Informatie

7.7C: Eiwitvouwing, -modificatie en targeting - Biologie


Om te kunnen functioneren, moeten eiwitten zich in de juiste driedimensionale vorm vouwen en op het juiste deel van de cel worden gericht.

LEERDOELEN

Bespreek hoe post-translationele gebeurtenissen de juiste functie van een eiwit beïnvloeden

Belangrijkste punten

  • Eiwitvouwing is een proces waarbij een lineaire keten van aminozuren een gedefinieerde driedimensionale structuur krijgt, maar er is een mogelijkheid om verkeerd gevouwen of gedenatureerde eiwitten te vormen, die vaak inactief zijn.
  • Eiwitten moeten zich ook in het juiste deel van de cel bevinden om goed te kunnen functioneren; daarom wordt vaak een signaalsequentie bevestigd om het eiwit naar de juiste locatie te leiden, die wordt verwijderd nadat het zijn locatie heeft bereikt.
  • Het verkeerd vouwen van eiwitten is de oorzaak van tal van ziekten, zoals de gekkekoeienziekte, de ziekte van Creutzfeldt-Jakob en cystische fibrose.

Sleutelbegrippen

  • prion: een zichzelf voortplantende verkeerd gevouwen conformer van een eiwit dat verantwoordelijk is voor een aantal ziekten die de hersenen en ander neuraal weefsel aantasten
  • chaperonne: een eiwit dat helpt bij het niet-covalent vouwen/ontvouwen van andere eiwitten

Eiwit vouwen

Nadat ze uit mRNA zijn vertaald, beginnen alle eiwitten op een ribosoom als een lineaire sequentie van aminozuren. Deze lineaire sequentie moet tijdens en na de synthese "vouwen" zodat het eiwit de zogenaamde natieve conformatie kan verwerven. De natieve conformatie van een eiwit is een stabiele driedimensionale structuur die de biologische functie van een eiwit sterk bepaalt. Wanneer een eiwit zijn biologische functie verliest als gevolg van verlies van driedimensionale structuur, spreken we van denaturatie van het eiwit. Eiwitten kunnen niet alleen door hitte worden gedenatureerd, maar ook door extreme pH-waarden; deze twee omstandigheden beïnvloeden de zwakke interacties en de waterstofbruggen die verantwoordelijk zijn voor de driedimensionale structuur van een eiwit. Zelfs als een eiwit correct wordt gespecificeerd door zijn corresponderende mRNA, kan het een volledig disfunctionele vorm aannemen als abnormale temperatuur- of pH-omstandigheden verhinderen dat het correct vouwt. De gedenatureerde toestand van het eiwit komt niet overeen met het ontvouwen van het eiwit en randomisatie van conformatie. In feite bestaan ​​gedenatureerde eiwitten in een reeks gedeeltelijk gevouwen toestanden die momenteel slecht worden begrepen. Veel eiwitten vouwen spontaan, maar sommige eiwitten hebben hulpmoleculen nodig, chaperonnes genaamd, om te voorkomen dat ze aggregeren tijdens het gecompliceerde vouwproces.

Eiwitmodificatie en targeting

Tijdens en na translatie kunnen individuele aminozuren chemisch worden gemodificeerd en kunnen signaalsequenties aan het eiwit worden toegevoegd. Een signaalsequentie is een korte staart van aminozuren die een eiwit naar een specifiek cellulair compartiment leidt. Deze sequenties aan het amino-uiteinde of het carboxyl-uiteinde van het eiwit kunnen worden gezien als het "treinkaartje" van het eiwit naar zijn uiteindelijke bestemming. Andere cellulaire factoren herkennen elke signaalsequentie en helpen het eiwit van het cytoplasma naar het juiste compartiment te transporteren. Een specifieke sequentie aan het amino-uiteinde zal bijvoorbeeld een eiwit naar de mitochondriën of chloroplasten (in planten) leiden. Zodra het eiwit zijn cellulaire bestemming heeft bereikt, wordt de signaalsequentie meestal afgekapt.

Verkeerd gevouwen

Het is erg belangrijk voor eiwitten om hun natieve conformatie te bereiken, aangezien het niet doen hiervan kan leiden tot ernstige problemen bij het vervullen van hun biologische functie. Defecten in eiwitvouwing kunnen de moleculaire oorzaak zijn van een reeks menselijke genetische aandoeningen. Cystic fibrosis wordt bijvoorbeeld veroorzaakt door defecten in een membraangebonden eiwit dat cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) wordt genoemd. Dit eiwit dient als kanaal voor chloride-ionen. De meest voorkomende mutatie die cystische fibrose veroorzaakt, is de deletie van een Phe-residu op positie 508 in CFTR, wat een onjuiste vouwing van het eiwit veroorzaakt. Veel van de ziektegerelateerde mutaties in collageen veroorzaken ook een defecte vouwing.

Een verkeerd gevouwen eiwit, bekend als prion, blijkt de verwekker te zijn van een aantal zeldzame degeneratieve hersenziekten bij zoogdieren, zoals de gekkekoeienziekte. Verwante ziekten omvatten kuru en Creutzfeldt-Jakob. De ziekten worden soms spongiforme encefalopathieën genoemd, zo genoemd omdat de hersenen vol gaten zitten. Prion, het verkeerd gevouwen eiwit, is een normaal bestanddeel van hersenweefsel bij alle zoogdieren, maar de functie ervan is nog niet bekend. Prionen kunnen zich niet zelfstandig voortplanten en worden niet als levende micro-organismen beschouwd. Een volledig begrip van prionziekten wacht op nieuwe informatie over hoe prioneiwit de hersenfunctie beïnvloedt, evenals meer gedetailleerde structurele informatie over het eiwit. Daarom kan een beter begrip van eiwitvouwing leiden tot nieuwe therapieën voor cystische fibrose, Creutzfeldt-Jakob en vele andere ziekten.


Biochemie van de ziekte van Alzheimer

De biochemie van de ziekte van Alzheimer, de meest voorkomende oorzaak van dementie, is nog niet erg goed begrepen. De ziekte van Alzheimer (AD) is geïdentificeerd als een proteopathie, een ziekte van eiwit die zich verkeerd vouwt als gevolg van de accumulatie van abnormaal gevouwen amyloïde bèta (Aβ)-eiwit in de hersenen. [1] Amyloïde bèta is een kort peptide dat een abnormaal proteolytisch bijproduct is van het transmembraaneiwit amyloïde-beta-precursoreiwit (APP), waarvan de functie onduidelijk is, maar waarvan wordt aangenomen dat het betrokken is bij neuronale ontwikkeling. [2] De presenilinen zijn componenten van een proteolytisch complex dat betrokken is bij de verwerking en afbraak van APP. [3] [4]

Amyloïde beta-monomeren zijn oplosbaar en bevatten korte gebieden van beta-sheet en secundaire polyproline II-helix-structuren in oplossing, [5] hoewel ze grotendeels alfa-spiraalvormig zijn in membranen [6], maar bij voldoende hoge concentratie ondergaan ze een dramatische conformationele verandering om te vormen een bèta-bladrijke tertiaire structuur die aggregeert om amyloïde fibrillen te vormen. [7] Deze fibrillen en oligomere vormen van Aβ zetten zich af buiten neuronen in formaties die bekend staan ​​als seniele plaques. Er zijn verschillende soorten plaques, waaronder de diffuus, compact, klokhuis of neuritische plaque-types, evenals Aβ-afzettingen in de wanden van kleine bloedvatwanden in de hersenen, cerebrale amyloïde angiopathie genoemd. [8] [9]

AD wordt ook beschouwd als een tauopathie als gevolg van abnormale aggregatie van het tau-eiwit, een microtubule-geassocieerd eiwit dat tot expressie wordt gebracht in neuronen en dat normaal gesproken werkt om microtubuli in het celcytoskelet te stabiliseren. Zoals de meeste met microtubuli geassocieerde eiwitten, wordt tau normaal gesproken gereguleerd door fosforylering, maar bij de ziekte van Alzheimer accumuleert hypergefosforyleerd tau als gepaarde spiraalvormige filamenten [10] die op hun beurt aggregeren tot massa's in zenuwcellichamen die bekend staan ​​als neurofibrillaire tangles en als dystrofische neurieten geassocieerd met amyloïde plaquettes. Hoewel er weinig bekend is over het proces van filamentassemblage, is recentelijk aangetoond dat een uitputting van een prolylisomerase-eiwit in de parvulin-familie de accumulatie van abnormaal tau versnelt. [11] [12]

Neuro-inflammatie is ook betrokken bij de complexe cascade die leidt tot AD-pathologie en symptomen. Aanzienlijk pathologisch en klinisch bewijs documenteert immunologische veranderingen die verband houden met AD, waaronder verhoogde pro-inflammatoire cytokineconcentraties in het bloed en cerebrospinale vloeistof. [13] [14] Of deze veranderingen een oorzaak of gevolg van AD kunnen zijn, moet nog volledig worden begrepen, maar ontsteking in de hersenen, inclusief verhoogde reactiviteit van de residente microglia op amyloïde afzettingen, is betrokken bij de pathogenese en progressie van AD . [15]


Laatste UT-BATTELLE, LLC-octrooien:

Deze aanvrage maakt aanspraak op het voordeel van de voorrang van de Amerikaanse voorlopige aanvrage nr. 62/523.294, ingediend op 22 juni 2017, waarvan de volledige inhoud hierin door verwijzing is opgenomen.

VERKLARING OVER FEDERAAL GESPONSORD ONDERZOEK OF ONTWIKKELING

Deze uitvinding is gedaan met overheidssteun onder Prime Contract No. DE-AC05-000R22725, toegekend door het U.S. Department of Energy. De overheid heeft bepaalde rechten op de uitvinding.

OPRICHTING DOOR VERWIJZING VAN VOLGORDE LIJST

De sequentievermelding in een ASCII-tekstbestand, 36087_SEQ1_ST25.txt van 168 KB, gemaakt op 21 juni 2018 en ingediend bij het United States Patent and Trademark Office via EFS-Web, is hierin door verwijzing opgenomen.

De meeste van de huidige gewassen voor de productie van voedsel, veevoer, vezels en biobrandstoffen maken gebruik van C3- of C4-fotosynthese. De productie van deze C3- of C4-gewassen wordt negatief beïnvloed door droogte en hittestress. Dit probleem zal de komende jaren nog verergeren door de voorspelde opwarming van de aarde. Het metabolisme van crassulaceanzuur (CAM) is een waterbesparende fotosyntheseroute die de efficiëntie van het watergebruik van planten (WUE) en de droogtetolerantie verbetert door het verlies van transpiratievocht door het sluiten van huidmondjes overdag te verminderen (West-Eberhard et al., 2011, Wetenschap, 332: 311-312). WUE van CAM-planten is ongeveer zes keer hoger dan die van C3-planten en drie keer hoger dan die van C4-planten onder vergelijkbare omstandigheden (Borland et al., 2009, Tijdschrift voor Experimentele Plantkunde, 60: 2879-2896). Er wordt aangenomen dat CAM-soorten een groot potentieel hebben voor duurzame voedsel- en biomassaproductie op semi-aride, verlaten of marginale landbouwgronden in het licht van de toenemende menselijke bevolking en de opwarming van de aarde (Borland et al. 2009, Tijdschrift voor Experimentele Plantkunde, 60: 2879-2896 Cushman et al. 2015, Tijdschrift voor Experimentele Plantkunde, 66: 4177-4193). De dielcyclus van CAM kan worden onderverdeeld in twee hoofdfasen: 1) Nachtelijke opname van atmosferisch CO2 via open huidmondjes en fixatie van koolstof (C) door fosfoenolpyruvaat-carboxylase (PEPC), wat leidt tot de vorming van appelzuur dat wordt opgeslagen in de centrale vacuolen van typisch sappige fotosynthetische organen 2) C3-fotosynthese overdag gemedieerd door ribulose-1,5- bisfosfaatcarboxylase/oxygenase (RuBisCO) dat CO . opnieuw fixeert2 gegenereerd door decarboxylatie van appelzuur wanneer de stomatale geleiding minimaal is (Rascher et al., 2001, PNAS, 98: 11801-11805 Owen en Griffiths, 2013, nieuwe fytoloog, 200: 1116-1131 Borland et al., 2014, Trends in plantenwetenschap, 19: 327-338 Yang et al., 2015, nieuwe fytoloog, 207: 491-504). CAM wordt gevonden in meer dan 400 geslachten in 36 families van vaatplanten (Yang et al. 2015, nieuwe fytoloog, 207: 491-504) en wordt verondersteld meerdere keren te zijn geëvolueerd uit verschillende C3-lijnen (Silvera et al., 2010, Functionele plantenbiologie, 37: 995-1010). De moleculaire basis van CAM-evolutie blijft echter onduidelijk. De belangrijkste biochemische kenmerken van de CAM-cyclus zijn vergelijkbaar in de plantenlijnen waar CAM is geëvolueerd, met enige variatie in de enzymen die gedurende de dag malaatdecarboxylering katalyseren en in de opslagkoolhydraten die 's nachts substraten vormen voor de synthese van appelzuur (Christopher en Holtum , 1996, Plantenfysiologie, 112: 393-399 Christopher en Holtum, 1998, Australian Journal of Plantenfysiologie, 25: 371-376 Holtum et al., 2005, Functionele plantenbiologie, 32: 429-449).

KORTE SAMENVATTING VAN DE OPENBAARMAKING

In één aspect verschaft deze beschrijving een werkwijze voor het verbeteren van droogte- en hittetolerantie in een plant of plantencel, omvattende het in de plant introduceren van een exogeen nucleïnezuur dat codeert voor ten minste één hitteschokproteïne (HSP) gekozen uit de groep bestaande uit HSP40, HSP60 en HSP70, en verder in de plant een nucleïnezuur te verschaffen dat codeert voor een fosfoenolpyruvaatcarboxylase (PEPC) dat een asparaginezuur (D) omvat op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4.

In sommige uitvoeringsvormen omvat de verschaffende stap het tot expressie brengen van een exogeen nucleïnezuur dat codeert voor een PEPC die een asparaginezuur (D) omvat op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4.

In sommige uitvoeringsvormen omvat de verschaffende stap het tot expressie brengen van een exogeen nucleïnezuur dat codeert voor een PEPC van een CAM-plantensoort.

In sommige uitvoeringsvormen omvat de verschaffende stap het introduceren van een mutatie in het endogene PEPC-gen waarbij het resulterende gemuteerde gen codeert voor een PEPC die een asparaginezuur (D) omvat op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4.

In een specifieke uitvoeringsvorm wordt de mutatie geïntroduceerd door middel van genoombewerking, die wordt bereikt door een methode die is gekozen uit de groep bestaande uit CRISPR/Cas-systeem, Cre/Lox-systeem, TALEN-systeem, ZFNs-systeem en homologe recombinatie.

In sommige uitvoeringsvormen omvat het CRISPR/Cas-systeem het in de plant brengen van een eerste nucleïnezuur dat codeert voor een Cas9- of Cas12-nuclease (voorheen Cpf1) genoemd, een tweede nucleïnezuur dat een gids-RNA (gRNA) omvat en een derde nucleïnezuur dat een homoloog reparatietemplate van een PEPC-gen waarbij het derde nucleïnezuur codeert voor een asparaginezuur (D) op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4.

In sommige uitvoeringsvormen wordt het exogene nucleïnezuur dat codeert voor ten minste één HSP overdag tot expressie gebracht en wordt het nucleïnezuur dat codeert voor PEPC gedurende de nacht tot expressie gebracht.

In sommige uitvoeringsvormen worden het exogene nucleïnezuur dat codeert voor ten minste één HSP en het nucleïnezuur dat codeert voor PEPC constitutief tot expressie gebracht.

In sommige uitvoeringsvormen wordt het exogene nucleïnezuur dat codeert voor ten minste één HSP stabiel getransfecteerd of getransformeerd in het plantengenoom.

In sommige uitvoeringsvormen wordt het exogene nucleïnezuur dat codeert voor ten minste één HSP tot expressie gebracht in het bladweefsel.

In sommige uitvoeringsvormen is de plant een C3-plant gekozen uit de groep bestaande uit genera Allium, Arabidopsis, Brassica, Capsicum, Citrullus, Cucumis, Eucalyptus, Fragaria, Glycine, Gossypium, Hordeum, Ipomoea, Malus, Manihot, Nicotiana, Oryza, Populus, Prunus, Rosa, Solanum, Spinacia en Triticum.

In sommige uitvoeringsvormen is de plant een C4-plant gekozen uit de groep bestaande uit genera Panicum, Saccharum, Setaria, Sorghum en Zea.

In sommige uitvoeringsvormen wordt de CAM-plantensoort gekozen uit de groep bestaande uit genera Kalanchoë, Phalaenopsis, Ananas en Crassula.

In sommige uitvoeringsvormen worden de HSP40, HSP60 en HSP70 gelijktijdig of afzonderlijk in een plant tot expressie gebracht.

Een ander aspect van deze beschrijving verschaft een genetisch gemodificeerde plant of plantencel. In sommige uitvoeringsvormen is de plant gemodificeerd om een ​​exogeen nucleïnezuur tot expressie te brengen dat codeert voor ten minste één HSP gekozen uit de groep bestaande uit HSP40, HSP60 en HSP70, en waarbij de plant verder is gemodificeerd om een ​​nucleïnezuur tot expressie te brengen dat codeert voor een PEPC dat een asparaginezuur omvat. (D) op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4.

In sommige uitvoeringsvormen wordt het PEPC tot expressie gebracht vanuit het endogene PEPC-gen dat is gemuteerd om te coderen voor een asparaginezuur (D) op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4.

In sommige uitvoeringsvormen worden het exogene nucleïnezuur dat codeert voor het ten minste ene HSP en het nucleïnezuur dat codeert voor het PEPC constitutief tot expressie gebracht.

In sommige uitvoeringsvormen wordt het exogene nucleïnezuur dat codeert voor het ten minste ene HSP overdag tot expressie gebracht en het nucleïnezuur dat codeert voor het PEPC wordt gedurende de nacht tot expressie gebracht.

In sommige uitvoeringsvormen is de genetisch gemodificeerde plant een C3-plant of een C4-plant gekozen uit de groep bestaande uit geslachten Allium, Arabidopsis, Brassica, Capsicum, Citrullus, Cucumis, Eucalyptus, Fragaria, Glycine, Gossypium, Hordeum, Ipomoea, Malus, Manihot, Nicotiana, Oryza, Populus, Prunus, Rosa, Solanum, Spinacia, Triticum, Panaria, Saccharum Sorghum, en Zea.

Een ander aspect van deze uitvinding is gericht op een expressievector, die een nucleotidesequentie omvat die functioneel is gekoppeld aan een regulerend gebied dat functioneel is in een plant of plantencel, waarbij de nucleotidesequentie codeert voor een HSP gekozen uit de groep bestaande uit HSP40, HSP60, HSP70, en een PEPC die een asparaginezuur (D) omvat op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4.

In sommige uitvoeringsvormen stuurt de expressievector tijdelijk gecontroleerde expressie van de nucleotidesequentie aan. In sommige uitvoeringsvormen omvat de tijdelijk gecontroleerde expressie genexpressie gedurende de nacht. In sommige uitvoeringsvormen omvat de tijdelijk gecontroleerde expressie overdag genexpressie.

In sommige uitvoeringsvormen omvat het regulerende gebied een promotor gekozen uit de groep bestaande uit een constitutieve promotor, een weefselspecifieke promotor en een gereguleerde promotor.

In sommige uitvoeringsvormen is de weefselspecifieke promotor een bladspecifieke promotor. In een specifieke uitvoeringsvorm wordt de bladspecifieke promotor gekozen uit de groep bestaande uit een promotor van ribulose-1,5-bisfosfaatcarboxylase/oxygenase (RbcS), een promotor van chlorofyl a/b bindend-6 (cab6), een promotor van chlorofyl a/ b binding-1(Cab-1) promotor, een cab IR promotor van rijst, een pyruvaat orthofosfaat dikinase (PPDK) promotor, een licht-oogst complex van fotosysteem (Lhcb1*2) promotor, een sucrose-H+ symporter (SUC2) promotor en een thylakoïde membraaneiwitpromotor.

In sommige uitvoeringsvormen wordt de constitutieve promotor gekozen uit de groep bestaande uit een ubiquitinepromotor, een bloemkoolmozaïekvirus (CaMV) 35S-promotor, een nopalinesynthase (nos)-promotor, een actinepromotor, een pinda chlorotic streak caulimovirus-promotor, een Chlorella virus-methyltransferase-genpromotor, een transcriptpromotor van volledige lengte van het vijgenkruidmozaïekvirus, een pEMU-promotor, een MAS-promotor, een H3-histonpromotor van maïs en een Agrobacterium gen promotor.

In sommige uitvoeringsvormen wordt de gereguleerde promotor gekozen uit de groep bestaande uit een door stress geïnduceerde promotor, een door chemicaliën geïnduceerde promotor, een door licht geïnduceerde promotor, een door het donker geïnduceerde promotor en een door de circadiane klok gereguleerde promotor.

In sommige uitvoeringsvormen is de beschrijving gericht op een werkwijze voor het verbeteren van droogte- en hittetolerantie in een plant of plantencel, omvattende het introduceren van de expressievector die een nucleotidesequentie omvat die functioneel is gekoppeld aan een regulerend gebied dat functioneel is in een plant of plantencel, waarbij de nucleotidesequentie codeert voor een HSP gekozen uit de groep bestaande uit HSP40, HSP60, HSP70 en een PEPC die een asparaginezuur (D) omvat op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4 in een plant of plantencel, en tot expressie brengt het nucleïnezuur in plant of plantencel.

In sommige uitvoeringsvormen is de beschrijving gericht op een plant of plantencel die de expressievector omvat die een nucleotidesequentie omvat die functioneel is gekoppeld aan een regulerend gebied dat functioneel is in een plant of plantencel, waarbij de nucleotidesequentie codeert voor een HSP gekozen uit de groep bestaande uit van HSP40, HSP60, HSP70 en een PEPC die een asparaginezuur (D) omvat op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4.

KORTE BESCHRIJVING VAN DE TEKENINGEN

Het octrooi- of aanvraagdossier bevat minimaal één in kleur uitgevoerde tekening. Kopieën van deze octrooi- of octrooiaanvraagpublicatie met kleurtekening(en) zullen op verzoek en tegen betaling van de benodigde vergoeding door het Bureau worden verstrekt.

FIG. 1A-1B. Een soortenboom gereconstrueerd uit 210 single-copy genen met behulp van een samenvattende methode. (A) Diploïde plant van Kalanchoë fedtschenkoi. (B) Individuele genbomen met maximale waarschijnlijkheid werden gereconstrueerd uit de CDS-uitlijningen voor elk van de 210 orthologgroepen met één kopie-gen met behulp van RAxML (Stamatakis, 2006, Bio-informatica, 22: 2688-2690), en de soortenboom werd samengevat uit de genenbomen met behulp van ASTRAL-II (Mirarab en Warnow, 2015, Bio-informatica, 31: i44-i52). Taartgrafieken op knooppunten vertegenwoordigen het aandeel genenbomen dat de verschillende kwartetten op elk knooppunt ondersteunt, met respectievelijk rood voor de hoofdtopologie in deze boom, blauw voor het eerste alternatief en groen voor het tweede alternatief. Kwartetfrequenties weergegeven in taartgrafieken en de posterieure waarschijnlijkheid bij elk knooppunt worden berekend door ASTRAL-II (Mirarab en Warnow, 2015, Bio-informatica, 31: i44-i52).

FIG. 2A-2C. Genoomduplicatie in Kalanchoë fedtschenkoi. (A) Syntenische diepte van de K. fedtschenkoi genoom voor elk druivengen. Syntenische diepte verwijst naar het aantal keren dat een genomisch gebied wordt bedekt door synteny-blokken tegen een ander genoom. (B) Typische micro-colineariteitspatronen tussen genomische regio's van druif en K. fedtschenkoi. Rechthoeken tonen voorspelde genmodellen met kleuren die relatieve oriëntaties tonen (blauw: dezelfde streng, groen: tegenovergestelde streng). Overeenkomende genenparen worden weergegeven als verbindende tinten. Drie orthologe gengroepen die maximaal werden behouden als vier kopieën in K. fedtschenkoi werden gemarkeerd met fylogenetische bomen aan de onderkant, wat suggereert dat twee rondes van genoomduplicaties in de Kalanchoë afstamming. (C) Viervoudige transversiesubstitutiesnelheid (4dtv) in K. fedtschenkoi en zes andere eudicot-plantensoorten.

FIG. 3A-3D. Een overzicht van CAM-pathway in Kalanchoë fedtschenkoi. (A) De CAM-routekaart in K. fedtschenkoi. Oranje kleuren geven de belangrijkste enzymen aan die betrokken zijn bij de CAM-route. De getallen tussen haakjes zijn de viervoudige waarden van de transversiesubstitutiesnelheid (4dtv). (B) Diel-expressieprofielen van gedupliceerde genen in CAM-gerelateerde genfamilies. De zwarte en witte balken geven respectievelijk de nacht en de dag aan. β-CA: β-type koolzuuranhydrase PEP: fosfoenolpyruvaat PEPC: PEP-carboxylase MDH: malaatdehydrogenase PPCK: PEPC-kinase ALMT: tonoplast-aluminium-geactiveerde malaat-transporter TDT: tonoplast-dicarboxylaat-transporter ME: appel-enzym PPDK: pyruvaatfosfaat-dikinase. Witte en zwarte balken geven respectievelijk dag (12 uur) en nacht (12 uur) aan. (C) Lijst van genen die betrokken zijn bij het CAM-carboxyleringsproces in Kalanchoë fedtschenkoi. (D) Lijst van genen die betrokken zijn bij het CAM-decarboxylatieproces in Kalanchoë fedtschenkoi.

FIG. 4A-4E. Convergente evolutie in CAM-carboxylering. (A) Regelgevende relatie tussen PPCK1 en PEPC1. (B) De PPCK1-transcriptexpressie in Kalanchoë (Kaladp0037s0517), ananas (Aco013938) en Arabidopsis (AT1G08650). (C) Diel-expressie van PEPC1- en PEPC2-transcripten in K. fedtschenkoi, respectievelijk weergegeven in de linker en rechter Y-as. (D) Waarschijnlijkheid van convergente veranderingen in PEPC2-eiwitsequentie tussen Kalanchoë (Kaladp0048s0578) en orchidee (PEQU_07008). (E) 3D-eiwitstructuur van Kalanchoë PEPC2. De PEPC2-convergente mutatie (D509, weergegeven door rode bollen) bevindt zich in een α-helix naast het actieve centrum bij de β-barrel (rood), terwijl de fosforyleringsplaats (S8, weergegeven door groene bollen) aan de N-terminus bevindt zich aan de andere kant van PEPC2. PEP: fosfoenolpyuvaat PEPC, PEP-carboxylase PPCK: PEPC-kinase OAA: oxaalacetaat.

