Informatie

2.4.1: Donkerveldmicroscopie - Biologie


LEERDOELEN

  • Generaliseer het proces van donkerveldmicroscopie

Stralen tegen een donkere achtergrond

Donkerveldmicroscopie wordt ideaal gebruikt om ongekleurde monsters te verlichten, waardoor ze helder verlicht lijken tegen een donkere achtergrond. Dit type microscoop bevat een speciale condensor die licht verstrooit en onder een hoek op het preparaat laat weerkaatsen. In plaats van het monster te verlichten met een gevulde lichtkegel, is de condensor ontworpen om een ​​holle lichtkegel te vormen. Het licht aan de top van de kegel is gericht op het vlak van het monster; als dit licht langs het monstervlak beweegt, verspreidt het zich weer in een holle kegel. De objectieflens zit in de donkere holte van deze kegel; hoewel het licht rond en langs de objectieflens reist, komen er geen stralen in.

Het hele veld lijkt donker als er geen monster op de microscooptafel is; vandaar de naam donkerveldmicroscopie. Wanneer een monster op het podium staat, valt het licht aan de top van de kegel erop. De stralen die door het monster worden verstrooid en in de objectieflens worden opgevangen, maken zo het beeld.

Monsters die onder donkerveldmicroscopie worden waargenomen, moeten zorgvuldig worden voorbereid, aangezien stof en andere deeltjes het licht ook verstrooien en gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd. Glasdia's moeten grondig worden ontdaan van stof en vuil van buitenaf. Het kan nodig zijn om monstermedia (agar, water, zoutoplossing) te filteren om verwarrende verontreinigingen uit te sluiten. Monstermaterialen moeten dun worden uitgesmeerd; te veel materiaal op de dia zorgt voor veel overlappende lagen en randen, waardoor het moeilijk is om structuren te interpreteren.

Donkerveldmicroscopie heeft veel toepassingen in de microbiologie. Het maakt de visualisatie van levende bacteriën mogelijk en onderscheidt enige structuur (staven, gebogen staven, spiralen of cocci) en beweging.

Belangrijkste punten

  • Bij donkerveldmicroscopie bereikt het licht het preparaat vanuit een hoek met behulp van een ondoorzichtige schijf.
  • Het exemplaar lijkt verlicht tegen een donkere achtergrond.
  • Donkerveldmicroscopie is vooral nuttig voor extreem kleine levende organismen die onzichtbaar zijn in de lichtmicroscoop.

Sleutelbegrippen

  • condensor: Een lens (of combinatie van lenzen) ontworpen om licht te verzamelen en te focussen op een specimen of een deel van een mechanisme.

Donkerveld circulaire depolarisatie optische coherentie microscopie

Optische coherentiemicroscopie (OCM) is een veelgebruikte modaliteit voor structurele beeldvorming. Om de toepassing ervan in moleculaire beeldvorming uit te breiden, worden gouden nanostaafjes veel gebruikt als contrastmiddelen voor OCM. Ze bieden echter heel vaak een beperkte gevoeligheid als gevolg van een slechte signaal-tot-achtergrondverhouding. Hier demonstreren we experimenteel dat een nieuwe OCM-implementatie op basis van donkere veld circulaire depolarisatiedetectie efficiënt circulair gedepolariseerd signaal van gouden nanostaafjes kan detecteren en tegelijkertijd de achtergrondsignalen efficiënt kan onderdrukken. Dit resulteert in een aanzienlijke verbetering van de signaal-tot-achtergrondverhouding.


1. Inleiding

De NIH voorspelt dat er in 2016 ongeveer 50.000 nieuwe hoofd- en halskankers zullen zijn in de VS en dat de geschatte kosten voor de zorg voor hoofd- en halskanker ongeveer $ 4,0 miljard zullen bedragen [1]. De incidentie van hoofd-halskanker is veel erger in lage- en middeninkomenslanden (LMIC's). Volgens de meest recente kankerfeiten en figuren [2] worden elk jaar ongeveer 1 miljoen nieuwe gevallen van hoofd- en nekkanker verwacht in LMIC's. Op basis van het rapport van de National Cancer Data Base is de 5-jaarsoverleving 77% als hoofd-halskanker in stadium I wordt gediagnosticeerd, terwijl de 5-jaarsoverleving bijna wordt gehalveerd als het wordt gediagnosticeerd in stadium IV [ 3]. Vroege diagnose van hoofd-halskanker is belangrijk om de kosten-batenverhouding van de gezondheidszorg te verbeteren in de VS en in LMIC's waar er beperkte middelen zijn voor de behandeling van kanker. Daarom is een eenvoudig te gebruiken en goedkope techniek nodig die door niet-specialisten kan worden gebruikt en die laesies in hun precancereuze stadium effectief kan diagnosticeren, zodat relatief goedkope interventies vroeg in de loop van de ziekte.

