA7 liever dan HAC1 plaats. Anders worden constructies afgebeeld zoals in figuur 2B. (C) Flowcytometrie-analyse van reporterstammen. Stammen die de . uitdrukken GFP reporter-mRNA's afgebeeld in (B) werden geanalyseerd zoals in figuur 2C, met gegevens voor de eerste drie stammen gedupliceerd uit figuur 2B ter vergelijking. (NS) Polysoomanalyse van reporter-mRNA's. Extracten werden bereid in heparine-bevattende lysisbuffer van stammen die de GFP reporter-mRNA's aangegeven in (B). Polysoomanalyse werd uitgevoerd zoals in figuur 1A, met gegevens voor het wildtype en intronless GFP verslaggevers uit figuur 2A gedupliceerd ter vergelijking. (E) Onderscheid maken tussen co-translationele en post-translationele silencing-mechanismen. Links: Schema van reporterconstruct dat twee afzonderlijke polypeptiden genereert uit elke translatieronde. Rechts: Extracten werden bereid van stammen die reporter-mRNA's tot expressie brengen die ofwel codeerden voor de C-terminale staart van 10 aminozuren van Hacl up (+staart) of een stopcodon bevatten net voor de staart (-staart). Immunoblotting werd gebruikt om HA-gelabelde mRuby (boven) en GFP (onder) te detecteren, met actine als laadcontrole. Voor elk genotype worden twee biologische replica's getoond.

    Om deze mogelijkheid te onderzoeken, hebben we een reporterconstruct ontworpen waarin we het hele intron hebben verwijderd, behalve het 5'-uiteinde dat codeert voor de 10-aminozuurstaart van Hac1 u p (Figuur 3B, vierde construct). Opmerkelijk was dat cellen die dit construct tot expressie brachten geen detecteerbare GFP hadden (Figuur 3C), ondanks dat het overeenkomstige mRNA overvloedig aanwezig was (Figuur 3 - figuur supplement 1A) en gedetecteerd werd op polysomen vanwege de afwezigheid van de basenparende interactie (Figuur 3D). Het coderende gebied aan het 5'-uiteinde van het intron is dus voldoende voor het volledig tot zwijgen brengen van de GFP-reporter. Introductie van een terminatiecodon tussen GFP en het intron herstelde robuuste fluorescentie vergelijkbaar met die waargenomen voor het intronloze construct, wat de translatie van het 5'-uiteinde van het intron impliceerde zoals vereist voor silencing. Bovendien had het aanbrengen van 10 nucleotide-veranderingen die het coderingspotentieel van de intron-gecodeerde staart (Figuur 3B, onder) behielden geen effect op het tot zwijgen brengen (Figuur 3C), wat suggereert dat de aminozuursequentie die wordt gecodeerd door het 5'-uiteinde van het intron is belangrijker dan de nucleotidesequentie zelf.

    Om te bepalen of het element van 10 aminozuren alleen voldoende was om het zwijgen op te leggen in afwezigheid van een ander: HAC1 sequenties, we uitgedrukt GFP van een andere locus in het gistgenoom (TMA7) met of zonder de staart van 10 aminozuren. Toen de 10-aminozuursequentie ofwel afwezig was of niet werd vertaald vanwege een voortijdig stopcodon, observeerden we een robuust GFP-signaal (Figuur 3C). Daarentegen werd er geen fluorescentie gedetecteerd in cellen die GFP tot expressie brengen die de staart van 10 aminozuren bevatten. De C-terminale staart van Hac1 u p is dus voldoende om onafhankelijk van de rest van de tot zwijgen te brengen HAC1 intron en andere HAC1 sequenties.

    Nadat we de effecten van de staart van 10 aminozuren afzonderlijk hadden vastgesteld, onderzochten we vervolgens de effecten van de staart wanneer de translatie-initiatie werd geremd door de interactie van basenparen. In een verder wild-type HAC1 context, waardoor translatie van de staart van 10 aminozuren werd voorkomen, hetzij door de volledige sequentie te verwijderen of door een stopcodon in te voeren, waardoor GFP zich ophoopte tot lage maar detecteerbare niveaus (Figuur 3C) zonder de sedimentatie van de overeenkomstige mRNA's sterk te beïnvloeden (Figuur 3D) . Dus zelfs wanneer de basenparing intact is, is er op een laag niveau een accumulatie van GFP die normaal wordt onderdrukt door het uitschakelingselement van 10 aminozuren.

    In de context van reporterconstructen zonder de intron-gecodeerde C-terminale staart, verhoogden mutaties in ofwel de 5'-UTR of intron die de basenparing verstoorden de hoeveelheid GFP aanzienlijk, terwijl het compenserende dubbel-mutantconstruct met herstelde basenparing slechts lage niveaus van GFP (Figuur 3C en Figuur 3-figuur supplement 1B). Deze resultaten zijn in overeenstemming met eerdere experimenten met GFP-reporter, die constructen gebruikten die een stopcodon bevatten tussen de GFP en intronsequenties en hadden daarom onbedoeld de effecten van de 10-aminozuurstaart geëlimineerd (Chapman en Walter, 1997 Rüegsegger et al., 2001).

    Samen geven onze GFP-reporterexperimenten aan dat de HAC1 intron bemiddelt post-transcriptionele silencing via een paar onafhankelijke maar gedeeltelijk redundante mechanismen: basenparende interacties met de 5'-UTR die de translatie-initiatie remmen, en een nieuw silencing-mechanisme dat wordt gemedieerd door de intron-gecodeerde C-terminale staart van Hac1 u p . Robuuste expressie vereist dat beide silencing-mechanismen worden geïnactiveerd, zoals gelijktijdig zou gebeuren wanneer het intron wordt verwijderd door Ire1p-afhankelijke splicing.

    Wat is het mechanisme waarmee de intron-gecodeerde staart van Hac1 up de genexpressie tot zwijgen brengt? Omdat het verstoren van de vertaling van de staart de eiwitniveaus verhoogde (Figuur 3C) zonder de vorming van polysoom te beïnvloeden (Figuur 3D), concludeerden we dat de staart zijn effect stroomafwaarts van de translatie-initiatie uitoefende. We redeneerden daarom dat de 10-aminozuursequentie werkte door ofwel de translatie over het gehele mRNA te stoppen (na polysoomvorming) of door eiwitafbraak te bevorderen. Ons onvermogen om GFP te detecteren dat de 10-aminozuurstaart bevat (Figuur 3C) verhinderde ons om de halfwaardetijden van GFP met en zonder de staart direct te vergelijken. In plaats daarvan hebben we, om onderscheid te maken tussen vastgelopen verlenging en eiwitafbraak, een reporterconstruct ontworpen dat twee afzonderlijke polypeptiden genereert uit een enkele translatieronde door co-translationele 'splitsing' gemedieerd door een viraal 2A-peptide (Sharma et al., 2012). Na screening op een 2A-peptidesequentie die efficiënt functioneert in S. cerevisiae (Figuur 3 - figuur supplement 2), ontwierpen we een construct met HA-mRuby- en GFP-sequenties gescheiden door het P2A-peptide (afgeleid van varkens-teschovirus-1). Aan de GFP-sequentie stroomafwaarts van P2A werd de staart van 10 aminozuren toegevoegd (of niet, als controle), wat zou moeten leiden tot de afwezigheid van detecteerbaar GFP, ongeacht het werkingsmechanisme. Daarentegen zou de stroomopwaartse HA-gelabelde mRuby alleen moeten worden gedetecteerd als de translatie zelf niet wordt beïnvloed door de 10-aminozuursequentie, omdat het rapporteert over het aantal ronden van translatie maar niet covalent is gekoppeld aan de remmende staart. Analyse van GFP door middel van immunoblotting onthulde dat accumulatie van het eiwit werd onderdrukt door de staart van 10 aminozuren, zoals verwacht (Figuur 3E). Daarentegen werd HA-mRuby gedetecteerd op vergelijkbare niveaus, ongeacht of de staart al dan niet in het construct was opgenomen. Deze resultaten geven aan dat de staart stroomafwaarts van translatie functioneert, waarschijnlijk door te werken als een 'degron' (Varshavsky, 1991) die zich richt op het eiwit voor onmiddellijke afbraak na synthese (Cox en Walter, 1996).

