Informatie

Wat is sequentiële passage?


Ik heb een tijdschrift gelezen waarin sequentiële passages worden beschreven met als doel resistentieontwikkeling bij bacteriën te meten. Ik zou graag meer willen weten over hoe de methode werkt, bijv. wat betekent "doorgang"?

https://www.nature.com/nature/journal/v517/n7535/pdf/nature14098.pdf, Methoden deel, onder resistentiestudies


Ik ben normaal gesproken terughoudend om Wikipedia-artikelen te citeren, maar die voor Sequential of Serial Passaging legt het heel mooi uit.

Kortom:

In de microbiologie verwijst sequentiële of seriële passages naar het proces van het groeien van bacteriën of virussen in iteraties. In wezen betekent dit dat een virus of een bacteriestam wordt geïsoleerd en gedurende een bepaalde periode kan groeien. Nadat het monster enige tijd is gegroeid, wordt een deel ervan overgebracht naar een nieuwe omgeving en mag het gedurende dezelfde periode groeien. Dit proces wordt zo vaak als gewenst herhaald. Het eindproduct wordt bestudeerd, vaak in vergelijking met de oorspronkelijke virus- of bacteriestam, om te zien of het is geëvolueerd of dat er andere veranderingen zijn opgetreden.


Studenten die een 5 behalen op het Biology AP I-examen of een IB-cijfer van 7, ontvangen credits die volledig gelijk zijn aan BIOS 10161 + 11161 en BIOS 10162 + 11162, dwz de eerste jaarreeks van Biological Sciences I en II met laboratoria die zijn ontworpen voor wetenschappelijke majors . Voor die studenten die ervoor kiezen om geen afstand te doen van AP- of IB-tegoed, worden BIOS 10098 en 10099 gecombineerd geaccepteerd als een vereiste voor alle biologiecursussen op het hoogste niveau waarbij BIOS 10161 en/of BIOS 10162 de vereiste zijn. Studenten die van plan zijn zich aan te melden bij medische of andere professionele scholen waar AP-wetenschappelijk krediet niet wordt geaccepteerd, of waar twee semesters algemene biologie met laboratoria op universitair niveau vereist zijn, zien bijna universeel af van hun AP-krediet aan de Notre Dame en volgen de lessen voor academische graad credit. In deze gevallen keert BIOS 10098/10099 terug naar niet-gradenkrediet op hun definitieve transcript, wanneer het wordt vervangen door 8,0 letter-gegradeerde studiepunten van ofwel BIOS 10161/11161 + 10162/1116201/21201 + 20202/21202 zoals bepaald door de vereisten van hun respectievelijke majors.

Studenten die een 5 behalen voor het Biology AP-examen of een IB-cijfer van 7, ontvangen credits die volledig gelijk zijn aan BIOS 10161 + 11161 en BIOS 10162 + 11162, d.w.z. de eerste jaarreeks van Biological Sciences I en II met laboratoria die zijn ontworpen voor wetenschappelijke majors. Voor die studenten die ervoor kiezen om geen afstand te doen van AP- of IB-tegoed, worden BIOS 10098 en 10099 gecombineerd geaccepteerd als een vereiste voor alle biologiecursussen op het hoogste niveau waarbij BIOS 10161 en/of BIOS 10162 de vereiste zijn. Studenten die van plan zijn zich aan te melden bij medische of andere professionele scholen waar AP-wetenschappelijk krediet niet wordt geaccepteerd, of waar twee semesters algemene biologie met laboratoria op universitair niveau vereist zijn, zien bijna universeel af van hun AP-krediet aan de Notre Dame en volgen de lessen voor academische graad credit. In deze gevallen keert BIOS 10098/10099 terug naar niet-gradenkrediet op hun definitieve transcript, wanneer het wordt vervangen door 8,0 letter-gegradeerde studiepunten van ofwel BIOS 10161/11161 + 10162/1116201/21201 + 20202/21202 zoals bepaald door de vereisten van hun respectievelijke majors. Zie het gedrukte gedeelte van dit bulletin (pagina 125) voor een algemene verklaring met betrekking tot cursussen Biologie-enquête.


Influenza passerende annotaties: wat ze ons vertellen en waarom we moeten luisteren

Influenzadatabases bevatten nu meer dan 100.000 wereldwijde sequentierecords voor de stammen influenza A(H3N2) en A(H1N1). Hoewel deze gegevens wereldwijde onderzoeksinspanningen en vaccinontwikkelingspraktijken vergemakkelijken, vormen ze ook een struikelblok voor onderzoekers vanwege hun verwarrende en heterogene annotatie. Onduidelijke passage-annotaties zijn met name zorgwekkend gezien het recente werk dat de aanwezigheid en het risico van valse aanpassingssignalen benadrukt die worden geïntroduceerd door celpassage van virale isolaten. Met dit in gedachten willen we een beknopt overzicht geven van de reden waarom virussen worden doorgegeven, een duidelijk overzicht van de huidige nomenclatuur voor passage-annotaties en suggesties voor een gestandaardiseerde nomenclatuur in de toekomst. We hopen dat deze samenvatting zowel onderzoekers als clinici in staat zal stellen om de passagegeschiedenis van een virusmonster gemakkelijker te begrijpen bij het analyseren van influenzasequenties.

trefwoorden: H1N1 H3N2 influenzaviruspassage-aanpassingen.

Figuren

HI-test voor vaccinontwikkeling.…

HI-test voor de ontwikkeling van vaccins. (A) overzicht van de HI-assay. Hemagglutinine op…

Woordwolk van influenza A(H3N2)...

Woordwolk van influenza A(H3N2) sequentieannotaties die de passage in een of meer...

Influenza A(H3N2) en A(H1N1) sequentie...

Influenza A(H3N2) en A(H1N1) sequentie-isolaattellingen in drie databases, 2005-18. (A) Totaal…


Toepassingen

De twee belangrijkste doelen van transfectie zijn het produceren van recombinante eiwitten, of het specifiek versterken of remmen van genexpressie in getransfecteerde cellen. Als zodanig is transfectie een krachtig analytisch hulpmiddel voor de studie van de functie en regulatie van genen of genproducten, voor de productie van transgene organismen en als methode voor gentherapie.

Genexpressie

Transfectie wordt meestal uitgevoerd om een ​​eiwit van belang tot expressie te brengen in gekweekte cellen (of een diermodel) door het gebruik van een plasmidevector of mRNA. Door expressie van het eiwit in eukaryote cellen kan het recombinante eiwit worden geproduceerd met de juiste vouwing en post-translationele modificaties die nodig zijn voor zijn functie. Verder maakt het introduceren van eiwitten met gemakkelijk detecteerbare markers en andere modificaties in cellen de studie van promotor- en enhancersequenties of eiwit:eiwit-interacties mogelijk.

Bovendien kan transfectie worden gebruikt in verschillende vormen van bioproductie, afhankelijk van de transfectiestrategie. De levering van herprogrammerende transcriptiefactoren maakt bijvoorbeeld het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) mogelijk. Stabiele transfectie daarentegen verschaft de middelen voor de bioproductie van verschillende therapeutische moleculen.

Genremming

Een ander frequent gebruik van transfectie is het remmen van de expressie van specifieke eiwitten door RNA-interferentie (RNAi). In zoogdiercellen vindt RNAi plaats via endogeen tot expressie gebracht niet-coderend RNA in de vorm van microRNA's (miRNA's), die zijn afgeleid van een dubbelstrengs RNA (dsRNA)-precursor. De voorloper wordt verwerkt tot een volwassen miRNA dat onderdeel wordt van een RNA-geïnduceerd silencing-complex (RISC), dat de translatie van complementaire doel-mRNA's remt.