FIG. 5A-5B. Een convergente verandering in fosfoenolpyruvaatcarboxylase (PEPC) eiwitsequenties. (A) een convergente aminozuurverandering (van R/K/H naar D) in PEPC2 gedeeld door diverse soorten (gemarkeerd in rood lettertype) op de uitlijningspositie aangegeven door de rode pijl. (B) In vitro activiteit van PEPC-isovormen in afwezigheid van fosforylering door PPCK. KfPEPC1: Kaladp0095s0055 KfPEPC1 R515D : KfPEPC1 met mutatie op residu 515 van arginine (R) naar asparaginezuur (D) KfPEPC2: Kaladp0048s0578.1 KfPEPC2 D509K : KfPEPC2 met mutatie op residu 509 van D naar lysine P. paardensport PEPC-gen PEQU07008 PqPEPC2 D504K: PqPEPC2 met mutatie op residu 504 van D naar K. "*" geeft een significant verschil aan tussen wildtype en mutant van PEPC1 of PEPC2 (Student's t-test P<0.01). De foutbalken geven de standaarddeviatie (SD) aan die is berekend op basis van drie herhalingen.

FIG. 6A-6B. Convergente veranderingen in diel-expressie van transcripten die betrokken zijn bij stomatale beweging in Kalanchoë en ananas. (A) Een overzicht van de moleculaire signaalroute die betrokken is bij stomatale beweging. (B) De convergente veranderingen in diel-expressieprofielen van PHOT2-transcript in Kalanchoë (Kaladp00033s0113) en ananas (Aco014242) vergeleken met Arabidopsis (AT5G58140). De zwarte en witte balken geven respectievelijk de nacht en de dag aan. ABA: abscisinezuur RABA: receptoren van ABA PP2C: eiwitfosfatase 2C OST1: open huidmondjes 1 CPK's: calciumafhankelijke eiwitkinasen SLAC1: geassocieerd met langzaam anionkanaal 1 QUAC1: snel activerend anionkanaal 1 SLAH3: SLAC1-homoloog 3. PHOT: fototropisme.

FIG. 7A-7D. Convergente evolutie van heat shock protein60 (HSP60). (A) Schematische weergave van het mogelijke mechanisme van HSP60 bij het reguleren van de activiteit van RuBisCo in Kalanchoë. (B) HeatMap toont de convergente veranderingen van het HSP40-expressiepatroon in Kalanchoë en ananas in vergelijking met Arabidopsis. (C) HeatMap toont de convergente veranderingen van het HSP60-expressiepatroon in Kalanchoë en ananas in vergelijking met Arabidopsis. (D) HeatMap toont de convergente veranderingen van het HSP70-expressiepatroon in Kalanchoë en ananas in vergelijking met Arabidopsis. De zwarte en witte balken geven respectievelijk de nacht en de dag aan. RuBisCo: Ribulose-1,5-bisfosfaatcarboxylase/oxygenase. RCA: rubisco-activase. RuBP: ribulose-1,5-bisfosfaat. PGA: 3-fosfoglyceraat.

FIG. 8A-8B. Convergente evolutie van langwerpig hypocotyl 5 (HY5) in Kalanchoë fedtschenkoi en orchidee. (A) Een overzicht van de signaalroute die betrokken is bij het circadiane ritme in planten. (B) Convergente verandering in HY5-eiwitsequenties (rood gemarkeerd in de fylogenetische boom) in K. fedtschenkoi en orchidee. De zwarte lijn geeft de positie van de eiwitsequentie-uitlijning aan die de convergente verandering toont. COP1: constitutief fotomorfogeen 1 CCA1: circadiane klok geassocieerd 1 LHY: laat langwerpig hypocotyl ELF 3/4: vroeg bloeiend 3/4 PRR5/7/9: pinoresinolreductase 5/7/9 cry: cryptochroom phyA/B: fytochroom A/B . TOC1: timing van cabine-expressie 1 GI: gigantea LUX: lux aritmo RVE's: reveilles EC: avondcomplex.

Afb. 9A-9B. Sequentie-uitlijning van PEPC-eiwitten van verschillende soorten. (A) In volgorde uitgelijnde sequenties omvatten SEQ ID NO:24 (aminozuren 489-538 van Kaladp0048s0578.1 (SEQ ID NO:4)), SEQ ID NO:25 (aminozuren 489-538 van Kaladp0011s0355.1 (SEQ ID NO:3)), SEQ ID NO:26 (aminozuren 489-538 van Kalax.0104s0064.1 (SEQ ID NO:5)), SEQ ID NO:27 (aminozuren 489-538 van Kalax.0283s0047.1 ( SEQ ID NO:6)), SEQ ID NO:28 (aminozuren 489-538 van Kalax.0445s0035.1 (SEQ ID NO:7)), SEQ ID NO:29 (aminozuren 489-538 van Kalax.0510s0003. 1 (SEQ ID NR:8)), SEQ ID NR:30 (aminozuren 489-538 van AAM95946.1 (SEQ ID NR:1)), SEQ ID NR:31 (aminozuren 489-538 van XP_020584551.1 ( SEQ ID NO:2)), SEQ ID NO:32 aminozuren 489-538 van PWZ12751.1 (SEQ ID NO:9), SEQ ID NO:33 (aminozuren 489-538 van XP_024436919.1 (SEQ ID NO: 10)), SEQ ID NR:34 (aminozuren 489-538 van XP_013628861.1 (SEQ ID NR:11)), SEQ ID NR:35 (aminozuren 489-538 van XP_009106983.1 (SEQ ID NR:12) ), SEQ ID NR:36 (aminozuren 489-538 van XP_008362419.1 (SEQ ID NR:13)), SEQ ID NR:37 (aminozuren 489-538 van XP_003527347.1 (SEQ ID NR:1 4)). (B) Een maximale waarschijnlijkheidsfylogenie van de PEPC-genfamilie. De taxonnamen in de fylogenetische boom staan ​​vermeld als soortafkorting (de eerste vier letters, zie tabel 2) gevolgd door gen/transcriptnaam. Rode stippen markeren de genen die convergente evolutie in eiwitsequentie laten zien. De rode pijl geeft de positie van de eiwitsequentie-uitlijning aan waar de mutatie (H/K/R-naar-D) optrad. De sequenties in de fylogenetische boom krijgen de volgende SEQ ID NRs: SEQ ID NR: 54: DTFRVTAE SEQ ID NR: 55: DTFKVAAE SEQ ID NR: 56: DTFRVAAE SEQ ID NR: 57: DTFRVAAQ SEQ ID NR: 58: DTFHVIAE SEQ ID NR: 59: GTFHVLAE SEQ ID NR: 60: GAFHVLAE SEQ ID NR: 61: GCFHVLAE SEQ ID NR: 62: GAMRVLAE SEQ ID NR: 63: GTFRVLAE SEQ ID NR: 64: GTFRVIAE SEQ ID NR: 65: GAFRVIAE SEQ ID NR: 66: QTLHVIAE SEQ ID NR: 67: QTFHVIAE SEQ ID NR: 68: DTLRVIAE SEQ ID NR: 69: DTFKVISE SEQ ID NR: 70: DTFHVISE SEQ ID NR: 71: GTFDVIAE SEQ ID NR: 72: GAFDVIAE SEQ ID NR : 73: DTFHVIAE SEQ ID NR: 74: NTFRVIAE SEQ ID NR: 75: NTFAVIAE SEQ ID NR: 76: DTFHVIAE SEQ ID NR: 77: NTFHVISE SEQ ID NR: 78: DTLHVIAE SEQ ID NR: 79: DTFKVISE SEQ ID NR: 80: DTFRVIAE SEQ ID NR: 81: ETFHVLAE SEQ ID NR: 82: DTFHVLAE SEQ ID NR: 83: DTFHVLAK SEQ ID NR: 84: DTFHVIAE.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING definities

Tenzij anders gedefinieerd, hebben alle hierin gebruikte technische en wetenschappelijke termen dezelfde betekenis als algemeen begrepen door een deskundige op het gebied waartoe deze uitvinding behoort.

Zoals hierin gebruikt, verwijst de term "ongeveer" naar een variatie van ongeveer +/- 10% van een gegeven waarde. Zoals hierin gebruikt, verwijst de term "CRISPR/Cas" naar een RNA-geleid endonuclease dat een nuclease omvat, zoals Cas9, en een gids-RNA dat de splitsing van het DNA stuurt door te hybridiseren met een herkenningsplaats in het genomische DNA.

De term "C3-plant" verwijst naar een plant die koolstofdioxide vangt in drie-koolstofverbindingen om de Calvin-cyclus (fotosyntheseroute) binnen te gaan. In een C3-plant vinden kooldioxide-afvang en de Calvin-cyclus overdag plaats, en huidmondjes van C3-planten zijn overdag open voor gasuitwisseling, wat ook leidt tot meer waterverlies via de huidmondjes (verdamping).

De term "C4-plant" verwijst naar een plant die koolstofdioxide vangt in vier-koolstofverbindingen om de Calvin-cyclus binnen te gaan. In een C4-plant vinden kooldioxide-afvang en de Calvin-cyclus overdag plaats, en huidmondjes van C4-planten zijn overdag open voor gasuitwisseling, wat ook leidt tot meer waterverlies.

De term "Crassulacean Acid Metabolism", ook bekend als CAM, verwijst naar een koolstoffixatieroute die in sommige planten is geëvolueerd als een aanpassing aan droge omstandigheden. In een plant die volledige CAM gebruikt, blijven de huidmondjes in de bladeren overdag gesloten om verdamping te verminderen, maar 's nachts open om koolstofdioxide (CO2). CAM-planten omvatten de meeste vetplanten, zoals cactussen en agaves, evenals enkele orchideeën en bromelia's. Specifieke soorten CAM-planten omvatten: Kalanchoë fedtschenkoi, Phalaenopsis equestris, Ananas comosus, en Crassula perforata.

De term "controleplant", zoals hierin gebruikt, verwijst naar een plant van dezelfde soort die niet de modificatie of modificaties omvat die in deze beschrijving worden beschreven. In sommige uitvoeringsvormen is de controleplant van dezelfde variëteit. In sommige uitvoeringsvormen heeft de controleplant dezelfde genetische achtergrond.

De zinsnede "een positie die overeenkomt met positie X van SEQ ID NO: Y" verwijst naar een positie die, wanneer de vakman een sequentie-uitlijning uitvoert, uitlijnt met positie X van SEQ ID NO: Y, waarbij X en Y nummers zijn van de corresponderende posities. Bijvoorbeeld, “een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NR: 4” verwijst naar positie 505 van SEQ ID NR: 1 positie 504 van SEQ ID NR: 2 positie 515 van SEQ ID NR: 9 positie 514 van SEQ ID NR: 10 positie 515 van SEQ ID NR: 11 positie 515 van SEQ ID NR: 12 positie 508 van SEQ ID NR: 13 positie 514 van SEQ ID NR: 14. Zie FIG. 9A. De vakman kan een sequentie-uitlijning uitvoeren (paarsgewijze of meervoudige sequentie-uitlijning) tussen een gegeven ten minste twee sequenties, en een positie bepalen die overeenkomt met een bepaalde positie tussen de sequenties. In sommige uitvoeringsvormen kan de vakman een sequentie-uitlijningsprogramma gebruiken, waaronder, maar niet beperkt tot, BLAST (NCBI) of ClustalW (EMBL) om de sequentie-uitlijning uit te voeren.

De term "DNA", zoals hierin gebruikt, verwijst naar een nucleïnezuurmolecuul met een lengte van één of meer nucleotiden. Met "nucleotide" wordt een natuurlijk voorkomend nucleotide bedoeld, evenals gemodificeerde versies daarvan. De term "DNA" omvat dubbelstrengs DNA, enkelstrengs DNA, geïsoleerd DNA zoals cDNA, evenals gemodificeerd DNA dat verschilt van natuurlijk voorkomend DNA door toevoeging, deletie, substitutie en/of wijziging van een of meer nucleotiden zoals hierin beschreven.

Zoals hierin gebruikt, verwijst de term "droogtestress" of "droogte" naar een suboptimale omgevingsconditie geassocieerd met beperkte beschikbaarheid van water voor een plant. Beperkte beschikbaarheid van water kan optreden als er bijvoorbeeld geen of minder regen is en/of wanneer de planten minder vaak water krijgen dan nodig is. Beperkte waterbeschikbaarheid voor een plant kan ook optreden wanneer bijvoorbeeld water in de bodem aanwezig is, maar niet efficiënt door de plant kan worden onttrokken. Wanneer bodems bijvoorbeeld sterk water binden of wanneer het water een hoog zoutgehalte heeft, kan het voor een plant moeilijker zijn om het water uit de bodem te halen. Daarom kunnen veel factoren ertoe bijdragen dat een plant een beperkte beschikbaarheid van water, d.w.z. droogte, tot gevolg heeft. Het effect van het onderwerpen van planten aan “droogte” of “droogtestress” kan zijn dat planten niet optimaal groeien en/of ontwikkelen. Planten die aan droogte zijn blootgesteld, kunnen verwelkingsverschijnselen hebben. Planten kunnen bijvoorbeeld worden onderworpen aan een periode van ten minste 15 dagen onder specifieke gecontroleerde omstandigheden waarin geen water wordt verschaft, b.v. zonder regenval en/of bewatering van de planten.

De term "exogeen", zoals hierin gebruikt, verwijst naar een stof of molecuul die afkomstig is van of geproduceerd wordt buiten een organisme. De term "exogeen gen" of "exogeen nucleïnezuurmolecuul", zoals hierin gebruikt, verwijst naar een nucleïnezuur dat codeert voor de expressie van een RNA en/of eiwit dat is geïntroduceerd ("getransformeerd") in een cel of een voorloper van de cel. Een exogeen gen kan van een andere soort zijn (en dus een "heteroloog" gen) of van dezelfde soort (en dus een "homoloog" gen), in verhouding tot de cel die wordt getransformeerd. Een getransformeerde cel kan een recombinante of genetisch gemodificeerde cel worden genoemd. Een "endogeen" nucleïnezuurmolecuul, gen of eiwit kan het eigen gen of eiwit van het organisme vertegenwoordigen zoals het van nature door het organisme wordt geproduceerd.

De term "expressie" verwijst naar het proces van het omzetten van genetische informatie van een polynucleotide in RNA door transcriptie, die wordt gekatalyseerd door een enzym, RNA-polymerase, en in eiwit, door translatie van mRNA op ribosomen. Expressie kan bijvoorbeeld constitutief of gereguleerd zijn, zoals door een induceerbare promotor (bijvoorbeeld lac-operon, dat kan worden getriggerd door isopropyl-a-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)). Up-regulatie of overexpressie verwijst naar regulatie die de productie van expressieproducten (mRNA, polypeptide of beide) verhoogt ten opzichte van basale of natieve toestanden, terwijl inhibitie of down-regulatie verwijst naar regulatie die de productie van expressieproducten (mRNA, polypeptide of beide verlaagt) ) ten opzichte van basale of inheemse staten. Expressie van een gen kan worden gemeten door middel van een geschikte test, zoals real-time kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR), Northern blot, transcriptoom sequencing en Western blot.

De term "gen", zoals hierin gebruikt, verwijst naar een segment van nucleïnezuur dat codeert voor een individueel eiwit of RNA en kan zowel exons als introns omvatten samen met geassocieerde regulerende regio's zoals promotors, operators, terminators, 5'-niet-vertaalde regio's, 3 ′ onvertaalde regio's, en dergelijke.

De term "genetisch gemodificeerd" (of "genetisch gemanipuleerd" of "transgeen" of "cisgeen") verwijst naar een plant die een gemanipuleerd genoom of nucleïnezuren omvat. In sommige uitvoeringsvormen is de manipulatie de toevoeging van exogene nucleïnezuren aan de plant. In sommige uitvoeringsvormen verandert de manipulatie de endogene genen van de plant.

De term "Heatshock-eiwitten (HSP)" verwijst naar een familie van eiwitten die door cellen worden geproduceerd als reactie op blootstelling aan stressvolle omstandigheden. Veel leden van de HSP-groep voeren de chaperonnefunctie uit door nieuwe eiwitten te stabiliseren om correcte vouwing te verzekeren of door te helpen bij het opnieuw vouwen van eiwitten die beschadigd waren door de celstress. Deze toename in expressie wordt transcriptioneel gereguleerd. De dramatische opregulatie van de hitteschok-eiwitten is een belangrijk onderdeel van de hitteschokreactie en wordt voornamelijk veroorzaakt door de hitteschokfactor (HSF).

De term "homoloog" verwijst naar nucleïnezuren of polypeptiden die sterk verwant zijn op het niveau van nucleotide- of aminozuursequentie. Nucleïnezuren of polypeptiden die homoloog aan elkaar zijn, worden "homologen" genoemd. De term "homoloog" verwijst naar een gen dat verwant is aan een tweede gen door afstamming van een gemeenschappelijke voorouderlijke DNA-sequentie, daarom heeft het overeenkomstige polynucleotide/polypeptide een zekere mate van homologie, dat wil zeggen sequentie-identiteit (bij voorkeur ten minste 40%, met meer voorkeur ten minste 60%, met nog meer voorkeur ten minste 65%, met bijzondere voorkeur ten minste 66%, 68%, 70%, 75%, 80%, 86%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97 % of 99%).

De term "verbeterde droogteresistentie" (ook bekend als "droogtetolerantie") verwijst naar planten die, wanneer ze zijn voorzien van verbeterde droogteresistentie, wanneer ze worden blootgesteld aan droogte of droogtestress, geen effecten of verlichte effecten vertonen zoals waargenomen bij controleplanten die niet zijn voorzien van verbeterde droogteresistentie. Een normale plant heeft een zekere mate van droogteresistentie.Of een plant een verbeterde droogteresistentie heeft, kan eenvoudig worden vastgesteld door een controleplant te vergelijken met een plant met verbeterde droogteresistentie onder gecontroleerde omstandigheden die zodanig zijn gekozen dat bij de controleplanten na een bepaalde periode, dat wil zeggen wanneer de planten worden blootgesteld aan droogte of droogtestress. De planten met verbeterde droogteresistentie zullen in vergelijking met de controleplanten minder en/of minder tekenen van droogte, zoals verwelking, vertonen. De vakman weet geschikte omstandigheden te selecteren. Wanneer een plant "verbeterde droogteresistentie" heeft, is hij in staat om normale groei en/of normale ontwikkeling in stand te houden wanneer blootstelling aan droogte of droogtestress anders zou hebben geleid tot verminderde groei en/of verminderde ontwikkeling van normale planten. Vandaar dat "verbeterde droogteresistentie" wordt bepaald door planten te vergelijken, waarbij de plant die het meest in staat is tot (normale) groei onder droogtestress een plant is met "verbeterde droogteresistentie". De vakman is in staat om geschikte omstandigheden te selecteren om de droogteresistentie van een plant te bepalen en hoe tekenen van droogte te meten, zoals beschreven in bijvoorbeeld handleidingen van de IRRI, Breeding rijst voor droogtegevoelige omgevingen, Fischer et al., 2003 en door de CIMMYT, Veredeling voor droogte- en stikstofstresstolerantie in maïs: van theorie naar praktijk, Banzinger et al, 2000. Voorbeelden van methoden voor het bepalen van verbeterde droogteresistentie bij planten worden gegeven in Snow en Tingey (1985, Planten Fysiol, 77, 602-7) en Harb et al., Analyse van droogtestress in Arabidopsis, AOP 2010, Plantenfysiologie Review.

De term "verbeterde hittebestendigheid" of "verbeterde hittetolerantie" verwijst naar planten die, wanneer ze zijn voorzien van hittebestendigheid (of hittebestendig zijn), bij blootstelling aan hittestress geen effecten of verlichte effecten vertonen zoals waargenomen bij planten die niet zijn voorzien van hittebestendig. Wanneer een plant "hittebestendig" is, is hij in staat om normale groei en/of normale ontwikkeling in stand te houden wanneer hij wordt blootgesteld aan een hoge temperatuur die anders zou hebben geleid tot verminderde groei en/of ontwikkeling bij normale planten. Daarom wordt hittebestendigheid bepaald door planten te vergelijken met een andere plant, waarbij de plant die het meest in staat is tot (normale) groei een "hittebestendige" plant kan zijn, terwijl de plant die minder goed in staat is een "hittegevoelige" plant kan worden genoemd. Onder het verschaffen van hittebestendigheid wordt dus begrepen het verbeteren van de hittebestendigheid van een plant in vergelijking met een plant die niet is voorzien van hittebestendigheid. Bij planten voorzien van hittebestendigheid is het b.v. mogelijk hogere opbrengsten van gewas en/of plantaardig product te verkrijgen wanneer de plant wordt blootgesteld aan een periode of perioden van hitte in vergelijking met planten die niet zijn voorzien van hittebestendigheid.

Zoals hierin gebruikt, zijn de termen “Kalanchoë laxiflora" en "Kalanchoë fedtschenkoi” verwijzen naar de twee CAM-plantensoorten uit het geslacht Kalanchoë.

Zoals hierin gebruikt, heeft de term "nucleïnezuur" zijn algemene betekenis in het vakgebied en verwijst naar een coderende of niet-coderende nucleïnezuursequentie. Nucleïnezuren omvatten DNA (deoxyribonucleïnezuur) en RNA (ribonucleïnezuur) nucleïnezuren. Voorbeelden van nucleïnezuur omvatten dus, maar zijn niet beperkt tot, DNA, mRNA, tRNA, rRNA, tmRNA, miRNA, piRNA, snoRNA en snRNA. Nucleïnezuren omvatten dus het coderende en niet-coderende gebied van een genoom (d.w.z. nucleair of mitochondriaal of chloroplast).

De term "functioneel gekoppeld" verwijst naar de positionering van een regulerend gebied en een sequentie die moet worden getranscribeerd in een nucleïnezuur om de transcriptie of translatie van een dergelijke sequentie te beïnvloeden. Om bijvoorbeeld een coderende sequentie onder de controle van een regulerend gebied te brengen, wordt de translatie-initiatieplaats van het translationele leesraam van het polypeptide typisch gepositioneerd tussen één en ongeveer vijftig nucleotiden stroomafwaarts van de promotor. Een regulerend gebied kan echter tot ongeveer 5.000 nucleotiden stroomopwaarts van de translatie-initiatieplaats of ongeveer 2.000 nucleotiden stroomopwaarts van de transcriptiestartplaats worden gepositioneerd. Een regulerend gebied omvat typisch ten minste een kern (basale) promotor.

De term "regulerend gebied" verwijst naar een nucleïnezuur met nucleotidesequenties die de transcriptie- of translatie-initiatie en snelheid en stabiliteit en/of mobiliteit van een transcriptie- of translatieproduct beïnvloeden. Regulerende regio's omvatten, zonder beperking, promotorsequenties, enhancersequenties, responselementen, eiwitherkenningsplaatsen, induceerbare elementen, eiwitbindingssequenties, 5'- en 3'-onvertaalde regio's (UTR's), transcriptionele startplaatsen, terminatiesequenties, polyadenyleringssequenties, introns en combinaties daarvan.

Een regulerend gebied kan ook ten minste één controle-element omvatten, zoals een versterkersequentie, een stroomopwaarts element of een stroomopwaarts activeringsgebied (UAR). Een geschikte versterker is bijvoorbeeld een cis-regulerend element (−212 tot −154) uit het stroomopwaartse gebied van het octopinesynthase (ocs)-gen (Fromm et al., De plantencel, 1:977-984 (1989)). De keuze van de op te nemen regulerende gebieden hangt af van verschillende factoren, waaronder, maar niet beperkt tot, efficiëntie, selecteerbaarheid, induceerbaarheid, gewenst expressieniveau en cel- of weefselpreferentiële expressie. Het is een routinekwestie voor een deskundige op dit gebied om de expressie van een coderende sequentie te moduleren door op de juiste wijze regulerende gebieden te selecteren en te positioneren ten opzichte van de coderende sequentie.

Een "vector" is een replicon, zoals een plasmide, faag of cosmide, waarin een ander DNA-segment kan worden ingevoegd om de replicatie van het ingevoegde segment te bewerkstelligen. Over het algemeen is een vector in staat tot replicatie wanneer deze wordt geassocieerd met de juiste controle-elementen. Geschikte vectorskeletten omvatten bijvoorbeeld die welke routinematig in het vakgebied worden gebruikt, zoals plasmiden, virussen, kunstmatige chromosomen, BAC's, YAC's of PAC's. De term "vector" omvat klonerings- en expressievectoren, evenals virale vectoren en integrerende vectoren. Een "expressievector" is een vector die een regulerend gebied omvat. Geschikte expressievectoren omvatten, zonder beperking, plasmiden en virale vectoren afgeleid van bijvoorbeeld bacteriofaag, baculovirussen en retrovirussen. Talrijke vectoren en expressiesystemen zijn in de handel verkrijgbaar bij bedrijven als Novagen (Madison, Wis.), Clontech (Mountain View, Californië), Stratagene (La Jolla, Californië) en Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, Californië).

ALGEMENE BESCHRIJVING

Er is geen specifieke beperking op de planten die kunnen worden gebruikt in de werkwijzen van de onderhavige beschrijving, zolang de plant maar geschikt is om door een gen te worden getransformeerd. De term "plant", zoals hierin gebruikt, omvat hele planten, plantenweefsels of plantencellen. De planten die kunnen worden gebruikt voor de werkwijzen en samenstellingen van de onderhavige beschrijving omvatten verschillende gewassen, bloemplanten of bosplanten, enz. Specifiek omvatten de planten, maar zijn niet beperkt tot, tweezaadlobbige, eenzaadlobbige of gymnosperm. Meer specifiek omvatten de planten, maar zijn niet beperkt tot, tarwe, gerst, rogge, rijst, maïs, sorghum, biet, appel, peer, pruim, perzik, abrikoos, kers, aardbei, Rubus swinhoei Hancebraambes, boon, linzen, erwt, soja, verkrachting, mosterd, papaver, olea, europa, helianthus, kokosnoot, plant producerende ricinusolie, cacao, pinda, kalebas, komkommer, watermeloen, katoen, vlas, cannabis, jute, citrusvrucht, citroen, grapefruit, spinazie, sla, asperges, kool, Brassica campestris L. ssp. Pekinensis, Brassica campestris L. ssp. chinensis, wortel, ui, murphy, tomaat, groene paprika, avocado, cassia, kamfer, tabak, noot, koffie, aubergine, suikerriet, thee, peper, wijnstok, brandnetelgras, banaan, natuurlijke rubberboom en sierplant, enz.