    Identificatie van DUH1 door een genetische selectie

    Als de C-terminale staart van Hac1 up functioneert als een degron, kunnen extra eiwitten betrokken zijn bij het herkennen van de degron en het richten op het covalent gekoppelde eiwit voor afbraak. Om dergelijke te identificeren trans-werkende factoren, gebruikten we een genetische benadering die gebruik maakte van het sterke silencing-fenotype dat alleen door de 10-aminozuurstaart wordt verleend (Figuur 3C). We construeerden stammen waarin het eerste exon van HAC1 werd vervangen door HIS3, waarvan we redeneerden dat het zich zou kunnen gedragen als het analoge GFP reportergenen en volledig tot zwijgen worden gebracht door de 10-aminozuursequentie. gelijk aan GFP, ter vervanging van de eerste exon van HAC1 met HIS3 maar het houden van HAC1 locus anders intact verhinderde expressie van His3p zoals blijkt uit histidine-auxotrofie (Figuur 4A). Het verwijderen van het gehele intron herstelde His3p-expressie en groei van de overeenkomstige stam op medium zonder histidine, wat suggereert dat silencing werd gemedieerd door de HAC1 intron. Stammen met een stopcodon tussen HIS3 en het intron (om translatie van het 10-aminozuur degron te voorkomen) had een laag maar detecteerbaar groeiniveau op histidine-ontbrekend medium (Figuur 4A), consistent met het zwakke fluorescentiesignaal waargenomen van de overeenkomstige GFP reporterconstructie (Figuur 3C). Aan de andere kant, stammen die His3p bevatten, hadden de C-terminale staart van Hac1 up maar geen andere elementen van de HAC1 intron kon niet groeien op medium zonder histidine. Deze resultaten geven aan dat de degron voldoende is voor functionele silencing van HIS3 expressie, wat een nuttig genetisch hulpmiddel biedt om extra genen te identificeren die betrokken zijn bij het degron-afhankelijke silencing-mechanisme.

    Identificatie van DUH1 door een genetische selectie.

    (EEN) Evaluatie van een genetische reporter voor intron-afhankelijke silencing. Stammen die de aangegeven uitdrukken HAC1-gebaseerd HIS3 reporter-mRNA's (afgebeeld zoals in figuur 2B) ofwel zonder (-) of met (+) een N-terminale HA-tag werden tot verzadiging gekweekt en 10-voudige verdunningsreeksen werden uitgeplaat op SC- of SC-His-media. (B) Stroomdiagram van genetische selectie voor dds mutanten. Na selectie op spontane mutanten die konden groeien op medium zonder histidine, werden opnieuw uitgestreken klonen eruit gefilterd cis mutanten, waarvan is vastgesteld dat ze HA-His3p tot expressie brengen, en een subset die is geanalyseerd door middel van sequencing van het hele genoom. (C) Chromosoomkaart van mutaties geïdentificeerd door sequencing van het hele genoom. Elke kleur komt overeen met een andere dds mutante stam. Rechts getoond is de DUH1 plaats (YJL149W), met locaties van nucleotideveranderingen (met betrekking tot DUH1 startcodon) en de overeenkomstige aminoveranderingen die hieronder worden vermeld. (NS) Effect van DUH1 verstoring van de expressie van de genetische reporter. Stammen die de aangegeven reporter-mRNA's uitdrukken die zijn afgebeeld in (EEN) in een van beide DUH1 of duh1∆ (twee onafhankelijke klonen) achtergrond werd tot mid-log fase gekweekt. Extracten werden bereid en onderworpen aan immunoblotting voor HA-His3p en actine-laadcontrole. (E) Flowcytometrie-analyse van reporterstammen. Stammen die de aangegeven uitdrukken GFP reporter-mRNA's in ofwel a DUH1 of duh1∆ achtergrond werden geanalyseerd zoals in figuur 2C. Gegevens worden uitgezet zoals in figuur 2C (N = 2 voor alle stammen).

    Hoewel we aanvankelijk van plan waren chemische mutagenese te gebruiken om silencing-defecte mutanten te genereren, merkten we bij het wegstrepen van de selectiestam op histidine-ontbrekend medium dat een klein aantal langzaam groeiende kolonies verscheen, zelfs zonder behandeling met mutageen. We redeneerden dat dergelijke spontane suppressorstammen heel weinig mutaties zouden hebben, waardoor het mogelijk werd om suppressormutaties te identificeren door middel van sequencing van het hele genoom zonder terugkruising of het vormen van complementaire groepen. Dus, om mutanten te isoleren met een defecte d egron-afhankelijke s ilencing ('dds mutanten ') hebben we eenvoudig de selectiestam die HA-gelabeld His3p tot expressie brengt uitgeplaat met de 10-aminozuurstaart op histidine-ontbrekend medium en de zeldzame enkele kolonies geïsoleerd die groeiden voor verdere analyse (Figuur 4B). Uit vijf onafhankelijke platen isoleerden we in totaal 123 mutante stammen die, wanneer ze opnieuw werden uitgestreken, konden groeien op medium zonder histidine. Sanger-sequencing van het C-terminale gebied van het reportergen in elke mutant identificeerde 15 stammen die a . herbergen cis mutatie die ofwel de sequentie van de degron veranderde, een voortijdig stopcodon voor of in de degron introduceerde, of het stopcodon van de degron verwijderde, wat resulteerde in een C-terminale extensie van zes aminozuren (Figuur 4 - figuursupplement 1A) - die allemaal een bevestiging gaven dat de genetische selectie naar wens werkte.

    Van de stammen die histidine-prototrofie vertoonden, kozen we er 35 (inclusief vier cis mutanten) om te analyseren door middel van immunoblotting en ontdekten dat ze allemaal detecteerbaar HA-His3p hadden (Figuur 4-figuur supplement 1B). We selecteerden 20 van deze stammen met onbekende mutaties voor sequencing van het hele genoom (evenals de ouderselectiestam als referentie, en drie stammen met bekende mutaties in de degron als positieve controles voor onze procedure voor het aanroepen van varianten), waarbij we zorgden voor de selectie stammen die sterk varieerden in HA-His3p-abundantie of groeisnelheid om onze kansen op het sequencen van dezelfde mutatie in meerdere stammen te minimaliseren. We hebben de 24 genomen samen gesequenced in een enkele rijstrook van een HiSeq-sequencer met behulp van 50-nucleotide single-end reads, die 38-74X dekking (9,3-18,0 miljoen reads) van elk gistgenoom opleverden. Vervolgens gebruikten we standaard mapping- en variant-calling-tools (respectievelijk BWA en FreeBayes) om varianten te identificeren die afwezig waren in het ouderlijk genoom, dat met succes de positieve controle herstelde cis mutanten. Opmerkelijk is dat 17 van de 20 stammen die we hebben gesequenced een mutatie in hetzelfde gen bevatten YJL149W (Figuur 4C en Figuur 4 - figuursupplement 1C), en in elk geval bevestigden we de mutatie door Sanger-sequencing (Figuur 4 - figuursupplement 1D). Omdat er geen ander ORF werd gevonden dat gemuteerd was in meer dan een van de 20 mutante stammen (Figuur 4 - figuur supplement 1C), hebben we onze vervolginspanningen gericht op YJL149W.

    YJL149W was eerder genoemd DAS1 voor 'D st1-delta 6- A zauracil S ensitivity 1' toen het werd geïdentificeerd in een genetisch scherm dat geen verband houdt met de UPR (Gómez-Herreros et al., 2012). Op basis van de domeinstructuur van het eiwit (met een F-box-domein en leucinerijke herhalingen) en fysieke interacties met de SCF-kerncomponenten Cdc53p en Skp1p (Willems et al., 1999), YJL149W werd geannoteerd als een 'vermeend SCF ubiquitine-ligase F-box-eiwit' (Cherry et al., 2012). F-box-eiwitten fungeren als adapters voor doelwitsubstraten voor ubiquitinatie en daaropvolgende afbraak door het proteasoom (Skaar et al., 2013). We stellen daarom voor om dit gen te hernoemen DUH1 voor 'D egrader van U nspliced' H AC1 genproduct 1' om zijn rol in de afbraak van Hac1 up te weerspiegelen, zoals we later zullen aantonen.