Op vectoren gebaseerde systemen brengen miRNA-precursoren of korte haarspeld-RNA (shRNA) -precursoren tot expressie die door endogene machines worden verwerkt om respectievelijk miRNA's of shRNA's te produceren, die vervolgens werken om genexpressie te remmen. Deze systemen maken stabiele transfectie van recombinante constructen mogelijk en kunnen induceerbare expressie van voorlopermoleculen mogelijk maken.

Chemisch gesynthetiseerde korte/kleine interfererende RNA's (siRNA's) kunnen ook worden opgenomen in een RISC en genuitschakeling induceren door complementair mRNA te richten op afbraak. Aanpassingen aan siRNA's helpen om off-target effecten te voorkomen, en ook om ervoor te zorgen dat de actieve streng van het dsRNA in de RISC wordt geladen.


4. Discussie

We vinden dat seriële passage van influenzavirus een meetbaar signaal van aanpassing introduceert in de evolutionaire analyse van natuurlijke influenzavirussequenties. Er zijn unieke, karakteristieke patronen van aanpassing aan de passage van eieren, passage van apencellen en passage van niet-SIAT1-cellen. Van apencellen afgeleide sequenties vertonen verschillende molecuulbrede evolutionaire snelheidspatronen. Niet-SIAT1-cel-afgeleide sequenties vertonen in plaats daarvan een hotspot van positieve selectie in een lus onder het siaalzuur bindende gebied. Deze hotspot is eerder opgemerkt (Meyer en Wilke, 2015) maar er was geen verklaring voor de oorsprong ervan. Extra passages in niet-SIAT1-cellen versterken dit artefact. Verder vinden we dat virus dat is gepasseerd in SIAT1-cellen slechts kleine passageartefacten lijkt te accumuleren. Tijdens onze analyses vinden we beperkt nut bij het onderverdelen van fylogenetische bomen naar interne en terminale takken. Terwijl signalen van aanpassing van de passage consequent worden verhoogd langs terminale takken en verzwakt langs interne takken, blijven evolutionaire snelheden langs interne takken verward door passerende artefacten. Bovendien kan passage-aanpassing lijken op vaste seizoen-tot-seizoen-mutatie langs stamtakken en op topologie gebaseerde voorspellingen van sequentie-fitness veranderen. Ten slotte kunnen we de experimenteel bepaalde antigene regio's van HA nauwkeurig herstellen van evolutionaire snelheidsanalyse door een dataset te gebruiken die alleen uit niet-gepasseerde virale sequenties bestaat.

Eerdere studies (Bush et al., 2001 Suzuki, 2006) suggereren het gebruik van interne vertakkingen om passageaanpassingen te verlichten. We vinden hier echter dat deze strategie onvoldoende is, omdat het evolutionaire signaal van passage-aanpassingen vaak langs interne takken kan worden gedetecteerd. Deze bevinding lijkt misschien contra-intuïtief, omdat interne knooppunten uitsluitend door mensen aangepast virus moeten vertegenwoordigen. We suggereren dat passageaanpassingen in interne takken homoplasieën kunnen zijn die worden veroorzaakt door convergente evolutie als verschillende klinische isolaten convergeren op dezelfde adaptieve mutaties tijdens passage, dan kunnen deze mutaties onjuist langs interne takken worden geplaatst onder fylogenetische boomreconstructie. Bovendien, hoewel het gebruik van alleen interne vertakkingen enkele verschillen tussen de passagegroepen wegneemt, kan de uitsluiting van terminale sequenties recente natuurlijke aanpassingen verdoezelen en dus feitelijke locaties onder positieve selectie verdoezelen. Daarom is analyse van interne vertakkingen niet alleen onvoldoende voor het elimineren van artefacten van passageaanpassingen, maar ook suboptimaal voor het detecteren van positieve selectie in seizoensgebonden H3N2-influenzavirus.

De veiligste manier om passaging-artefacten te vermijden, is om sequentiegegevenssets te beperken tot alleen niet-doorgelaten virussen, hoewel deze benadering de sequentienummers beperkt. De mensachtige 6-gekoppelde siaalzuren in SIAT1 (Matrosovich et al., 2003) verminderen de waargenomen celcultuurspecifieke aanpassingen aanzienlijk, met name in de lus van HA die site 224 bevat. Dit gebrek aan selectie komt overeen met meerdere experimenten die lage niveaus vonden van aanpassing in deze cellijn (Oh et al., 2008 Hamamoto et al., 2013). Aangezien onze analyse slechts kleine verschillen detecteert tussen niet-gepasseerd en SIAT1-gepasseerd virus, stellen we dat deze passage-conditie een acceptabele vervanging is voor niet-gepasseerde klinische monsters. Toch sluiten onze bevindingen het bestaan ​​niet uit van SIAT1-specifieke aanpassingen die specifieke analyses kunnen verstoren.

Meer dan de helft van de gepasseerde HA-sequenties in de GISAID-database van 2005 tot 2015 werden meer dan eens gepasseerd. Meerdere passages in niet-SIAT1-cellen veroorzaken een toenemende accumulatie van passage-artefacten, en we zouden verwachten dat alle nog onbekende passage-effecten zich op dezelfde manier zouden kunnen ophopen. Niettemin introduceert zelfs een enkele passage in niet-SIAT1-cellen merkbare artefacten van aanpassing. Influenzavirus wordt vaak meerdere keren gepasseerd om de virale titers voor hemagglutinatieremmingstests te verbeteren, en daarom verwachten we dat meervoudig gepasseerde virussen in de nabije toekomst zullen blijven worden gedeponeerd. We raden aan om dergelijke virussen met zorg te gebruiken bij het bestuderen van de evolutionaire dynamiek van influenzavirusstammen die in de menselijke populatie circuleren.

Hoewel de meerderheid van de sequenties uit het jaar 2015 SIAT1-passaged of unpassaged zijn, zijn enkele honderden sequenties uit dat jaar afkomstig van apencelcultuur. Het gebruik van apencelcultuur steeg in 2014 en 2015 in vergelijking met voorgaande jaren. We raden aan om deze recent verzamelde sequenties uit te sluiten van de evolutionaire snelheidsanalyse van het influenzavirus, in het voordeel van de meerderheid van de niet-gepasseerde en SIAT1-gepasseerde sequenties. Aangezien passage een nuttige en kosteneffectieve methode is voor de amplificatie van klinisch verzameld virus, is het onwaarschijnlijk dat niet-gepasseerde virale sequenties in de nabije toekomst de databases met sequenties van influenzavirussen volledig zullen domineren. Nieuwe menselijke epitheliale celcultuursystemen voor het passeren van influenzavirus (Ilyushina et al., 2012) zouden echter binnenkort een ideaal systeem kunnen bieden dat zowel het virus versterkt als het beschermt tegen niet-menselijke selectieve druk.