In een bepaalde uitvoeringsvorm worden de werkwijzen en samenstellingen van de onderhavige beschrijving ook gebruikt voor een breed scala aan plantensoorten van de tweezaadlobbige geslachten Acer, Afzelia, Arabidopsis, Betula, Brassica, Eucalyptus, Fagus, Fraxinus, Glycine, Gossypium, Jatropha, Juglans, Linum, Lycopersicon, Medicago, Micropus, Populus, Prunus, Quercus, Salix, Solanum, Tectona en Trifolium en de eenzaadlobbige geslachten Agrostis, Avena, Festuca, Hordeum, Lemna, Lolium, Milium, Miscanthus, Oryza, Panicum, Pennisetum, Phalaris, Phleum, Poa, Saccharum, Secale, Sorghum, Triticum, Zea en Zoysia en de gymnosperm-geslachten Abies, Picea en Pinus. In sommige uitvoeringen is een plant een lid van de soort Festuca arundinacea, Miscanthus hybride (Miscanthus x giganteus), Miscanthus sinensis, Miscanthus sacchariflorus, Panicum virgatum, Pennisetum purpureum, Phalaris arundinacea, Populus spp inclusief maar niet beperkt tot: balsamifera, deltoides, tremuloides, tremula, alba en maximowiczii, Saccharum spp., Secale granen, Sorghum almum, Sorghum halcapense of Sorghum vulgare. In bepaalde uitvoeringsvormen kunnen de hierin beschreven polynucleotiden en vectoren worden gebruikt om een ​​aantal eenzaadlobbige en tweezaadlobbige planten en plantencelsystemen te transformeren, waarbij dergelijke planten hybriden van verschillende soorten zijn.

In sommige uitvoeringsvormen is de plant voor de werkwijzen en samenstellingen van de onderhavige beschrijving een C3-plant. In een bepaalde uitvoeringsvorm wordt de C3-plant gekozen uit de groep bestaande uit genera Allium, Arabidopsis, Brassica, Capsicum, Citrullus, Cucumis, Eucalyptus, Fragaria, Glycine, Gossypium, Hordeum, Ipomoea, Malus, Manihot, Nicotiana, Oryza, Populus, Prunus, Rosa, Solanum, Spinacia en Triticum.

In sommige uitvoeringsvormen is de plant voor de werkwijzen en samenstellingen van de onderhavige beschrijving een C4-plant. In een bepaalde uitvoeringsvorm wordt de C4-plant gekozen uit de groep bestaande uit genera Panicum, Saccharum, Setaria, Sorghum en Zea.

Gerichte genoombewerking (ook bekend als genoom-engineering) is naar voren gekomen als een alternatief voor klassieke plantenveredeling en transgene (genetisch gemodificeerde organismen-GMO) methoden om gewassen te verbeteren. Beschikbare methoden voor gerichte genoombewerking zijn onder meer het CRISPR/Cas-systeem, zinkvingernucleasen (ZFN's) en TAL-effectornucleasen (TALEN's). ZFN's worden beoordeeld in Carroll, D. (Genetica, 188,4 (2011): 773-782) en TALEN's worden besproken in Zhang et al. (Plantenfysiologie, 161.1 (2013): 20-27), die hierin integraal zijn opgenomen.

In sommige uitvoeringsvormen wordt genmodificatie bereikt met behulp van beschikbare gentargeting-technologieën in het vakgebied. Voorbeelden van technologieën voor gentargeting zijn het Cre/Lox-systeem (beschreven in Kuhn, R., & M. Tones, R., Transgenesetechnieken: principes en protocollen, (2002), 175-204.), homologe recombinatie (beschreven in Capecchi, Mario R., Wetenschap (1989), 244: 1288-1292), en TALENs (beschreven in Sommer et al., Chromosoomonderzoek (2015), 23: 43-55, en Cermak et al., Onderzoek naar nucleïnezuren (2011): gkr218.).

In sommige uitvoeringsvormen wordt genmodificatie bereikt met behulp van een CRISPR/Cas-systeem. CRISPR-Cas en vergelijkbare systemen voor gentargeting zijn algemeen bekend in de techniek met reagentia en protocollen die direct beschikbaar zijn (Mali, P. et al., (2013), Wetenschap, 339 (6121), 823-826 Hsu, P.D. et al., (2014), Cel, 157.6: 1262-1278.). Voorbeeldige protocollen voor genoombewerking worden beschreven in Jennifer Doudna en Prashant Mali, "CRISPR-Cas: een laboratoriumhandleiding” (2016) (CSHL Press, ISBN: 978-1-621821-30-4) en Ran, F. Ann, et al., Natuurprotocollen (2013), 8 (11): 2281-2308.

Een CRISPR-Cas-systeem bestaat uit twee componenten: (1) een RNA-afhankelijk nuclease, typisch microbieel Cas9 of Cas12 (Cpf1) en (2) een kort "gids-RNA" (gRNA of sgRNA) dat een targetingsequentie van 20 nucleotiden omvat die de het nuclease naar een interessante plaats in het genoom. Wanneer het samen tot expressie wordt gebracht met een kunstmatig sgRNA dat zich richt op een cellulair gen, genereert het Cas9-endonuclease dubbelstrengs DNA-breuken op de beoogde locus. Bovendien, wanneer CRISPR-endonuclease wordt aangevuld met een stuk DNA-matrijs dat homoloog is aan het breukgebied, wordt de breuk gerepareerd met behulp van het meegeleverde homologe DNA-matrijs via het proces van homologe recombinatie (HR). CRISPR-gemedieerde HR maakt het mogelijk om de doel-DNA-sequentie specifiek te bewerken en/of genexpressie te veranderen. In sommige uitvoeringsvormen worden sgRNA's en Cas9 in plasmiden gekloond en vervolgens door transfectie of transformatie in plantencellen geïntroduceerd.

Methoden voor het verbeteren van droogte- en hittetolerantie in planten (CAM Engineering)

De uitvinders van de onderhavige beschrijving hebben een proces beschreven voor het verbeteren van droogte- en hittetolerantie/weerstand in planten, genaamd CAM-engineering. Droogtetolerantie/weerstand en hittetolerantie/weerstand zijn gewenste eigenschappen die de biomassa van planten aantasten. Met werkwijzen van deze beschrijving is het mogelijk planten te genereren die meer biomassa produceren, en/of meer daarvan afgeleide gewassen en plantenproducten, indien gekweekt onder omstandigheden van lage waterbeschikbaarheid/droogte in vergelijking met planten die niet zijn onderworpen aan de werkwijze volgens de huidige onthulling. In sommige uitvoeringsvormen wordt de biomassa van de door CAM ontworpen plant met ten minste 5%, met ten minste 10%, met ten minste 15% of met ten minste 20% verhoogd in vergelijking met een overeenkomstige controleplant.

In sommige uitvoeringsvormen wordt de droogte- en hittetolerantie van een plant verbeterd door de plant te transformeren met een nucleïnezuur dat codeert voor ten minste één heat shock-eiwit (HSP) gekozen uit de groep bestaande uit HSP40, HSP60 en HSP70. In sommige uitvoeringsvormen wordt het geïntroduceerde nucleïnezuur dat codeert voor ten minste één HSP constitutief tot expressie gebracht. In sommige uitvoeringsvormen wordt het geïntroduceerde nucleïnezuur dat codeert voor ten minste één HSP op een tijdelijk gecontroleerde manier tot expressie gebracht. In een specifieke uitvoeringsvorm verwijst tijdelijk gecontroleerde expressie van ten minste één HSP naar expressie van het (de) gen(en) overdag.

In sommige uitvoeringsvormen worden twee HSP's gekozen uit HSP40, HSP60 en HSP70 gelijktijdig tot expressie gebracht in een plant. In sommige uitvoeringsvormen worden alle drie de HSP's (HSP40, HSP60 en HSP70) gelijktijdig in een plant tot expressie gebracht.

In sommige uitvoeringsvormen omvat de werkwijze verder het tot expressie brengen van een fosfoenolpyruvaatcarboxylase (PEPC) dat een asparaginezuur (D) omvat op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4. In sommige uitvoeringsvormen wordt de PEPC tot expressie gebracht vanuit het endogene PEPC-gen gemuteerd om een ​​asparaginezuur (D) te omvatten op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4. In sommige uitvoeringsvormen wordt het endogene PEPC-gen gemuteerd met behulp van gerichte genoombewerking.

In sommige uitvoeringsvormen wordt een exogeen nucleïnezuur dat codeert voor een PEPC dat een asparaginezuur (D) omvat op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4 in de plant geïntroduceerd dat ook een exogeen nucleïnezuur tot expressie brengt dat codeert voor ten minste één van HSP40 , HSP60 en HSP70. In sommige uitvoeringsvormen codeert het exogene nucleïnezuur voor een PEPC-gen van een CAM-plantensoort. In een specifieke uitvoeringsvorm wordt de CAM-plantensoort gekozen uit de groep bestaande uit: Kalanchoë fedtschenkoi, Phalaenopsis equestris en Ananas comosus.

In sommige uitvoeringsvormen wordt het PEPC dat een asparaginezuur (D) omvat op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4 constitutief tot expressie gebracht. In sommige uitvoeringsvormen wordt de PEPC die een asparaginezuur (D) omvat op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4 uitgedrukt op een tijdelijke gecontroleerde manier. In een specifieke uitvoeringsvorm verwijst expressie van PEPC op tijdelijke gecontroleerde wijze naar expressie van PEPC gedurende de nacht.

In sommige uitvoeringsvormen kan een plant, plantencel of plantenweefsel worden getransformeerd door een construct geïntegreerd te hebben in zijn genoom, d.w.z. stabiel kan worden getransformeerd. Stabiel getransformeerde cellen behouden typisch het geïntroduceerde nucleïnezuur bij elke celdeling. Een plant of plantencel kan ook tijdelijk worden getransformeerd zodat het construct niet in zijn genoom wordt geïntegreerd. Transiënt getransformeerde cellen verliezen typisch alle of een deel van het geïntroduceerde nucleïnezuurconstruct bij elke celdeling, zodat het geïntroduceerde nucleïnezuur niet kan worden gedetecteerd in dochtercellen na een voldoende aantal celdelingen. Zowel tijdelijk getransformeerde als stabiel getransformeerde transgene planten en plantencellen kunnen bruikbaar zijn bij de hierin beschreven werkwijzen.

In sommige uitvoeringsvormen wordt de beschreven PEPC-mutatie geïntroduceerd door een CRISPR/Cas-systeem. CRISPR/Cas en vergelijkbare gentargeting-systemen zijn algemeen bekend in de techniek met reagentia en protocollen die direct beschikbaar zijn (Mali, P. et al., (2013), Wetenschap, 339(6121), 823-826 Hsu, P.D. et al., (2014), Cel, 157.6: 1262-1278.). Voorbeeldige protocollen voor genoombewerking worden beschreven in Jennifer Doudna en Prashant Mali, "CRISPR-Cas: een laboratoriumhandleiding” (2016) (CSHL Press, ISBN: 978-1-621821-30-4) en Ran, F. Ann, et al. Natuurprotocollen (2013), 8 (11): 2281-2308.

In sommige uitvoeringsvormen wordt modulatie van het endogene PEPC-gen bereikt door plaatsgerichte mutagenese om een ​​mutant gen met veranderde genexpressie te creëren. Plaatsgerichte mutagenese wordt beschreven in: Moleculair klonen, 3e druk, Huidige protocollen in moleculaire biologie, en de Amerikaanse octrooiaanvrage Ser. Nr. 12/442,143

De hierin beschreven polynucleotiden en expressievectoren kunnen worden gebruikt om de expressies van heat shock-eiwitten (HSP's) HSP40, HSP60, HSP70 en fosfoenolpyruvaatcarboxylase (PEPC) die een asparaginezuur (D) bevatten op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID te verhogen. NO: 4, in planten en droog- en hittebestendig maken.

In sommige uitvoeringsvormen omvat de vector een nucleïnezuursequentie die codeert voor ten minste één van de HSP40-, HSP60-, HSP70-genen, of een PEPC die een asparaginezuur (D) omvat op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4. In sommige uitvoeringsvormen is het PEPC van een CAM-plantensoort. In een specifieke uitvoeringsvorm wordt de CAM-plantensoort gekozen uit de groep bestaande uit: Kalanchoë fedtschenkoi, Phalaenopsis equestris en Ananas comosus.

De hierin verschafte vectoren kunnen replicatieoorsprongen, scaffold-bevestigingsgebieden (SAR's) en/of markers omvatten. Een markergen kan een selecteerbaar fenotype aan een plantencel verlenen. Een marker kan bijvoorbeeld biocideresistentie verlenen, zoals resistentie tegen een antibioticum (bijv. kanamycine, G418, bleomycine of hygromycine) of een herbicide (bijv. chloorsulfuron of fosfinothricine). Bovendien kan een expressievector een tagsequentie omvatten die is ontworpen om manipulatie of detectie (bijvoorbeeld zuivering of lokalisatie) van het tot expressie gebrachte polypeptide te vergemakkelijken. Tag-sequenties, zoals groen fluorescerend eiwit (GFP), glutathion 5-transferase (GST), polyhistidine, c-myc, hemagglutinine of Flag-tag (Kodak, New Haven, Conn.) sequenties worden doorgaans uitgedrukt als een fusie met de gecodeerde polypeptide. Dergelijke tags kunnen overal in het polypeptide worden ingevoegd, met inbegrip van ofwel het carboxyl- of amino-uiteinde.Zoals hierin beschreven, kunnen plantencellen worden getransformeerd met een recombinant nucleïnezuurconstruct om een ​​van belang zijnd polypeptide tot expressie te brengen.

Een verscheidenheid aan promotors is beschikbaar voor gebruik, afhankelijk van de gewenste mate van expressie. Een breed tot expressie brengende promotor bevordert bijvoorbeeld transcriptie in veel, maar niet noodzakelijkerwijs alle, plantenweefsels. Niet-beperkende voorbeelden van in brede zin tot expressie brengende promotors die kunnen worden opgenomen in de hierin verschafte nucleïnezuurconstructen omvatten de bloemkoolmozaïekvirus (CaMV) 35S-promotor, de mannopinesynthase (MAS)-promotor, de 1′- of 2′-promotors afgeleid van T-DNA van Agrobacterium tumefaciens, de helmkruidmozaïekvirus 34S-promotor, actinepromotors zoals de rijstactinepromotor en ubiquitinepromotors zoals de maïs-ubiquitine-1-promotor.

In sommige uitvoeringsvormen is de promotor die de expressie van genen van belang aanstuurt, een constitutieve promotor. In sommige uitvoeringsvormen wordt de constitutieve promotor gekozen uit de groep bestaande uit een ubiquitinepromotor, een bloemkoolmozaïekvirus (CaMV) 35S-promotor, een actinepromotor, een pinda-chlorotic streak-caulimovirus-promotor, een Chlorella virus-methyltransferase-genpromotor, een transcriptpromotor van volledige lengte van het vijgenkruidmozaïekvirus, een pEMU-promotor, een MAS-promotor, een H3-histonpromotor van maïs en een Agrobacterium gen promotor.

In sommige uitvoeringsvormen is de promotor die de expressie van genen van belang aanstuurt, een gereguleerde promotor. In sommige uitvoeringsvormen wordt de gereguleerde promotor gekozen uit de groep bestaande uit een stress-geïnduceerde promotor, chemisch-geïnduceerde promotor, een licht-geïnduceerde promotor, een donker-geïnduceerde promotor en een circadiane klok-gecontroleerde promotor.

Sommige geschikte regulerende gebieden initiëren transcriptie, alleen of overwegend, in bepaalde celtypen. Promotors die actief zijn in fotosynthetisch weefsel, verlenen bijvoorbeeld transcriptie in groene weefsels zoals bladeren en stengels. Voorbeelden van dergelijke promotors zijn onder meer de promotors van ribulose-1,5-bisfosfaatcarboxylase (RbcS), zoals de promotor van RbcS uit oosters lariks (Larix laricina), de pine chlorofyl a/b binding-6 (cab6) promotor (Yamamoto et al., Plantencel Fysiol., 35:773-778 (1994)), de chlorofyl a/b binding-1 (Cab-1) promotor van tarwe (Fejes et al., Plant Mol. Biol., 15:921-932 (1990)), de chlorofyl a/b binding-1 (CAB-1) promotor van spinazie (Lubberstedt et al., Plantenfysio., 104:997-1006 (1994)), de cab IR-promotor van rijst (Luan et al., Plantaardige cel, 4:971-981 (1992)), de promotor van pyruvaatorthofosfaatdikinase (PPDK) uit maïs (Matsuoka et al., Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS, 90:9586-9590 (1993)), het tabakslichtoogstcomplex van de fotosysteem (Lhcb1*2) promotor (Cerdan et al., Plant Mol. Biol., 33:245-255 (1997)), de Arabidopsis SUC2 sucrose-H+ symporter promotor (Truernit et al., Planta, 196:564-570 (1995)) en thylakoïde membraaneiwitpromoters uit spinazie (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS).

In sommige uitvoeringsvormen omvatten promotors van de onderhavige aanvrage induceerbare promotors. Induceerbare promotors verlenen transcriptie als reactie op externe stimuli zoals chemische agentia of omgevingsstimuli. Induceerbare promotors kunnen bijvoorbeeld transcriptie verlenen in reactie op hormonen zoals gibberellinezuur of ethyleen of in reactie op licht, stikstof, schaduw of droogte.

Een basale promotor is de minimale sequentie die nodig is voor assemblage van een transcriptiecomplex dat nodig is voor transcriptie-initiatie. Basale promoters bevatten vaak een "TATA-box"-element dat zich tussen ongeveer 15 en ongeveer 35 nucleotiden stroomopwaarts van de plaats van transcriptie-initiatie kan bevinden. Basale promotors kunnen ook een "CCAAT-box" -element (meestal de sequentie CCAAT) en/of een GGGCG-sequentie bevatten, die kan worden gelokaliseerd tussen ongeveer 40 en ongeveer 200 nucleotiden, typisch ongeveer 60 tot ongeveer 120 nucleotiden, stroomopwaarts van de transcriptiestartplaats .

Een 5'-onvertaald gebied (UTR) kan worden opgenomen in hierin beschreven nucleïnezuurconstructen. Een 5'-UTR wordt getranscribeerd, maar wordt niet getranslateerd en ligt tussen de startplaats van het transcript en het translatie-initiatiecodon en kan het +1 nucleotide omvatten. Een 3'-UTR kan worden gepositioneerd tussen het translatieterminatiecodon en het uiteinde van het transcript. UTR's kunnen bepaalde functies hebben, zoals het verhogen van de mRNA-stabiliteit of het verzwakken van translatie. Voorbeelden van 3'-UTR's omvatten, maar zijn niet beperkt tot, polyadenyleringssignalen en transcriptieterminatiesequenties, bijvoorbeeld een nopalinesynthaseterminatiesequentie.

Het zal duidelijk zijn dat meer dan één regulerend gebied in een vector aanwezig kan zijn, bijvoorbeeld introns, enhancers, stroomopwaartse activeringsgebieden, transcriptieterminators en induceerbare elementen. Regulerende regio's, zoals promotors voor endogene genen, kunnen worden verkregen door chemische synthese of door subklonering van een genomisch DNA dat een dergelijk regulerend gebied omvat. Een nucleïnezuur dat een dergelijk regulerend gebied omvat, kan ook flankerende sequenties omvatten die restrictie-enzymplaatsen bevatten die daaropvolgende manipulatie vergemakkelijken.

Technieken voor het introduceren van nucleïnezuren in eenzaadlobbige en tweezaadlobbige planten zijn in de techniek bekend en omvatten, zonder beperking, Agrobacterium-gemedieerde transformatie, virale vector-gemedieerde transformatie, elektroporatie en deeltjeskanontransformatie, bijv. U.S. Pat. nrs. 5.538.880, 5.204.253, 6.329.571 en 6.013.863. Indien een cel- of weefselkweek wordt gebruikt als het ontvangende weefsel voor transformatie, kunnen desgewenst planten worden geregenereerd uit getransformeerde kweken, met technieken die bekend zijn bij de vakman. Zie bijvoorbeeld Niu et al., Plant Cell Rep. V19:304-310 (2000) Chang en Yang, Bot. Stier. Acad. Zonde., V37:35-40 (1996) en Han et al., Biotechnologie in land- en bosbouw, V44:291 (red. door Y.P.S. Bajaj), Springer-Vernag, (1999).

Genetisch gemodificeerde (transgene) planten/plantensoorten/plantencellen/plantenweefsels

Ook hierin beschreven zijn planten en plantencellen die genetisch zijn gemodificeerd door introductie van de beschreven genbewerkingsconstructen en expressievectoren om verhoogde hitte- en droogteresistentie te vertonen.

In sommige uitvoeringsvormen omvat de genetisch gemodificeerde plant een plant die is gemodificeerd om een ​​exogeen nucleïnezuur tot expressie te brengen dat codeert voor ten minste één heat shock-eiwit (HSP) gekozen uit de groep bestaande uit HSP40, HSP60 en HSP70, en de plant is verder gemodificeerd om een fosfoenolpyruvaatcarboxylase (PEPC) dat een asparaginezuur (D) omvat op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4.

In sommige uitvoeringsvormen worden de HSP40, HSP60 en HSP70 constitutief tot expressie gebracht in de genetisch gemodificeerde plant. In sommige uitvoeringsvormen worden de HSP40, HSP60 en HSP70 op een tijdelijk gecontroleerde manier tot expressie gebracht in de genetisch gemodificeerde plant. In een specifieke uitvoeringsvorm omvat de tijdgestuurde wijze de expressie van de HSP40, HSP60 en HSP70 overdag.

In sommige uitvoeringsvormen is het PEPC-gen het endogene gen van de genetisch gemodificeerde plant en is het endogene PEPC-gen gemuteerd op de positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4 met behulp van de hierboven beschreven genoombewerkingstechnieken (bijv. een van CRISPR /Cas-systeem, Cre/Lox-systeem, TALEN-systeem, ZFNs-systeem en homologe recombinatie). In een specifieke uitvoeringsvorm is de PEPC-mutatie op de positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4 een arginine (R) naar asparaginezuur (D)-mutatie. In een specifieke uitvoeringsvorm is de PEPC-mutatie op de positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4 een histidine (H) naar asparaginezuur (D)-mutatie. In een specifieke uitvoeringsvorm is de PEPC-mutatie op de positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4 een lysine (K) naar asparaginezuur (D)-mutatie.

In sommige uitvoeringsvormen omvat de genetisch gemodificeerde plant een exogeen nucleïnezuur dat codeert voor een PEPC-gen dat een asparaginezuur (D) omvat op een positie die overeenkomt met positie 509 van SEQ ID NO: 4. In sommige uitvoeringsvormen codeert het exogene nucleïnezuur voor een PEPC is van een CAM-plantensoort. In een specifieke uitvoeringsvorm wordt de CAM-plantensoort gekozen uit de groep bestaande uit: Kalanchoë fedtschenkoi, Phalaenopsis equestris, Ananas comosus en Crassula perforata.

In sommige uitvoeringsvormen wordt het exogene PEPC-gen constitutief tot expressie gebracht. In sommige uitvoeringsvormen wordt het exogene PEPC-gen op een tijdelijk gecontroleerde manier tot expressie gebracht in de genetisch gemodificeerde plant. In een specifieke uitvoeringsvorm omvat de temporeel gecontroleerde manier de expressie van het PEPC-gen gedurende de nacht.

In sommige uitvoeringsvormen kan een plant of plantencel worden getransformeerd door een construct geïntegreerd te hebben in zijn genoom, d.w.z. stabiel kan worden getransformeerd. Stabiel getransformeerde cellen behouden typisch het geïntroduceerde nucleïnezuur bij elke celdeling. Een plant of plantencel kan ook tijdelijk worden getransformeerd zodat het construct niet in zijn genoom wordt geïntegreerd. Transiënt getransformeerde cellen verliezen typisch alle of een deel van het geïntroduceerde nucleïnezuurconstruct bij elke celdeling, zodat het geïntroduceerde nucleïnezuur niet kan worden gedetecteerd in dochtercellen na een voldoende aantal celdelingen. Zowel tijdelijk getransformeerde als stabiel getransformeerde transgene planten en plantencellen kunnen bruikbaar zijn bij de hierin beschreven werkwijzen.

Typisch vormen transgene plantencellen die worden gebruikt in hierin beschreven werkwijzen een deel of de gehele plant. Dergelijke planten kunnen worden gekweekt op een voor de betreffende soort geschikte wijze, hetzij in een groeikamer, een kas of in een veld. Transgene planten kunnen naar wens worden gekweekt voor een bepaald doel, bijvoorbeeld om een ​​recombinant nucleïnezuur in andere lijnen te introduceren, om een ​​recombinant nucleïnezuur over te dragen naar andere soorten of voor verdere selectie van andere gewenste eigenschappen. Nakomelingen omvatten afstammelingen van een bepaalde plant of plantenlijn, op voorwaarde dat het nageslacht het transgen erft. Nakomelingen van een plant omvatten zaden gevormd op F1, F2, F3, F4, F5, F6 en daaropvolgende generatie planten of zaden gevormd op BC1, BC2, BC3 en daaropvolgende generatie planten of zaden gevormd op F1BC1, F1BC2, F1BC3 en daaropvolgende generatie planten. Zaden geproduceerd door een transgene plant kunnen worden gekweekt en vervolgens zelfbestuivend (of uitgekruist en zelfbestuivend) om zaden te verkrijgen die homozygoot zijn voor het nucleïnezuurconstruct. Als alternatief kunnen transgene planten vegetatief worden vermeerderd voor die soorten die vatbaar zijn voor dergelijke technieken.

Transgene plantencellen die groeien in suspensiekweek of weefsel- of orgaankweek kunnen bruikbaar zijn voor extractie van polypeptiden of verbindingen van belang, bijvoorbeeld ligninemonomeren of verbindingen in een ligninebiosyntheseroute. Voor de doeleinden van deze uitvinding kunnen vaste en/of vloeibare weefselkweektechnieken worden gebruikt. Bij gebruik van vast medium kunnen transgene plantencellen direct op het medium worden geplaatst of op een filterfilm worden geplaatst die vervolgens in contact wordt gebracht met het medium. Bij gebruik van vloeibaar medium kunnen transgene plantencellen op een drijfinrichting worden geplaatst, bijvoorbeeld een poreus membraan dat in contact komt met het vloeibare medium. Vast medium wordt meestal gemaakt van vloeibaar medium door agar toe te voegen. Een vast medium kan bijvoorbeeld elk van verschillende minerale zoutmedia zijn, bijv. Murashige en Skoog (MS) medium dat agar en een geschikte concentratie van een auxine bevat, bijv. 2,4-dichloorfenoxyazijnzuur (2,4-D) en een geschikte concentratie van een cytokinine, bijv. kinetine.