    De DUH1 varianten die we in onze 17 stammen identificeerden, omvatten 16 verschillende mutaties, waarvan 8 onzin waren, 7 missense en 1 een frameshift was (Figuur 4C, rechts). De nonsense-mutaties hadden de neiging om te clusteren in de eerste helft van de ORF, wat suggereert dat ze waarschijnlijk functioneerden als nul-allelen. Bovendien zijn drie van de 17 stammen met mutaties in DUH1 bevatte geen andere mutaties, wat impliceert dat de DUH1 mutaties als veroorzaker van het fenotype. Daarom hebben we getest of knock-out DUH1 (wat niet essentieel is) in de oorspronkelijke selectiestam recapituleerde het de-silencing fenotype. verstorend DUH1 leidde tot een dramatische toename van de steady-state-abundantie van HA-His3p dat de 10-aminozuurstaart bevat, terwijl het geen effect had op HA-His3p zonder de staart of constructies die worden onderdrukt door basenparing op lange afstand (Figuur 4D). Analoog, verwijderen DUH1 in de GFP-reporterstammen elimineerden het silencing-effect van de Hac1 up-staart volledig, maar hadden geen effect op door basenparing gemedieerde silencing (Figuur 4E en Figuur 4 - figuursupplement 2). Met name bij afwezigheid van DUH1 de GFP-reporter in een wild-type HAC1 context werd nu uitgedrukt op hetzelfde lekkende niveau als eerder gezien voor de verslaggever waarin een stopcodon was geplaatst tussen GFP en het intron, wat aangeeft dat degron-afhankelijke silencing vereist is om lekkende GFP-expressie te onderdrukken. Samen leveren deze resultaten genetisch bewijs dat: DUH1 is het adaptereiwit dat de Hac1 up-staart herkent en zich richt op het covalent gehechte eiwit voor afbraak.

    Effecten van DUH1 op Hac1p-abundantie, synthese en omzet

    Dat hebbende vastgesteld DUH1 is vereist voor degron-afhankelijke silencing van twee verschillende reportergenen, keerden we terug naar HAC1 zelf. Om Hac1p te detecteren, hebben we een 3xHA-tag geïntroduceerd aan het uiterste N-uiteinde van de endogene HAC1 allel (Figuur 5A), dat niet interfereerde met de post-transcriptionele silencing in afwezigheid van de UPR (Figuur 5B en C). Om te bepalen welke Hac1p-isovormen worden gereguleerd door: DUH1, hebben we een reeks HA-gelabelde stammen geconstrueerd die constitutief ofwel Hac1 ip produceerden met de 18-aminozuur exon 2-gecodeerde staart (construct 3), Hac1 up met de 10-aminozuur intron-gecodeerde staart (construct 5) , of Hacl Δtail p die helemaal geen staart bevat (constructen 4 en 6). Alle mRNA's die coderen voor HA-gelabelde Hac1p-varianten werden op vergelijkbare niveaus tot expressie gebracht in aanwezigheid versus afwezigheid van DUH1 (Figuur 5B). Opvallend is dat op eiwitniveau alleen de abundantie van Hac1 u p werd beïnvloed door verstoring van DUH1, toenemend met

    vijfvoudig in de knock-out stam (Figuur 5C). De verhoogde abundantie van Hac1 u p bij afwezigheid van DUH1 was niet te wijten aan een toegenomen vertaling, zoals blijkt uit de schrapping van DUH1 geen invloed hebben op de ribosoomdichtheid op een van de HA-gelabelde reporter-mRNA's (Figuur 5D). In plaats daarvan suggereren onze resultaten dat Duh1p specifiek de omzet van Hac1 up beïnvloedt vanwege de staart van 10 aminozuren, zoals werd gesuggereerd door de resultaten van onze reporterexperimenten.

    Effecten van DUH1 op expressie en stabiliteit van Hac1p.

    (EEN) Ontwerp van 3xHA-gelabeld HAC1 mRNA-varianten. Constructen worden weergegeven zoals in figuur 2B, met de locatie van de N-terminale 3xHA-tag aangegeven. (B) RNA-abundantiemetingen voor: HAC1 mRNA-varianten. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit stammen die de aangegeven mRNA's tot expressie brengen in ofwel a DUH1 of duh1∆ achtergrond. qRT-PCR werd gebruikt om de abundanties van HAC1 varianten ten opzichte van ACT1 mRNA, met alle gegevens genormaliseerd naar de overvloed van construct 1 in stam BY4741. Getoond zijn het gemiddelde ± SD (N = 2). (C) Effect van DUH1 verstoring van eiwit-abundanties. Stammen die de aangegeven mRNA's tot expressie brengen die zijn afgebeeld in (EEN) in een van beide DUH1 of duh1∆ achtergrond werden gekweekt tot de mid-log-fase. Extracten werden bereid en onderworpen aan immunoblotting voor 3xHA-Hac1p en actine-laadcontrole. (NS) Polysoomanalyse van 3xHA-gelabeld HAC1 mRNA-varianten. Extracten werden bereid in heparine-bevattende lysisbuffer van stammen die de mRNA's tot expressie brengen die zijn aangegeven in (EEN) in een van beide DUH1 of duh1∆ achtergrond. Polysoomanalyse werd uitgevoerd zoals in figuur 1A. (E) Analyse van de kinetiek van eiwitafbraak. Stammen die construct 5 tot expressie brengen (afgebeeld in EEN) in een van beide DUH1 of duh1∆ achtergrond werden gekweekt tot de mid-log-fase voordat ze werden behandeld met cycloheximide (CHX) om de translatie te stoppen. Op de aangegeven tijdstippen werden hoeveelheden cellen geblust in droogijs-koude methanol en geoogst door centrifugeren. Eiwitextractie en immunoblotting werden uitgevoerd zoals in (C), behalve dat een hooggevoelig antilichaam werd gebruikt om 3xHA-Hac1 up te detecteren. Getoond zijn het gemiddelde ± SD (N = 3), uitgedrukt als een fractie van het gedetecteerde eiwit bij t = 0.

    Omdat we Hac1 up konden detecteren door middel van immunoblotting (met behulp van een hooggevoelig antilichaam), zelfs wanneer DUH1 intact was (in tegenstelling tot de corresponderende GFP-reporter), konden we cycloheximide (CHX) afsluitexperimenten gebruiken om de impact van DUH1 op de omzet van Hac1 u p. Zowel bij aanwezigheid als bij afwezigheid van DUH1, Hac1 u p werd zo snel afgebroken dat we de halfwaardetijd ervan niet nauwkeurig konden meten, zelfs niet met een snelle oogstprocedure, vanwege de

    2 minuten nodig voor CHX om zich op te hopen in cellen en translatie te stoppen (Gerashchenko en Gladyshev, 2014). Dankzij de kinetiek van eiwitafbraak konden we echter een bovengrens berekenen voor de halfwaardetijd van Hac1 u p, die 50 seconden was toen DUH1 aanwezig was (Figuur 5E). Verwijdering van DUH1 stabiliseerde Hac1 up en verhoogde de bovengrens van de halfwaardetijd tot 2 minuten. Deze resultaten tonen aan dat DUH1 is vereist voor de extreem korte halfwaardetijd van Hac1 u p die normaal de accumulatie ervan beperkt. Het echte verschil in halfwaardetijd op DUH1 verwijdering is waarschijnlijk groter dan de

    2-voudig verschil in bovengrenzen dat we hebben gemeten, op basis van de

    5-voudig verschil in steady-state eiwitniveaus die niet konden worden verklaard door verschillen in mRNA-abundantie of ribosoomdichtheid (Figuur 5B en D).

    Synergie tussen basenparing op lange afstand en Duh1p-afhankelijke degradatie

    Eerder werd waargenomen dat het verstoren van de interactie van basenparen tussen de 5'-UTR en het intron van HAC1 mRNA was voldoende om accumulatie van Hac1 up mogelijk te maken, wat leidde tot een model waarin alleen basenparing verantwoordelijk was voor het post-transcriptionele silencing-fenomeen (Rüegsegger et al., 2001). Onze resultaten met behulp van constructen waarin het basenparingsgebied was verwijderd (Figuur 5), suggereerden dat de eerder waargenomen accumulatie van Hac1 up onbewust werd gebufferd door Duh1p-afhankelijke afbraak. Om deze mogelijkheid direct aan te pakken, hebben we HA-gelabelde constructen gegenereerd waarin het basenparingsgebied werd verstoord door mutaties in de 5'-UTR of intron of werd gereconstitueerd door de compenserende mutaties (Figuur 6A) en bepaalden we het effect van DUH1 deletie op steady-state eiwitniveaus. Omdat de 5'- en 3'-splitsingsplaatsen in deze constructen intact bleven, hebben we ze in een ire1Δ achtergrond om eventuele verstorende effecten van achtergrondsplitsing te elimineren (Figuur 1 - figuursupplement 1B). Zoals eerder waargenomen, muteert het basenparende gebied in aanwezigheid van DUH1 resulteerde in detecteerbare niveaus van Hac1 up (Figuur 6C). De accumulatie van Hac1 u p werd echter sterk gestimuleerd door deletie van DUH1, wat niet werd verklaard door een overeenkomstige toename van de hoeveelheid mRNA (Figuur 6B en C). Dus, hoewel het verstoren van de basenparing detecteerbare hoeveelheden Hac1 up produceert zoals eerder gerapporteerd (Rüegsegger et al., 2001), beperkt Duh1p-afhankelijke afbraak het steady-state niveau van het eiwit.