Passagegeschiedenis moet routinematig worden beschouwd als een mogelijke verstorende variabele in toekomstige analyses van de evolutiesnelheid van het influenzavirus. Toekomstige studies moeten worden vergeleken met niet-gepasseerde monsters om ervoor te zorgen dat conclusies niet gebaseerd zijn op aanpassing aan niet-menselijke gastheren. We raden de uitsluiting aan van virale sequenties die afkomstig zijn van seriële passage in eiervlooien, apenniercelcultuur en elke niet-gespecificeerde celcultuur. Eerder werk dat geen rekening hield met het passeren van de geschiedenis, kan worden vertroebeld door aanpassingen aan het passeren, zoals gebeurde in onze vorige publicatie (Meyer en Wilke, 2015). In dat artikel concludeerden we dat sites onder positieve selectie verschillen van sites die betrokken zijn bij immuunontsnapping. Hier vinden we dat de oorsprong van deze positieve selectie de aanpassing aan de niet-menselijke passerende gastheer is, niet immuunontsnapping in of aanpassing aan mensen. In het bijzonder stellen we voor dat de evolutionaire markers van het influenzavirus bepaald in (Belanov et al., 2015) opnieuw worden geëvalueerd om ervoor te zorgen dat deze sites geen artefacten zijn van virale passage. Evenzo hebben veel van de eerdere onderzoeken (Bush et al., 1999 Suzuki, 2006, 2008 Shih et al., 2007 Pan and Deem, 2011 Tusche, Steinbrück, en McHardy, 2012 Meyer en Wilke, 2013, 2015) locatiespecifieke evolutionaire analyse van HA bevat waarschijnlijk enkele conclusies die terug te voeren zijn op passerende artefacten. Bovendien, hoewel passage-artefacten niet sterk genoeg lijken om de reconstructie van de clade-structuur te beïnvloeden (Bush et al., 2000), hebben ze het potentieel om kunstmatig lange taklengtes te veroorzaken, als gevolg van dN/dS inflatie, of misplaatste takken, als gevolg van convergente evolutie tijdens het passeren. We vinden dat steekproeven die zijn samengesteld uit niet-SIAT1 zich anders lijken te gedragen dan niet-gepasseerde steekproeven onder de LBI-metriek. Toekomstige fylogenetische voorspellende modellen van de fitness en antigeniciteit van het influenzavirus, zoals in (Bedford et al., 2014 Łuksza en Lässig, 2014 Neher et al., 2014), moeten dus ook worden gecontroleerd op robuustheid voor passage-gerelateerde signalen. Ten slotte, hoewel het buiten het bestek van dit werk valt om de effecten van passagegeschiedenis in andere virussen te onderzoeken, vermoeden we dat van passage afgeleide artefacten ook een factor kunnen zijn in hun fylogenetische analyses. Het gebruik van datasets die vrij zijn van passage-aanpassingen zal waarschijnlijk de computationele voorspellingen van influenza-positieve selectie meer in overeenstemming brengen met de overeenkomstige experimentele resultaten.

Sequenties zonder passage-annotaties zijn ontoereikend voor een betrouwbare evolutionaire analyse van het influenzavirus. Toch ontbreken passage-annotaties vaak volledig in staminformatie en, indien aanwezig, zijn ze vaak inconsistent. Er is momenteel geen gestandaardiseerde taal om het aantal en het type seriële passage weer te geven. We merken echter op dat de passage-annotaties van het seizoen 2015 sterk zijn verbeterd in vergelijking met voorgaande seizoenen. Verschillende grote influenza-opslagplaatsen, waaronder de Influenza Research Database (Squires et al., 2012) en de NCBI Influenza Virus Resource (Bao et al., 2008), bieden helemaal geen passage-annotaties. Bovendien is de passagegeschiedenis niet vereist voor het indienen van nieuwe sequenties bij de NCBI Genbank (Benson et al., 2012). De EpiFlu-database die wordt onderhouden door de GISAID (Bogner et al., 2006) en OpenFluDB (Liechti et al., 2010), onderscheidt zich echter door annotaties van de passagegeschiedenis te bieden voor de meeste van hun sequenties. Hiervan staat alleen de OpenFluDB-repository het filteren van sequenties toe op passagegeschiedenis tijdens het downloaden van gegevens. Onze resultaten demonstreren de kracht van passerende artefacten in evolutionaire analyse van influenzavirus. Het ontbreken van een universele standaard voor annotatie van virale passagegeschiedenissen en een universele standaard voor seriële passage-experimentele omstandigheden bemoeilijken de analyse en beperking van passage-effecten.


Zoogdiercel weefselkweek technieken protocol

Het volgende is een algemene richtlijn voor het kweken van cellijnen. Alle celculturen moeten worden uitgevoerd in een microbiologische veiligheidskast met behulp van aseptische techniek om steriliteit te garanderen.

Inhoud

​1) Een aseptische omgeving voorbereiden

Hood regelgeving

Autoclaveren

  • (a) Pipettips (of kunnen voorgeautoclaveerd worden gekocht, DNAse/RNAse-vrij)
  • (b) Glazen 9-inch pasteurpipetten
  • (c) 70% ethanol (Zorg ervoor dat u alle oppervlakken besproeit)

Alle media, supplementen en reagentia moeten steriel zijn om microbiële groei in de celcultuur te voorkomen. Voor sommige reagentia en supplementen is filtersterilisatie vereist als ze niet steriel worden geleverd.

Bekijk ons ​​videoprotocol voor aseptische technieken voor gedetailleerde richtlijnen om besmetting te voorkomen.

2) Bereiding van celgroeimedium

Controleer voordat u met het werk begint de informatie die bij de cellijn wordt gegeven om te bepalen welk mediumtype, additieven en aanbevelingen moeten worden gebruikt.

De meeste cellijnen kunnen worden gekweekt met behulp van DMEM-kweekmedia of RPMI-kweekmedia met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM glutamine en indien nodig kunnen antibiotica worden toegevoegd (zie onderstaande tabel).

Controleer welke kweekmedia en kweeksupplementen de door u gebruikte cellijn nodig heeft voordat u met kweken begint. Kweekmedia en supplementen moeten steriel zijn. Koop indien mogelijk steriele reagentia, gebruik alleen onder aseptische omstandigheden in een kweekkap om ervoor te zorgen dat ze steriel blijven.

​​Algemeen voorbeeld met DMEM-media

MediaMeeteenheid
DMEM - Haal 50 ml uit de fles van 500 ml, voeg andere bestanddelen toe. 450 ml
10% FBS50 ml
2 mM glutamine5 ml
100 E penicilline / 0,1 mg/ml streptomycine5 ml

3) Het creëren van de juiste kweekomgeving

De meeste cellijnen zullen op kweekflessen groeien zonder dat speciale matrices enz. nodig zijn. Sommige cellen, met name primaire cellen, zullen echter moeten groeien op speciale matrices zoals collageen om celhechting, differentiatie of celgroei te bevorderen. We raden u aan de relevante literatuur te raadplegen voor meer informatie over de cellen die u kweekt.

Het volgende is een voorbeeld voor endotheel- en epitheelcellen:

Bedek kolven voor menselijke cellen met 1% gelatine. Als alternatief kunnen kolven voor andere celtypen zoals BAEC worden gecoat met 1% fibronectine.

  1. Bereid 10 ml coatingoplossing voor bestaande uit 1% gelatine of 1% fibronectine door te verdunnen met gedestilleerd water, gevolgd door filtratie. Dit is efficiënt om ongeveer 5 kolven te coaten.
  2. Pipetteer de coatingoplossing in de kolf. Schud heen en weer om de bodem van de kolf gelijkmatig te verdelen. Laat 15-30 minuten in een incubator zitten.
  3. Zuig de coatingoplossing op en was met steriele dH2O voordat je cellen ziet.

4) Cellen controleren

Cellen moeten dagelijks microscopisch worden gecontroleerd om de gezondheid, groeisnelheden en confluentie te controleren (% oppervlakte bedekt met celmonolaag).

Hechtende cellen moeten voornamelijk aan de bodem van de kolf worden bevestigd, een hechtende morfologie vertonen (afhankelijk van de cellijn) en licht breken rond hun membraan (zie afbeeldingen van Abcam-cellijngegevens).

Suspensiecellen moeten een cirkelvormige morfologie vertonen en licht rond hun membraan breken. Sommige suspensiecellen kunnen klonteren (dissociatiereagentia zoals Pluronic PF68 kunnen worden toegevoegd om de klonterverwijdering te bevorderen).