In sommige uitvoeringsvormen brengen de transgene planten de beschreven genen op een weefselspecifieke manier tot expressie. In sommige uitvoeringsvormen worden de genen tot expressie gebracht uit nucleïnezuurconstructen die een celtype of weefseltype-preferentiële promotor omvatten. Zoals hierin gebruikt, verwijst een "celtype- of weefselpreferentiële promotor" naar een promotor die expressie bij voorkeur in het doelweefsel aanstuurt, maar kan ook leiden tot enige expressie in andere celtypen of weefsels. In een specifieke uitvoeringsvorm worden de beschreven genen tot expressie gebracht in het bladweefsel.

Eerste en onmiddellijke toepassing van de beschreven methoden kan worden gemaakt in de bio-energiegewassen Populus en switchgrass, maar de toepassing kan worden uitgebreid tot andere bio-energiegewassen zoals maïs, andere bronnen van lignocellulosische biomassa en andere modelplanten, bijv. Salix, Miscanthus, rijst, tarwe, sojabonen en medicijn.

De hierin beschreven polynucleotiden en vectoren kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om een ​​aantal eenzaadlobbige en tweezaadlobbige planten en plantencelsystemen te transformeren, waaronder alfalfa, es, beuk, berk, canola, kers, klaver, katoen, katoenzaad, eucalyptus, vlas, jatropha. , mahonie, esdoorn, mosterd, eik, populier, koolzaad, koolzaad (hoog erucazuur en koolzaad), rode klaver, teak, tomaat, walnoot en wilg, evenals eenzaadlobbigen zoals gerst, bluegrass, kanariegras, maïs, zwenkgras, veldmaïs, gierst, miscanthus, haver, rijst, rogge, raaigras, sorghum, sudangras, suikerriet, suikermaïs, switchgrass, turfgrassen, timothee en tarwe. Gymnospermen zoals dennen, dennen en sparren kunnen ook geschikt zijn.

Tenzij anders gedefinieerd, hebben alle hierin gebruikte technische en wetenschappelijke termen dezelfde betekenis als algemeen wordt begrepen door een deskundige op het gebied van de techniek waartoe deze uitvinding behoort. Hoewel alle methoden en materialen die vergelijkbaar of equivalent zijn aan die welke hierin zijn beschreven ook kunnen worden gebruikt in de praktijk of het testen van de onderhavige uitvinding, worden nu de voorkeursmethoden en materialen beschreven. Alle hierin genoemde publicaties zijn hierin door verwijzing opgenomen om de werkwijzen en/of materialen in verband waarmee de publicaties worden geciteerd te openbaren en te beschrijven.

De onderhavige beschrijving wordt verder geïllustreerd door de volgende niet-beperkende voorbeelden.

voorbeeld 1 Kalanchoë Genoomassemblage en annotatie

de diploïde K. fedtschenkoi (2n=2x=34 chromosomen) de genoomgrootte werd geschat op ˜260 Mb. De K. fedtschenkoi genoom werd samengesteld uit ˜ 70 × gepaarde-end-uitlezingen en ˜37 × mate-paar-uitlezingen gegenereerd met behulp van een Illumina MiSeq-platform. De genoomassemblage bestond uit 1.324 scaffolds met een totale lengte van 256 Mb en scaffold N50 van 2,45 Mb, waarin de uitvinders 30.964 eiwitcoderende genen voorspelden en annoteerden.

Voorbeeld 2 De fylogenetische plaatsing van Kalanchoë

Kalanchoë is de eerste eudicot CAM-lijn met een genoomsequentie tot nu toe en dient als een belangrijke referentie voor het begrijpen van de evolutie van CAM. In aanvulling, K. fedtschenkoi is de eerste gesequenced soort in de verschillende eudicot-lijn, Saxifragales. Hoewel de monofylie van deze morfologisch diverse orde goed wordt ondersteund door moleculaire gegevens, was de fylogenetische plaatsing ervan minder duidelijk (Soltis et al., 2013, Amerikaans tijdschrift voor plantkunde, 100: 916-929). De recente consensusvisie, voornamelijk gebaseerd op analyses van plastide-DNA-sequenties, heeft de Saxifragales als een zustergroep van de rosiden geplaatst en samen vormen ze de grote open plek van superrosiden (The Angiosperm Phylogeny Group, 2016, Botanisch tijdschrift van de Linnean Society, 181: 1-20 Zeng et al., 2017, nieuwe fytoloog, 214: 1338-1354). Er zijn echter aanwijzingen voor conflicten tussen bomen op basis van plastidegenomen en nucleaire genomen voor deze Glade (Cal et al., 2015, Natuurgenetica, 47: 65-72 Zeng et al., 2017, nieuwe fytoloog, 214: 1338-1354). Bovendien wordt aangenomen dat de belangrijkste geslachten van kerneudicots zich snel hebben gediversifieerd na hun eerste verschijning, waardoor het oplossen van de relaties tussen deze clades bijzonder uitdagend is (Moore et al., 2010, Proc Natl Acad Sci VS, 107: 4623-4628 Magallon et al., 2015, nieuwe fytoloog, 207: 437-453) en impliceert onvolledige afstammingssortering (ILS) als een potentieel belangrijk proces dat zou leiden tot onenigheid tussen gengeschiedenissen (Maddison en Knowles, 2006, systematische biologie, 55: 21-30). Fylogenetische analyses werden uitgevoerd met 210 single-copy nucleaire genen van 26 gesequentieerde plantengenomen met behulp van meerdere fylogenetische inferentiestrategieën. De resulterende soortbomen zijn congruent met elkaar, behalve voor de plaatsing van K. fedtschenkoi, die ofwel als zus van de rosiden in een fylogenetische boom werd geplaatst die was gereconstrueerd met behulp van een op kwartet gebaseerde coalescente soortenboommethode (FIG. 1B) of als zuster van alle andere kerneudicots zoals onthuld door alternatieve fylogenetische bomen gereconstrueerd uit 1) aaneengeschakelde eiwitsequentie uitlijning zonder genpartitie met behulp van maximale waarschijnlijkheid, 2) een gepartitioneerde analyse van multi-genuitlijning met behulp van maximale waarschijnlijkheid en Bayesiaanse methoden, en 3) analyse van individuele genbomen met behulp van de volledig Bayesiaanse multispecies-coalescentiemethode. Ondanks aanzienlijke onenigheid tussen geschatte nucleaire genenbomen, was de op coalescentie gebaseerde boom consistent met de resultaten van de op plastoom gebaseerde analyses, waardoor Kalanchoë als zuster van de rosiden (FIG. 1B). Coalescente soortenboomschattingen kunnen de discordantie van genenbomen verklaren als gevolg van ILS (Degnan en Rosenberg, 2009, Trends in ecologie & Evolutie, 24: 332-340). Tegelijkertijd kunnen alternatieve plaatsingen van Kalanchoë als zuster van de asteroïden, of als zuster van alle andere kerneudicots, werden in veel genenbomen waargenomen (FIG. 1B). Genboomdiscordantie als gevolg van snelle diversificatie vroeg in de geschiedenis van eudicot is ook door anderen gekenmerkt (Zeng et al., 2017, nieuwe fytoloog, 214: 1338-1354). Ongeacht de optimale plaatsing van de Saxifragales, inclusief Kalanchoë, zullen individuele genenbomen vaak een alternatieve geschiedenis hebben als gevolg van ILS in het licht van snelle soortendiversificatie.

Reconstructie van de tijdgekalibreerde fylogenetische boom met behulp van het BEAST-programma (Drummond et al., 2012, Moleculaire Biologie en Evolutie, 29: 1969-1973) op basis van bekende fossielen voorspelt dat Kalanchoë afweek van andere eudicots c.a. 110 miljoen jaar geleden (Mya). De leeftijdsschattingen in deze in de tijd gekalibreerde fylogenetische boom zijn over het algemeen consistent met de fossielen en eerdere schattingen (Bell et al., 2010, Amerikaans tijdschrift voor plantkunde, 97: 1296-1303 Magallon et al., 2015, nieuwe fytoloog, 207: 437-453). Daarom is de geschatte leeftijd van het basale angiosperm (Amborella trichopoda) is 163 Mya (miljoen jaar geleden), consistent met de oorspronkelijke schatting van ten minste 160 Mya (Amborella Genoomproject, 2013, Wetenschap, 342: 1241089). Het verschil tussen de eenzaadlobbige en tweezaadlobbige geslachten werd geschat op ca. 133,3 Mya, consistent met de eerdere schatting van tussen ˜ 125 en 142 Mya (Kramer, 2009, Jaaroverzicht van plantenbiologie, 60: 261-277).

Voorbeeld 3 Kalanchoë Genoomduplicatie

Het druivengenoom heeft geen extra genoomduplicatie na de voorouderlijke gamma-hexaploïdisatie (Jaillon et al., 2007, Natuur, 449: 463-467 Murat et al., 2015, Genoombiologie en evolutie, 7: 735-749) en is de best beschikbare referentie voor het bestuderen van voorouderlijke eudicot-genoomduplicatiegebeurtenissen. Syntenische diepteanalyses (Paterson et al., 2012, Natuur, 492: 423-427 Amborella Genoomproject, 2013, Wetenschap, 342: 1241089) toonde aan dat er meerdere zijn: K. fedtschenkoi blokken die elk druivengen bedekken (FIG. 2A). In het bijzonder had 65% van het druivengenoom één tot vier syntenische blokken in K. fedtschenkoi. Daarentegen trad een plotselinge daling in syntenische diepte op na een diepte van 4× (FIG. 2A), wat aangeeft dat elk druivengenoomgebied tot vier K. fedtschenkoi blokken en levert daarmee sterk bewijs voor twee verschillende gebeurtenissen in het hele genoomduplicaties (WGD's) in K. fedtschenkoi. De microsynteny-patronen ondersteunen verder twee WGD's op de lijnen die leiden tot K. fedtschenkoi. In het bijzonder weerspiegelt het microsynteniepatroon een 1:4-genkopieverhouding tussen het druivengenoom en het diploïde K. fedtschenkoi genoom (FIG. 2B). Van de Kalanchoë oogpunt vonden de uitvinders dat 49% van de Kalanchoë genoom werd bedekt door één druif-Kalanchoë blok, 7% bedekt met twee druiven-Kalanchoë blokken, en 1% bedekt met drie druiven-Kalanchoë blokken. Dit suggereert dat de uitvinders vaak één beste druivensoort konden vinden.Kalanchoë blokkeren van de drie gamma-verdrievoudigde regio's in druiven. Dit past in het scenario dat de gamma-WGD dateerde van vóór de divergentie en dat er geen WGD in de druivenlijn is sinds druiven-Kalanchoë divergeerde. Als alternatief, als de divergentie ouder was dan de gamma WGD, dan van Kalanchoë oogpunt zouden de uitvinders in plaats daarvan drie bijpassende druivenregio's moeten zien. Vandaar de druiven-Kalanchoë genoomvergelijkingen ondersteunden de gamma-WGD sterk als een gedeelde gebeurtenis en ondersteunden verder de fylogenetische positie van Kalanchoë in FIG. 1B.

Ondanks twee schijnbare WGD's in de K. fedtschenkoi afstamming vertoonden synonieme substituties per synonieme plaats (Ks) tussen dubbele genenparen slechts één prominente piek rond 0,35. De unimodale verdeling van Ks suggereert dat de twee WGD-gebeurtenissen dicht in de tijd plaatsvinden. Evenzo verschijnen er twee verschillende pieken in de verdeling van de viervoudige transversiesubstitutiesnelheid (4dtv) waarden tussen de K. fedtschenkoi genenparen (FIG. 2C). Druif-Kalanchoë genenparen vertonen een prominente piek rond Ks=1,5, wat aangeeft dat de WGD's in de K. fedtschenkoi afstamming vond plaats lang na de afwijking van de druif in het begin van de geschiedenis van de rosid-afstamming.

Voorbeeld 4 CAM Pathway-genen in K. fedtschenkoi

CAM-route kan worden onderverdeeld in twee tijdelijk gescheiden processen: carboxylatie 's nachts en decarboxylatie gedurende de dag. Er zijn vijf enzymen/eiwitten betrokken bij het carboxylatieproces, waaronder bèta-koolzuuranhydrase (β-CA), fosfoenolpyruvaatcarboxylase (PEPC), fosfoenolpyruvaatcarboxylasekinase (PPCK), malaatdehydrogenase (MDH) en aluminium-geactiveerde malaattransporter (ALMT). ) en vijf enzymen/eiwitten mediëren het decarboxyleringsproces, waaronder ALMT, tonoplast-dicarboxylaattransporteur (TDT), appelenzym (ME), pyruvaatfosfaatdikinase (PPDK) en PPDK-regulerend eiwit (PPDK-RP) (FIG. 3A). De genen die coderen voor deze enzymen/eiwitten werden geïdentificeerd in K. fedtschenkoi (FIG. 3C en FIG. 3D).

Er zijn acht β-CA-genen voorspeld in de K. fedtschenkoi genoom (Kaladp0095s0400, Kaladp0081s0140, Kaladp0081s0143, Kaladp0034s0051, Kaladp00240122, Kaladp0538s0011, Kaladp0018s0287 en Kaladp0018s0289). Van deze β-CA-genen hebben twee (d.w.z. Kaladp0034s0051, Kaladp0018s0289) een relatief hoge transcript-overvloed in vergelijking met de andere β-CA-genen in K. fedtschenkoi. De transcriptieexpressie van Kaladp0034s0051 is relatief hoger tijdens de nacht en vroege ochtend, vergelijkbaar met die van zijn A. comosus ortholoog Aco005402 die ook een relatief hoge transcript-abundantie heeft in vergelijking met de andere twee paralogen in A. comosus. De diel-transcriptexpressie van Kaladp0018s0289 heeft een piek tijdens de middernacht. Aangezien carboxylatie 's nachts plaatsvindt, kan worden gesuggereerd dat Kaladp0018s0289 relevanter is voor CAM dan Kaladp0034s0051.

Er zijn vijf PEPC-genen voorspeld in de K. fedtschenkoi genoom (Kaladp0095s0055, Kaladp0048s0578, Kaladp0011s03355, Kaladp0011s1355 en Kaladp0062s0055). Van deze PEPC-genen hebben twee (d.w.z. Kaladp0095s0055, Kaladp0048s0578) een relatief hoge transcript-overvloed in vergelijking met de andere PEPC-genen in K. fedtschenkoi. Kaladp0095s0055 en Kaladp0048s0578 hebben respectievelijk in de late namiddag en middernacht relatief hogere niveaus van transcriptie. In A. comosus, heeft het PEPC-gen Aco010025 met relatief hoge expressie twee transcriptiepieken tijdens respectievelijk de middag en middernacht.

Er zijn zeven PPCK-genen voorspeld in de K. fedtschenkoi genoom (Kaladp0015s0074, Kaladp0076s0015, Kaladp0071s0190, Kaladp0037s0517, Kaladp0050s0014, Kaladp0604s0001, Kaladp0082s0192). Van deze PPCK-genen heeft één (d.w.z. Kaladp0037s0517.1) een relatief hoge transcript-abundantie vergeleken met de andere PPCK-genen in K. fedtschenkoi, met transcriptie-expressie die midden in de nacht piekt, vergelijkbaar met zijn A. comosus ortholoog Aco013938 die het hoogste niveau van transcriptexpressie heeft, met een piek midden in de nacht, van de vier PPCK-genen in A. comos.

Er zijn 11 MDH-genen voorspeld in de K. fedtschenkoi genoom, dat kan worden onderverdeeld in twee groepen: MDH1 dat acht genen bevat (Kaladp0101s0211, Kaladp0095s0052, Kaladp0022s0111, Kaladp0001s0257, Kaladp0099s0144, Kaladp0095s0564, Kaladp0048s0189 en Kaladp0048s0189 en Kaladp0058s056993) en MDH2001. Onder de K. fedtschenkoi MDH1-genen, Kaladp0001s0257 heeft een relatief hoge transcript-overvloed in vergelijking, met transcriptie-expressie die een piek bereikt vóór de schemering en tussen de vijf A. comosus MDH1-genen, Aco004996 heeft een relatief hoge transcript-overvloed in vergelijking met transcriptie-expressie die halverwege de nacht piekt. Zowel Kaladp0001s0257 als Aco004996 bevinden zich in dezelfde open plek van de fylogenetische boom. Onder de K. fedtschenkoi MDH2-genen, Kaladp0082s0194 heeft een relatief hoge transcript-overvloed in vergelijking, met een piek in de transcriptie in de middag en tussen de vijf A. comosus MDH1-genen, Aco013935 heeft een relatief hoge transcript-overvloed in vergelijking, met transcriptie-expressie hoger tijdens de nacht en vroege ochtend.

Er zijn vijf ALMT-genen voorspeld in de K. fedtschenkoi genoom (Kaladp0073s0021, Kaladp0024s0194, Kaladp0062s0038, Kaladp0048s0850 en Kaladp0050s0298). Onder de K. fedtschenkoi ALMT-genen, drie (d.w.z. Kaladp0073s0021, Kaladp0024s0194, Kaladp0062s0038) hebben een relatief hogere transcript-overvloed. De transcriptieexpressie van Kaladp0073s0021 en Kaladp0062s0038 piekt respectievelijk in de ochtend en rond middernacht. ALMT kan malaat in of uit de vacuole transporteren (Palmer et al., 2016, Transacties van de biochemische samenleving, 44: 856-862). Daarom geven de gegevens aan dat Kaladp0062s0038 betrokken is bij het transport van malaat in de vacuole tijdens de nacht en Kaladp0073s0021 overdag malaat uit de vacuole transporteert.

Er zijn twee PPDK-genen (Kaladp0039s0092 en Kaladp0076s0229) voorspeld in de K. fedtschenkoi genoom. Beiden vertoonden een hogere transcriptie-expressie na middernacht tot vroeg in de ochtend. Er zijn twee genen voor PPDK-regulerend eiwit (PPDK-RP) voorspeld in de K. fedtschenkoi genoom, met een hoger niveau van transcriptie gedurende de dag dan tijdens de nacht (FIG. 3E).

Er zijn 13 genen voorspelde malic enzyme (ME) genen in de K. fedtschenkoi genoom (Kaladp0092, s0166, Kaladp0045s0427, Kaladp0024s0016, Kaladp0102s0114, Kaladp0098s0037, Kaladp0046s0046, Kaladp0015s0134, Kaladp0472s0027, Kaladp0001s670130, Kaladp0063s008937, Kaladp Onder de K. fedtschenkoi ME-genen, Kaladp0092s0166.1 heeft de hoogste transcript-overvloed, met een piek in transcriptie aan het einde van de donkere periode.

Genduplicatie is een belangrijke bron van genetische nieuwigheid (Qian en Zhang, 2014, Genoomonderzoek, 24: 1356-1362). De meeste genen die nodig zijn voor de CAM-route in K. fedtschenkoi, waaronder β-CA, PEPC, MDH, ALMT, NAD-ME en NADP-ME, waren het resultaat van recente genoomduplicatiegebeurtenissen, met 4DTV-waarden variërend van 0,11-0,20 (FIG. 3A). Verder werden verschillen geïdentificeerd in de hoeveelheid transcriptie tussen elk paar gedupliceerde CAM-genen evenals in de diel-expressiepatronen tussen de gedupliceerde genen (FIG. 3B). De resultaten suggereren dat zowel recente volledige genoomduplicatie als functionele diversificatie in termen van de diel-herprogrammering van genexpressie na genduplicatie hebben bijgedragen aan de evolutie van CAM-genen.

Voorbeeld 5 Co-expressiemodules in K. fedtschenkoi

Genfunctie op wereldwijde schaal ophelderen in K. fedtschenkoi, werden gewogen correlatienetwerkanalyses uitgevoerd van transcriptexpressie in 16 monsters, waaronder 12 volwassen bladmonsters die om de twee uur werden verzameld over een periode van 24 uur en vier niet-bladmonsters (dwz scheuttop, stengel, wortel en bloem) verzameld op één tijdstip (10:00 uur). Netwerkanalyse identificeerde 23 co-expressiemodules, met 408-3.052 genen per module.

Hiervan waren twee modules (MEblack met 782 genen en MEsalmon met 731 genen) significant gecorreleerd met de bladmonsters verzameld tijdens de nacht (donkere) periode. Verschillende biologische processen (bijv. oxylipinemetabolisme, carbonzuurbiosyntheseproces, terpeenbiosyntheseproces, zetmeelmetabolische processen) waren oververtegenwoordigd (p<0.05) in deze twee modules. Alle vijf genen die worden getoond voor nachtelijke CAM-carboxylatie en vacuolaire opname van malaat (Figuur 3A) behoren tot deze twee modules: vier genen (dwz PEPC, PPCK, MDH, ALMT) behoren tot de MEblack-module en één gen (β- CA) behoort tot de MEsalmon-module (FIG. 3C). Deze resultaten suggereren dat genen in de co-expressiemodules MEblack en MEsalmon een belangrijke rol spelen in de nachtelijke processen die CAM definiëren. Eén module (MEblue met 1911 genen) was positief gecorreleerd met de bladmonsters die gedurende de dag werden verzameld. Verschillende biologische processen (bijv. fotosynthese-lichtreactie) waren oververtegenwoordigd (p<0.05) in deze module. Eén gen in het CAM-decarboxyleringsproces, PPDK-RP, behoort tot MEblue (FIG. 3D).

Voorbeeld 6 Globaal beeld van genen die betrokken zijn bij convergente evolutie

Transcript-expressiepatroon (bijv. Tijdelijke en ruimtelijke expressie) en eiwitsequenties zijn twee belangrijke kenmerken die de functie van eiwitcoderende genen definiëren. Het is algemeen bekend dat CAM fundamenteel verschilt van C3 fotosynthese in termen van de diel-timing van belangrijke metabolische en fysiologische processen zoals weergegeven door invers stomataal gedrag en nachtelijke CO2 opname. Om de mogelijkheid te onderzoeken dat de diel-herprogrammering van het metabolisme die CAM onderscheidt van C3-fotosynthese wordt bereikt door convergente verschuivingen in diel-patronen van genexpressie, werd een vergelijkende analyse van het diel-expressiepatroon in CAM- en C3-plantensoorten uitgevoerd. Met name het diel-expressiepatroon van 9.733 orthologe groepen die genen bevatten in K. fedtschenkoi (eudicot, CAM-fotosynthese), A. comosus (eenzaadlobbige, CAM-fotosynthese), en Arabidopsis thaliana (eudicot, C3-fotosynthese), met transcriptie-expressieniveau groter dan 0 FPKM in volwassen bladmonsters verzameld op vijf of meer tijdstippen werd uitgevoerd. EEN K. fedtschenkoi gen wordt gedefinieerd als onder convergente evolutie in genexpressie als het diel-transcriptexpressiepatroon sterk gecorreleerd is (Spearman-correlatiecoëfficiënt >0.8) met ten minste één van de orthologen in A. comosus maar niet sterk gecorreleerd (Spearman-correlatiecoëfficiënt <0.5) met een van de orthologen in A. thaliana (Spearman-correlatiecoëfficiënt <−0.6). Als zodanig, 118 K. fedtschenkoi genen werden geïdentificeerd die onder convergente evolutie waren in genexpressie, waarvan sommige sleutelgenen zijn in de CAM-route, zoals PPCK1 (tabel 1) dat een sleutelrol speelt bij de verwerking van koolhydraten voor CAM (Borland et al, 2016, Huidige mening in plantenbiologie 31: 118-124). De gegevens suggereren dat convergentie in diel-herprogrammering van genexpressie heeft bijgedragen aan de evolutie van CAM-planten.

Te identificeren K. fedtschenkoi genen onder convergente evolutie in termen van eiwitsequentie in CAM-soorten, genfamilies (of stammen) werden gereconstrueerd uit eiwitsequenties in de 25 soorten die in FIG. 1B, behalve Aquilegia coerulea, met behulp van de TRIBE-MCL-benadering (Enright et al., 2002, Onderzoek naar nucleïnezuren, 30: 1575-1584). Vervolgens werden fylogenetische bomen gemaakt voor de genen in alle stammen die ten minste één gen bevatten in elk van de 13 representatieve soorten (tabel 2).

EEN K. fedtschenkoi gen wordt gedefinieerd als onder convergente evolutie in eiwitsequentie als het voldoet aan de volgende twee criteria: 1) de K. fedtschenkoi gen wordt samen met gen(en) van ten minste één van de twee eenzaadlobbige CAM-soorten (A. comosus en P. paardensport) in een fylogenetische tak die geen genen van C . bevat3 of C4 soorten en 2) de K. fedtschenkoi gen deelt ten minste één aminozuurmutatie met zijn ortholoog in eenzaadlobbige CAM-soorten, die niet werd gevonden in de C3 of C4 soort. Als zodanig 8 K. fedtschenkoi genen toonden convergente veranderingen in eiwitsequenties, waarvan sommige sleutelgenen zijn in de CAM-route, zoals PEPC (Tabel 3, FIG. 9B).

