Informatie

Wat is een DNA-klem precies?


Ik dacht altijd dat een DNA-klem een ​​eiwit is. Maar vandaag merkte ik dat het niet op deze foto staat. Toen ging ik naar de Wikipedia-pagina, waar het stond:

Een DNA-klem, ook bekend als een glijdende klem, is een eiwitvouw die dient als een processiviteitsbevorderende factor bij DNA-replicatie. Als een kritische component van het DNA-polymerase III-holo-enzym bindt het klemeiwit DNA-polymerase en voorkomt dat dit enzym dissociëert van de matrijs-DNA-streng. De klem-polymerase-eiwit-eiwit-interacties zijn sterker en specifieker dan de directe interacties tussen het polymerase en de matrijs-DNA-streng

Wat ik een beetje verwarrend vind. Voor nu lijkt het me alsof DNA-klem een ​​subeenheid is van DNA-polymerase en het heeft op zichzelf geen functie en het is geen echt eiwit, maar het bindt aan polymerase en wordt functioneel. Kan iemand mij deze kwestie ophelderen?!


Je hebt gedeeltelijk gelijk in beide richtingen. In zekere zin is de DNA-klem een ​​eiwit, in een andere betekenis is het slechts een deel van een eiwit. Wat het eigenlijk is, is wat we een eiwitsubeenheid noemen, die is een eiwit, maar dat bindt met andere eiwitsubeenheden om complexe eiwitten te vormen.

Om dit te begrijpen, moet je onthouden wat een eiwit is. Een eiwit is in wezen een keten van aminozuren. Dat kunnen korte ketens zijn, lange ketens, middellange ketens: maar het zijn allemaal eiwitten. Soms zullen een paar korte eiwitten (subeenheden) aan elkaar binden om één lang eiwit (eiwitcomplex) te vormen. Dit is wat er gebeurt in het geval van een DNA-klem.

Kortom, de DNA-klem is (een) onafhankelijke eiwiteenheid (eenheden) die het vermogen heeft (hebben) om de DNA-streng te omcirkelen en er langs te reizen. Ze binden aan het polymerase, daarom zie je ze niet op je diagram. Hun functie is heel eenvoudig om het polymerase mogelijk te maken om nauw aan de DNA-standaard te blijven hechten.


bronnen:


Prolifererend celkernantigeen

Prolifererend celkernantigeen (PCNA) is een DNA-klem die fungeert als een processiviteitsfactor voor DNA-polymerase δ in eukaryote cellen en essentieel is voor replicatie. PCNA is een homotrimeer en bereikt zijn procesiviteit door het DNA te omringen, waar het fungeert als een scaffold om eiwitten te rekruteren die betrokken zijn bij DNA-replicatie, DNA-reparatie, chromatine-remodellering en epigenetica. [4]

Veel eiwitten interageren met PCNA via de twee bekende PCNA-interagerende motieven PCNA-interacting peptide (PIP) box [5] en AlkB homoloog 2 PCNA-interagerend motief (APIM). [6] Eiwitten die via de PIP-box aan PCNA binden, zijn voornamelijk betrokken bij DNA-replicatie, terwijl eiwitten die via APIM aan PCNA binden vooral belangrijk zijn in de context van genotoxische stress. [7]


Wat je leert:

De loader is een heteropentameermolecuul, wat betekent dat het bestaat uit twee of meer monomere eenheden die met elkaar zijn verbonden. Het is ook een ATPase-molecuul dat ATP gebruikt om de energie te krijgen die nodig is om de klem te sluiten.

De klemlader bevat een gebied dat homoloog is aan de AAA+-superfamilie van eiwitten. De bovenstaande afbeeldingen tonen twee vormen van klemladers, de ene is de kristallijne structuur en de andere is het vormvulmodel.

Het grijze deel in de onderste helft is het cirkelvormige klemeiwit waar de klemlader is bevestigd. De klem wordt bevestigd aan AAA+ domeinen op de klemlader. De gele strengen in het midden zijn een DNA-streng, dus er is een kamer waar het DNA in kan glijden. Alle kleuren en letters duiden de verschillende monomere structuren aan waaruit het pentameer bestaat.


Kwesties van genetica en DNA duiken voortdurend op in het nieuws over kwesties met betrekking tot voedselproductie, gezondheid, rechtszaken en ethiek. We horen over DNA in films als Jurassic Park en X-Men, we leren er stukjes en beetjes over van tv-programma's zoals Rechts en CSI, maar wat is DNA precies en hoe werkt het?

Deze korte animatie is gemaakt voor diegenen die een eenvoudige introductie willen - of zelfs een opfriscursus - over hoe DNA een levend wezen creëert. In deze video leer je iets over genetische code, DNA-transcriptie en -vertaling, en het belang van eiwitten in de chemie van het leven.

Voor leraren

De inhoud van deze video voldoet aan de criteria in de volgende disciplinaire kernideeën die zijn gedefinieerd door Next Generation Science Standards. Gebruik onze video's als aanvulling op het lesprogramma in de klas.

Middelbare school, Life Science 1

Van moleculen tot organismen: structuren en processen.

Middelbare school, levenswetenschappen 3

Erfelijkheid: overerving en variatie van eigenschappen.