Media die fenolrood bevatten, moeten roze/oranje van kleur zijn (de kleur van de media kan veranderen afhankelijk van CO2 omgeving). Voor beeldvormingstoepassingen kunnen media zonder fenolrood worden gebruikt, waardoor interferentie met beeldopname wordt voorkomen. Een lichtgele kleur van media zou wijzen op een zuurgraad en een verlaging van de pH die vaak wordt geassocieerd met verontreiniging of ongezonde cellen.

  • Ze laten in grote aantallen los (bijgevoegde lijnen) en/of zien er verschrompeld en korrelig/donker van kleur uit.
  • Ze zijn in rust (lijken helemaal niet te groeien).

5) Subcultuur

Ook wel celsplitsing en celpassage genoemd.

Gesplitste verhoudingen of seeding-dichtheden kunnen worden gebruikt om ervoor te zorgen dat cellen op een bepaalde dag klaar zijn voor een experiment of om celculturen te behouden voor toekomstig gebruik of als back-up. Suspensiecellijnen worden gezaaid op basis van volume, zodat de zaaidichtheden worden berekend als cellen/ml, terwijl hechtende cellijnen worden gezaaid op basis van het kolfoppervlak en dus worden berekend als cellen/cm2. Cellijnen vereisen vaak specifieke zaaidichtheden, dus controleer altijd de richtlijnen voor de gebruikte cellijn. Langzaam groeiende cellen groeien mogelijk niet als een hoge splitsingsverhouding wordt gebruikt. Snelgroeiende cellen hebben mogelijk een hoge splitsingsverhouding nodig om te voorkomen dat ze overgroeien.

Aanhechtende cellijnen kunnen worden gesplitst met behulp van cellijnspecifieke splitsingsverhoudingen of zaaidichtheden (cellen/cm2):

  • 1:2 split moet 70-80% confluent zijn en klaar voor een experiment in 1 tot 2 dagen
  • 1:5-splitsing moet 70-80% confluent zijn en klaar voor een experiment in 2 tot 4 dagen
  • 1:10 split moet 70-80% confluent zijn en klaar voor subkweek of plating in 4 tot 6 dagen.

Splitverhoudingen zijn gebaseerd op het kolfoppervlak, bijvoorbeeld:

1 kolf van 25 cm 2 Split 1:3 zou 3 kolven van 25 cm 2 opleveren of 1 x 75 cm 2

Suspensiecellijnen moeten worden gehandhaafd met behulp van cellijnspecifieke zaaidichtheden (cellen/ml):

  • 2e5 zou binnen 3-4 dagen klaar moeten zijn voor een experiment
  • 1e6 zou binnen 1-2 dagen klaar moeten zijn voor een experiment

Als cellen voor langere perioden onbeheerd moeten worden achtergelaten (d.w.z. feestdagen tijdens weekends), wordt aanbevolen om een ​​lager dan normale zaaidichtheid/splitsingsverhouding te gebruiken.

​6) Aanhangend subcultuurprotocol (met behulp van dissociatiereagens)

Wanneer de cellen ongeveer 80% confluent zijn (80% van het kolfoppervlak is bedekt met een celmonolaag), moeten de cellen zich nog steeds in hun log-groeifase bevinden en moeten ze opnieuw worden gekweekt. Het wordt niet aanbevolen om cellen te confluent te laten worden, omdat dit de genexpressie en levensvatbaarheid van de cellen negatief kan beïnvloeden.

  1. Verwijder celkweekmedia en dissociatiereagens uit de koelkast en plaats in een 37 o C incubator en laat komen tot 37 o C te temperen.
    - Laat media niet langer in de incubator dan nodig is, aangezien de mediacomponenten na verloop van tijd zullen verslechteren.
  2. Schakel in en voer een basisreiniging uit voor uw biologische veiligheidskast.
    - Spuit alle mediaflessen, pipetten en centrifugebuizen met ethanol voordat u ze in de biologische veiligheidskast plaatst.
  3. Verwijder onder de biologische veiligheidskast de geconditioneerde media en was de celmonolaag voorzichtig met DPBS op kamertemperatuur.
    - Voeg DPBS voorzichtig toe aan de zijkant van de kolf, zodat aanhangende cellen niet met kracht loskomen.
  4. Verwijder de DPBS met behulp van een steriele serologische pipet en voeg voorverwarmd dissociatiereagens (trypsine-EDTA) toe aan de kolf en plaats deze in een incubator voor

7) Subkweek losjes gehechte cellijnen waarvoor celschrapen nodig is voor subkweek;

  1. Als u klaar bent, giet u het medium voorzichtig uit de kolf met de vereiste cellen in de afvalpot (met ongeveer 100 ml 10% natriumhypochloriet) en zorg ervoor dat u het risico op besmetting met eventuele druppels niet verhoogt.
  2. Vervang deze onmiddellijk door voorzichtig een gelijk volume voorverwarmde verse kweekmedia in de kolf te gieten.
  3. Gebruik een celschraper om de cellen voorzichtig van de bodem van de kolf in de media te schrapen. Controleer of alle cellen zijn losgekomen door de bodem van de kolf te inspecteren voordat u verder gaat.
  4. Neem de vereiste hoeveelheid celsuspensie voor de vereiste split-ratio met behulp van een serologische pipet.
    bijv. voor 1:2 splitsen van 100 ml neem 50 ml in een nieuwe kolf
    1:5 splitsen van 100 ml neem 20 ml in een nieuwe kolf
    1:10 splitsen van 100 ml neem 10 ml in een nieuwe kolf
  5. Vul de nieuwe kolven tot het vereiste volume (rekening houdend met de split-verhouding) met voorverwarmde verse kweekmedia
    bijv. in maatkolf van 25 cm 2 ca. 5-10 ml
    75 cm 2 kolf ca. 10-30 ml
    175 cm 2 kolf ca. 40-150 ml

8) Subkweken van aangehechte cellijnen waarvoor trypsine nodig is

Opmerking - niet alle cellen hebben trypsinisatie nodig en voor sommige cellen kan het giftig zijn. Het kan ook tijdelijke internalisatie van sommige membraaneiwitten induceren, waarmee rekening moet worden gehouden bij het plannen van experimenten. Andere methoden, zoals voorzichtig schrapen van cellen of het gebruik van een zeer mild reinigingsmiddel, kunnen in deze omstandigheden vaak als vervanging worden gebruikt.

  1. Als u klaar bent, giet u het medium voorzichtig uit de kolf met de vereiste cellen in de afvalpot (met ongeveer 100 ml 10% natriumhypochloriet) en zorg ervoor dat u het risico op besmetting met eventuele druppels niet verhoogt.
  2. Giet/pipetteer met behulp van aseptische techniek voldoende steriele PBS in de kolf om de cellen een wasbeurt te geven en verwijder eventuele FBS in de resterende kweekmedia. Tip de kolf voorzichtig een paar keer om de cellen te spoelen en giet / pipet de PBS voorzichtig terug in de afvalpot.

Dit kan indien nodig nog een of twee keer worden herhaald (sommige cellijnen hebben veel tijd nodig om te trypsiniseren en deze hebben meer wasbeurten nodig om eventuele resterende FBS te verwijderen om trypsinisatie te helpen)

9) ​Subkweek van suspensiecellijnen​

  1. Controleer de richtlijnen voor de cellijn voor de aanbevolen splitsingsratio of celdichtheden voor subculturen.
  2. Haal de benodigde hoeveelheid celsuspensie uit de kolf met behulp van een pipet en plaats deze in een nieuwe kolf.
    ​bijv. Voor 1:2 splitsen van 100 ml celsuspensie, neem 50 ml
    ​Voor 1:5 splitsen van 100 ml celsuspensie 20 ml eruit halen
  3. Voeg de vereiste hoeveelheid voorverwarmde celkweekmedia toe aan een verse kolf.
    bijv. Voeg voor 1:2 split van 100 ml 50 ml verse media toe aan 50 ml celsuspensie
    ​Voor 1:5 splitsen van 100 ml 80 ml verse media toevoegen aan 20 ml celsuspensie

10) Media wijzigen

Als cellen al een paar dagen goed groeien maar nog niet samenvloeien, moeten ze van medium worden veranderd om voedingsstoffen aan te vullen en de juiste pH te behouden. Cellen produceren positieve groeibevorderende factoren die in hun media worden uitgescheiden, zodat het gunstig kan zijn om een ​​halve mediaverandering uit te voeren, voedingsstoffen aan te vullen die door de media worden geleverd en ook deze positieve groeifactoren te behouden.