Voorbeeld 7 Convergente evolutie van genen die betrokken zijn bij nachtelijke CO2 fixatie

PEPC en PPCK zijn twee sleutelenzymen voor nachtelijke CO2 fixatie in CAM-planten (Borland et al., 2014, Trends in plantenwetenschap, 19: 327-338 Yang et al., 2015, nieuwe fytoloog, 207: 491-504). PPCK fosforyleert PEPC (FIG. 4A) en vermindert daardoor de malaatremming van PEPC, waardoor nachtelijke CO2 opname (Hartwell et al., 1999, Plantenjournaal, 20: 333-342 Taybi et al., 2000, Plantenfysiologie, 123: 1471-1482). PPCK wordt verondersteld te worden gereguleerd op het niveau van transcriptie (Hartwell et al., 1999, Plantenjournaal, 20: 333-342). De uitvinders identificeerden vier PPCK-genen in de K. fedtschenkoi genoom, waarvan twee (Kaladp0037s0517 en Kaladp0604s0001) een relatief hogere transcript-overvloed vertoonden dan de andere (FIG. 3C). Het diel-expressiepatroon van de meest voorkomende PPCK-transcripten in K. fedtschenkoi (Kaladp0037s0517) en A. comosus (Aco013938) waren positief gecorreleerd (Spearman-correlatiecoëfficiënt van 0,91), terwijl beide negatief waren gecorreleerd (Spearman-correlatiecoëfficiënt <−0,67) met hun Arabidopsis ortholoog (AT1G08650). Deze convergente verandering in PPCK-transcriptie verschoof de piektranscriptie-abundantie van de dag in C3 soort (Arabidopsis) tot de nacht in de twee CAM-soorten (FIG. 4B), wat consistent is met de rol van PPCK bij het activeren van PEPC-gemedieerde nachtelijke C-fixatie. Vijf PEPC-genen werden geïdentificeerd in K. fedtschenkoi, waarvan twee (Kaladp0095s0055 en Kaladp0048s0578) een relatief hogere transcript-overvloed vertoonden dan de andere (FIG. 3C). De meest voorkomende PEPC-transcripten in K. fedtschenkoi (Kaladp0095s0055) werden zowel overdag als 's nachts in hoge mate tot expressie gebracht met een piek op het overgangspunt van dag naar nacht, terwijl de op één na meest voorkomende PEPC-transcripten in K. fedtschenkoi (Kaladp0048s0578) vertoonde 's nachts een veel hogere expressie dan overdag (FIG. 4C). De uitvinders ontdekten dat een gedupliceerd paar K. fedtschenkoi PEPC-genen (Kaladp0048s0578 en Kaladp0011s0355) werden samen met een PEPC-gen (PEQU_07008) in P. paardensport in een unieke fylogenetische tak (FIG. 9B). PEQU_07008 werd onlangs gerapporteerd als de PEPC van het CAM-type in P. paardensport, en net als Kaladp0048s0578 vertoonde deze PEPC ook hogere transcriptie tijdens de nacht dan overdag (Zhang et al., 2016, Plantenjournaal, 86: 175-185). Bovendien onthulde de analyse van de uitvinders van de uitlijning van meerdere eiwitsequenties dat één aminozuur, asparaginezuur (D), is geconserveerd in PEQU_07008 en Kaladp0048s0578, samen met Kaladp0011s0355 dat een gedupliceerde kopie is van Kaladp0048s0578, en dit ene aminozuur werd veranderd in arginine ( R), Lysine (K) of Histidine (H) in andere eiwitsequenties in de PEPC-familie (FIG. 4D en FIG. 9B). Het structurele model geeft aan dat de enkele aminozuurmutatie (van een basisch aminozuur R/K/H naar een zuur aminozuur D) in Kaladp0048s0578 zich bevindt in een α-helix naast de actieve plaats van een β-vat PEPC ( figuur 4E). Op basis van de omgekeerde elektrostatische kenmerken is het mogelijk dat deze mutatie de onderdrukking van PEPC-activiteit door appelzuur zou kunnen tegengaan, wat leidt tot de hypothese dat de PEPC die wordt gecodeerd door Kaladp0048s0578 niet onderhevig is aan fosforylering aan het N-terminale serineresidu (S8 in Kaladp0048s0578 ). Deze resultaten suggereren twee alternatieve wijzen van convergente evolutie in nachtelijke CO2 fixatie: 1) PPCK-expressie wordt verschoven van dag naar nacht om PEPC1 (de meest voorkomende isovorm) te activeren, zoals weergegeven in K. fedtschenkoi en A. comosus of 2) een enkele aminozuurmutatie van R/K/H naar D handhaaft de actieve toestand van PEPC2 (de op één na meest voorkomende isovorm) zonder dat fosforylering nodig is, zoals getoond in K. fedtschenkoi en P. paardensport. Verder ontdekten de uitvinders dat het eiwit (PEPC2) dat wordt gecodeerd door Kaladp0048s0578 een nieuwe eigenschap bezit dat het geen activering door PPCK nodig heeft, en deze eigenschap zou kunnen worden gemodificeerd door een enkele aminozuurmutatie van D naar R, K of H (Fig. 5A en 5B). Met andere woorden, de resultaten geven aan dat een enkele aminozuurmutatie de PEPC-activiteit significant kan wijzigen.

De evolutionaire analyses van de uitvinders hebben geen convergente evolutie gedetecteerd in de verschillende decarboxyleringsgenen die tot expressie werden gebracht in Kalanchoë en ananas. In Kalanchoë waren NAD(P)-ME-genen sterk tot expressie gebracht, terwijl de expressie van het PEPCK-gen erg laag was. Daarentegen was in ananas de transcriptovervloed van PEPCK veel hoger dan die van ME-transcripten. Deze resultaten ondersteunen het concept dat malaatdecarboxylering in Kalanchoë wordt gemedieerd door ME (Dever et al., 2015, Plantenfysiologie, 167: 44-59) en in ananas door PEPCK, consistent met eerdere onderzoeken naar enzymactiviteit (Holtum et al., 2005, Functionele plantenbiologie, 32: 429-449).

Voorbeeld 8 Convergente evolutie van genen die betrokken zijn bij CAM stomatale beweging

De stomatale poriën van plantenbladeren, gelegen in de epidermis en omgeven door een paar wachtcellen, reguleren CO2 opname voor fotosynthese en waterverlies door transpiratie (Shimazaki et al., 2007, Jaaroverzicht van plantenbiologie, 58: 219-247). Een uniek kenmerk van CAM-fysiologie is het omgekeerde dag/nachtpatroon van stomatale beweging ten opzichte van C3, met huidmondjes die 's nachts opengaan in CAM en overdag in C3-planten (Borland et al., 2014, Trends in plantenwetenschap, 19: 327-338). Blauw licht is een belangrijk omgevingssignaal dat de stomatale opening regelt en de reactie op blauw licht is afhankelijk van de fotoreceptoren phototropin 1 (PHOT1) en phototropin 2 (PHOT2) (Kinoshita et al., 2001, Natuur, 414: 656-660), rekrutering van een 14-3-3-eiwit naar een plasmamembraan H+-ATPase (Kinoshita et al., 2003, Plantenfysiologie, 133: 1453-1463), fosforylering van zijn C-terminus, protonextrusie, plasmamembraanhyperpolarisatie, kaliumopname via naar binnen rectificerende K+-kanalen (Schroeder et al., 1987, Proceedings van de National Academy of Sciences, 84: 4108-4112) en daaropvolgende zwelling van de wachtcellen (Kinoshita en Shimazaki, 2002, Planten- en celfysiologie, 43: 1359-1365) (FIG. 6A). De genontologie-analyse van de uitvinders voorspelde een lijst van 21 genen die betrokken zijn bij stomatale beweging in K. fedtschenkoi 4). Van deze genen vertoonde één gen (d.w.z. Kaladp0033s0113) dat codeert voor PHOT2 convergente verandering in het expressiepatroon van dieltranscript (tabel 4).

In het bijzonder is het diel-transcriptexpressiepatroon van Kaladp0033s0113 sterk gecorreleerd (Spearman-correlatiecoëfficiënt = 0,85) met dat van zijn A. comosus ortholoog (Aco014242.1) terwijl de transcriptiepatronen van deze twee PHOT2-genen in CAM-planten gescheiden waren van die van de PHOT2-genen in C3 soort Arabidopsis, met een verschuiving in de piek van transcriptovervloed vanaf zonsopgang in C3 soort (Arabidopsis) tot de schemering in de twee CAM-soorten (FIG. 6B). Deze convergente verandering in diel-expressie suggereert dat PHOT2 bijdraagt ​​aan het omgekeerde dag/nachtpatroon van stomatale sluiting/opening bij CAM-soorten.

Voorbeeld 9 Convergente evolutie van genen die betrokken zijn bij hittetolerantie/-bescherming

Het overdag sluiten van huidmondjes gedurende een groot deel van de dag is een bepalend kenmerk van CAM en kan worden overwogen om de interne warmtebelasting op de bladeren te verergeren. Fotosynthese is erg gevoelig voor hittestress en kan worden geremd lang voordat andere symptomen van hittestress worden gedetecteerd (Berry en Bjorkman, 1980, Jaaroverzicht van plantenfysiologie, 31: 491-543 Kobza en Edwards, 1987, Plantenfysiologie, 83: 69-74). Talrijke onderzoeken hebben aangetoond dat de remming van fotosynthese door matige hittestress een gevolg is van ribulose-1,5-bis-fosfaatcarboxylase/oxygenase (Rubisco)-deactivering, gedeeltelijk veroorzaakt door de thermische instabiliteit van Rubisco-activase (RCA) (Fig. 7A) (Feller et al., 1998, Plantenfysiologie, 116: 539-546 Salvucci en ambachten, Brandner, 2004, Fysiologia Plantarum, 122: 513-519 Kurek et al., 2007, Plantaardige cel, 19: 3230-3241). Wang et al. (2015, Tijdschrift voor Experimentele Plantkunde, 66: 3027-3240) meldden dat S1CDJ2, een heat shock-eiwit 40 (HSP40), bijdraagt ​​aan het behoud van CO2 assimilatiecapaciteit voornamelijk door Rubisco-activiteit onder hittestress te beschermen, en een HSP70 fungeert als een bindende partner van S1CDJ2. Salvucci (2008, Tijdschrift voor Experimentele Plantkunde, 59: 1923-1933) ontdekten dat HSP60 een belangrijke rol speelt bij het acclimatiseren van fotosynthese aan hittestress, mogelijk door Rubisco-activase te beschermen tegen thermische denaturatie (FIG. 7A). De HSP40, HSP60 en HSP70 kunnen ook fungeren als nano-compartimenten voor enkele RbcL/RbcS-subeenheden van Rubisco om geïsoleerd te vouwen, onaangetast door aggregatie (Liu et al., 2010, Natuur, 463: 197-202 Vervoerder et al., 2011, Amerikaans tijdschrift voor plantkunde, 98: e13-15 Zhang et al., 2016, Moleculaire Plant: DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.molp.2016.1004.1019). Er werden twee HSP40-genen voorspeld in K. fedtschenkoi en het diel-transcriptexpressiepatroon van een van deze twee genen (d.w.z. Kaladp0059s0286) piekt rond de middag en is sterk gecorreleerd (Spearman-correlatiecoëfficiënt = 0,80) met zijn A. comosus ortholoog (Aco006149.1) maar negatief gecorreleerd (Spearman correlatiecoëfficiënt=−0,28) met zijn A. thaliana ortholoog (AT1G71000) (FIG. 7B). Zeven HSP60-genen werden voorspeld in K. fedtschenkoi en het diel-transcriptexpressiepatroon van een van deze zeven genen (d.w.z. Kaladp0073s0051) piekt rond de middag en is sterk gecorreleerd (Spearman-correlatiecoëfficiënt = 0,83) met zijn A. comosus ortholoog (Aco010207.1) maar gescheiden van alle orthologen in A. thaliana (FIG. 7C). Twintig HSP70-genen werden voorspeld in K. fedtschenkoi en het diel-transcriptexpressiepatroon van een van deze genen (d.w.z. Kaladp0060s0296) piekt in de ochtend en is sterk gecorreleerd (Spearman-correlatiecoëfficiënt = 0,94) met zijn A. comosus ortholoog (Aco031458.1) maar gescheiden van alle orthologen in A. thaliana (FIG. 7D). Deze drie HSP-genen (d.w.z. Kaladp0059s0286, Kaladp0073s0051, Kaladp0060s0296) die een kloosterverandering in transcriptexpressie in de twee CAM-soorten (d.w.z. K. fedtschenkoi, A. comosus), met een hogere transcript-overvloed in de ochtend of middag, suggereert dat ze de fotosynthese van CAM-planten overdag kunnen beschermen tegen extreme hittestress.

Voorbeeld 10 Convergente evolutie van genen die betrokken zijn bij circadiaans ritme/klok

Belangrijkste kenmerken van CAM inclusief netto CO2 opname en PEPC-fosforylering zijn goed gedocumenteerd en vertonen onder constante omstandigheden circadiane ritmiek (Rascher et al., 2001, Proceedings van de National Academy of Sciences, 98: 11801-1805). De circadiane klok is gesuggereerd als een belangrijke regulator van de diel-herprogrammering van het metabolisme en de stomatale functie die CAM definieert. De moleculaire basis van circadiane ritmes is uitgebreid bestudeerd bij niet-CAM-soorten (McClung, 2013, Seminars in Cell & Ontwikkelingsbiologie, 24: 430-436 Hsu en Harmer, 2014, Trends in plantenwetenschap, 19: 240-249). In de Kalanchoë genoom, werd voorspeld dat 36 genen betrokken zijn bij circadiaanse ritmes, die zijn onderverdeeld in vier groepen: invoer, klok, uitvoer en andere (tabel 5).

Al deze K. fedtschenkoi genen behalve Kaladp0033s0113 vertoonden een vergelijkbaar diel-transcriptexpressiepatroon met hun orthologen in A. thaliana (Tabel 5). Kaladp0033s0113 codeert voor PHOT2 dat lid is van de invoergroep en waarvan is vastgesteld dat het convergente verandering vertoont in het expressiepatroon van dieltranscript in twee CAM-soorten, zoals weergegeven in de bovengenoemde sectie "Stomatale beweging". Een ander K. fedtschenkoi gen Kaladp0060s0460, dat codeert voor ELONGATED HYPOCOTYL5 (HY5), bleek een convergente verandering in eiwitsequentie te hebben in K. fedtschenkoi en P. paardensport (Tafel 3). Er is één aminozuurmutatie (E-naar-R) in het bZIP-domein aan het C-uiteinde van de eiwitten die worden gecodeerd door Kaladp0060s0460 en zijn P. paardensport ortholoog (PEQU_13446) in vergelijking met de HY5-eiwitten in C3- of C4-soorten (FIG. 8B). Het bZIP-domein bepaalt het DNA-bindend vermogen van HY5 als transcriptiefactor (Nijhawan et al., 2008, Plantenfysiologie, 146: 333-350) en bemiddelt ook de interactie tussen HY5 en GBF1 (Ram en Chattopadhyay, 2013, Plant signalering & Gedrag, 8: e22703). HY5 is een transcriptiefactor in de signaalroute voor blauw licht die relevant is voor de regulatie van de circadiane klok (FIG. 8A) (Li et al., 2011, Natuur Celbiologie, 13: 616-622 Hsu en Harmer, 2014, Trends in plantenwetenschap, 19: 240-249). Recent is gemeld dat HY5 van scheut naar wortel kan gaan om de bovengrondse koolstofopname van planten in het blad en de ondergrondse stikstofopname in de wortel te coördineren (Chen et al., 2016, huidige biologie, 26: 640-646). Daarom kan worden gepostuleerd dat HY5 een belangrijke rol zou kunnen spelen in zowel het circadiane ritme als de communicatie van boven naar beneden.

Voorbeeld 11 Convergente evolutie van genen die betrokken zijn bij koolhydraatactieve enzymen

Nachtelijke productie van PEP als substraat voor donkere CO2 opname vertegenwoordigt een aanzienlijke opslag van koolhydraten in CAM-planten die in evenwicht moet worden gehouden met de voorziening van koolhydraten voor groei en onderhoud (Borland et al., 2016, Huidige mening in plantenbiologie, 31: 118-124). De koolhydraatactieve enzymen (CAZyme) spelen een cruciale rol bij het reguleren van de synthese, het metabolisme en het transport van koolhydraten in levende organismen. Er zijn zes CAZyme-klassen: glycosidehydrolasen (GH's), glycosyltransferasen (GT's), polysacharidelyasen (PL's), koolhydraatesterasen (CE's), hulpactiviteiten (AA's) en koolhydraatbindende modules (CBM). Elk van de klassen bevat een dozijn tot meer dan honderd verschillende eiwitfamilies die zijn geclassificeerd op basis van sequentieovereenkomst (Lombard et al., 2014, Onderzoek naar nucleïnezuren, 42: D490-495). Deze zes klassen van CAZymes hebben verschillende functies. GH-enzymen katalyseren bijvoorbeeld de hydrolyse van glycosidebindingen, terwijl GT-enzymen de vorming van glycosidebindingen katalyseren.

Met behulp van CAZyme-domeinspecifieke verborgen markov-modellen gedefinieerd in de dbCAN-database (Yin et al., 2012, Onderzoek naar nucleïnezuren, 40: W445-W451), identificeerden de uitvinders 103 CAZyme-families, waaronder 1.134 genen in de Kalanchoë fedtschenkoi genoom. Onder deze CAZyme-genen zijn vier orthologe groepen (dwz ORTHOMCL68, ORTHOMCL93, ORTHOMCL207 en ORTHOMCL9830), die genen hebben (zoals Kaladp0550s0020.1, Kaladp0011s0363.1, Kaladp0037s0421.1 en Kaladp0055s0317.1) die behoren tot de GH10055s0317.1 Van respectievelijk GT20, GT2 en GT5 werd vastgesteld dat ze convergente veranderingen vertonen in het diel-expressiepatroon in twee CAM-soorten (Kalanchoë fedtschenkoi en Ananas comosus) in vergelijking met een C3 soort (Arabidopsis thaliana). Specifiek, in orthogroep ORTHOMCL68, de diel-transcriptexpressiepatronen van vijf Kalanchoë genen (Kaladp0034s0187.1 Kaladp0008s0205.1 Kaladp0550s0020.1 Kaladp0058s0533.1 en Kaladp0003s0101.1) en twee ananasgenen (Aco014041.1 en Aco007782.1) geclusterd in orthogroep ORTHOMCL93, de dieltranscriptexpressiepatronen van twee Kalanchoë genen (Kaladp0008s0756.1 en Kaladp0011s0363.1) en twee ananasgenen (Aco012107.1 en Aco006034.1) geclusterd in orthogroep ORTHOMCL207, de dieltranscriptexpressiepatronen van één Kalanchoë gen (Kaladp0037s0421.1) en twee ananasgenen (Aco011603.1 en Aco008242.1) samen geclusterd en in orthogroep ORTHOMCL9830, de dieltranscriptexpressiepatronen van één Kalanchoë genen (Kaladp0055s0317.1) en één ananasgenen (Aco010848.1) samen geclusterd. Interessant is dat de Kalanchoë CAZyme-genen die convergente veranderingen in het diel-expressiepatroon vertonen (bijv. Kaladp0550s0020.1, Kaladp0011s0363.1, Kaladp0037s0421.1 en Kaladp0055s0317.1) vertoonden een hogere expressie 's nachts of in de vroege ochtend. In het bijzonder werd voorspeld dat twee genen (Kaladp0011s0363.1 en Kaladp0055s0317.1) betrokken zijn bij de synthese en het metabolisme van zetmeel en sucrose. Kaladp0011s0363 codeert voor waarschijnlijke trehalosefosfaatsynthasen (TPS). Trehalose 6-P is een belangrijke suikersignalerende metaboliet en wordt verondersteld de afbraak van zetmeel te koppelen aan de vraag naar sucrose en groei (Martins et al., 2013, Plantenfysiologie, 163: 1142-1163). Kaladp0550s0020 codeert voor alkalisch-neutraal invertase (A/N Inv) dat de hydrolyse van sucrose tot glucose en fructose katalyseert, belangrijke regulatoren zijn van plantengroei en -ontwikkeling en betrokken zijn bij metabole signaleringsprocessen (Xiang et al., 2011, Journal of Experimental Botany: err069). Alles bij elkaar genomen suggereren de gegevens dat de opkomst van CAM uit C3-fotosynthese een herschikking van de transcriptie van metabole en signaalgenen vereiste die betrokken zijn bij het reguleren van de verdeling van koolhydraten tussen reserves die gereserveerd zijn om substraat voor CAM en koolhydraten te verschaffen die nodig zijn voor groei.

Voorbeeld 12 Convergente evolutie van genen die relevant zijn voor biosynthese van secundaire metaboliet

Secundair metabolisme speelt een belangrijke rol bij plant-omgevingsinteracties en planten bevatten verschillende soorten secundaire metabolieten zoals fenylpropanoïden, glucosinolaten, terpenoïden en fytoalexines/alkaloïden (Kliebenstein, 2004, Plant, cel & Omgeving, 27: 675-684). Onder de 118 K. fedtschenkoi genen die convergente veranderingen vertonen in het diel-expressiepatroon in twee CAM-soorten (en Ananas comosus) in vergelijking met een C3 soort (Arabidopsis thaliana), werd voorspeld dat drie genen (d.w.z. Kaladp0016s0071.1, Kaladp0043s0207.1, Kaladp0022s0177.1) betrokken zijn bij meerdere processen van secundair metabolisme, waaronder de biosynthese van de terpenoïde ruggengraat, de biosynthese van jasmonzuur en de biosynthese van aromatische aminozuren via de shikimaat-route. In het bijzonder codeert Kaladp0016s0071.1 3-hydroxy-3-methylglutaryl-co-enzym, een reductase 1 (HMG-CoA-reductase) dat een snelheidsbeperkend enzym is in de mevalonaat (MVA) -route voor de biosynthese van de terpenoïde backbone. Terpenen spelen een rol bij de ontwikkeling van planten en de reactie op abiotische/biotische factoren. Hoewel CAM-soorten eerder zijn beschreven als niet-stralers van terpenen, is het genoom van K. laxifora onthulde het vermogen voor terpeenmetabolisme met orthologe gencomplimenten voor de precursor mevalonzuur (MVA) -route en methyl-D-erythritol 4-fosfaat (MEP) -route, evenals negenentwintig terpeensynthasegenen van volledige lengte die de geconserveerde N- en C-terminale terpeensynthase Pfam-domeinen (respectievelijk PF01397 en PF03936). De diel-transcript-expressieprofielen van Kaladp0016s0071.1 en zijn ortholoog (Aco18529.1) in Ananas comosus waren geclusterd, los van die van zijn orthologe in Arabidopsis. Kaladp0016s0071.1 werd geclassificeerd in de co-expressiemodule MEdarkgrey, die positief gecorreleerd was met bladmonsters die 's nachts van 4.00 uur tot 6.00 uur waren verzameld. Verder werden vijf genen voor de biosynthese van terpeen (dwz Kaladp0535s0004.1, Kaladp0010s0015.1, Kaladp1277s0005.1, Kaladp0887s0001.1, Kaladp0095s0367.1) geclusterd in de co-expressiemodule MEblack, die positief gecorreleerd was met bladmonsters die tijdens de nacht werden verzameld tijd van 20.00 uur tot 02.00 uur. Deze resultaten suggereren dat de biosynthese van terpeen, althans gedeeltelijk, 's nachts plaatsvindt.

Kaladp0022s0177.1 codeert voor vetzuur-bèta-oxidatie multifunctioneel eiwit AIM1 dat betrokken is bij de laatste biosynthesestap van jasmonzuur, een belangrijke regulator van plantontwikkeling en stressreacties (Delker et al., 2007, fytochemie, 68: 1642-1650). Het werd geclassificeerd in de co-expressiemodule MEblack, die positief gecorreleerd was met bladmonsters die 's nachts van 20:00 uur tot 02:00 uur waren verzameld. De diel-transcriptexpressieprofielen van Kaladp0022s0177.1 en zijn ortholoog (Aco010785.1) in Ananas comosus waren geclusterd, los van die van zijn orthologe in Arabidopsis.

Kaladp0043s0207.1 codeert voor shikimaatkinase dat het vijfde enzym is van de shikimaat-route, katalyseert de fosforylering van de C3-hydroxylgroep van shikimaat om shikimaat 3-fosfaat op te leveren, en kan een regulerende link vormen tussen de energievereisende shikimaat-route en cellulaire energiebalans in planten (Maeda en Dudareva, 2012, Jaaroverzicht van plantenbiologie, 63: 73-105). Het werd geclassificeerd in de co-expressiemodule MEdarkgrey, die positief gecorreleerd was met bladmonsters die 's nachts van 4.00 uur tot 6.00 uur waren verzameld. De diel-transcriptexpressieprofielen van Kaladp0043s0207.1 en zijn ortholoog (Aco001151.1 en Aco002852.1) in Ananas comosus waren geclusterd, los van die van zijn orthologe in Arabidopsis.

K. fedtschenkoi heeft een relatief kleine genoomgrootte (˜ 250 Mb), lage repetitieve genomische regio's (˜ 10%), een unieke fylogenetische plaatsing tussen de plantensoorten waarvan de sequentie is bepaald (zus van zowel rosiden als asteroïden) en gemakkelijke stabiele transformatiesystemen. Daarom, met de beschikbaarheid van de genoomsequentie die in deze studie wordt gepresenteerd, K. fedtschenkoi heeft het potentieel om een ​​zeer bruikbaar model te worden voor plantevolutionair en vergelijkend genomics-onderzoek.

Er wordt verondersteld dat de eenzaadlobbigen en eudicots zijn afgeweken van een gemeenschappelijke voorouder 140-150 miljoen jaar geleden (mya) en de afgeleide meest recente gemeenschappelijke voorouder (MRCA) van eudicots is gereconstrueerd met zeven protochromosomen, die een paleohexaploïdisatiegebeurtenis hebben ondergaan (toen het afleiden van zeven voorouderlijke verdrievoudigde blokken geïdentificeerd in moderne eudicots) om een ​​​​tussenproduct van 21 chromosomen te bereiken (Salse, 2016, Huidige mening in plantenbiologie, 30: 134-142). Dienovereenkomstig kan worden aangenomen dat de 17 chromosomen in K. fedtschenkoi zijn het gevolg van een oude verdrievoudiging van de 7 protochromosomen in MRCA, met een verlies van vier chromosomen na de verdrievoudiging. Van de zeven eudicot-soorten (d.w.z. Arabidopsis thaliana, Carica papaya, Kalanchoe fedtschenkoi, Populus trichocarpa, Theobroma cacao, Vitis vinifera, Solanum lycopersicum), zijn de oude duplicatiegebeurtenissen van het hele genoom het minst duidelijk in Kalanchoë fedtschenkoi ( FIGUUR 2 ). De genoomduplicatie wordt gedomineerd door twee opeenvolgende rondes van volledige genoomduplicatie (WGD), die ouder zijn dan de meest recente WGD in P. trichocarpa maar jonger dan WGD's in andere vijf eudicot-soorten (FIG. 2). Deze twee recente WGD-gebeurtenissen hebben invloed gehad op de genen van de CAM-pathways in K. fedtschenkoi (FIG. 3), wat een uitstekende gelegenheid biedt voor het bestuderen van de evolutionaire dynamiek van gedupliceerde genen.

De genoombrede vergelijking van CAM-soorten versus niet-CAM-soorten door de uitvinders onthulde twee soorten convergente veranderingen die ten grondslag liggen aan de CAM-evolutie: convergente veranderingen in eiwitsequenties en convergente verandering in diel-genexpressiepatronen. In deze studie werden ongeveer 130 genen geïdentificeerd die convergente evolutie hebben doorgemaakt in twee uiteenlopende lijnen: eudicot en monocot, wat sterk bewijs levert dat convergente moleculaire evolutie het CAM-fenotype in deze fylogenetisch verre plantensoorten ondersteunt. CRISPR/Cas9 (Liu et al., 2016, Huidige mening in plantenbiologie, 30: 70-77) kunnen worden gebruikt voor het genereren van gemanipuleerde transgene planten met gewenste fotosynthesemogelijkheden.