    Relatie tussen basenparing en degron-afhankelijke repressie.

    (EEN) Ontwerp van 3xHA-gelabeld HAC1 mRNA-varianten. Constructen worden afgebeeld zoals in figuur 2B. Gekleurde sterren duiden op mutaties in het basenparingsgebied, met specifieke nucleotideveranderingen weergegeven in figuur 2B (rode en blauwe sterren) of hieronder (groene en zwarte sterren) in rood. (B) RNA-abundantiemetingen voor: HAC1 mRNA-varianten in de aangegeven stamachtergronden, geanalyseerd zoals in figuur 5B. (CNS) Effect van DUH1 verstoring van eiwit-abundanties. ire1∆ stammen die de aangegeven mRNA's tot expressie brengen die zijn afgebeeld in (EEN) in een van beide DUH1 of duh1∆ achtergrond werden geanalyseerd zoals in figuur 5C, behalve dat een hooggevoelig antilichaam werd gebruikt om 3xHA-Hac1 u p te detecteren.

    Opmerkelijk is dat zelfs een enkele nucleotideverandering in het midden van het basenparende gebied (Sathe et al., 2015) voldoende was voor enige accumulatie van Hac1 up, die opnieuw werd versterkt door deletie van DUH1 (Figuur 6D). Dit resultaat suggereert dat de 5'-UTR-intron base-paring interactie slechts marginaal stabiel is, wat nodig kan zijn voor een efficiënte dissociatie van het intron na splitsing (zie discussie).

    Functionele gevolgen van onvolledige silencing

    Gezamenlijk hebben we aangetoond dat een paar silencing-mechanismen, de ene translationeel en de andere post-translationeel, valse productie van Hac1 up voorkomt in afwezigheid van de UPR. Het bestaan ​​van een dergelijk faalveilig dempingsmechanisme impliceert dat ectopische productie van Hac1 up fysiologische gevolgen heeft die een negatieve invloed hebben op de cellulaire fitheid. Een eerdere studie suggereerde echter dat Hac1 up zelf geen actieve transcriptiefactor is omdat het de activerende staart van 18 aminozuren mist die wordt gevonden in Hac1 ip (Mori et al., 2000), waardoor de vraag rijst waarom Hac1 up-accumulatie zou strak gereguleerd moeten worden. We veronderstelden dat Hac1 u p in feite een actieve transcriptiefactor was, maar dat in de vorige studie de accumulatie ervan was voorkomen vanwege de experimenten die werden uitgevoerd in een DUH1 achtergrond. Om deze hypothese te testen, evalueerden we het vermogen van stammen die constitutief Hac1 i p, Hac1 u p of Hac1 Δtail p produceerden om te groeien onder omstandigheden van chronische ER-stress veroorzaakt door het medicijn tunicamycine. Stammen die Hac1 i p of Hac1 Δtail p tot expressie brengen, groeiden op tunicamycine-bevattend medium, ongeacht of DUH1 (of IRE1) aanwezig was (Figuur 7A), consistent met het feit dat beide eiwitten actieve transcriptiefactoren zijn die niet het doelwit zijn van Duhlp. Daarentegen groeiden stammen die Hac1 up tot expressie brachten alleen robuust op tunicamycine-bevattend medium wanneer DUH1 werd uitgeschakeld (maar onafhankelijk van IRE1). Deze resultaten bevestigen onze hypothese dat Duh1p-afhankelijke afbraak normaal gesproken de activiteit van Hac1 u p maskeert. Onze bevindingen verklaren ook hoe HAC1 kon aanvankelijk worden geïdentificeerd als een high-copy activator van de UPR in een ire1 stam, aangezien de in deze stam gedetecteerde UPR-activiteit het gevolg moest zijn van Hac1 u p geproduceerd uit niet-gesplitste HAC1 mRNA (Chapman en Walter, 1997 Cox en Walter, 1996).

    Vereiste voor DUH1 om Ire1p-onafhankelijke activering van de UPR te onderdrukken.

    (EEN) Analyse van Hac1p-activiteit in de UPR. Stammen die de aangegeven uitdrukken HAC1 mRNA-varianten, met (+) of zonder () IRE1 en/of DUH1 aanwezig, waren tot verzadiging gegroeid. 10-voudige verdunningsreeksen werden uitgeplaat op YPD zonder (-Tm) of met (+ Tm) 400 ng / ml tunicamycine om ER-stress te induceren. (B) Impact van DUH1 bij detectie van Hac1 u p. Stammen die de aangegeven mRNA's tot expressie brengen, met (+) of zonder () IRE1 en/of DUH1 aanwezig, werden geanalyseerd zoals in figuur 6C. Zwarte pijl geeft de positie van Hac1 u p aan, die langzamer migreert dan Hac1 i p. Construct 1, dat een 3xHA-tag mist, werd gebruikt als een negatieve controle voor anti-HA-immunoblotting. (C) Effect van Duh1p-afhankelijke afbraak op de UPR. Stammen die wildtype tot expressie brengen HAC1 met een N-terminale 3xHA-tag, met (+) of zonder () IRE1 en/of DUH1 aanwezig, waren tot verzadiging gegroeid. 10-voudige verdunningsreeksen werden uitgeplaat op YPD zonder tunimacyine (-Tm) of met de aangegeven concentratie tunicamycine (+ Tm). Platen werden afgebeeld op dag 2 (boven), 3 (midden) en 6 (onder).

    Omdat Hac1 u p UPR-inducerende activiteit heeft (Figuur 7A), redeneerden we dat het faalveilige mechanisme dat we ontdekten nodig is om lekkende productie van Hac1 up te voorkomen die anders Ire1p-onafhankelijke activering van de UPR zou veroorzaken. In eerste instantie konden we Hac1 u p geproduceerd uit unspliced ​​. echter niet detecteren HAC1 mRNA zelfs wanneer DUH1 werd verstoord (Figuur 5C). Aan de andere kant, onze resultaten van de analoge GFP en HIS3 reportergenstudies toonden aan dat translationele repressie gemedieerd door 5'-UTR-intron basenparing onvolledig was en een laag niveau van eiwitsynthese mogelijk maakte dat normaal werd 'opgeschoond' door Duh1p-afhankelijke afbraak (Figuur 4D en E). Dit bracht ons ertoe te veronderstellen dat Hac1 up zelf ook af en toe werd geproduceerd uit HAC1 u mRNA en snel afgebroken op een Duh1p-afhankelijke manier, maar dat de korte halfwaardetijd van Hac1 up (Figuur 5E) - in vergelijking met zowel GFP (Natarajan et al., 1998) als His3p (Belle et al., 2006) - verder werd verminderd de steady-state abundantie van Hac1 tot een extreem laag niveau dat aanvankelijk niet detecteerbaar was.

    Om de detectie van HA-gelabelde Hac1 u p te verbeteren, hebben we twee wijzigingen aangebracht: we gebruikten een gevoeliger anti-HA-antilichaam voor immunoblotting en we schakelden IRE1 in onze stammen, waardoor de achtergrond Ire1p-afhankelijke splicing van HAC1 mRNA (Figuur 1 - figuur supplement 1B) en gelijktijdige productie van Hac1 i p die anders het signaal op immunoblots kan domineren. Met deze aanpassingen konden we nu detecteren dat Hac1 u p wordt geproduceerd uit niet-gesplitste HAC1 mRNA, maar alleen wanneer het eiwit werd gestabiliseerd door deletie van DUH1 (Figuur 7B) en op niveaus ver onder zelfs die van Hac1 up die constitutief wordt geproduceerd in aanwezigheid van DUH1 (Figuur 7 - figuurbijlage 1). Ondanks het relatief lage niveau van lekkend vertaalproduct dat we hebben gedetecteerd, leveren deze resultaten moleculair bewijs dat Hac1 u p continu wordt geproduceerd uit HAC1 u mRNA maar snel afgebroken vanwege zijn C-terminale degron.