Om van media te wisselen, warmt u de kweekmedia op bij 37°C met behulp van een waterbad of incubator gedurende ten minste 30 minuten. Zuig oude media uit de kolf en vervang de media door het benodigde volume verse voorverwarmde kweekmedia en keer terug naar de incubator.

11) Passagenummer

Het passagenummer is het aantal subculturen waar de cellen doorheen zijn gegaan. Het passagenummer moet worden geregistreerd en niet te hoog worden. Dit is om het gebruik van cellen die genetische drift en andere variaties ondergaan, te voorkomen.


Wat is uw passagenummer?

Goede celpraktijken vereisen het starten van elk experiment met celcultuur met een lage doorgang, en beperk het aantal passages dat u in uw experiment accepteert. Maar wat is een goed passagenummer (behalve 'nul' dus)? De aantallen zijn in de loop der jaren verschillend geweest. Sommige normen bevelen drie stamsubculturen en drie "werkcultuur" -subculturen aan - die optellen tot zeven passages, inclusief de originele passage uit de referentie. Ondertussen vragen sommige producenten van celkweek meer voor kweken van twee passages of minder. De ATCC waarschuwt onderzoekers echter om aan te nemen dat een celcultuur uit een commerciële bron al een of twee passages verwijderd kan zijn van de referentiestam. Over het algemeen beveelt de ATCC aan dat celkweek wordt beperkt tot vijf passages, ten minste voor gebruik in medische en biofarmaceutische toepassingen.


Wat is sequentiële passage? - Biologie

Instructies om analyse uit te voeren

  • Python 2.7
  • Panda's (Hier, 0.13)
  • BioPython (Hier, 1.66)
  • FastTree 2.18 of hoger samengesteld voor korte taklengtes (zie hieronder)
  • HyPhy (Hier, 2.26) http://hyphy.org/
  • R 3.2.1 of hoger
  • FigTree of andere boomvisualisatiesoftware
  • ete3

Verwijder eerst alle .tree-bestanden in /trees/, .txt-bestanden in input_fasta_summary en .dat-bestanden in /rate_measurement_data/, en .corr .raw .png- en .csv-bestanden in data_analysis

Initiële gegevensdownload en FASTA-opmaak

1. Stappen voor het downloaden en instellen van gegevens

  • git clone-project naar de linux-thuismap
  • GISAID-account aanmaken (http://platform.gisaid.org/epi3/frontend)
  • Selecteer op het tabblad http://platform.gisaid.org/epi3/frontend -> EpiFlu sequenties met de volgende parameters Type = EEN, H = 3, N=2, Gastheer = Menselijk, Locatie = Noord Amerika, Vereiste segmenten = HA, alleen compleet
  • Selecteer alles op de pagina met vrijgegeven bestanden en klik op Downloaden
  • Download op de downloadoptiepagina met de volgende parameters: Formaat = Sequenties (nucleotiden) als FASTA, Eiwitten = HA, FASTA-koptekst = Isoleer naam, Passage details/geschiedenis, Datumnotatie= YYYY-MD-DD, Vervang spaties door underscores in FASTA-header -> klik op downloaden
  • Download ook de GISAID-bevestigingstabel
  • Als er voldoende reeksen zijn, kan de GISAID-bevestigingstabel mogelijk niet allemaal tegelijk worden gedownload. Mogelijk moet de download worden opgedeeld in verschillende tijdsperioden
  • Plaats het onbewerkte GISAID fasta-bestand in de /invoergegevens map

A. Compileer FastTree voor korte taklengtes geschikt voor griepgegevens

  • Standaard FastTree staat geen vertakkingslengtes toe die kleiner zijn dan 0,0005
  • FastTree moet versie 2.1.7 of hoger zijn, gecompileerd met de volgende regel om het type korte taklengtes in influenzabomen mogelijk te maken:
  • Download FastTree.c (http://meta.microbesonline.org/fasttree/FastTree.c)
  • Loop:

3. Schone startsnelheid van lange vertakkingen en abnormale sequenties

  • In /run_analyse uitvoeren: $ bash step1_format_fasta.bash ../input_data/[name_of_downloaded_gisaid.fasta]
  • Hierdoor wordt formatted.tree uitgevoerd naar de map /trees op het hoogste niveau.

4. Handmatige inspectie van fylogenetische boom en verwijdering van abnormale clades

  • Vaak bevatten gedownloade griepgegevens afwijkende sequenties die lange vertakkingen introduceren
  • Open formatted.tree (opgeslagen in /trees/formatting_trees) met behulp van een boomvisualisatieprogramma zoals FigTree
  • Kopieer elke lange branch (meer dan 0,01 lengte) clades naar een nieuw bestand en noem het ab.txt (kan nog steeds in newick formaat string zijn).
  • FASTA ID's worden geparseerd uit ab.txt en verwijderd uit de rest van de analyse
  • Plaats ab.txt op het hoogste niveau /invoergegevens map

5. Verdeel FASTA door passagegeschiedenis en jaar

  • In /run_analyse uitvoeren: $ bash step2_divide_passage_and_year.bash
  • Voert FASTA-bestanden uit, gedeeld door jaar en passagegeschiedenis naar /fastas/passage_and_year_divided_fastas/
  • Voert FASTA-bestanden uit, alleen gedeeld door de passagegeschiedenis naar /fastas/passage_divided_fastas/
  • Dit bash-script roept remove_sequences.py, align_and_translate.py, passageparser.py, timeseries.py, timesort.py, getpassage.py, getidentifiers.py en get_unique_records.py aan.
  • remove_sequences.py verwijdert alle abnormale clades die in de vorige stap zijn gemaakt
  • passageparser.py verdeelt FASTA door passagegeschiedenis
  • timesort.py verdeelt de output van passageparser.py per jaar, van 2005-2015, en creëert een outgroup van sequenties van 1968-1977
  • timesort.py maakt ook een reeks samenvattingsbestanden van passage-ID's, FASTA-ID's en tellingen per jaar, die worden opgeslagen in /input_fasta_summary
  • timeseries.py creëert timeseries_all.txt en timeseries_yearly, die tellingen van reeksen bevatten, gedeeld door het type passage voor respectievelijk alle jaren en elk jaar
  • getpassage.py maakt passageIDs_all.txt en passageIDs_yearly aan, waarin alle passage-ID's worden weergegeven, gesorteerd op hun gedefinieerde passagetype voor respectievelijk alle jaren en elk jaar. Handig om ervoor te zorgen dat de passagegeschiedenis correct wordt geparseerd
  • getidentifiers.py creates identifies_all.txt and identifiers_yearly.txt, which list all record ids sorted by passage type for all years or each year, respectively.
  • align_and_translate.py translates and align sequences. Outputs to /fastas/formatting_fastas/. Viewing the protein alignment is useful as a check for gap introducing sequences, which should be removed from this analysis

##Evolutionary rate reconstructions

In this section, evolutionary rates (dN/dS) are reconstructed from selections of subdivided FASTA files created from step2_divide_passage_and_year.bash