Convergenties kunnen worden veroorzaakt door twee basisscenario's: 1) een mutatie of mutaties in hetzelfde gen of dezelfde genen veroorzaakten de homoplasie in de organismen 2) de causale mutatie of mutaties traden op in verschillende genen in elke lijn (Wake et al., 2011, Wetenschap, 331: 1032-1035 Washburn et al., 2016, Internationaal tijdschrift voor plantenwetenschappen, 177: 305-318). In deze studie identificeerden de uitvinders 8 genen die convergente veranderingen in eiwitsequenties vertonen, waarvan twee genen die worden gedeeld door de drie CAM-soorten (d.w.z. A. comosus, K.fedtschenkoi, P. equestris. Dit geeft aan dat CAM-convergenties voornamelijk het gevolg zijn van het tweede scenario (dwz een mutatie of mutaties zijn opgetreden in verschillende genen in elke afstamming), terwijl het eerste scenario (dwz een mutatie of mutaties in hetzelfde gen in elke afstamming) een minder belangrijke rol speelt . K. fedtschenkoi deelt de convergente mutatie in de PEPC2-eiwitsequentie met P. paardensport ( FIG. 5 ) terwijl het de convergente verandering in diel-expressiepatroon van PPCK1 deelt met A. comosus (Figuur 4). Dit resultaat suggereert dat K. fedtschenkoi heeft twee alternatieve convergente strategieën voor PEPC-gemedieerde CO2 fixatie, die worden gedeeld met twee eenzaadlobbige CAM-soorten, A. comosus en P. paardensport, respectievelijk.

De steeds groter wordende menselijke bevolking en de voorspelde opwarming van de aarde creëren grote uitdagingen voor de duurzame levering van voedsel, voer, vezels en brandstof in de komende jaren. Als een bewezen mechanisme voor het verhogen van WUE in planten, biedt CAM een groot potentieel om deze uitdagingen op te lossen en CAM-into-C3 engineering kan een haalbare strategie zijn om WUE te verbeteren in bestaande niet-CAM-gewassen voor voedsel- en biomassaproductie in droge gebieden (Yang et al., 2015, nieuwe fytoloog, 207: 491-504). De genen waarvan werd voorspeld dat ze betrokken zijn bij de convergente evolutie van CAM in deze studie, zouden uitstekende kandidaten kunnen zijn voor CAM-in-C3 Engineering. Er is geen overlap tussen de lijst met 118 genen met convergente veranderingen in transcriptie-expressiepatroon (Tabel 1) en de lijst met 8 genen met convergente veranderingen in eiwitsequentie (Tabel 3), wat leidt tot een hypothese dat dubbele selectie op zowel eiwitsequentie als cis-regulerende elementen kwamen niet voor op hetzelfde gen en herbedrading van het temporele transcriptie-expressiepatroon heeft een belangrijke rol gespeeld in de convergente evolutie van CAM. Een implicatie van deze hypothese is dat de CAM-in-C3 engineering (CAM-engineering) inspanningen moeten worden gericht op het veranderen van het temporele transcriptie-expressiepatroon van het endogene gen in de doelsoort die overeenkomt met de K. fedtschenkoi genen vermeld in Tabel 1. In sommige uitvoeringsvormen, om de eiwitsequentieveranderingen aan te brengen die nodig zijn voor CAM-in-C3-engineering, K. fedtschenkoi genen vermeld in tabel 1 kunnen worden overgedragen naar de doel-C3-soort met behulp van de klassieke Agrobacterium-gemedieerde transformatiebenadering. Als alternatief kan de PEPC2 in K. fedtschenkoi zou de noodzaak voor activering door PPCK1 kunnen omzeilen (Fig. 5B), wat leidt tot een nieuwe strategie voor CAM-in-C3-engineering op basis van overdracht K. fedtschenkoi PEPC2 in de C3 gewassen of het creëren van de "R-naar-D"-mutatie in PEPC1 zoals aangegeven in FIG. 5B.

Op CRISPR/Cas9 gebaseerde knock-in-aanpak kan worden gebruikt om de oorspronkelijke endogene promoters van de doelgenen te vervangen door tijdelijke promoters die tijdelijke expressiepatronen verlenen die vergelijkbaar zijn met die van hun orthologe genen in de CAM-soorten. Donker-induceerbare promotors zoals Din10 (Fujiki, Y. et al., 2001, Fysiol. Plant., 111, 345-352) kunnen worden gebruikt om de expressie van carboxylatie-genmodules tijdens de nacht en door licht induceerbare promotors, zoals GT1-GATA-NOS101 (Puente, P. et al., EMBO J., 15, 3732 (1996)), kan worden gebruikt om de expressie van decarboxyleringsgenmodules overdag aan te sturen.

Voorbeeld 14 Sequenties van geselecteerde genen

SEQ ID NR: 1 Gennaam: XmoPEPC2 Beschrijving: Fosfoenolpyruvaatcarboxylase 2 NCBI-registratienummer: AAM95946 Bron: x Mokara cv. 'Geel'.

SEQ ID NR: 2 Gennaam: PheqPEPC2 Beschrijving: Fosfoenolpyruvaatcarboxylase 2 NCBI-registratienummer: XP_020584551 Bron: Phalaenopsis equestris.

SEQ ID NR: 3 Gennaam: Kaladp0011s0355.1 Beschrijving: Fosfoenolpyruvaatcarboxylase 2 NCBI-registratienummer: Niet beschikbaar Bron: Kalanchoë fedtschenkoi.

SEQ ID NR: 4 Gennaam: Kaladp0048s0578.1 Beschrijving: Fosfoenolpyruvaatcarboxylase 2 NCBI-registratienummer: Niet beschikbaar Bron: Kalanchoë fedtschenkoi.

SEQ ID NR: 5 Gennaam: Kalax.0104s0064.1 Beschrijving: Fosfoenolpyruvaatcarboxylase 2 NCBI-registratienummer: Niet beschikbaar Bron: Kalanchoë laxiflora.

SEQ ID NR: 6 Gennaam: Kalax.0283s0047.1 Beschrijving: Fosfoenolpyruvaatcarboxylase 2 NCBI-registratienummer: Niet beschikbaar Bron: Kalanchoë laxiflora.

SEQ ID NR: 7 Gennaam: Kalax.0445s0035.1 Beschrijving: Fosfoenolpyruvaatcarboxylase 2 NCBI-registratienummer: Niet beschikbaar Bron: Kalanchoë laxiflora.

SEQ ID NR: 8 Gennaam: Kalax.0510s0003.1 Beschrijving: Fosfoenolpyruvaatcarboxylase 2 NCBI-registratienummer: Niet beschikbaar Bron: Kalanchoë laxiflora.

SEQ ID NR: 9 Gennaam: ZemaPEPC2 Beschrijving: Fosfoenolpyruvaatcarboxylase 2 NCBI-registratienummer: PWZ12751.1 Bron: Zea mays.

SEQ ID NR: 10 Gennaam: PotrPEPC Beschrijving: Fosfoenolpyruvaatcarboxylase NCBI-registratienummer: XP_024436919.1 Bron: Populus trichocarpa.

SEQ ID NR: 11 Gennaam: BrolPEPC1 Beschrijving: Fosfoenolpyruvaatcarboxylase 1 NCBI-registratienummer: XP_013628861.1 Bron: Brassica oleracea.

SEQ ID NR: 12 Gennaam: BrraPEPC1 Beschrijving: Fosfoenolpyruvaatcarboxylase 1 NCBI-registratienummer: XP_009106983.1 Bron: Brassica rapa.

SEQ ID NR: 13 Gennaam: MadoPEPC2 Beschrijving: Fosfoenolpyruvaatcarboxylase 2 NCBI-registratienummer: XP_008362419.1 Bron: Malus domestica.

SEQ ID NR: 14 Gennaam: GlmaPEPC2 Beschrijving: Fosfoenolpyruvaatcarboxylase 2 NCBI-registratienummer: XP_003527347.1 Bron: Glycine max.

SEQ ID NR: 15 Gennaam: Kaladp0059s0286.1 Beschrijving: Hitteschok 40 kDa eiwit NCBI-toegangsnummer: Niet beschikbaar Bron: Kalanchoë fedtschenkoi.

SEQ ID NR: 16 Gennaam: Aco006149.1 Beschrijving: Hitteschok 40 kDa eiwit NCBI-registratienummer: Niet beschikbaar Bron: Ananas comosus.

SEQ ID NR: 17 Gennaam: Kaladp0073s0051.1 Beschrijving: Hitteschok 60 kDa eiwit NCBI-toegangsnummer: Niet beschikbaar Bron: Kalanchoë fedtschenkoi.

SEQ ID NR: 18 Gennaam: Aco010414.1 Beschrijving: Hitteschok 60 kDa eiwit NCBI-toegangsnummer: Niet beschikbaar Bron: Ananas comosus.

SEQ ID NR: 19 Gennaam: Aco010207.1 Beschrijving: Hitteschok 60 kDa eiwit NCBI-toegangsnummer: Niet beschikbaar Bron: Ananas comosus.

SEQ ID NR: 20 Gennaam: Aco015991.1 Beschrijving: Hitteschok 60 kDa eiwit NCBI-toegangsnummer: Niet beschikbaar Bron: Ananas comosus.

SEQ ID NR: 21 Gennaam: Kaladp0060s0296.1 Beschrijving: Hitteschok 70 kDa eiwit NCBI-toegangsnummer: Niet beschikbaar Bron: Kalanchoë fedtschenkoi.

SEQ ID NR: 22 Gennaam: Kaladp0039s0620.1 Beschrijving: Hitteschok 70 kDa eiwit NCBI-toegangsnummer: Niet beschikbaar Bron: Kalanchoë fedtschenkoi.

SEQ ID NR: 23 Gennaam: Aco031458.1 Beschrijving: Hitteschok 70 kDa eiwit NCBI-toegangsnummer: Niet beschikbaar Bron: Ananas comosus.

SEQ ID NO: 24: aminozuren 489-538 van Kaladp0048s0578.1 (SEQ ID NO: 4).

SEQ ID NO: 25: aminozuren 489-538 van Kaladp0011s0355.1 (SEQ ID NO: 3).

SEQ ID NO: 26: aminozuren 489-538 van Kalax.0104s0064.1 (SEQ ID NO: 5).

SEQ ID NO: 27: aminozuren 489-538 van Kalax.0283s0047.1 (SEQ ID NO: 6).

SEQ ID NO: 28: aminozuren 489-538 van Kalax.0445s0035.1 (SEQ ID NO: 7).

SEQ ID NO: 29: aminozuren 489-538 van Kalax.0510s0003.1 (SEQ ID NO: 8).

SEQ ID NO: 30: aminozuren 489-538 van AAM95946.1 (SEQ ID NO: 1).

SEQ ID NO: 31: aminozuren 489-538 van XP_020584551.1 (SEQ ID NO: 2).

SEQ ID NO: 32: aminozuren 489-538 van PWZ12751.1 (SEQ ID NO: 9).

SEQ ID NR: 33: aminozuren 489-538 van XP_024436919.1 (SEQ ID NR: 10).

SEQ ID NR: 34: aminozuren 489-538 van XP_013628861.1 (SEQ ID NR: 11).

SEQ ID NO: 35: aminozuren 489-538 van XP_009106983.1 (SEQ ID NO: 12).

SEQ ID NO: 36: aminozuren 489-538 van XP_008362419.1 (SEQ ID NO: 13).

SEQ ID NO: 37: aminozuren 489-538 van XP_003527347.1 (SEQ ID NO: 14).


Invoering

De productie van stikstofmonoxide (NO) door neuronaal NO-synthase (nNOS) is betrokken bij een overvloed aan fysiopathologische processen waarbij het neuromusculaire apparaat betrokken is. Omdat NO een pleiotroop molecuul is, kan het verschillende signaalroutes uitlokken die nodig zijn voor correcte spiercontractie (56) en hypertrofie veroorzaakt door overbelasting (54), of, paradoxaal genoeg, voor het mediëren van atrofie (21, 56, 61). Met betrekking tot dit laatste probleem is het nog steeds een kwestie van discussie over hoe NO de neuromusculaire functie negatief beïnvloedt.

Naast het goed gedocumenteerde vermogen om heem-ijzer te binden (Fe-nitrosylering) (38) kan NO reageren met reactieve zuurstofsoorten (ROS), waardoor gevaarlijkere reactieve stikstofsoorten ontstaan ​​(bijv., peroxynitriet, ONOO − ), dat de eiwitstructuur en -functie kan beïnvloeden (21). Tyrosinenitratie is een van de belangrijkste modificaties die optreden onder omstandigheden van overproductie van NO, en het hangt meestal af van het vermogen van ONOO − om de toevoeging van een nitrogroep (NO2) aan de aromatische ring in tyrosineresiduen (7, 26). De accumulatie van eiwitnitrotyrosines wordt vaak gebruikt als een pathologische marker van eiwitten die worden blootgesteld aan overmatige nitroxidatieve stress (6, 55) en is gedetecteerd bij perifere neuropathieën, wat leidt tot spieratrofie, zoals die gerelateerd aan ontstekingstoestanden (32), diabetes ( 48), of amyotrofische laterale sclerose (5, 45). Bovendien is gemeld dat verouderingsgerelateerde sarcopenie en cachexie, evenals genetisch gebaseerde dystrofieën, geassocieerd zijn met verhoogde nitrotyrosinespiegels (2, 18, 41). In rattenmodellen van door onbruik of denervatie geïnduceerde atrofie is aangetoond dat nNOS zich losmaakt van het dystrofine-glycoproteïnecomplex dat is geassocieerd met het sarcolemmale membraan en zich herverdeelt naar het cytosol, waar het NO produceert en Forkhead box O (FoxO) transcriptiefactoren activeert ( 61). Hoewel het precieze mechanisme van NO-gemedieerde FoxO-activering nog moet worden ontrafeld, is voorgesteld dat het zou kunnen afhangen van nitrering van de remmer van NF-KB-kinase β (IKKβ) (61). Meer recentelijk is ook aangetoond dat nNOS-dislocatie een krachtvermindering veroorzaakt die typisch is voor dystrofine-null (mdx) muismodellen door middel van nog steeds niet opgehelderde mechanismen die vermoedelijk betrekking hebben op tyrosinenitratie en ook: S-nitrosylering (34).

De schadelijke rol van NO-overproductie in de neuromusculaire functie is goed gedocumenteerd, maar vanwege de aard van het gebruikte experimentele systeem is het nog steeds een kwestie van discussie of dit voornamelijk afhangt van nitroxidatieve schade of S-nitrosylering. Hier bieden we de eerste in vivo bewijs dat de genetische ablatie van GSNOR, dat uitsluitend de nitrosothiolreductie beïnvloedt zonder de nitrotyrosinespiegels te veranderen, resulteert in een klinisch relevant neuromusculair fenotype dat lijkt op neuropathische pijn-geassocieerde spieratrofie. Onze resultaten geven aan dat S-nitrosoglutathionreductase (GSNOR) en nitrosatieve stress kunnen electieve doelwitten zijn voor op denitrosylerende middelen gebaseerde therapieën.

S-nitrosylering bestaat uit de covalente, maar omkeerbare toevoeging van een NO-rest aan reactieve sulfhydrylresten van laag- (peptiden en aminozuren) en hoogmoleculaire moleculen (eiwitten) om S-nitrosothiolderivaten (SNO's) (15). De S-nitrosothiol steady-state niveau hangt af van het fijne evenwicht tussen NO-productie en SNO's-reductie. Deze laatste reactie wordt gekatalyseerd door denitrosylerende enzymen, waarvan de belangrijkste de NADH-afhankelijke S-nitrosoglutathion (GSNO)-reductase (GSNOR) (9, 21). GSNOR is een evolutionair geconserveerd en algemeen tot expressie gebracht enzym dat, door het laagmoleculaire nitrosothiol GSNO te verminderen, indirect de concentratie van eiwit-SNO's (PSNO's) verlaagt (35). Zoals eerder vermeld, S- Er is voorgesteld dat nitrosylering betrokken is bij spierveranderingen die typisch zijn voor neuromusculaire aandoeningen (13, 59). Vooral, S-nitrosylering van proteïnekinase B (66) en ryanodinereceptor 1 (RyR1) (3, 8, 57) is waargenomen bij verouderingsgerelateerde cachexie, tijdens langdurige inspanning en bij spierdystrofie. Bovendien is gesuggereerd dat NO-onbalans en toename van PSNO-niveaus ook optreden bij atrofie-gerelateerde pathologieën, zoals kanker en diabetes (28, 61). Deze veranderingen, die vaak worden geassocieerd met mitochondriale fragmentatie en disfunctie (52), veroorzaken vermoeidheid en spierpijn die typisch zijn voor atrofische toestanden van skeletspieren. Interessant genoeg is aangetoond dat N-acetylcysteïne (NAC), een bekend denitrosylerend middel, vermindert neuropathische pijn en verbetert de spierprestaties (10, 21, 51), wat suggereert dat S-nitrosylering zou sterk betrokken kunnen zijn bij signaaltransductie die ten grondslag ligt aan neuromusculaire homeostase. In overeenstemming hiermee is aangetoond dat farmacologische remming (61) of genetische ablatie van nNOS, maar niet van de induceerbare vorm induceerbare NOS (iNOS) (33, 34), pathologische fenotypes terugdraait. Deze benaderingen hebben het echter niet mogelijk gemaakt te onderscheiden of de belangrijkste mediator van neuropathie en myopathie veroorzaakt door NO-overproductie tyrosinenitratie of cysteïne was. S-nitrosylering.

In deze studie hebben we door middel van een GSNOR-null (GSNOR-KO) muismodel de algehele impact van GSNOR-deficiëntie en de resulterende S-nitrosylering in neuromusculaire homeostase, waaruit blijkt dat: S-nitosylering zou een algemene moleculaire signatuur kunnen zijn van neuropathische en myopathische toestanden.


7.7C: Eiwitvouwing, -modificatie en targeting - Biologie

Het artikel geeft een samenvatting van eiwitmodificaties uit de UniProt-database en een overzicht van onderzoeksmethoden voor belangrijke eiwitmodificaties: fosforylering, acetylering en methylering, ubiquitinatie, glycosylering en sumoylering.

Het menselijke proteoom bestaat uit significant meer functionele polypeptiden dan de verzameling genen in het genoom, gedeeltelijk als gevolg van co- en post-translationele eiwitmodificaties (Fig. 1A). Een van de belangrijke gebieden van proteomisch onderzoek is het identificeren van die eiwitten die post-translationeel gemodificeerd zijn en hun modificatieplaatsen en om de functie van de modificaties en de interactie van het gemodificeerde eiwit binnen een functioneel cellulair netwerk te karakteriseren.

De samengestelde SWISS-Prot Protein Knowledgebase bevat 649 unieke modificaties [6], per 8 augustus 2019 (UniProt Release 2019_07). RESID-database [7] door Dr. John S. Garavelli biedt ook uitgebreide informatie voor elke wijziging. Tabel 1 geeft een overzicht van de statistieken met betrekking tot eiwitmodificaties over menselijke eiwitten in de UniProt-databases vanaf 8 augustus 2019, gebaseerd op het browsen op trefwoorden op https://www.uniprot.org/keywords/KW-9991.

Wijziging Swiss-Prot
Fosforylering 48300
Glycosylering 31828
Acetylering 18366
Ubiquitylering / Sumoylering 10424
methylering 8486
Palmitoylering 5397
chinon 4658
Amidatie 3689
Myristoylering 1750
Pyrrolidoncarbonzuur 1481
Hydroxylering 1427
Fosforantetheïne 1294
prenylatie 1194
GPI-verankering 1188
Oxidatie 634
ADP-ribosylering 561
sulfatering 548
S-nitrosylering 517
Citrullinatie 292
Nitratie 242
Gamma-carboxyglutaminezuur 279
Formylering 121
Hyposine 109
Topaquinon / TPQ 57
bromering 56
Lysine-topaquinon / LTQ 27
Tryptofaan tryptofylquinon / TTQ 6
jodium 5
Cysteïne tryptofylquinon / CTQ4

Er zijn de afgelopen decennia meerdere methoden ontwikkeld om eiwitmodificaties te testen. Hier richten we ons op de massaspectrometrie als een algemene benadering voor het detecteren van eiwitmodificaties en specifieke methoden voor fosforylering, ubiquitinatie, glycosylering en sumoylatie, evenals voor het analyseren van histonacetylering en methylering in de context van chromatine-remodellering (tabel 2 en figuur 1B ). Gedetailleerde protocollen worden niet gedekt. Discussie over citrullinatie, met behulp van histon-citrullinatie als voorbeeld, is te vinden bij de recensie over histon-modificaties. Eiwitcitrullinatie kan ook worden onderzocht door plaatsspecifieke incorporatie van citrulline in eiwitten met een gemodificeerd leucyl-tRNA-synthetase-tRNA-paar [8]. De biotine-switch-techniek kan worden gebruikt om de mate van S-nitrosylering van eiwit van belang te bepalen [9].

Wijziging Functie Assay
FosforyleringIntracellulaire signaleringMassaspectrometrie
Radiometrie
Western blotting
Phos-tag elektroforese
ubiquitinatieEiwitafbraakMassaspectrometrie
In vitro ubiquitinatie-assays
Western blotting
BUIZEN
Acetylering en methyleringchromatine-regulatie
Transcriptieregulatie
Massaspectrometrie
CHIP
CHIP-op-CHIP
GlycosyleringExtracellulaire signaleringMassaspectrometrie
HPLC
Elektroforese
SUMOylatieIntracellulair transport
Transcriptieregulatie
apoptose
Eiwit stabiliteit
Stress reactie
Regeling van de celcyclus
Massaspectrometrie
SUBES
PRISMA

Een belangrijke voorlopige benadering voor het identificeren van nieuwe modificatiesites is de in silico-analyse. Computerprogramma's die vermeende modificatiesites identificeren op basis van sequentie, zijn uitgebreid gebruikt en vallen buiten het bestek van deze beoordeling. Zie Liu en Li, 2011 [10] voor een uitstekend overzicht van computerprogramma's.

In de afgelopen 20 jaar is massaspectrometrische analyse een essentieel hulpmiddel geworden bij het bepalen van de soorten en plaatsen van eiwitmodificaties. Massaspectrometrische analyse kan worden uitgevoerd op zowel gezuiverde eiwitten als een mengsel van eiwitten, bijvoorbeeld cellysaten [11, 12] of weefselextracten [13, 14].

Een massaspectrometer genereert gasfase-ionen uit een monster, scheidt ze volgens hun massa-tot-ladingverhouding (m/z) en genereert een record van hun overvloed. Massaspectrometrie kan worden gebruikt voor de bepaling van het molecuulgewicht van peptiden en eiwitten, voor het bepalen van de aminozuursequentie van peptiden en voor de detectie van post-translationele modificaties, evenals de relatieve kwantificering van peptiden en eiwitten. Deze methode kan niet worden gebruikt voor absolute kwantificering.

Voor de voorbereiding van een monster voor massaspectrometrische analyse wordt het eiwit of lysaat gedigereerd tot kleine peptidefragmenten met behulp van trypsine of, meer recentelijk, andere proteasen [15]. De fragmenten worden vervolgens verdampt en geanalyseerd om hun m/z-waarde te bepalen. Omdat de plaatsen van restrictiedigestie bekend zijn, bepaalt een computerprogramma vervolgens de unieke aminozuursequentie van elk peptide op basis van massa. Het molecuulgewicht en de lading van een groep zoals een fosfaatgroep zijn ook bekend, de fosforylering van specifieke aminozuren in een peptidefragment kan ook worden bepaald.

Een verteerd eiwitmonster kan worden geanalyseerd door matrix-assisted laser desorptie/ionisatie (MALDI) peptide mapping of nanoelectrospray massaspectrometer. Het gebruik van deze methoden kan echter leiden tot onvolledige dekking, waarbij sommige peptiden duidelijk zichtbaar zijn en andere helemaal niet. Dit is vaak een groot probleem bij het analyseren van complexe mengsels, en voor gemodificeerde peptiden en bij de analyse van post-translationele modificaties worden peptiden eerst gescheiden door omgekeerde-fasechromatografie, gevolgd door fractieverzameling en analyse door massaspectrometrie (een methode die bekend staat als LC /MS) (Fig 2B) [16]. Om de aard van de peptide-modificatie nauwkeuriger te bepalen, worden vaak tandem-massaspectrometrie-experimenten (MS/MS) uitgevoerd (Fig. 2A).Na de eerste MS-stap botsen de peptide-ionen met een inert gas, wat leidt tot verdere fragmentatie. Deze peptidefragmenten worden vervolgens geanalyseerd in de tweede MS-stap [17]. Sommige gemodificeerde peptiden zullen tijdens dit proces intact blijven, waardoor een fragmentatiepatroon wordt gegenereerd dat vergelijkbaar is met het niet-gemodificeerde peptide, terwijl andere aanzienlijk zullen fragmenteren, waardoor een patroon ontstaat dat meer informatie kan geven over de aard en locatie van de gemodificeerde aminozuren. Liu Y et al identificeerden bijvoorbeeld demethylering en methylering op verschillende residuen van ALKBH5 met nano-ultra-performance vloeistofchromatografie-elektrospray-inonisatie tandem massaspectrometrie met behulp van Q-Exactive MS van Thermo Fisher Scientific, na immunoprecipitatie en SDS-PAGE-scheiding [18] . Hoxhaj G et al. gebruikten LC-MS/MS om de plaatsen op NAD-kinase gefosforyleerd door akt-kinase [19] te bepalen. Black MH et al. gebruikten LC-MS/MS om geglutamyleerde peptiden in SdeA te identificeren door de Legionella-meta-effector SidJ [20]. Bhogaraju S et al. voerden verdere analyse uit op de glutamylering van SdeA [21].

Naast het gebruik om de modificatiestatus van een enkel eiwit te bepalen, is massaspectrometrie gebruikt om uitgebreide datasets te genereren van eiwitten die een specifieke modificatie dragen [22]. Enkele voorbeelden zijn Asn-deamidering [13], fosforylering [23], sumoylatie [24], ubiquitinatie [25], niet-histon [26] en histonmethylering [27], glycosylering [28] of geoxideerde eiwitten [29-32]. Deze analyse omvat meestal affiniteitsselectie voorafgaand aan de massaspectrometrische analyse [33]. Dergelijke technieken worden gebruikt om 'sub-proteomen' te definiëren terwijl de activeringsstatus van volledige signaalnetwerken bij kanker [34], neurodegeneratieve ziekten [35, 36] of interacties tussen pathogeen en gastheer [37, 38] wordt geanalyseerd.