Neovascularisatie is vooral belangrijk voor de ontwikkeling van kanker, aangezien de grootte van de tumor beperkt is tot 1-2 mm vóór het begin van angiogenese, ook bekend als het activeren van de angiogene switch [4, 5]. Zodra de angiogene schakelaar is geactiveerd, zal zich neovascularisatie vormen rond hypoxische gebieden om voldoende zuurstof en voeding te leveren om de tumorgroei te voeden. Deze proliferatie van vasculatuur kan worden gekwantificeerd via een toename van de dichtheid van microvaten en wordt waargenomen in precancereuze en kankerachtige laesies [6𠄸]. Er zijn echter maar weinig onderzoeken die gebruik hebben gemaakt van in vivo vasculaire morfologie voor de detectie van voorstadia van hoofd-halskanker. In tegenstelling tot neovascularisatie bij het normale wondgenezingsproces, is de tumor-geïnduceerde neovasculatuur zeer ongeorganiseerd, lek, kronkelig en verwijd [9]. Kwantitatieve beeldvorming van neovascularisatie kan dus een effectief middel zijn om pre-kankers van hoofd en nek te detecteren.

Verschillende labelvrije optische technieken, waaronder optische coherentietomografie (OCT) [10, 11], laminaire optische tomografie (LOT) [12], donkerveld (DF) microscopie [13] en kruisgepolariseerde (CP) microscopie [14], zijn onderzocht voor niet-invasieve vasculaire beeldvorming in vivo. OCT biedt labelvrije vasculaire beeldvorming met hoge resolutie (meerdere microns) met behulp van het laser-Doppler-effect als gevolg van bewegende bloedcellen. De detectiediepte voor OCT in mondslijmvliesweefsels is ongeveer 900 µm met een 950 nm laser [15, 16]. LOT maakt gebruik van Monte Carlo-modellering, scanspiegels en optische vezels om dieptegevoelige (

2 mm) vasculaire beelden met een resolutie van minder dan een millimeter. Zowel DF als CP zijn eenvoudige technieken om vasculatuur in beeld te brengen in vivo. DF- en CP-microscopie kunnen micronresolutiebeelden opleveren van het vaatstelsel in de mondholte met een detectiediepte tot 1 mm [17, 18]. DF-microscopie is gevoelig voor verstrooid licht van achteren en verwerpt effectief spiegelende weefselreflectie door eenvoudig verschillende verlichtings- en verzamelpaden opnieuw te ontwerpen met behulp van een stop en iris. CP-microscopie verzamelt alleen licht met orthogonale polarisatie. Daarom is het onwaarschijnlijk dat spiegelreflectie wordt verzameld, omdat de polarisatietoestand hetzelfde is als het verlichtende licht. Heger et al. gecombineerde CP- en DF-technieken en toonde aan dat de CPDF-techniek een superieur vasculair contrast vertoonde dan de CP-techniek alleen [19]. Om te bepalen welke techniek meer geschikt is voor LMIC's-toepassing, hebben we de kosten van de kritieke componenten voor typische OCT-, LOT- en CPDF-microscoopsystemen samengevat (tabel 1). Prijzen werden geschat van Thorlab, Prixmatix en Melles Griot. Vanwege het goedkope karakter en de eenvoud van systeemontwerpen voor CPDF-microscopie, hebben we ervoor gekozen om carcinogenese-geassocieerde vasculaire veranderingen te onderzoeken met behulp van CPDF-microscopie.

Tafel 1

OKTOBERKAVELCPDF-microscopie
BronGeveegde bronlaser$35,000DPSS-laser$6,000LED-module$2,000
DetectorDBD$1,5507 APD$8,000CMOS-camera$350
Doelstelling
lens
5X Scanlens$9004.6X Scanlens$9004X Plan Achromat$200
Andere kritische componentenGalvo-systeem$2,4002 Galvo-systemen$4,800stop en iris$100
Totaal $39,850 $19,700 $2,650

(DBD: Dual balanced detector, DPSS: Diode-gepompte solid-state, APD: Lawine fotodiode detector).

In deze studie hebben we een goedkope en labelvrije techniek ontwikkeld, d.w.z. cross-polarized dark field microscopie (CPDF-microscopie), om neovascularisatieveranderingen in verband met pre-kanker en kankerontwikkeling in beeld te brengen. Vasculaire beelden werden verwerkt met een Gabor-algoritme om objectief en automatisch vasculaire kenmerken te extraheren. Er werden simulaties uitgevoerd om de nauwkeurigheid van de segmentatie van het bloedvat en de extractie van kenmerken te evalueren. De gevoeligheid en specificiteit voor vaatsegmentatie van de Gabor-maskers bleven beide boven 80% en fouten voor extractie van vasculaire kenmerken waren minder dan 5%. Bovendien werden vasculair contrast en vaatdiameter geïdentificeerd als de twee belangrijkste factoren die de nauwkeurigheid van de segmentatie beïnvloedden. Nadat de nauwkeurigheid van ons algoritme was geëvalueerd, volgden we de bloedvaten in een induceerbaar hamsterwangzaktumormodel, een goed ingeburgerd induceerbaar model voor hoofd- en nekkanker [20], gedurende de 17 weken van tumorinductie. Vasculaire kronkeligheid en lengte in de controle en de kankerverwekkende wangzakken volgen significant verschillende trends door kwaadaardige transformatie. Onze resultaten suggereren dat het monitoren van vasculaire kenmerken met een goedkope CPDF-microscopie een veelbelovende benadering is voor detectie van hoofd-halskanker in LMIC's.