Parameters for each condition are stored in bash scripts in /condition_parameters with matching names. A new condition can be made in /condition_parameters/ using the format parameters_[condition_name].sh. Each new [condition_name] must be added to run_analysis/step3_sort_conditions.bash and step4_analyze_conditions.bash

Reconstruct dN/dS for sample sizes matched to the number of sequences in the passage type with fewest sequences between 2005 and 2015. Sample size limiter = egg culture (79 sequences) Folders or files with names including "eggmatched20052015" contain data associated with this condition

Reconstruct dN/dS for size matched samples of unpassaged, non-SIAT1 cell culture, MDCK-SIAT1 cell culture, generic cell culture, and a pooled group of sequences from 2005-2015. Sample size limiter = MDCK-SIAT1 cell culture (1046 sequences) Folders or files with names including "siatmatched20052015" contain data associated this condition

Reconstruct dN/dS for size matched samples of unpassaged, monkey cell culture, non-SIAT1 cell culture, MDCK-SIAT1 cell culture, generic cell culture, and a pooled group of sequences from 2005-2015. Sample size limiter = monkey cell culture (917 sequences) Folders or files with names including "monkeymatched20052015" contain data associated this condition

Reconstruct dN/dS for size matched samples of unpassaged, non-SIAT1 cell culture, gneric cell culture, and a pooled groups of sequences from 2005-2015. Sample size limiter = unpassaged (1703 sequences) Folders or files with names including "unpassagedmatched20052015" contain data associated this condition Sample size limiter = unpassaged

Reconstruct dN/dS for size matched samples of non-SIAT1 MDCK cell culture, MDCK-SIAT1 cell culture, unpassaged sequences from 2014. Sample size limiter = unpassaged (249 sequences) Folders with names including "unpassagedmatched2014" contain data associated with this condition

(Not used in paper) Reconstruct dN/dS for all sequences available for all passage types from 2005-2015 unpassagedmatched2014 Folders or fileswith names including "allsequences20052015" contain data associated with this condition

6. Sort fastas divided by year and passage history into experimental groups. Also, take random samples for matched conditions

  • In run_analysis/ $ bash step3_sort_conditions.bash
  • This script calls sort_conditions.sh for each condition, and sorts/randomly samples FASTAs according to parameters stored in /condition_parameters/
  • Requires script randomdraw.py
  • For each FASTA in a condition's experimental set, this step uses FastTree to reconstruct a phylogenetic tree
  • There is a choice whether to manually reroot trees (manual) or trim down an existing full tree (auto)
  • Modify command in step3_sort_conditions.bash to ex. bash bash sort_conditions.sh unpassagedmatched2014 samp manual

7 (Optional): Manually format trees

  • For each tree in /trees/allpassages_trees/, trees/matched_allpassages_trees, /trees/matched_nonsiatunpassaged_trees, and trees/matched_siatnonsiat_trees:
  • Open tree in FigTree (or other tree visualization software)
  • Select the outgroup branch of sequences from 1968-1977, and click Reroot (ctrl + r)
  • Sort branches ascending (ctrl + u)
  • Select the non outgroup branch and copy (ctrl + c)
  • Open new FigTree window (ctrl + n)
  • Paste in non-outgroup branch (ctrl + v)
  • For an original tree named outgroup_X_N_20052014.tree, save the new non-outgroup containing tree in the same folder with the prefix samp_ or complete_ depending on if it derives from a random sample or not. Only trees from the allpassages condition should be named complete_. Trees from matched conditions should be named samp_. Ex.outgroup_samp_siat_229a_2014.tree (unrooted tree with outgroup)-> samp_siat_229a_2014.tree (rooted tree without outgroup)

In /run_analysis run: $ bash step4_analyze_conditions.bash This script calls start_SLAC for each condition, which formats tree files for SLAC analysis, starts SLACrun.sh, sorts output data files to rate_measurement_data, and calls consolidate.py to compile output dN lists to slac_output.csv in /data_analysis/

  • Requires SLACrun.sh, and consolidate.py
  • It is important that .tree and .fasta base filenames match exactly, ie. complete_pooled_all_20052014.tree and complete_pooled_all_20052014.fasta
  • The formatting step creates a temporary tree files with removed spaces, extra text, pipes (|), apostrophes, and tabs, which cause errors in the HyPhy SLAC analysis.
  • slac_output.csv is the input data file for figures and statistical analysis

9. Map dN/dS onto structure

First, run stats_and_figs.Rmd to generate correlations between dN and moveable inverse distance as well as a file of sitewise dN/dS (see paper for description).

This script will generate:

nonsiat_inverse_dnds.corr -> Data for Figure 5A

unpassaged_inverse_dnds.corr -> Data for Figure 5B, 6A

unpassaged_dnds.raw -> Data for Figure 6B

Ensure files are saved in /data_analysis directory

In pymol GUI command line, navigate to /data_analysis

Modify input filename in color_script.py

In the pymol GUI command line, input "run color_script.py"

This will open 2YP7clean.pdb

In the pymol GUI command line, input "import spectrumany"

In the pymol GUI command line, input "spectrumany b, white red, [structure name], [minvalue], [maxvalue]"

Save image, and repeat for each .corr or .raw file

Extra instructions to generate a new structure_map.txt and distances.dat for a different influenza structure. Files structure_map.txt and distances.dat for pdb:2YP7 are already provided in /data_analysis.

For more details see Meyer and Wilke, 2015 scripts and files for this analysis are in structure_mapping/

  • Download the H3N2 2YP7.pdb or other file from the Protein Data Bank
  • Open in Pymol GUI
  • Click S at the lower right
  • Then Display -> Sequence mode -> Chains
  • Then click to highlight all chains after B, and right click delete
  • Then Display -> Sequence mode -> Residues codes, and delete until first aa is position 10.
  • Make sure each alpha carbon CA corresponds to one amino acid, ie. consolidate CA1 and CA2 lines to one CA
  • Check to make sure the end is around 570 aa
  • Run python /scripts/translate_align_mapping.py /fastas/formatting_fastas/protein.fasta [structure_name].pdb *This generates structure_map.txt *protein.fasta was generated from the formatted input FASTA by /scripts/align_and_translate.py called in step2_divide_passage_and_year.bash
  • See how many lines the structure_map.text is
  • See how long any sequence in protein.fasta is
  • Delete -'s from end of structure_map.txt until they match the length of a protein in protein.fasta (ex. 577 lines)
  • Run /scripts/distances.py [clean structure name] to generate distances.dat for data analysis

After running step2_divide_passage_and_year.bash to remove any clades that stick out as long branch, manually check the output outgroup_pooled_all_20052014.tree first for any long branch clades remaining in the dataset. If any are found, add them to ab.txt, and rerun starting from step2_divide_passage_and_year.bash

Random sample size can be modified in any sort_matched_type.sh script by placed the desired sample size as the first argument to python randomdraw.py, prior to the list of input files

The regex for dividing sequences by passage type in passageparser.py is checked only for accuracy only for passage annotations in the dataset used for this project. Passage sorting of any new dataset should be manually checked for accuracy. Useful files for checking passage sorting are created by step2_divide_passage_and_year.bash, and stored in input_fasta_summaries/. Check unsortable.txt for sequences that can't be separated by year. Check passageIDs_all.txt to make sure passage annotations match categories, i.e. egg or generic cell.