Massaspectrometrische analyse is echter kostbaar en vereist specifieke apparatuur en training. Omdat er vaak meer kwantitatieve gegevens nodig zijn, worden andere biochemische methoden gebruikt in combinatie met massaspectrometrie om post-translationele modificaties te analyseren. Bovendien heeft de op MS gebaseerde analyse van PTM's zijn eigen kanttekeningen die tot verkeerde conclusies kunnen leiden. Oudere [11], [12] en recentere [39-41] uitgebreide overzichten van de meervoudige MS-methoden, veelvoorkomende fouten en suggesties voor nauwkeurige gegevensverzameling en computationele analyse zijn beschikbaar [42, 43].

Fosforylering, of de toevoeging van een fosfaatgroep aan serine-, threonine- of tyrosineresiduen, is een van de meest voorkomende vormen van eiwitmodificatie (Fig. 3A). Eiwitfosforylering speelt een belangrijke rol in intracellulaire signaalcascades en is omkeerbaar, waardoor het signaal wordt verfijnd [44]. Er worden verschillende in vivo en in vitro methoden gebruikt om de eiwitfosforylatiestatus te beoordelen, om de fosforylering van een specifiek aminozuur te beoordelen en om vast te stellen of een specifiek kinase (of fosfatase) een eiwit in kwestie wijzigt. Naast de hieronder besproken methoden, kan Pro-Q® Diamond fosfoproteïnegelkleuring fosfoproteïnen direct labelen op een 2D PAGE-gel, zoals in het geval van SY5Y-cellen die zijn behandeld met Ab42-peptiden [45].

Radiometrische kinasereacties met 32P-gamma-ATP kunnen worden gebruikt om de fosforyleringsstatus in vitro te bepalen [46]. Dit is ook de gouden standaard voor het beoordelen van de rol van specifieke kinasen. Gezuiverd doeleiwit, kinase en 32P-gamma-ATP worden in een reactiebuffer geïncubeerd. De reactieoplossing wordt vervolgens door een filter geleid om eiwit te binden maar niet-gebonden ATP weg te wassen, en het niveau van fosforylering (radio-isotoop vastgehouden op een filter) wordt gedetecteerd door een scintillatieteller. Als alternatief kan de reactie worden opgelost door SDS-PAGE en gevisualiseerd door blootstelling aan röntgenfilm [47]. Deze methode is minder kwantitatief maar kan het molecuulgewicht van het gefosforyleerde eiwit bevestigen.

Evenzo kan de reactie fosfatase omvatten in plaats van het kinase om te bepalen of een gefosforyleerd eiwit een substraat is van een specifieke fosfatase.

Om fosforylering in vivo te testen, is radioactieve pulslabeling gebruikt [48]. Cellen worden gekweekt in aanwezigheid van 32P-orthofosfaat. Het eiwit van belang wordt vervolgens immunologisch neergeslagen met een specifiek antilichaam en de vastgehouden radio-isotoop wordt gekwantificeerd door scintillatieteller of opgelost op een SDS-PAGE en blootgesteld aan röntgenfilm. Deze methode kan worden gebruikt om fosforylering onder verschillende fysiologische omstandigheden te testen. Bovendien kan deze methode, in combinatie met een eiwit-knock-down-stap, ook worden gebruikt om een ​​specifiek kinase of fosfatase te betrekken bij de modificatiestatus van het doeleiwit.

Er zijn twee categorieën fosfo-specifieke antilichamen. Eén categorie is het generieke fosfotyrosine-, fosfoserine- en fosfothreonine-antilichaam, dat zal binden aan alle fosfotyrosine-, fosfo-serine- en fosfo-threonine-resten, ongeacht de naburige aminozuurresten. De tweede categorie omvat de antilichamen (of andere affiniteitsreagentia [49] ) tegen fosfo-specifieke aminozuurepitopen (zie een samenvatting van fosfo-specifieke antilichamen in de Labome-productdatabase).

Na identificatie van een (vermeende) fosforyleringsplaats door een in silico-methode of door massaspectrometrie, kunnen in de handel verkrijgbare antilichamen voor de algemene klasse van fosforyleringsplaatsen worden gebruikt in combinatie met een immunoprecipitatiestap om te bepalen of het eiwit van belang is gefosforyleerd op een specifieke type site (bijvoorbeeld een canonieke cycline/cdk-site) [50]. Antilichamen die zijn gegenereerd tegen een specifiek gefosforyleerd aminozuur, zoals fosfotyrosine, kunnen ook worden gebruikt (Figuur 3B). Dit kan worden gevolgd door het genereren van een fosfo-specifiek antilichaam tegen het specifieke epitoop en het testen van fosforylering door eenvoudige Western-blotting. Om een ​​groot aantal monsters te analyseren, kan een ELISA worden uitgevoerd, waarbij het substraat wordt opgevangen door het membraan en gedetecteerd door het fosfo-specifieke antilichaam [51]. Kenner LR et al bevestigden fosforylering van humaan eIF2alpha door middel van western bloting met een eIF2alpha S51 fosforylatie-specifiek antilichaam van Cell Signaling (cat# 9721) [52]. Het specificeren van fosforylatie-specifieke antilichamen wordt echter vaak in twijfel getrokken [53].

Anti-fosfoproteïne-antilichaam-microarrays zijn krachtige hulpmiddelen voor het onderzoeken van door eiwitfosforylering gemedieerde signaleringssystemen. Deze microarrays vergemakkelijken de semi-kwantitatieve meting van de fosforyleringsstatus van eiwitkinasen en hun substraten. Een gedetailleerd protocol wordt hier besproken [54].

Phos-tag is een selectief fosfaatbindend molecuul, 1,3-bis'91bis(pyridin-2-ylmethyl) amino'93propaan-2-olato dizink(II), ontwikkeld voor op MS gebaseerde proteomics [55], en kan worden gebruikt voor de scheiding van gefosforyleerde eiwitten in acrylamide- en agarosegels [56]. Door gebruik te maken van Phos-tag SDS-PAGE kunnen verschillende gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde eiwitsoorten worden gevisualiseerd vanwege hun merkbare mobiliteitsverschuivingen [57-59]. De methode is gemakkelijk te gebruiken omdat deze lijkt op de klassieke SDS-PAGE-analyse. Gebiotinyleerde Phos-tag kan ook worden gebruikt om Western-blot-analyse van monsters te vergemakkelijken [60, 61]. Protocollen voor Phos-tag SDS-PAGE met ofwel alkalische pH [62] of neutrale pH [63] buffersystemen zijn nu beschikbaar. Een overzicht van recente vorderingen van de op Phos-tag gebaseerde methodologieën werd gepubliceerd in 2015 [62]. Kenner LR et al bevestigden fosforylering van humaan eIF2alpha via Phos-Tag SDS-PAGE [52].

Behalve dat het nuttige hulpmiddelen zijn voor de identificatie van fosfoproteïnen, bleek de Phos-tag SDS-PAGE-techniek, in combinatie met andere niet-denaturerende gelelektroforesemethoden, krachtige methoden voor de karakterisering van de fosforyleringsafhankelijke activiteit van bepaalde enzymen. Meisrimler et al. combineerden bijvoorbeeld de Phos-tag-technologie met tweedimensionale elektroforese waarbij ofwel niet-reducerende iso-elektrische focussering (IEF) PAGE of niet-evenwichtige pH-gelelektroforese (NEPHGE) werd gebruikt in de eerste dimensie en hoge resolutie clear native elektroforese (hrCNE) in de tweede dimensie, om fosforyleringsafhankelijke veranderingen in enzymactiviteit te onderzoeken [64]. De auteurs bespraken in detail de voor- en nadelen van deze nieuwe technieken [64]. Kitchen P et al. gebruikten Phos-tag-reagens van NARD Chemicals, Kobe City, Japan om de fosforylering van AQP4 te analyseren [65].

Eiwitubiquitinatie, of de covalente hechting van ubiquitine aan doeleiwitten, is het best bestudeerd in de context van eiwitafbraak. Het is bijvoorbeeld aangetoond dat de door ubiquitinatie gemedieerde eiwitomzetting een essentiële rol speelt bij het aansturen van de celcyclus [66]. Recent onderzoek heeft echter ook een rol onthuld voor ubiquitinatie in meerdere eiwitdegradatie-onafhankelijke intracellulaire signaalroutes.

Als voorbeeld kan hier een protocol worden gevonden voor de detectie van lineaire polyubiquitineketens door een anti-lineair ubiquitine-antilichaam dat door Sasaki et al in hun studies wordt gebruikt [67]. Voor- en nadelen van de veelgebruikte op immunoblotting gebaseerde methoden, evenals de suggestie voor hun optimalisatie, worden benadrukt in een recent overzicht [68]. De beoordeling omvat aanbevelingen over monstervoorbereiding, scheiding, detectie en identificatie van ubiquitineketens, evenals over de analyse van de ubiquitineketentopologie.

Als alternatief kunnen ubiquitinated eiwitten worden gedetecteerd door affiniteitszuivering. Twee van dergelijke benaderingen worden steeds populairder: ligase trapping [69], en de TUBEs (Tandem Ubiquitin Binding Entity) techniek [70]. Bij ligase-trapping worden ubiquitine-ligasen gefuseerd aan een polyubiquitine-bindend domein, wat de isolatie van specifieke ubiquitine-substraten mogelijk maakt die verder kunnen worden geanalyseerd met massaspectrometrie of western blotting. Evenzo worden TUBE's, die gemanipuleerd gelabelde sequenties zijn van vier ubiquitine-bindende domeinen die aan elkaar zijn gekoppeld via flexibele likers, gebruikt om polyubiquitinated eiwitten uit celextracten affiniteit te zuiveren [70, 71],]. De TUBE's beschermen het ubiquitinated eiwit tegen afbraak en de-ubiquitinatie, waardoor de identificatie van ubiquitination-target-sites wordt vergemakkelijkt, bijvoorbeeld als specifieke substraten van ubiquitine-ligasen [72]. TUBE's voor eiwitzuivering (agarose-TUBE's, GST- en His6-TUBE's), immunohistochemie (fluorescerende TUBE's) of Far Western (ligand) blotting (biotine-TUBE's) zijn nu beschikbaar voor onderzoekers van LifeSciences.

De diversiteit van door ubiquitine gemedieerde signalering hangt af van de meerdere manieren waarop een doeleiwit kan worden gemodificeerd door ubiquitine - monoubiquitinatie op een of meerdere plaatsen en polyubiquitinatie via verschillende mogelijke koppelingen [73]. Substraateiwitten zijn gekoppeld aan ubiquitine via zeven verschillende ubiquitine-lysineresiduen (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48 en Lys63). De vorming van een polyubiquitineketen vindt plaats wanneer een lysineresidu van ubiquitine wordt gekoppeld aan de carboxy-terminale glycine van een ander ubiquitine. Het functionele resultaat van polyubiquitinatie hangt dus af van het lysineresidu in ubiquitine dat wordt gebruikt. Dit wordt op zijn beurt bepaald door de specifieke E2 (ubiquitine-conjugerende enzym) of E3 (ubiquitine-ligase), maar niet door de El (ubiquitine-activerende enzym) (Fig. 4A). De generatie van polyubiquitineketens met specifieke lysinebindingen creëert een uniek bindingsoppervlak voor de gespecialiseerde ubiquitine-bindende domeinen van interagerende eiwitten.

Methoden voor het testen van ubiquitinatie kunnen de ubiquitinatie bij specifieke lysineresiduen onthullen of de rol van specifieke E3's (of E2's) bij de modificatie van het doeleiwit bevestigen. De meest ongecompliceerde en algemeen aanvaarde manier om ubiquitinatie in vivo te beoordelen, is door het vermeende alomtegenwoordige eiwit te immunoprecipiteren en het te onderwerpen aan SDS-PAGE/Western-blotting om de laddering te observeren die kenmerkend is voor alomtegenwoordige eiwitten. Het doeleiwit, E3-ligase en zelfs ubiquitine worden vaak ectopisch tot expressie gebracht om de effecten van mutatie te bepalen (Fig. 4B). Remmers van proteasomale afbraak, zoals MG132, worden vaak gebruikt om de in vivo K48 (degradatie-targeting) ubiquitinatie van doeleiwitten te analyseren.

In vitro ubiquitinatie-assays (waar het doeleiwit, ubiquitine en de E1, E2 en E3 worden geleverd) kunnen worden gebruikt in combinatie met SDS-PAGE gevolgd door Western-blotting om de ubiquitinatie van het betreffende eiwit directer te bepalen. Mutaties van lysineresiduen in het betreffende eiwit kunnen dienen om de plaats van ubiquitineaanhechting te bepalen. Omgekeerd, in het geval van poly-ubiquitinatie, kan het gebruik van ubiquitine met mutaties van specifieke lysineresiduen informatie verschaffen over de specifieke ubiquitine-koppeling. Om nieuwe ubiquitinated eiwitten te ontdekken, kan ubiquitine-gemedieerde eiwitzuivering gevolgd door massaspectrometrische analyse worden uitgevoerd [74].

Epigenetische modificaties (zoals fosforylering, ubiquitinatie, acetylering en methylering) van de geconserveerde kernhistonen H2A, H2B, H3 en H4 spelen een belangrijke regulerende rol bij genexpressie [75]. Acetylering en methylering van lysineresiduen op de N-terminale histonstaarten mediëren bijvoorbeeld de vorming van chromatinedomeinen, zoals euchromatine en heterochromatine, en brengen zo direct gen-uitschakeling tot stand. Het bepalen van de modificatiestatus van kernhistonen is een belangrijke techniek geweest bij het analyseren van de regulatie van genexpressie [76]. Gedetailleerde histonmodificatie onderzoeksmethoden worden hier besproken.

Acetylering en methylering van andere eiwitten zijn ook bestudeerd, bijvoorbeeld K49-acetylering van bèta-catenine [77] of α-tubuline-acetylering [78]. M Oginuma et al. detecteerden het geacetyleerde bèta-catenine in Western-blots met behulp van een specifiek antilichaam (9534 van Cell Signaling Technology) [77].

Uitgebreide verzamelingen antilichamen zijn in de handel verkrijgbaar voor alle bekende histonmodificatiesites. Met behulp van deze antilichamen kan een experiment met chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) worden uitgevoerd [79]. In het kort wordt het cel- of weefselmonster behandeld met een verknopingsmiddel zoals formaldehyde om histonen te verknopen met chromatine. Het chromatine wordt gesoniceerd of behandeld met een nuclease om korte DNA-fragmenten te genereren. Een immunoprecipitatie (IP) stap wordt vervolgens uitgevoerd met behulp van een antilichaam tegen de gewenste histonmodificatie. Als de vermeende histonmodificatieplaats binnen een gen of promotor bekend is, kan PCR worden gebruikt om de aanwezigheid van de betreffende modificatie op een bepaalde plaats te kwantificeren. (Afb. 5A). Als alternatief kan deze methode worden gebruikt om de histonmodificatieplaats binnen het algemene promotorgebied te identificeren, evenals de kinetiek van histonmodificatie op die plaats (Fig 5B).

Als de plaats van histon-modificatie niet bekend is, kan een ChIP-on-chip worden uitgevoerd om de regio's in het genoom te identificeren die specifieke histon-modificaties dragen [80]. In deze opstelling zijn de DNA-fragmenten in de IP-ingang en de IP zelf gelabeld met verschillende fluoroforen. De monsters worden vervolgens over een chip met DNA-probes geleid en de verrijking van een bepaald DNA-fragment in de IP-fractie correleert met de lokalisatie van het betreffende gemodificeerde histon op een bepaalde plaats in het genoom.

ChIP- en ChIP-on-chip-experimenten kunnen informatie verschaffen over histonmodificatie bij een promotor van belang, de kinetiek van verandering in de modificatiestatus, evenals de locatie van histonmodificaties met betrekking tot een gen of regulerende sequentie, of door het hele genoom . Deze epigenetische veranderingen kunnen licht werpen op zowel genregulatie bij normaal functioneren als de ontregeling die optreedt bij ziekte.

Glycosylering, of de aanhechting van een van een groot aantal glycaangroepen, zal naar verwachting plaatsvinden in bijna 50% van alle eiwitten en speelt een rol in biologische processen die zo divers zijn als embryonale ontwikkeling, celdeling en regulering van de eiwitstructuur. De glycosyleringsstatus van een breed scala aan eiwitten verandert aanzienlijk tijdens normale fysiologische gebeurtenissen en bij ziekten (bijvoorbeeld ontsteking, sepsis en kanker). Zo kunnen assays voor eiwitglycosylering informatief zijn bij onderzoek dat zowel op ziekteprognose als op therapeutische doeleinden is gericht.

De twee belangrijkste vormen van eiwitglycosylering zijn N-glycosylering (waarbij het glycaan is gehecht aan een asparagine) en O-glycosylering (waarbij het glycan is bevestigd aan een serine of threonine). Glycosylering verschilt van eiwitmodificaties die hierboven zijn besproken doordat een groot aantal modificerende glycanen is beschreven. Analyse van eiwitglycosylering is gericht op het identificeren van de glycaangroep, het gemodificeerde eiwit of de plaats van aanhechting. In het algemeen kan glycosyleringsanalyse worden uitgevoerd met behulp van drie verschillende benaderingen, zoals uiteengezet in Fig. 6A: de analyse van chemisch of enzymatisch vrijgekomen glycanen zelf, de karakterisering van glycopeptiden na een tryptische digestie, of de karakterisering van glycanen in intacte glycoproteïnen.

Voor de analyse van glycanen kan massaspectrometrie-analyse, soms gekoppeld aan een HPLC-stap, worden gebruikt. De suikergroepen worden eerst ofwel enzymatisch (peptide N glycosidase A of F) ofwel chemisch (hydrazinolyse) uit het glycoproteïne vrijgemaakt. LC/MS-analyse kan dan direct op de vrijgekomen oligosachariden worden uitgevoerd (bijvoorbeeld [81]). Als alternatief kan het reducerende uiteinde geproduceerd door enzymatische of chemische splitsing worden gelabeld met een fluorofoorlabel en kunnen de met fluorofoor gelabelde glycanen worden geanalyseerd met een aantal mogelijke HPLC-methoden, zoals hydrofiele interactie HPLC [82].

Een toegevoegde fluorofoor of chromofoor aan het reducerende uiteinde van de glycaan zorgt voor hun scheiding door elektroforese of chromatografie, en voor hun kwantificering. Momenteel worden op vaste fase gebaseerde benaderingen zoals glycoproteïne-immobilisatie of glycan-massaspectrometriebeeldvorming op het weefsel gebruikt naast de meer gebruikelijke oplossingsgebaseerde analyses. Een recent overzicht van de review, methoden voor glycaanisolatie, identificatie en kwantificering is hier te vinden [83].

Reagentia met een hoge affiniteit voor glycanen, zoals lectines en glycan-bindende antilichamen, zijn meestal gebruikt om geglycosyleerde eiwitten in klinische monsters te detecteren. Recente ontwikkelingen omvatten het gebruik van glycan-arrays, lectine-engineering en kwantitatieve lectinemetingen. Enkele van de uitdagingen en voordelen van deze nieuwe hulpmiddelen voor analyse van biologische monsters zijn onlangs beoordeeld [84].

Hoewel de hierboven beschreven methoden informatie verschaffen over de specifieke glycanen, zijn ze niet informatief als het gaat om de identiteit van het eiwit dat een specifieke modificatie draagt ​​of de plaats van aanhechting. Om deze informatie te verkrijgen, wordt endoproteïnase-splitsing uitgevoerd (bijvoorbeeld een tryptische digestie) en worden de glycopeptiden geanalyseerd door LC/MS of HILIC-MS/MS. Deze methode kan informatie verschaffen over ofwel alle eiwitten die een specifiek glycaandeel dragen of de plaats binnen een bepaald eiwit waar het glycaan is bevestigd [85]. In Fig. 6B wordt bijvoorbeeld het effect van incubatie met Cc5-bacteriën op de glycosyleringsstatus van specifieke fetuïne-residuen getest, na de tryptische digestie, door LC-MS.

Voor sommige glycopeptiden kan het onderwerpen van het intacte eiwit aan massaspectrometrische analyse gegevens opleveren over de eiwitidentiteit en de glycosyleringsstatus ervan.Deze methode is echter afhankelijk van de biochemische eigenschappen van het glycopeptide en biedt vaak een lager resolutieniveau dan de twee hierboven beschreven methoden.

Er zijn meerdere overzichten gepubliceerd van de belangrijkste ontwikkelingen op het gebied van glycoproteomics die zich richten op de meest recente ontwikkelingen (2012-2015) waarbij gebruik wordt gemaakt van op MS gebaseerde benaderingen [86-89].

Sumoylatie, de toevoeging van SUMO's (kleine ubiquitine-achtige modifiers) aan eiwitten, is een post-translationele modificatie die vergelijkbaar is met ubiquitinatie. Zoals alle andere PTM's kan sumoylatie de structuur, subcellulaire lokalisatie en functie van een eiwit beïnvloeden. Wat betreft de identificatie van andere PTM's, is massaspectrometrie ondanks zijn beperkingen een nuttig hulpmiddel. Vanaf juni 2016 hebben een paar recente beoordelingen van de op MS gebaseerde technieken voor PTM-analyse zich niet alleen gericht op de meer bestudeerde typen (fosforylering, glycosylering, acetylering, methylering of ubiquitinatie), maar ook op de minder gebruikelijke modificaties, zoals sumoylatie [40] , 90].

Er zijn verschillende andere methoden voorgesteld. Onder hen was het gebruik van SUMO-specifieke moleculaire vallen, genaamd SUBE's (SUMO Binding Entities), die vergelijkbaar zijn met de eerder beschreven TUBE's (zie Ubiquitinatie hierboven) en waarvoor een methodologisch overzicht is gepubliceerd [71] belangrijk voor het begrip van tumoronderdrukkende routes in menselijke cellen [91].

Bovendien is de Protease-Reliant Identification of SUMO Modification (PRISM) -methode gebruikt, die detectie van SUMOylated eiwitten en de identificatie van SUMOylation-sites mogelijk maakt [92]. De methode omvat de chemische blokkering van alle vrije lysines, met SUMO-specifieke proteasensplitsing en MS-gebaseerde identificatie van de niet-geblokkeerde lysines (Figuur 7).


FKBP's en ziekten bij de mens

FKBP's reguleren tumorigenese geassocieerd met steroïde hormoonreceptoren

Bij zoogdieren is gemeld dat FKBP51 en FKBP52 (dFKBP59), eiwitfosfatase 5 (PP5) en Cyclophilin 40 (CyP40) koppelen met Hsp90 in steroïde receptor (SHR)-Hsp90 heterocomplexen [3, 6, 51]. Interessant is dat de expressie van twee co-factoren, FKBP51 en FKBP52, die respectievelijk de nucleaire translocatie van de glucocorticoïde receptor remmen en vergemakkelijken, ook negatief gecorreleerd waren. Dit suggereert dat deze co-factoren niet gecoördineerd worden opgereguleerd om hun effecten 'in evenwicht te brengen', maar wederzijds kunnen worden gereguleerd om hun individuele effecten te overdrijven [51]. Sinds Drosophila alleen FKBP59 heeft, is het belangrijk om te bepalen hoe het zo'n rol speelt. Hun welbekende effecten op steroïdereceptoren maken deze immunofilines tot potentiële geneesmiddeldoelen in de paden die verband houden met normale fysiologie en een verscheidenheid aan op steroïden gebaseerde ziekten, waaronder prostaatkanker, borstkanker, stressgerelateerde ziekten en metabole ziekten [3, 6, 52 ,53,54,55].

Tot op heden hebben onderzoekers hun inspanningen gericht op de identificatie en ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen die gericht zijn op FKBP51 en FKBP52, voornamelijk door gebruik te maken van hun functionele domeinen. FKBP51 en FKBP52 delen 70% overeenkomst en hebben respectievelijk 2 PPIase (FK1 en FK2) domeinen. Momenteel is het FK2-domein raadselachtig. Dit domein is structureel vergelijkbaar met FK1, maar mist PPIase-activiteit omdat er geen binding is met het immunosuppressieve FK506. Deletie van drie aminozuren (D195, H196 en D197) in het FKBP51 FK2-domein onderbreekt de Hsp90-binding niet, maar beïnvloedt eerder de integratie van het eiwit in progesteronreceptorcomplexen [1, 6, 55,56,57,58]. Een redelijke verklaring is dat de deletie van deze drie aminozuren de interactie van het FK2-domein met andere componenten van het receptorcomplex, inclusief de receptor zelf, vermindert. De interactie van het TPR-domein met de SHR-complexen van Hsp90 vergemakkelijkt de binding van Hsp90 aan de FKBP's [1, 6, 16].

FKBP52 FK1 is het functionele domein van FKBP's, terwijl de rest van het eiwit het interactieplatform vormt van waaruit FKBP52 direct associeert met steroïde receptor-chaperoncomplexen [1, 16]. Het FKBP52 FK1-domein, gestabiliseerd door de p23-co-chaperon, interageert met het Hsp90-receptorcomplex om te binden met het receptorligandbindende domein en heeft direct invloed op de hormoonbindende affiniteit van steroïdereceptor-chaperonreceptoren [1, 58]. Onderbreking van deze interactie tussen FKBP's en receptorcomplexeiwitten onderdrukt SHR-retrotransport op een niveau dat vergelijkbaar is met de aanwezigheid van Hsp90-remmers [1, 6, 16]. Dit impliceert dat FKBP's een sleutelcomponent zijn van de functie van de steroïde hormoonreceptor, waarvan de remming even krachtig zou kunnen zijn als de Hsp90-remming bij met steroïde hormoonreceptor geassocieerde kankers.

Bij zoogdieren spelen FKBP51 en FKBP52 een belangrijke rol in de embryonale ontwikkeling [1]. Er is gesuggereerd dat FKBP51 en FKBP52 (dFKBP59) transcriptie zouden kunnen reguleren op de plaats van genpromotors, maar er is meer bewijs nodig bij zowel zoogdieren als Drosofiel.