    Wordt de lekkende productie van Hac1 u p ontmaskerd door het verwijderen van? DUH1 functionele consequenties hebben? Het vermogen van constitutief geproduceerde Hac1 up om overleving te bevorderen onder UPR-inducerende omstandigheden (Figuur 7A) suggereerde dat kleine hoeveelheden Hac1 up tot op zekere hoogte ook de UPR zouden kunnen induceren. Om deze mogelijkheid te testen, hebben we onderzocht hoe stammen die HA-gelabeld maar verder niet gemodificeerd zijn HAC1 mRNA groeide op media die verschillende concentraties tunicamycine bevatten. Bij de hoogste tunicamycineconcentratie alleen stammen die tot expressie brengen IRE1 zou kunnen groeien, ongeacht of DUH1 was ook aanwezig (Figuur 7C), wat suggereert dat groei afhankelijk was van de overvloedige Hac1 i p geproduceerd uit HAC1 ik mRNA. Daarentegen bij lagere concentraties van tunicamycine de IRE1 deletiestam vertoonde enige groei, maar dit werd reproduceerbaar versterkt door gelijktijdige deletie van DUH1. Deze resultaten geven aan dat het lage niveau van Hac1 u p detecteerbaar is in stammen die ontbreken DUH1 (Figuur 7B) is voldoende om de UPR voldoende te activeren om celoverleving onder stress te vergemakkelijken, zelfs in de afwezigheid van Ire1p. Degron-afhankelijke afbraak van Hac1 up gemedieerd door Duh1p is dus normaal gesproken vereist om ectopische Ire1p-onafhankelijke activering van de UPR te voorkomen.


    Mechanismen van antibacteriële geneesmiddelen

    Leerdoel

    Beschrijf de werkingsmechanismen die verband houden met geneesmiddelen die de biosynthese van de celwand, eiwitsynthese, membraanfunctie, nucleïnezuursynthese en metabole routes remmen

    Een belangrijke eigenschap van een antimicrobieel middel is: selectieve toxiciteit , wat betekent dat het selectief de groei van microbiële doelen doodt of remt, terwijl het de gastheer minimale of geen schade toebrengt. De meeste antimicrobiële geneesmiddelen die momenteel klinisch worden gebruikt, zijn antibacterieel omdat de prokaryotische cel een grotere verscheidenheid aan unieke doelen biedt voor selectieve toxiciteit, in vergelijking met schimmels, parasieten en virussen. Elke klasse antibacteriële geneesmiddelen heeft een unieke actie modus (de manier waarop een medicijn microben op cellulair niveau beïnvloedt), en deze zijn samengevat in: Afbeelding 14.9 en Tabel 14.1 .

    Vaz, L.E., et al. "Prevalentie van misvattingen van ouders over het gebruik van antibiotica." Kindergeneeskunde 136 nr.2 (augustus 2015). DOI: 10.1542/ peds.2015-0883.

    Afbeelding 14.9 Er zijn verschillende klassen van antibacteriële verbindingen die doorgaans worden geclassificeerd op basis van hun bacteriële doelwit.

    Veel voorkomende antibacteriële geneesmiddelen per werkingsmechanisme

    Remmers van celwandbiosynthese

    Verschillende klassen van antibacteriële middelen blokkeren stappen in de biosynthese van peptidoglycaan, waardoor cellen vatbaarder worden voor osmotische lysis ( Tabel 14.2 ). Daarom zijn antibacteriële middelen die zich richten op de biosynthese van de celwand bactericide in hun werking. Omdat menselijke cellen geen peptidoglycaan maken, is dit werkingsmechanisme een uitstekend voorbeeld van selectieve toxiciteit.

    Penicilline, het eerste antibioticum dat is ontdekt, is een van de vele antibacteriële middelen binnen een klasse genaamd β-lactams . Deze groep verbindingen omvat de penicillines, cefalosporines, monobactams en carbapenems, en wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van een β-lactamring die wordt aangetroffen in de centrale structuur van het geneesmiddelmolecuul ( Afbeelding 14.10 ). De β-lactam-antibacteriële middelen blokkeren de verknoping van peptideketens tijdens de biosynthese van nieuw peptidoglycaan in de bacteriële celwand. Ze kunnen dit proces blokkeren omdat de β-lactamstructuur vergelijkbaar is met de structuur van de peptidoglycan-subeenheidcomponent die wordt herkend door het verknopende transpeptidase-enzym, ook bekend als een penicilline-bindend eiwit (PBP). Hoewel de β-lactamring onveranderd moet blijven om deze geneesmiddelen hun antibacteriële activiteit te laten behouden, hebben strategische chemische veranderingen in de R-groepen de ontwikkeling mogelijk gemaakt van een breed scala aan semi-synthetische β-lactamgeneesmiddelen met een verhoogde potentie, een groter werkingsspectrum en langer halfwaardetijden voor een betere dosering, naast andere kenmerken.

    Penicilline G en penicilline V zijn natuurlijke antibiotica van schimmels en zijn voornamelijk actief tegen grampositieve bacteriële pathogenen en enkele gramnegatieve bacteriële pathogenen zoals Pasteurella multocida . Afbeelding 14.10 vat de halfsynthetische ontwikkeling van sommige penicillines samen. Toevoegen van een aminogroep (-NH 2 ) tot penicilline G creëerde de aminopenicillines (d.w.z. ampicilline en amoxicilline) die een groter werkingsspectrum hebben tegen meer gramnegatieve pathogenen. Bovendien verhoogde de toevoeging van een hydroxylgroep (-OH) aan amoxicilline de zuurstabiliteit, wat een verbeterde orale absorptie mogelijk maakt. Methicilline is een semisynthetische penicilline die is ontwikkeld om de verspreiding van enzymen (penicillinasen) aan te pakken die de andere penicillines inactiveerden. Door de R-groep van penicilline G te veranderen in de meer omvangrijke dimethoxyfenylgroep, werd de β-lactamring beschermd tegen enzymatische vernietiging door penicillinasen, wat ons de eerste penicillinaseresistente penicilline opleverde.

    Net als bij de penicillines, cefalosporines een β-lactamring bevatten ( Afbeelding 14.10 ) en blokkeren de transpeptidase-activiteit van penicilline-bindende eiwitten. De β-lactamring van cefalosporines is echter gefuseerd aan een zesdelige ring, in plaats van de vijfledige ring die in penicillines wordt aangetroffen. Dit chemische verschil geeft cefalosporines een verhoogde weerstand tegen enzymatische inactivatie door: β-lactamasen . Het medicijn cefalosporine C werd oorspronkelijk geïsoleerd uit de schimmel Cephalosporium acremonium in de jaren vijftig en heeft een soortgelijk werkingsspectrum als dat van penicilline tegen grampositieve bacteriën, maar is actief tegen meer gramnegatieve bacteriën dan penicilline. Een ander belangrijk structureel verschil is dat cefalosporine C twee R-groepen heeft, vergeleken met slechts één R-groep voor penicilline, en dit zorgt voor een grotere diversiteit in chemische veranderingen en ontwikkeling van semisynthetische cefalosporines. De familie van semisynthetische cefalosporines is veel groter dan de penicillines, en deze geneesmiddelen zijn ingedeeld in generaties, voornamelijk op basis van hun werkingsspectrum, waarbij het spectrum toeneemt van de smalspectrum cefalosporines van de eerste generatie tot de breedspectrum, vierde generatie cefalosporines. cefalosporines. Er is een nieuwe cefalosporine van de vijfde generatie ontwikkeld die actief is tegen methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA).

    De carbapenems en monobactams hebben ook een β-lactamring als onderdeel van hun kernstructuur, en ze remmen de transpeptidase-activiteit van penicilline-bindende eiwitten. Het enige monobactam dat klinisch wordt gebruikt, is aztreonam. Het is een antibacterieel middel met een smal spectrum dat alleen werkzaam is tegen gramnegatieve bacteriën. Daarentegen omvat de carbapenem-familie een verscheidenheid aan halfsynthetische geneesmiddelen (imipenem, meropenem en doripenem) die een zeer breedspectrumactiviteit bieden tegen grampositieve en gramnegatieve bacteriële pathogenen.

    De drugs vancomycine , een lid van een klasse van verbindingen genaamd de glycopeptiden , werd in de jaren vijftig ontdekt als een natuurlijk antibioticum uit de actinomyceet Amycolatopsis orientalis . Net als de β-lactams remt vancomycine de biosynthese van de celwand en is het bacteriedodend. In tegenstelling tot de β-lactams is de structuur van vancomycine echter niet vergelijkbaar met die van celwand-peptidoglycaansubeenheden en inactiveert het penicilline-bindende eiwitten niet direct. Vancomycine is eerder een zeer groot, complex molecuul dat bindt aan het einde van de peptideketen van celwandprecursoren, waardoor een structurele blokkade ontstaat die voorkomt dat de celwandsubeenheden worden opgenomen in het groeiende N-acetylglucosamine en N-acetylmuraminezuur (NAM -NAG) ruggengraat van de peptidoglycaanstructuur (transglycosylering). Vancomycine blokkeert ook structureel transpeptidatie. Vancomycine is bacteriedodend tegen gram-

    positieve bacteriële pathogenen, maar het is niet actief tegen gramnegatieve bacteriën vanwege het onvermogen om het beschermende buitenmembraan te penetreren.