/data_analysis scripts for making paper figures, as well as raw data used by these scripts

  • stats_and_figs_influenza_passaging.Rmd - R markdown script for making figures. Open in R studio, and set current working directory to /data_analysis and run
  • slac_output.csv - dN data generated from SLAC analysis
  • color_script.py - Run from pymol command line. Colors amino acids in a pymol structure by assigned values.
  • H3N2clean.pdb - modified structure from PDB:2YP7. Used as structure in figures
  • distances.dat - Each line contains distance measurements between a reference amino acid and every other amino acid in Renumbered_Structure.pdb
  • structure_map.txt - Guides the alignment of an input FASTA alignment and a pdb structure for generating correlations between sitewise dNs and amino acids in a structure
  • spectrumany.py - script imported by color_script.py for custom structure coloring

/run_analysis: Starting point for running analysis on an input fasta of Influenza hemagglutinin sequences annotated with passage information (available from gisaid.org). Pulls scripts from /scripts. Stores output data in /rate_measurement_data, and creates summary of evolutionary rates, slac_output.csv, stored in /data_analysis

  • step1_format_fasta.bash - Requires filename of influenza sequences with passaging information as an argument. Input FASTA headers must have format >[passage_abbreviation]_|_[strain_ID]
  • step2_divide_passage_and_year.bash - Requires output of step 1, and manually confirmed phylogenetic trees. Divides sequences from the formatted FASTA by passage history and year
  • step3_sort_conditions.sh - Compiles FASTAs for each experimental condition in /condition_parameters and builds phylogenetic trees of each sample group
  • step4_analyze_conditions - Starts the HyPhy SLAC analysis for each sample group

/input_data: Folder where user places input data for analysis

  • Holds input FASTA from GISAID, as well as user created ab.txt file of abnormal clade identifiers from manual tree trimming after step 1

/input_fasta_summary: Folder stores summary data of sequences in the starting FASTA file

  • This folder will contain counts of sequences divided by passage history and year created during run_step2.sh
  • timeseries_all.txt - counts of sequences from each passage type
  • timeseries_yearly.txt - counts of sequences from each passage type by year
  • identifiers_all.txt - all FASTA headers divided by passage type
  • identifiers_yearly.txt - all FASTA headers divided by passage type and year
  • passageIDs_all.txt - all nonredundant passage identifiers - useful to check that passage history sorting from passageparser.py is correct

/trees: Storage of phylogenetic trees constructed by FastTree 2.0

  • /formatting_trees - Trees used in course of formatting input FASTA. Will hold formatted.tree (the tree created during step 1)
  • /allpassages_trees - see above or /condition_parameters below
  • /matched_allpassages_trees- see above or /condition_parameters below
  • /matched_nonsiatunpassaged_trees - see above or /condition_parameters below
  • /matched_siatnonsiat_trees - see above or /condition_parameters below

/fastas: Storage of all FASTAs

  • /formatting_fastas - FASTAs created in course of formatting input FASTA, including outgroup.fasta, trimmed.fasta, unsortable.fasta, unusedyears.fasta, protein.fasta, nucleotide.fasta, and abnormal_clade.fasta
  • /passage_divided_fastas - naming format allyears_X.fasta
  • /passage_and_year_divided_fasta - naming format div_X.fasta
  • /tenyear_passage_divided_fastas - naming format complete_X.fasta
  • /allsequences20052015_fastas - see above or /condition_parameters below
  • /eggmatched20052015_fastas - see above or /condition_parameters below
  • /monkeymatched20052015_fastas - see above or /condition_parametersbelow
  • /siatmatched20052015_fastas- see above or /condition_parameters below
  • /unpassagedmatched20052015_fastas - see above or /condition_parametersbelow
  • /unpassaged2014_fastas- see above or /condition_parameters below

/rate_measurement_data: Storage of all SLAC analysis evolutionary rate outputs

  • Naming convention of files is [complete/samp][passage_type][Number of sequences]_[year range].dat
  • complete prefix files originate from allpassaged analysis, using all available sequences from tenyear_passage_divided_fastas
  • samp prefix files originate from matched analyses, using random samples of sequences from either 2005-2015 or 2014

/SLAC: Folder holds everything necessary to run SLAC on a matching FASTA and .tree file

  • /fulltree - Conventional SLAC analysis. Models evolutionary rates from all available sequences and branches
  • /internals - Uses only internal branches of the tree to model evolutionary rates
  • /tips - Uses only tips of the tree to model evolutionary rates
  • HYPHYMP must be installed

align_and_translate.py - Takes in a file of nucleotide sequences, translates, aligns, and returns both a nucleotide and protein alignment. Outputs nucleotide.fasta, protein.fasta

get_unique_records.py - Takes in a FASTA of DNA sequences and removes duplicate

getidentifiers.py - Takes in a FASTA of sequences and lists all record IDs

getpassage.py - Takes in a FASTA of sequences with header format "PASSAGE_HISTORY_|_STRAIN_ID" and lists all passage IDs

timesort.py - Takes in a FASTA of sequences and sorts them into new FASTA files by year

lengthdetermine.py - Determines number of records in shortest of input FASTA files.

formattingparser.py - Takes in FASTA, gets ORFS, and exclude sequences with insertions or deletions, and standardizes record ID formats.

passageparser.py - Takes in FASTA of sequences, and sorts them into new FASTAs by their passage history.

processtrees.sh - Takes in Newick format .tree file and corresponding FASTA file, removes pipe character from record IDs. Starts SLACrun.sh.

SLACrun.sh - Organizes files into /SLAC folder. Starts run_dNdS.bash for fulltree, internal branches, and tips conditions. Renames and moves sites.dat file output by HYPHYMP to /rate_measurement_data.

randomdraw.py - Takes up to three random samples (without replacement) of sequences from each input FASTA file.

remove_sequences.py - This script takes a text file of identifiers-to-remove, removes them from the original FASTA, and saves a FASTA of the sequences which were removed

sort_conditions.sh X Y- For condition X, this script pulls appropriate FASTAs files, add in an outgroup, and starts FastTree. Y is either "samp" or "complete", without quotes, depending on whether a random draw is performed in the condition.

start_SLAC.sh X - For condition X, this script starts processtree.sh (SLAC analysis), and adds output to slac_output.csv

consolidate.py - Takes all dN columns from .dat SLAC output files in in rate_measurements, as well as "numbering_table.csv" from Meyer and Wilke, 2015, and combines them into slac_output.csv

run_dNdS.bash - Script to automate SLAC analysis

/condition_parameters:

parameters_allsequences.sh - Take every FASTA from fastas/tenyear_passage_divided_fastas/

parameters_eggmatched20052015.sh - Take every FASTA from fastas/tenyear_passage_divided_fastas/ and randomly draw up to three groups of sequences from each passage type, size matched to the FASTA with the fewest number of records.

parameters_monkeymatched20052015.sh - Take monkey, cell, unpassaged, and pooled FASTAs from fastas/tenyear_passage_divided_fastas/ and randomly draw up to three groups of sequences from each passage type, size matched to the FASTA with the fewest number of records.

parameters_siatmatched20052015.sh - Take FASTAs from passage groups nonsiat, siat and unpassaged from fastas/tenyear_passage_divided_fastas/ from 2005-2015 and randomly draw up to three groups of sequences from each passage type, size matched to the FASTA with the fewest number of records.

parameters_unpassagedmatched20052015.sh - Take FASTAs from passage groups nonsiat and unpassaged from fastas/tenyear_passage_divided_fastas/ from 2005-2015 and randomly draw up to three groups of sequences from each passage type, size matched to the FASTA with the fewest number of records.

parameters_unpassagedmatched2014.sh - Take FASTAs from passage groups siat, nonsiat, and unpassaged from fastas/passage_and_year_divided_fastas/ from 2014 and randomly draw up to three groups of sequences from each passage type, size matched to the FASTA with the fewest number of records.