Er is een groeiende belangstelling voor het verband tussen FKBP's en kanker. Dit komt door de up-gereguleerde activiteit van mTOR (zoogdierdoelwit van rapamycine) door FKBP's, vooral in cellen zonder functionele PTEN, waardoor eiwitsynthese en tumorgroei worden ondermijnd. De succesvolle behandeling van kanker met behulp van immunosuppressiva FK506 en rapamycine, benadrukt het potentieel van het richten op FKBP's bij kankertherapie. Bij leukemie versterkte remming van FKBP51 door rapamycine-geabrogeerde doxorubicine-geïnduceerde activering van NF-kB door geneesmiddelen geïnduceerde apoptose [1, 57,58,59,60].

Het FKBP51-eiwit speelt een belangrijke rol bij de regulatie van verschillende signaalroutes, terwijl het expressieniveau onder verschillende omstandigheden verandert. Door het reguleren van de rijping van steroïde receptoren, de Akt en nucleaire factor KB (NF-KB) signaalroutes, is FKBP51 betrokken bij tumorigenese en in de respons op chemotherapie [6, 55, 61]. Het verminderen van AKT-S473-fosforylering of het verhogen van de gevoeligheid voor gemcitabine als gevolg van de overexpressie van FKBP51 is inderdaad afhankelijk van de AKT-S473-fosfatase PHLPP (PH-domein en leucine-rijke herhalende eiwitfosfatasen). Interessant is dat FKBP51 gelieerd is aan AKT via zijn geconserveerde FKBP-domeinen en een interactie aangaat met PHLPP via een C-terminaal TPR-domein. De PPIase-activiteit van FKBP51 is echter niet vereist voor de effecten op AKT-fosforylering en lijkt de PHLPP-activiteit ook niet te beïnvloeden. Gezamenlijk toonden verschillende rapporten aan dat FKBP51 als een scaffold diende om de PHLPP-gemedieerde defosforylering van AKT-S473 te vergemakkelijken. In tot zwijgen gebrachte FKBP51-cellen leidde bestraling tot apoptose in plaats van autofagie zoals geïnduceerd in controlecellen. Preventie van apoptose in controlecellen omvatte FKBP51-afhankelijke initiatie van NF-KB na bestraling [6, 55, 62].

Over het algemeen lijkt het erop dat, afhankelijk van het cel- en kankertype, het bevorderen of verminderen van de FKBP51-activiteit een gunstig effect kan hebben tegen celproliferatie van kankercellen. Hoogstwaarschijnlijk waren verschillende aspecten van FKBP51 betrokken vanwege zijn uiteenlopende acties, die uiteindelijk zouden kunnen worden benut voor de ontwikkeling van geneesmiddelen voor specifieke ziekten [1, 62, 63].

Mogelijke rol van FKBP's bij de ziekte van Alzheimer

De ziekte van Alzheimer (AD) is een tau-pathologie die de verzameling van tau-eiwitten in neurofibrillaire tangles (NFT's) omvat [53]. Post-translationele modificaties beïnvloeden de conformatie van het tau-eiwit, dat inherent een ongeorganiseerd eiwit is [53]. Verschillende onderzoeken hebben AD gerapporteerd als een progressieve neurodegeneratieve aandoening, de meest voorkomende vorm van dementie geassocieerd met leeftijd [53, 64, 65]. Hoewel er aanwijzingen zijn voor de interactie tussen FKBP12 en Amyloid Precursor Protein (APP) [53, 65], is een fysiologische functie van de interactie nog niet voorgesteld. Er wordt echter vermoed dat de interactie tussen FKBP12/APP een rol speelt bij de amyloïdogene verwerking van APP, waardoor het expressieniveau van Aβ-peptiden wordt beïnvloed [65]. Dit zal de functie van Pin1 (eiwit interageert met NIMA-1) op Alzheimer APP [65] weerkaatsen. Het FKBP52-eiwit wordt adequaat tot expressie gebracht in het zenuwstelsel, met verhoogde expressie in zowel beschadigde als degenererende hersengebieden [64]. Na verschillende fundamentele observaties hebben kritische gegevens zich gericht op de pathogenese van FKBP52 en AD. Het zou redelijk zijn om te speculeren dat FKBP's met PPIase-motief kunnen configureren voor de Tau-structuur en de Tau-functie beïnvloeden. Dit komt omdat bekend is dat PPIasen eiwitfosforylering moduleren [65]. Of de interactie van FKBP12 met het APP-intracellulaire domein invloed heeft op de Aβ-productie of dat blootstelling aan FK506 een gunstig of nadelig effect zou hebben, is onduidelijk [17, 53, 65, 66]. Het is echter duidelijk dat FKBP12 niet alleen zijn co-lokalisatie met NFT's vertoont om Tau-oligomerisatie te voorkomen, maar ook de in vitro Tau-aggregatie remt [65].

Recente studies tonen aan dat Hsp90-co-begeleiders de stabiliteit, aggregatie en klaring van Tau reguleren. Dit betekent dus een extra functionele rol van FKBP's in AD-gerelateerde ontwikkeling [65, 67]. Zodra FK506/rapamycinederivaten in staat zijn om de PPIase-activiteit van FKBP51 en FKBP52 te moduleren, kunnen ze een unieke benadering bieden om de pathogene effecten van verkeerd gevouwen Tau te voorkomen of te minimaliseren [6, 53, 63]. Er worden momenteel inspanningen geleverd om de FKBP-eiwitten farmacologisch te targeten. De uitkomst hiervan zal ons begrip van de interactie tussen FKBP en het receptor-chaperoncomplex [1, 68] vergroten. Deze co-begeleiders suggereren verder dat FKBP51 en FKBP52 inwerken op zowel het Aβ-metabolisme als de toxiciteit [64, 68]. de transgene D. melanogaster stammen die menselijke Aβ42-peptiden tot overexpressie brengen, vertonen degeneratie van het zenuwstelsel met gelijktijdige leer- en geheugendefecten, op een dosisafhankelijke manier [17, 64, 66]. Mutaties in de Drosophila FKBP59 (zoogdier FKBP52) verergert de Aβ-toxiciteit, terwijl transgene vliegen die wildtype dFKBP59 tot overexpressie brengen de Aβ-toxiciteit verminderen. De effecten op Aβ-fenotypen komen overeen met veranderde niveaus van het peptide, wat suggereert dat dFKBP59 de Aβ-turnover in de bovengenoemde fysiologische processen kan beïnvloeden. Daarom is het beschermende effect van dFKBP59 op Aβ-toxiciteit tijdens Drosophila veroudering was duidelijk uit de waarnemingen dat dFKBP59-verlies van functie-mutaties de Aβ-toxiciteit versterkten, terwijl overexpressie van dFKBP59 door Aβ geïnduceerde fenotypen vertraagde [17, 64, 66].

In monsters van menselijke patiënten hebben de beperkte gegevens waardevolle informatie opgeleverd over de betrokkenheid van FKBP52 bij de ziekte van Alzheimer. Een vergelijking van FKBP52-eiwitexpressie in beide hersengebieden van mensen die waren overleden aan AD met degenen die waren overleden aan andere niet-AD-neurologische ziekten, toonde aan dat de AD-monsters een lagere expressie van FKBP52 hadden in vergelijking met controles [17, 64, 68]. Aangezien het FK506-bindende domein van FKBP52 betrokken is bij APP-binding, is het denkbaar dat immunofiline-liganden zoals FK506 en rapamycine ook kunnen associëren met de ziekte van Alzheimer. Bovendien is de rol van FKBP51 bij het reguleren van Tau-biologie ook goed gekarakteriseerd. De overexpressie van FKBP51 behoudt Tau, terwijl knock-down van FKBP51 leidt tot Tau-degradatie [17, 64, 65]. Verdere studies zullen dus bewijs leveren voor de rol van liganden bij het moduleren van de toxiciteit van Aβ en kunnen het veld openen voor de ontwikkeling van een nieuwe groep middelen tegen AD.


Discussie

Het huidige rapport suggereert dat 㬛-kristallijn is een doelwitgen voor de transcriptiefactor, AhR. De expressie van 㬛-kristalline-eiwit was verminderd in de ogen (lens en hoornvlies), hart, skeletspieren en voornamelijk gekweekte fibroblasten in AhR −/− muizen. De AhR −/− muizen hadden geen detecteerbaar 㬛-crystallin in het netvlies, waarvan bekend is dat zowel 㬛-crystallin als AhR voorkomen bij gewervelde en ongewervelde dieren [22], [23], [27 ], [28], [29], [30]. Hoewel er geen verband bekend is tussen 㬛-crystallin en de functie van het netvlies, is het opmerkelijk dat verstoring van de Drosophila AhR ortholoog, Zonder ruggengraat, schakelt kleurenzicht bij deze soort uit [29].

De huidige gegevens geven aan dat de niveaus van 㬛-crystalline-eiwit en mRNA zijn verlaagd in de ogen van AhR −/− muizen, maar histologisch onderzoek van deze ogen bracht geen duidelijke morfologische afwijking aan het licht in de ogen van volwassen of 19 dagen -oude postnatale pups van AhR −/− muizen (gegevens niet getoond). In dit verband is het opmerkelijk en consistent met rapporten dat hoewel AhR-eiwit [31], [32] en 㬛-crystallin mRNA [33] sterk tot expressie worden gebracht in de lens van 12� dagen oude muizenembryo's, de lenzen van noch AhR null-muizen [34] noch 㬛-crystallin [35] nul-muizen lijken abnormaal. De precieze ontwikkelingsrollen van AhR en 㬛-crystallin in de lens, evenals in andere weefsels, vereisen dus aanvullend onderzoek.

Ons sterkste bewijs dat AhR reguleert 㬛-kristallijn genexpressie komt van de combinatie van transfectie-experimenten die zijn getest op promotorfunctie en gelmobiliteitsverschuivingsassays die zijn getest op directe binding aan DNA. AhR stimuleerde de 㬛-kristallijn promotor in getransfecteerde cellen en vormden een complex met de XRE-achtige plaats in de 㬛-kristallijn Versterker. Mutatie van deze site verminderde zowel de activatie van de promotor als de AhR-binding. Mutatie van de XRE-achtige site verlaagde ook de basale promotoractiviteit van de 㬛-kristallijn gen evenals het vermogen van de promotor om door AhR te worden geactiveerd. Opmerkelijk is echter dat AhR niet stimuleerde 㬛-kristallijn promotoractiviteit in alle typen getransfecteerde cellen. Positieve resultaten werden verkregen in HeLa-, NIH3T3-, COS-7- en αTN4-cellen, maar niet in C2C12, CV-1- of Hepa-1-cellen. De reden voor deze celtype-afhankelijkheid is niet bekend, maar suggereert dat specifieke interactie met een of meer factoren essentieel is. Het is ook intrigerend dat, hoewel de XRE-achtige plaats noodzakelijk is voor zowel basale promotoractiviteit als AhR-stimulatie van promotoractiviteit, deze AhR zwak bindt. Een mogelijkheid voor de zwakke binding in onze tests is dat extra eiwitten die niet aanwezig waren in het gelverschuivingsreactiemengsel nodig zijn voor maximale complexvorming. het onvermogen van in vitro vertaald AhR/ARNT om een ​​complex te vormen met de XRE-achtige site is consistent met deze mogelijkheid. Verdere studies over de binding van AhR aan de 㬛-kristallijne promotor, zowel in vivo als in vitro, met behulp van fysiologische niveaus van nucleaire eiwitten zijn gerechtvaardigd.

Ons in vitro functionele en gelshift-experimenten, evenals ChIP-experimenten, geven aan dat AhR kan stimuleren 㬛-kristallijn promotoractiviteit in afwezigheid van TCDD. Een voorbehoud is dat TCDD-toename van AhR-stimulatie van de 㬛-kristallijn promotor hangt af van het celtype (d.w.z. αTN4-cellen). AhR kan bijvoorbeeld ook andere genexpressie reguleren TGF㬡, onafhankelijk van TCDD [36]. Inderdaad, de expressie van een groot aantal genen die niet door TCDD werden beïnvloed in verschillende weefsels was veranderd in AhR −/− muizen [17], [18]. Het is niet bekend of dit directe of indirecte effecten van AhR zijn. De genen die zijn gewijzigd in de AhR-nulmuizen zijn verrijkt voor klassieke XRE-sites, en het is waarschijnlijk dat verschillende transcriptiefactoren op een combinatorische manier samenwerken met AhR om weefselspecifieke mRNA-regulatie in wildtype muizen te reguleren [18]. Het blijft natuurlijk mogelijk dat een nog onbekend endogeen ligand in bepaalde gevallen of onder specifieke omstandigheden TCDD vervangt. FICZ (6-formylindolo[3,2-b]carbazol) en/of andere tryptofaanderivaten zijn kandidaat-endogene liganden voor AhR [37].

Ten slotte is het opmerkelijk dat in voorlopige tests (gegevens niet getoond) AhR/ARNT de activiteit van een afgeknotte 㬛-kristallijn promotor zonder de XRE-achtige site (� tot ⭃) tot 24% van de AhR/ARNT-geïnduceerde wildtype-promotor. Aangezien de geïdentificeerde XRE-achtige plaats de enige sequentie is die lijkt op een klassieke XRE-sequentie in het 5′ flankerende gebied van de 㬛-kristallijn gen, is het mogelijk dat AhR gestimuleerd 㬛-kristallijn activiteit van de afgeknotte promotor door een andere sequentie te binden via een of meer steigereiwitten. Als alternatief kan AhR/ARNT een ander gen hebben geactiveerd dat op zijn beurt de activiteit van de afgeknotte promotor stimuleerde. Verdere studies zijn nodig om de meerdere interacties die betrokken zijn bij 㬛-kristallijn genexpressie.

Samengevat, wat het mechanisme ook is, onze gegevens suggereren dat AhR/ARNT deelneemt aan de regulering van de 㬛-kristallijn gen. Afgezien van zijn intrinsieke interesse met betrekking tot het complexe mechanisme van aB-kristallijn genexpressie [38], [39], AhR-regulatie van de 㬛-kristallijn gen is biologisch logisch: zowel 㬛-crystallin als AhR werken bij het mediëren van cellulaire stressreacties [39], [40].


DISCUSSIE

Hier hebben we testen opgezet in intacte zoogdiercellen om oxidatie en import van mitochondriale IMS-eiwitten te beoordelen. Op basis van gegevens die met deze tests zijn verkregen, stellen we het volgende model voor voor oxidatie-afhankelijke import van Cox19 zoals het in vivo plaatsvindt (Figuur 8B). Dit model is waarschijnlijk ook van toepassing op andere cysteïnerijke Mia40-substraten in verschillende celtypen. Volgens ons model accumuleert Cox19 na zijn synthese in het cytosol, waar het enkele minuten stabiel blijft, waardoor het niet wordt afgebroken. Pas na geruime tijd wordt Cox19 door het translocase van het buitenste membraan (TOM) kanaal in het IMS gestoken, waar het Mia40 tegenkomt en een disulfide-gebonden complex vormt met het oxidoreductase. Overexpressie van Mia40 versnelt de import en oxidatie van Cox19 sterk, wat aangeeft dat de concentratie van Mia40 in het IMS snelheidsbeperkend is voor Cox19-translocatie naar mitochondriën. Dit suggereert dat translocatie naar het IMS alleen plaatsvindt bij TOM-complexen die in nauw contact staan ​​met Mia40. Een dergelijke receptorachtige functie voor gist Mia40 is voorgesteld volgens welke Mia40 wordt geassocieerd met sommige TOM-complexen via het structurele IMS-eiwit Fcj1/mitofiline (von der Malsburg et al., 2011). Dienovereenkomstig vermindert overexpressie van de redox-inactieve Mia40 SPS-mutant eiwittranslocatie, omdat het de kans verkleint dat voorlopers een TOM-porie vinden die in contact staat met een functioneel Mia40-eiwit. Sommige Cox19 wordt echter nog steeds geïmporteerd na overexpressie van Mia40 SPS, hoewel het niet wordt geoxideerd, wat aangeeft dat niet-covalente interacties tussen Cox19 en Mia40 mitochondriale accumulatie kunnen veroorzaken.

Bij interactie met Mia40 vindt vorming van beide disulfiden in Cox19 plaats. Merk op dat we geen Cox19-tussenproducten waarnemen die slechts één disulfidebinding bevatten, wat suggereert dat beide disulfidebindingen worden geïntroduceerd in een snel, mogelijk gecoördineerd proces. Door Mia40 gemedieerde vorming van disulfidebindingen binnen Cox19 gaat hoogstwaarschijnlijk gepaard met een proefleesstap waarbij GSH betrokken is. Wanneer we een remmer van glutathionreductase toepassen, vinden we een duidelijke vermindering van de oxidatiesnelheid van Cox19, wat suggereert dat GSH de oxidatie-efficiëntie verbetert.Deze afname van de oxidatiesnelheid wordt nog meer uitgesproken voor NDUFA8, dat vier disulfidebindingen in zijn volgroeide vorm bevat. Onze gegevens van intacte cellen komen overeen met gegevens die zijn verkregen door in vitro reconstitutiebenaderingen waarin GSH oxidatieve vouwing versnelt door ingesloten Mia40 vrij te maken uit onproductieve Mia40-substraatcomplexen (Bien et al., 2010).

Translocatie van nieuw gesynthetiseerd Cox19 van het cytosol naar mitochondriën loopt parallel met de kinetiek van Cox19-oxidatie. Bij verslechtering van de machinerie voor oxidatieve vouwing door neerwaartse regulatie van Mia40 of ALR of expressie van het Mia40 SPS-eiwit, worden oxidatie en import belemmerd. We concluderen dus dat import en oxidatie nauw gekoppelde processen zijn, wat kan worden verklaard door ons model, volgens welke import alleen plaatsvindt bij TOM-kanalen die zijn geassocieerd met Mia40.

Bij cytosolische accumulatie wordt Cox19 aanvankelijk beschermd tegen voortijdige oxidatie en afbraak. We stellen voor dat deze stabilisatie ook plaatsvindt tijdens de normale invoer van Cox19. Dienovereenkomstig is Cox19 dat zich ophoopt in het cytosol als gevolg van een opgeloste membraanpotentiaal, nog steeds competent voor import, omdat het wordt geoxideerd bij herstel van de membraanpotentiaal. Deze bevinding ondersteunt ook sterk het idee dat Cox19-import posttranslationeel verloopt vanuit een cytosolische pool van Cox19-precursoren in intacte cellen. Dat deze cytosolische pool een regulatiepunt zou kunnen zijn, wordt ondersteund door recente gegevens verkregen met het gistsysteem die aangeven dat het cytosolische thioredoxinesysteem bijdraagt ​​aan het in stand houden van een verminderde redoxtoestand van cytosolische voorlopers (Durigon et al., 2012). Bovendien toonde een ander onderzoek in gist aan dat de beschikbare hoeveelheden cytosolische voorlopers worden gemoduleerd door het proteasoom (Bragoszewski et al., 2013).

In vergelijking met andere routes van mitochondriale eiwitimport, lijkt oxidatie-afhankelijke import aanzienlijk langzamer te verlopen. Smac, dat een splitsbare mitochondriale targeting-sequentie bevat, wordt bijna volledig geïmporteerd na de initiële radioactieve puls, terwijl Cox19-import doorgaat gedurende de gehele achtervolgingsperiode van 20 minuten. Het is belangrijk op te merken dat, hoewel Smac in korte tijd is verwerkt en geïmporteerd, dit niet betekent dat het eiwit in die tijd ook is gevouwen. Toen we oxidatie en import van Cox19 ontkoppelden door het eiwit uit te rusten met de mitochondriale targetingsequentie van Smac, zagen we een snelle verwerking van de presequentie zoals voor Smac, maar na een aanvankelijke "sprong" in de mate van oxidatie, een langzame oxidatiesnelheid van Cox19 vergelijkbaar met die van wildtype Cox19. Dit geeft aan dat het niet gericht is op mitochondriën die beperkend is voor oxidatie-afhankelijke import, maar herkenning en oxidatieve vouwing door Mia40. Het verklaart ook waarom import en oxidatie nauw met elkaar verbonden processen lijken te zijn.

Een kenmerk van oxidatie-afhankelijke import in geïsoleerde mitochondriën is de onafhankelijkheid van het mitochondriale membraanpotentiaal (Lutz et al., 2003 Mesecke et al., 2005). Dit in tegenstelling tot substraten die vertrouwen op mitochondriale targeting-sequenties voor mitochondriale import. Met behulp van onze oxidatietest in intacte cellen, vonden we ook een sterke afhankelijkheid van Cox19-import op het mitochondriale membraanpotentieel. De remming van import is omkeerbaar, omdat verwijdering van de chemicaliën de functionaliteit van de route voor oxidatieve eiwitvouwing herstelt. Dit ondersteunt ook sterk het idee dat in intacte cellen de import van Cox19 posttranslationeel kan plaatsvinden. Eukaryotische cellen bevatten veel mitochondriën, die aanzienlijk kunnen verschillen in membraanpotentiaal (Exner et al., 2012 Rugarli en Langer, 2012 Youle en van der Bliek, 2012). De voorwaarde van een hoog membraanpotentieel en de stabiele aard van cytosolische voorlopereiwitten impliceren dat voorlopers voornamelijk kunnen worden geïmporteerd in sterk geactiveerde mitochondriën, zodat mitochondriën met functionele genomen de voorkeur kunnen krijgen boven die met mitochondriale DNA-mutaties. In de toekomst zal het spannend zijn om oxidatie-afhankelijke import in levende zoogdiercellen verder te analyseren en mitochondriale biogenese te bestuderen in de context van zich voortplantende cellen.


PS.04: Het cellulaire prioneiwit octarepeat-gebied als herkenningsmotief voor heminebinding

Het prioneiwit bestaat in twee vormen. De eerste (Prpsc), staat bekend om zijn onomkeerbare neurodegeneratie en dodelijke ziekte. In schril contrast hiermee lijkt de normale, niet-pathologische vorm van het prioneiwit (PrPc, of cellulair PrP) talrijke kritische cellulaire functies te omvatten, waaronder signaaltransductie, neuroprotectie en angiogenese. Hoewel het N-terminale domein van het cellulaire prioneiwit is geclassificeerd als intrinsiek ongeordend, lijkt het elementen van structurele organisatie te hebben en dient het als een herkenningsmotief voor binding van een aantal liganden, waaronder hemine. Belangrijk is dat is aangetoond dat PrPc een belangrijke speler is in de reactie op vaatletsel, waarbij de celdood en schade als gevolg van een beroerte significant groter blijkt te zijn in de afwezigheid van PrPc. Bij vaatletsel is een van de kritieke gebeurtenissen het vrijkomen van toxische niveaus van vrij hemine die het omringende weefsel beschadigen. Aangezien is aangetoond dat PrP c hemine bindt, is het waarschijnlijk dat het cellulaire prioneiwit een rol speelt bij het neutraliseren van het toxische hemine tijdens een beroerte. Deze studie test de hypothese dat de N-terminale PrPc-domeinfragmenten kunnen dienen als effectieve wegvangers van vrij hemine. Door dit te doen, zouden ze mogelijk kunnen dienen als therapeutische middelen bij vasculaire letsels. Even belangrijk is dat de relevantie van de hemine/N-PrP c-interactie die in deze studie is onderzocht, zich kan uitstrekken tot normale, fysiologische omstandigheden, en ons kan helpen de rol te begrijpen die dit complex kan dienen bij het handhaven van de heem/hemine-homeostase. De focus van onze veelzijdige biofysische analyse is de interactie van hemine met het 2-herhaalde fragment (OR2) van het PrP c N-terminale domein. Gebruikte methodologieën omvatten isotherme titratiecalorimetrie (ITC), oppervlakteplasmonresonantie (SPR), fluorescentie, circulair dichroïsme (CD) spectroscopie en röntgenkristallografie. Aangezien dit onderzoek draait om belangrijke aspecten van eiwitvouwing, zelfassociatie en macromoleculaire herkenning, wordt ook verwacht dat de resulterende bevindingen nieuwe inzichten zullen opleveren in de fundamentele kennis met betrekking tot grotendeels ongestructureerde, maar functioneel belangrijke eiwitten en hun domeinen.


Geschiedenis

Eiwitten werden in de achttiende eeuw door Antoine Fourcroy en anderen erkend als een aparte klasse van biologische moleculen, die zich onderscheidden door het vermogen van de moleculen om te stollen of uit te vlokken onder behandelingen met hitte of zuur. Bekende voorbeelden in die tijd waren eiwit uit eiwitten, bloed, serumalbumine, fibrine en tarwegluten. De Nederlandse chemicus Gerhardus Johannes Mulder voerde elementaire analyse uit van veel voorkomende eiwitten en ontdekte dat bijna alle eiwitten dezelfde empirische formule hadden. De term "eiwit" om deze moleculen te beschrijven werd in 1838 voorgesteld door Jöns Jakob Berzelius, een medewerker van Mulder. Mulder ging verder met het identificeren van de producten van eiwitafbraak zoals het aminozuur leucine waarvoor hij een (bijna correct) molecuulgewicht van 131 Da vond.

De moeilijkheid om eiwitten in grote hoeveelheden te zuiveren, maakte ze erg moeilijk voor vroege eiwitbiochemici om te bestuderen. Vandaar dat vroege studies zich richtten op eiwitten die in grote hoeveelheden konden worden gezuiverd, bijvoorbeeld die van bloed, eiwit, verschillende toxines en spijsverterings-/metabolische enzymen die uit slachthuizen werden verkregen. Eind jaren vijftig zuiverde Armor Hot Dog Co. 1 kg (= één miljoen milligram) pure runder-pancreas ribonuclease A en maakte het vrij beschikbaar voor wetenschappers over de hele wereld.

Linus Pauling wordt gecrediteerd voor de succesvolle voorspelling van reguliere secundaire eiwitstructuren op basis van waterstofbinding, een idee dat voor het eerst naar voren werd gebracht door William Astbury in 1933. Later werk van Walter Kauzmann over denaturatie, gedeeltelijk gebaseerd op eerdere studies van Kaj Linderstrøm-Lang, droeg een begrip van eiwitvouwing en structuur gemedieerd door hydrofobe interacties. In 1949 bepaalde Fred Sanger correct de aminozuurvolgorde van insuline, waarmee hij overtuigend aantoonde dat eiwitten bestonden uit lineaire polymeren van aminozuren in plaats van vertakte ketens, colloïden of cyclolen. De eerste atomaire resolutiestructuren van eiwitten werden opgelost door röntgenkristallografie in de jaren zestig en door NMR in de jaren tachtig. Vanaf 2006 heeft de Protein Data Bank bijna 40.000 atomaire resolutiestructuren van eiwitten. In recentere tijden zijn cryo-elektronenmicroscopie van grote macromoleculaire assemblages en computationele eiwitstructuurvoorspelling van kleine eiwitdomeinen twee methoden die atomaire resolutie benaderen.