    De drugs bacitracine bestaat uit een groep structureel vergelijkbare peptide-antibiotica die oorspronkelijk zijn geïsoleerd uit Bacillus subtilis . Bacitracine blokkeert de activiteit van een specifiek celmembraanmolecuul dat verantwoordelijk is voor de verplaatsing van peptidoglycaanprecursoren van het cytoplasma naar de buitenkant van de cel, waardoor uiteindelijk hun opname in de celwand wordt voorkomen. Bacitracine is effectief tegen een breed scala aan bacteriën, waaronder grampositieve organismen die op de huid worden aangetroffen, zoals: Stafylokokken en Streptokokken . Hoewel het in sommige gevallen oraal of intramusculair kan worden toegediend, is aangetoond dat bacitracine nefrotoxisch is (schade aan de nieren). Daarom wordt het vaker gecombineerd met neomycine en polymyxine in actuele zalven zoals Neosporin.

    Afbeelding 14.10 Penicillines, cefalosporines, monobactams en carbapenems bevatten allemaal een β-lactamring, de plaats van aanval door het inactiveren van β-lactamase-enzymen. Hoewel ze allemaal dezelfde kern delen, verschillen verschillende penicillines van elkaar in de structuur van hun R-groepen. Chemische veranderingen aan de R-groepen zorgden voor een verhoogd activiteitsspectrum, zuurstabiliteit en weerstand tegen afbraak van β-lactamase.

    Geneesmiddelen die de synthese van bacteriële celwanden remmen

    Werkingsmechanisme

    Natuurlijk of halfsynthetisch

    Spectrum van activiteit

    Smal-spectrum tegen gram-positieve en enkele gram-negatieve bacteriën

    Geneesmiddelen die de bacteriële celwandsynthese remmen

    Werkingsmechanisme

    Natuurlijk of halfsynthetisch

    Spectrum van activiteit

    Smal spectrum tegen grampositieve bacteriën maar met verhoogd gramnegatief spectrum

    Smal-spectrum alleen tegen gram-positieve bacteriën, inclusief stammen die penicillinase produceren

    Smal spectrum vergelijkbaar met penicilline maar met verhoogd gramnegatief spectrum

    Cefalosporines van de eerste generatie

    Smal spectrum vergelijkbaar met cefalosporine C

    Cefalosporines van de tweede generatie

    Smal spectrum maar met verhoogd gramnegatief spectrum vergeleken met de eerste generatie

    Cefalosporines van de derde en vierde generatie

    Breedspectrum tegen grampositieve en gramnegatieve bacteriën, waaronder enkele β- lactamaseproducenten

    Cefalosporines van de vijfde generatie

    Breedspectrum tegen grampositieve en gramnegatieve bacteriën, waaronder MRSA

    Smal-spectrum tegen gram-negatieve bacteriën, waaronder enkele β-lactamase-producenten

    Breedste spectrum van de β-lactams tegen gram-positieve en gram-negatieve bacteriën, waaronder veel β-lactamase-producenten

    Smal spectrum alleen tegen grampositieve bacteriën, inclusief multiresistente stammen

    Geneesmiddelen die de bacteriële celwandsynthese remmen

    Werkingsmechanisme

    Natuurlijk of halfsynthetisch

    Spectrum van activiteit

    Beschrijf het werkingsmechanisme van β-lactams.

    Remmers van eiwitbiosynthese

    De cytoplasmatische ribosomen die worden gevonden in dierlijke cellen (80S) zijn structureel verschillend van die gevonden in bacteriële cellen (70S), waardoor eiwitbiosynthese een goed selectief doelwit is voor antibacteriële geneesmiddelen. Verschillende soorten eiwitbiosyntheseremmers worden in deze sectie besproken en samengevat in: Afbeelding 14.11 .

    Eiwitsyntheseremmers die de 30S-subeenheid binden

    Aminoglycosiden zijn grote, zeer polaire antibacteriële geneesmiddelen die binden aan de 30S-subeenheid van bacteriële ribosomen, waardoor het proefleesvermogen van het ribosomale complex wordt aangetast. Deze stoornis veroorzaakt mismatches tussen codons en anticodons, wat resulteert in de productie van eiwitten met onjuiste aminozuren en verkorte eiwitten die in het cytoplasmatische membraan worden ingebracht. Verstoring van het cytoplasmatische membraan door de defecte eiwitten doodt de bacteriële cellen. De aminoglycosiden , waaronder geneesmiddelen zoals streptomycine, gentamicine, neomycine en kanamycine, zijn krachtige antibacteriële middelen met een breed spectrum. Van aminoglycosiden is echter aangetoond dat ze nefrotoxisch (schadelijk voor de nieren), neurotoxisch (schadelijk voor het zenuwstelsel) en ototoxisch (schadelijk voor het oor) zijn.

    Een andere klasse van antibacteriële verbindingen die binden aan de 30S-subeenheid is de tetracyclines . In tegenstelling tot aminoglycosiden zijn deze geneesmiddelen bacteriostatisch en remmen ze de eiwitsynthese door de associatie van tRNA's met het ribosoom tijdens translatie te blokkeren. Natuurlijk voorkomende tetracyclines geproduceerd door verschillende stammen van Streptomyces werden voor het eerst ontdekt in de jaren 1940, en er zijn ook verschillende halfsynthetische tetracyclines geproduceerd, waaronder doxycycline en tigecycline. Hoewel de tetracyclines een breed spectrum hebben in hun dekking van bacteriële pathogenen, omvatten bijwerkingen die het gebruik ervan kunnen beperken, fototoxiciteit, permanente verkleuring van zich ontwikkelende tanden en levertoxiciteit bij hoge doses of bij patiënten met nierinsufficiëntie.

    Eiwitsyntheseremmers die de 50S-subeenheid binden

    Er zijn verschillende klassen van antibacteriële geneesmiddelen die werken door binding aan de 50S-subeenheid van bacteriële ribosomen. De macrolide antibacteriële geneesmiddelen hebben een grote, complexe ringstructuur en maken deel uit van een grotere klasse van natuurlijk geproduceerde secundaire metabolieten, polyketiden genaamd, complexe verbindingen die stapsgewijs worden geproduceerd door de herhaalde toevoeging van twee-koolstofeenheden door een mechanisme dat vergelijkbaar is met dat gebruikt voor vetzuursynthese. Macroliden zijn breedspectrum, bacteriostatische geneesmiddelen die de verlenging van eiwitten blokkeren door de vorming van peptidebindingen tussen specifieke combinaties van aminozuren te remmen. De eerste macrolide was erytromycine . Het werd geïsoleerd in 1952 van Streptomyces erythreus en voorkomt translocatie. Halfsynthetische macroliden omvatten azithromycine en telithromycine. In vergelijking met erytromycine, azithromycine heeft een breder werkingsspectrum, minder bijwerkingen en een aanzienlijk langere halfwaardetijd (1,5 uur voor erytromycine versus 68 uur voor azithromycine) die een eenmaal daagse dosering en een korte 3-daagse therapiekuur mogelijk maakt (dwz Zpac-formulering ) voor de meeste infecties. Telithromycine is de eerste halfsynthetische

    binnen de klasse die bekend staat als ketoliden. Hoewel telithromycine een verhoogde potentie en activiteit vertoont tegen macrolide-resistente pathogenen, heeft de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) het gebruik ervan beperkt tot de behandeling van buiten het ziekenhuis opgelopen pneumonie en vereist het het sterkste "black box-waarschuwingslabel" voor het medicijn vanwege ernstige hepatotoxiciteit .

    De lincosamiden omvatten de natuurlijk geproduceerde lincomycine en halfsynthetisch clindamycine . Hoewel ze structureel verschillen van macroliden, zijn lincosamiden qua werkingsmechanisme vergelijkbaar met de macroliden door binding aan de 50S-ribosomale subeenheid en het voorkomen van vorming van peptidebindingen. Lincosamiden zijn bijzonder actief tegen streptokokken- en stafylokokkeninfecties.