/structure_measurements: This folder contains scripts and datafiles for generating structural measurements. Output from this analysis is prestored in /data_analysis

  • distances.py - Creates a file of measurements from each amino acid in a protein structure to every other amino acid. Each line in the output distance.dat contains measurements from one amino acid as reference point /structure_mapping - Storage for files for structural measurements and mapping
  • translate_align_mapping.py - for aligning sites with structure. outputs structure_map.txt
  • 2YP7H3N2.pdb - Raw structure from the Protein Data Bank.
  • 2YP7clean.pdb - Modifed structure compatible for structure painting (see above)
  • structure_map.txt - for aligning sites with structure
  • distances.dat - Distances from every site in 2YP7clean to every other site

LBI (Least Branching Index)

This is an analysis using a method from Neher et al 2014, "Prediction evolution from the shape of genealogical trees" - https://elifesciences.org/content/3/e03568

The LBI_analysis directory is built off a clone of https://github.com/rneher/FitnessInference Using the scripts rank_sequences.py, and the prediction_src directory

In this analysis, sequences are ranked by their degree of branching in a reconstructeed tree. Top ranked sequences ideally predict the following years ancestral better than a randomly picked sequence.

Conditions of sequences in paper

  • 50 draws of up to 100 sequences per passage group per year
  • If 100 sequences are not available, 70% of available sequences are repeatedly drawn

Sequences for this analysiswere generated with :

  • bash scripts/sort_conditions_LBI.sh sampleSingleyears samp
  • with parameter script: condition_parameters/parameters_allsequencesSingleyears.sh

Place target FASTA in fastas/

Create an Outgroup file called "outgroup" and place in LBI_analysis/ basedir

This file should contain one outgroup sequence in FASTA format for the analysis

cat this file onto each analyis FASTA in fastas/

ex. for f in samp_* do cat outgroup $f > outgroup$ done

To run the analysis on files in the fastas:

for f in fastas/outgroup* do bash run_analysis_passages.sh $f done

Folders with results are saved in output/

ancestral_sequences.fasta : Internal nodes of ancestral tree. Sequence 1 = root

reconstructed_tree.nwk : Ancestrally reconstructed tree

sequence_ranking_terminals : Ranking of terminal sequences according to LBI algorithms. 1 is top rank

marked_up_tree.pdf : image of reconstructed tree with LBI algorithm ranking coloring

In order to consolidate outputs of LBI analysis:

For multiple random draws (analysis used in this manuscript) :

  • /fastas : Where to put input fastas
  • /output : Where output results are sent
  • prediction_src : Core scripts from Neher et al. 2015 for calculating LBI
  • /processed : output folders not currently being used
  • /scripts : Scripts to control analysis
  • /scripts/rank_sequences.py : Main control script for LBI from Neher 2014
  • /scripts/infer_fitness.py : Make predictions with fitness instead of LBI
  • /scripts/get_data_randdraws.py : After analysis is run, this scripts collects output into a table format
  • Headers of output table:
  • passage, year, category, trial, stat, num_seq : identifying information of sequence. Stat in this case is always rankseqs
  • topRankID, topRankSeq, mean stdev : The top ranked LBI sequence/ID, as well as the mean and standard deviation of LBI scores
  • ancestral_seq : The ancestral sequence of the condition
  • random_seqID, random_seq : A random sequence to compare performance of the top ranked sequence
  • hamming_to_next_self, hamming_to_next_unpassaged, hamming_to_next_pooled: hamming distance to following years ancestral_seq from different passage conditions.
  • hamming_rand_self, hamming_rand_unpassaged, hamming_rand_pooled: Likewise, but calculated with the random sequence
  • ratio_self, ratio_unpassaged, ratio_pooled : The ratio of the hamming distance from LBI choice sequence to the random sequence.

Serial passaging analysis

This analysis demonstrates that as number of passages in nonSIAT1 MDCK increase, spurious correlation strength increases

  • To run:
  • bash run_analysis/serial_analysis2.sh
  • This will select sequences from complete_nonsiat_all_20052015.fasta which are passaged once, twice, or 3-5 times.
  • then, bash scripts/start_SLAC.sh singleserial20052015 samp
  • This using the condition_parameters file /condition_parameters/singleserial20052015.sh
  • This will pull complete_unpassaged_all_20052015.fasta as the zero passage case, then take a sample size matched draw and start HYPHY SLAC to get dN/dS
  • Visualiziation included in main scripts stats_and_figs.Rmd

In this analysis, trunk sequences are pulled from a reconstructed tree.

dN/dS is calculated for trees constructed from different passage histories in order to determine if passaging signal extends to the trunk of the tree

  • Move fastas of conditions to get trunk dN/dS for into trunk_analysis/fastas
  • Get reconstructed trees and trunk sequences with:
  • bash scripts/get_trunk.sh
  • Output is placed in trunk_analysis/output
  • Calculate dN/dS (where dS=1) with:
  • bash scripts/get_dnds.sh
  • Output dN is placed in /rate_measurement_data and added to slac_output.csv
  • Analyzed in stats_and_figs.Rmd main analysis script

Take 200 random draws from the pooled condition a null to calculate likelihood of unpassaged correlation

  • bash get_random_tree.sh
  • bash scripts/start_SLAC.sh randomsamples20052015 samp
  • This using the condition_parameters file /condition_parameters/randomsamples20052015.sh
  • Visualiziation and statistics included in main scripts stats_and_figs.Rmd

Toegangsopties

Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

Alle prijzen zijn NET prijzen.
De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

Alle prijzen zijn NET prijzen.


All Science Journal Classification (ASJC) codes

  • APA
  • Auteur
  • BIBTEX
  • Harvard
  • Standaard
  • RIS
  • Vancouver

In: Aquaculture , Vol. 132, No. 1-2, 15.04.1995, p. 73-80.

Onderzoeksoutput : Bijdrage aan tijdschrift › Artikel › peer-review

T1 - The sequential changes of the virion polypeptides of CV HB1 virus (Birnaviridae) during serial undiluted passaging

N2 - Clam virus (CV HB-1) isolated from hard clam Meretrix lusoria, typed as infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) Ab serotype, was employed for the present study. The structural polypeptides of purified virus generated by serial undiluted and diluted passaging were analyzed using sodiumdodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The results indicated that in VP2, the virus particles of serial undiluted passaging had viral polypeptides smaller than those of serial diluted passaging. Furthermore, a polypeptide with a molecular mass of 105 kDa was found in the serial undiluted virus preparation. Further analysis by monoclonal antibodies showed that VP105 might be a polyprotein produced by genomic RNA segment A. To investigate the sequential changes of viral polypeptides of the virus preparation at high multiplicity infection, the viral polypeptides at each undiluted passage were analyzed by SDS-PAGE followed by immunoblotting. The results indicated that VP105 was present by undiluted passage 7, while the smaller VP2 was present by undiluted passage 10. The amount of smaller VP2 and VP105 increased as the number of passages increased.

AB - Clam virus (CV HB-1) isolated from hard clam Meretrix lusoria, typed as infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) Ab serotype, was employed for the present study. The structural polypeptides of purified virus generated by serial undiluted and diluted passaging were analyzed using sodiumdodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The results indicated that in VP2, the virus particles of serial undiluted passaging had viral polypeptides smaller than those of serial diluted passaging. Furthermore, a polypeptide with a molecular mass of 105 kDa was found in the serial undiluted virus preparation. Further analysis by monoclonal antibodies showed that VP105 might be a polyprotein produced by genomic RNA segment A. To investigate the sequential changes of viral polypeptides of the virus preparation at high multiplicity infection, the viral polypeptides at each undiluted passage were analyzed by SDS-PAGE followed by immunoblotting. The results indicated that VP105 was present by undiluted passage 7, while the smaller VP2 was present by undiluted passage 10. The amount of smaller VP2 and VP105 increased as the number of passages increased.