    De drugs chlooramfenicol vertegenwoordigt nog een andere structureel verschillende klasse van antibacteriële middelen die ook binden aan het 50S-ribosoom, waardoor de vorming van peptidebindingen wordt geremd. Chlooramfenicol, geproduceerd door Streptomyces venezuelae , werd ontdekt in 1947 in 1949, werd het het eerste breedspectrumantibioticum dat werd goedgekeurd door de FDA. Hoewel het een natuurlijk antibioticum is, is het ook gemakkelijk te synthetiseren en was het het eerste antibacteriële medicijn dat in massa werd geproduceerd. Als gevolg van de massaproductie, het brede spectrum en het vermogen om efficiënt in weefsels te penetreren, werd chlooramfenicol van oudsher gebruikt om een ​​breed scala aan infecties te behandelen, van meningitis tot buiktyfus tot conjunctivitis. Helaas hebben ernstige bijwerkingen, zoals het dodelijke grijze babysyndroom en de onderdrukking van de beenmergproductie, de klinische rol ervan beperkt. Chlooramfenicol veroorzaakt ook op twee verschillende manieren bloedarmoede. Eén mechanisme omvat het richten van mitochondriale ribosomen in hematopoëtische stamcellen, waardoor een omkeerbare, dosisafhankelijke onderdrukking van de productie van bloedcellen wordt veroorzaakt. Zodra de toediening van chlooramfenicol is stopgezet, keert de productie van bloedcellen terug naar normaal. Dit mechanisme benadrukt de overeenkomst tussen 70S-ribosomen van bacteriën en de 70S-ribosomen in onze mitochondriën. Het tweede mechanisme van bloedarmoede is idiosyncratisch (d.w.z. het mechanisme wordt niet begrepen) en omvat een onomkeerbaar dodelijk verlies van de productie van bloedcellen, bekend als aplastische anemie. Dit mechanisme van aplastische anemie is niet dosisafhankelijk en kan zich ontwikkelen nadat de behandeling is gestopt. Vanwege bezorgdheid over de toxiciteit is het gebruik van chlooramfenicol bij mensen nu zeldzaam in de Verenigde Staten en beperkt tot ernstige infecties die niet kunnen worden behandeld met minder giftige antibiotica. Omdat de bijwerkingen bij dieren veel minder ernstig zijn, wordt het gebruikt in de diergeneeskunde.

    De oxazolidinonen , waaronder linezolid, zijn een nieuwe breedspectrumklasse van synthetische eiwitsyntheseremmers die binden aan de 50S-ribosomale subeenheid van zowel grampositieve als gramnegatieve bacteriën. Hun werkingsmechanisme lijkt echter enigszins te verschillen van dat van de andere reeds besproken remmers van de 50S-subeenheid-bindende eiwitsynthese. In plaats daarvan lijken ze de vorming van het initiatiecomplex (associatie van de 50S-subeenheid, 30S-subeenheid en andere factoren) voor translatie te verstoren, en ze voorkomen translocatie van het groeiende eiwit van de ribosomale A-plaats naar de P-plaats. Tabel 14.3 vat de eiwitsyntheseremmers samen.

    Afbeelding 14.11 De belangrijkste klassen van eiwitsyntheseremmers richten zich op de 30S- of 50S-subeenheden van cytoplasmatische ribosomen.

    Geneesmiddelen die de bacteriële eiwitsynthese remmen

    Werkingsmechanisme

    Bacteriostatisch of bactericide

    Spectrum van activiteit

    Veroorzaakt mismatches tussen codons en anticodons, wat leidt tot defecte eiwitten die het cytoplasmatische membraan invoegen en verstoren Aminoglycosiden Streptomycine, gentamicine, neomycine, kanamycine Blokkeert de vorming van peptidebindingen tussen aminozuren Macroliden Erytromycine, azithromycine, telithromycine

    Vergelijk en contrasteer de verschillende soorten eiwitsyntheseremmers.

    Remmers van membraanfunctie

    Een kleine groep antibacteriële middelen richt zich op het bacteriële membraan als hun werkingsmechanisme ( Tabel 14.4 ). De polymyxines zijn natuurlijke polypeptide-antibiotica die voor het eerst werden ontdekt in 1947 als producten van Bacillus polymyxa alleen polymyxine B en polymyxine E ( colistine ) klinisch zijn gebruikt. Ze zijn lipofiel met wasmiddelachtige eigenschappen en interageren met de lipopolysaccharidecomponent van het buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, waardoor uiteindelijk zowel hun buiten- als binnenmembraan wordt verstoord en de bacteriële cellen worden gedood. Helaas is het membraangerichte mechanisme geen selectieve toxiciteit, en deze geneesmiddelen richten zich ook op en beschadigen het membraan van cellen in de nier en het zenuwstelsel wanneer ze systemisch worden toegediend. Vanwege deze ernstige bijwerkingen en hun slechte absorptie uit het spijsverteringskanaal, wordt polymyxine B gebruikt in vrij verkrijgbare lokale antibiotische zalven (bijv. Neosporin), en orale colistine werd in het verleden alleen gebruikt voor darmontsmetting om infecties afkomstig van de darm te voorkomen. microben bij immuungecompromitteerde patiënten of bij patiënten die bepaalde buikoperaties ondergaan. De opkomst en verspreiding van multiresistente pathogenen heeft echter geleid tot een toenemend gebruik van intraveneus colistine in ziekenhuizen, vaak als laatste redmiddel om ernstige infecties te behandelen. de antibacteriële daptomycine is een cyclisch lipopeptide geproduceerd door Streptomyces roseosporus dat lijkt te werken als de polymyxinen, die het bacteriële celmembraan inbrengen en het verstoren. In tegenstelling tot polymyxine B en colistine, die zich alleen richten op gramnegatieve bacteriën, richt daptomycine zich echter specifiek op grampositieve bacteriën. Het wordt meestal intraveneus toegediend en lijkt goed te worden verdragen, en vertoont reversibele toxiciteit in skeletspieren.

    Geneesmiddelen die de bacteriële membraanfunctie remmen

    Werkingsmechanisme

    Spectrum van activiteit

    Intraveneuze dosering voor de behandeling van ernstige systemische

    Geneesmiddelen die de bacteriële membraanfunctie remmen

    Werkingsmechanisme

    Spectrum van activiteit

    Hoe remmen polymyxines de membraanfunctie?

    Remmers van nucleïnezuursynthese

    Sommige antibacteriële geneesmiddelen werken door de nucleïnezuursynthese te remmen ( Tabel 14.5 ). Bijvoorbeeld, metronidazol is een semi-synthetisch lid van de nitroimidazol-familie die ook een antiprotozoa is. Het interfereert met DNA-replicatie in doelcellen. De drugs rifampicine is een semi-synthetisch lid van de rifamycine-familie en functioneert door de RNA-polymerase-activiteit in bacteriën te blokkeren. De RNA-polymerase-enzymen in bacteriën verschillen structureel van die in eukaryoten, wat zorgt voor selectieve toxiciteit tegen bacteriële cellen. Het wordt gebruikt voor de behandeling van een verscheidenheid aan infecties, maar het primaire gebruik ervan, vaak in een cocktail met andere antibacteriële geneesmiddelen, is tegen mycobacteriën die tuberculose veroorzaken. Ondanks de selectiviteit van zijn mechanisme, kan rifampicine leverenzymen induceren om het metabolisme van andere geneesmiddelen die worden toegediend te verhogen (antagonisme), wat leidt tot hepatotoxiciteit (levertoxiciteit) en een negatieve invloed heeft op de biologische beschikbaarheid en het therapeutische effect van de begeleidende geneesmiddelen.

    Een lid van de chinolonfamilie, een groep synthetische antimicrobiële middelen, is nalidixinezuur . Het werd in 1962 ontdekt als een bijproduct tijdens de synthese van chloroquine, een antimalariamiddel. Nalidixinezuur remt selectief de activiteit van bacterieel DNA-gyrase en blokkeert DNA-replicatie. Chemische modificaties aan de oorspronkelijke chinolonruggengraat hebben geleid tot de productie van: fluorochinolonen , zoals ciprofloxacine en levofloxacine, die ook de activiteit van DNA-gyrase remmen. Ciprofloxacine en levofloxacine zijn effectief tegen een breed spectrum van grampositieve of gramnegatieve bacteriën en behoren tot de meest voorgeschreven antibiotica die worden gebruikt voor de behandeling van een breed scala aan infecties, waaronder urineweginfecties, luchtweginfecties, buikinfecties en huidinfecties. . Ondanks hun selectieve toxiciteit tegen DNA-gyrase, omvatten bijwerkingen geassocieerd met verschillende fluoroquinolonen fototoxiciteit, neurotoxiciteit, cardiotoxiciteit, disfunctie van het glucosemetabolisme en een verhoogd risico op peesruptuur.

    Geneesmiddelen die de bacteriële nucleïnezuursynthese remmen

    Werkingsmechanismen

    Spectrum van activiteit

    Smal spectrum met activiteit

    tegen grampositief en beperkt

    aantal gramnegatieve bacteriën.

    positieve en gram-negatieve bacteriën

    Waarom richten remmers van bacteriële nucleïnezuursynthese zich niet op gastheercellen?

    Remmers van metabole routes

    Sommige synthetische drugs bestrijden bacteriële infecties door te functioneren als antimetabolieten , competitieve remmers voor bacteriële metabole enzymen ( Tabel 14.6 ). De sulfonamiden ( sulfamedicijnen ) zijn de oudste synthetische antibacteriële middelen en zijn structurele analogen van para -aminobenzoëzuur (PABA), een vroeg tussenproduct in foliumzuursynthese ( Afbeelding 14.12 ). Door remming van het enzym dat betrokken is bij de productie van dihydrofoliumzuur, blokkeren sulfonamiden de bacteriële biosynthese van foliumzuur en vervolgens de pyrimidinen en purines die nodig zijn voor de synthese van nucleïnezuur. Dit werkingsmechanisme zorgt voor een bacteriostatische remming van de groei tegen een breed spectrum van grampositieve en gramnegatieve pathogenen. Omdat mensen foliumzuur uit voedsel halen in plaats van het intracellulair te synthetiseren, zijn sulfonamiden selectief toxisch voor bacteriën. Allergische reacties op sulfamedicijnen komen echter vaak voor. De sulfonen lijken qua structuur op sulfonamiden, maar worden tegenwoordig niet vaak gebruikt, behalve voor de behandeling van de ziekte van Hansen (lepra).

    Trimethoprim is een synthetische antimicrobiële verbinding die dient als een antimetaboliet binnen dezelfde foliumzuursyntheseroute als sulfonamiden. Echter, trimethoprim is een structureel analoog van dihydrofoliumzuur en remt een latere stap in de metabole route ( Afbeelding 14.12 ). Trimethoprim wordt gebruikt in combinatie met het sulfamedicijn sulfamethoxazol om urineweginfecties, oorinfecties en bronchitis te behandelen. Zoals besproken is de combinatie van trimethoprim en sulfamethoxazol een voorbeeld van antibacteriële synergie. Wanneer alleen gebruikt, vermindert elke antimetaboliet de productie van foliumzuur tot een niveau waarop bacteriostatische remming van de groei optreedt. Wanneer ze echter in combinatie worden gebruikt, verlaagt remming van beide stappen in de metabole route de foliumzuursynthese tot een niveau dat dodelijk is voor de bacteriële cel. Vanwege het belang van foliumzuur tijdens de ontwikkeling van de foetus, moeten sulfamedicijnen en trimethoprim-gebruik zorgvuldig worden overwogen tijdens de vroege zwangerschap.

    De drugs isoniazide is een antimetaboliet met specifieke toxiciteit voor mycobacteriën en wordt al lang gebruikt in combinatie met rifampicine of streptomycine bij de behandeling van tuberculose. Het wordt toegediend als een prodrug, die activering vereist door de werking van een intracellulair bacterieel peroxidase-enzym, dat isoniazide-nicotinamide-adenine-dinucleotide (NAD) en isoniazide-nicotinamide-adenine-dinucleotide-fosfaat (NADP) vormt, waardoor uiteindelijk de synthese van mycolzuur wordt voorkomen, wat essentieel is voor mycobacteriële celwanden. Mogelijke bijwerkingen van het gebruik van isoniazide zijn hepatotoxiciteit, neurotoxiciteit en hematologische toxiciteit (bloedarmoede).

    Afbeelding 14.12 Sulfonamiden en trimethoprim zijn voorbeelden van antimetabolieten die interfereren met de bacteriële synthese van foliumzuur door de biosynthese van purine en pyrimidine te blokkeren, waardoor de bacteriegroei wordt geremd.

    Antimetabolietgeneesmiddelen

    Doel metabole route

    Werkingsmechanisme

    Spectrum van activiteit

    Breed spectrum tegen grampositieve en gramnegatieve bacteriën

    Breed spectrum tegen grampositieve en gramnegatieve bacteriën

    Antimetabolietgeneesmiddelen

    Doel metabole route

    Werkingsmechanisme

    Spectrum van activiteit

    Smal spectrum tegen Mycobacterium spp., inclusief M. tuberculose

    Hoe richten sulfonamiden en trimethoprim zich selectief op bacteriën?

    Remmer van ATP-synthase

    Bedaquiline, dat de synthetische antibacteriële klasse van verbindingen vertegenwoordigt die de diarylquinolonen worden genoemd, gebruikt een nieuw werkingsmechanisme dat specifiek de groei van mycobacteriën remt. Hoewel het specifieke mechanisme nog moet worden opgehelderd, lijkt deze verbinding de functie van ATP-synthasen te verstoren, misschien door te interfereren met het gebruik van de waterstofionengradiënt voor ATP-synthese door oxidatieve fosforylering, wat leidt tot verminderde ATP-productie. Vanwege de bijwerkingen, waaronder hepatotoxiciteit en mogelijk dodelijke hartritmestoornissen, is het gebruik ervan voorbehouden aan ernstige, anders onbehandelbare gevallen van tuberculose.


    SLOTOPMERKINGEN

    EF-P werd voor het eerst ontdekt als een verlengingsfactor die de vorming van peptidebindingen tussen arme aminoacylacceptoren bevorderde. Een tijd lang werd verkeerd begrepen dat EF-P betrokken was bij de synthese van de eerste peptidebinding, maar nu herkennen we het als een bonafide verlengingsfactor, zij het een zeer ongebruikelijke omdat het sequentiespecificiteit vertoont. Moleculair-genetische benaderingen en benaderingen op systeemniveau laten zien dat de specificiteitsvereiste afhangt van het verbeteren van de translatiesnelheid via primaire sequenties die coderen voor bijzonder slechte peptidyloverdrachtsubstraten zoals opeenvolgende prolines. Dus, na bijna 4 decennia van studie, is ons begrip van de activiteit van EF-P rond en de rol van EF-P in vertaling voorgesteld door Glick, Chládek en Ganoza in 1979 lijkt accuraat te zijn.

    Hoewel we tegenwoordig veel meer over EF-P begrijpen dan toen het werd ontdekt, blijven veel aspecten van de EF-P-biologie mysterieus. EF-P bevordert bijvoorbeeld de vertaling via veel, maar niet alle XPPX-motieven, wat duidt op nog verdere regels die de specificiteit ervan bepalen. Bovendien ervaren niet alle eiwitten die XPPX-gemedieerde stalling ervaren, daadwerkelijk een verminderd aantal eiwitkopieën (Elgamal et al. 2014 Woolstenhulme et al. 2015). Precies waarom sommige XPPX-motieven bijzonder moeilijk te vertalen zijn, is niet helemaal duidelijk, evenmin als het mechanisme waarmee EF-P dit probleem oplost. De functie van post-translationele modificatie, waarvan ooit werd gedacht dat het essentieel was voor EF-P-activiteit, rechtvaardigt heroverweging omdat niet-gemodificeerde EF-P en varianten die zijn gemodificeerd met een vreemde chemische groep recentelijk als functioneel zijn gerapporteerd (Hummels et al. Volkwein 2017 et al. 2019). Als de modificatie deel uitmaakt van het mechanisme waarmee EF-P translationeel pauzeren verlicht, hoe kunnen zoveel verschillende modificaties dan allemaal een geconserveerde functie accommoderen? Als alternatief, als de wijziging regelgevend is, wanneer en hoe wordt de wijziging toegevoegd of gewijzigd om de EF-P-functie te wijzigen?

    Ten slotte, en misschien wel de grootste vraag, is: hoe bevordert EF-P groei? De afwezigheid van EF-P resulteert in verlaagde niveaus van een subset van eiwitten, waarvan sommige enzymen zijn die betrokken zijn bij het essentiële metabolisme. Enzymen zijn echter nogal resistent tegen fluctuaties in overvloed, en het is niet duidelijk waarom een ​​verlaging van hun niveau(s) groeibeperkend of zelfs remmend zou zijn. Bovendien suggereert recent werk dat de eis van EF-P, tenminste in E coli, kan voorwaardelijk worden verlicht door simpelweg langzamere groei te induceren bij lagere temperaturen (Tollerson, Witzky en Ibba 2018). Als langzame groei en de overeenkomstige vermindering van de translatiesnelheid voldoende is om de behoefte aan EF-P af te schaffen, waarom lijkt EF-P dan essentieel te zijn in langzaam groeiende organismen zoals Mycobacterium (Sassetti, Boyd en Rubin 2003)? Het is duidelijk dat EF-P zowel in vorm als in functie geconserveerd is in alle organismen in elk domein van het leven en een specifieke maar niettemin belangrijke rol speelt bij het handhaven van hoge translatiesnelheden. Essentiële groei zou een sterke selectie zijn om zo'n hoge conservering te garanderen, maar als EF-P niet strikt vereist is voor groei, waarom is het dan zo sterk geconserveerd?