Middelbare school, natuurkunde 4

Waves en hun toepassingen in technologieën voor informatieoverdracht.

Georgië Biologie 1

Relaties tussen structuren en functies in levende cellen.

Georgië Biologie 2

Hoe genetische informatie wordt uitgedrukt in cellen.

Georgië Biologie 3

Hoe biologische eigenschappen worden doorgegeven aan opeenvolgende generaties.

Georgië Biologie 6

Bijdragers

Onze video's profiteren van begeleiding en advies van experts in wetenschap en onderwijs. Deze animatie is het resultaat van een samenwerking tussen de volgende wetenschappers, docenten en ons team van creatievelingen.

Adviseurs

Vertaling

Vermeld duidelijk presenteert: wat is DNA en hoe werkt het?

DNA (of "deoxyribonucleïnezuur") is een molecuul. Het is een verzameling atomen die aan elkaar vast zitten.

In het geval van DNA vormen deze atomen samen de vorm van een lange spiraalvormige laatste soort, zoals deze hier. Als je ooit biologie hebt gestudeerd of de film Jurassic Park hebt gezien, heb je waarschijnlijk gehoord dat DNA fungeert als een blauwdruk of een recept voor een levend wezen. Maar hoe? Hoe kan slechts een molecuul fungeren als een blauwdruk voor zoiets complex en wonderbaarlijks als een?
Laten we, om die vraag te helpen beantwoorden, eerst eens kijken naar Aminozuren.

Aminozuren zijn kleine chemische stoffen in ons lichaam die zo belangrijk zijn dat ze vaak de bouwstenen van het leven worden genoemd.

Er zijn ongeveer 20 verschillende soorten aminozuren, elk met hun eigen unieke vorm.

Het leuke aan hen is dat ze aan elkaar kunnen worden vastgemaakt, zoals Lego's om een ​​eindeloze verscheidenheid aan grotere deeltjes te produceren die bekend staan ​​als eiwitten.

Aminozuren vormen eiwitten, eiwitten (samen met andere chemicaliën) worden gecombineerd om levende cellen te maken, cellen vormen weefsel, weefsels vormen organen en organen, als ze allemaal bij elkaar zijn en functioneren, vormen levende wezens zoals jij en ik.

Deze eiwitten waaruit ons lichaam bestaat (en houd er rekening mee dat er miljoenen verschillende soorten eiwitten zijn) moeten in de perfecte vorm worden gevormd om te kunnen functioneren. Als ze de verkeerde vorm hebben, werken ze meestal niet. Dat is waar DNA binnenkomt.

DNA doet veel interessante dingen (waarvan we sommige niet volledig begrijpen), maar een van de belangrijkste en meest duidelijk begrepen functies is om aminozuren te vertellen hoe ze zich moeten opstellen en zichzelf in specifieke eiwitvormen moeten vormen.

In theorie, als de juiste eiwitten op het juiste moment en op de juiste plaats worden gebouwd, komt al het andere, van cellen tot organen tot hele wezens, prima uit.

Dit is een vereenvoudigd model van DNA.

Het laat ons zien dat de stappen van de laatste zijn samengesteld uit 4 verschillende soorten chemicaliën die hier worden weergegeven met verschillende kleuren en letters.

Als je naar slechts één kant van het molecuul kijkt, kun je de chemische code (of genetische sequentie) van boven naar beneden lezen, een soort boek.

Een enkele DNA-streng is extreem lang, miljoenen letters lang. Het grootste deel van zijn leven is het opgerold als een noedel en leeft het in de kern of het middelpunt van een cel. Aminozuren leven echter buiten de kern in wat het cytoplasma wordt genoemd.

Om DNA te helpen interageren met het cytoplasma en die eiwitten te creëren, maken speciale chemicaliën in de kern gedeeltelijke kopieën van de DNA-code.

Deze nieuwe kopieën, RNA genaamd, lijken precies op DNA, maar ze zijn natuurlijk korter en ze missen een van hun zijkanten.

Door hun kleine vorm en grootte kunnen ze door kleine poriën in de kern naar het cytoplasma gaan en in de mond van een ander deeltje dat een ribosoom wordt genoemd.

Ribosomen zijn machines voor het opbouwen van eiwitten. Ze lezen het RNA met 3 letters tegelijk, zuigen aminozuren uit hun omgeving en plakken ze aan elkaar in een ketting volgens de RNA-code. Naarmate de ketting groeit, buigt, vouwt en plakt het aan zichzelf om een ​​perfect gevormd eiwit te vormen.

Vertel het ribosoom om de 3 letters van de RNA-code welke van de 20 verschillende soorten aminozuren vervolgens moet worden toegevoegd. CAA vertelt het ribosoom bijvoorbeeld om een ​​glutamine vast te pakken, AGU vertelt het een serine te pakken, enzovoort.

Als een eiwit eenmaal is opgebouwd, kan het een aantal verschillende dingen gaan doen, waaronder het helpen vormen van een geheel nieuwe cel.

Dus, om de oorspronkelijke vraag te beantwoorden: wat is DNA? DNA is een moleculaire blauwdruk voor een levend wezen.
Hoe werkt het? DNA creëert RNA, RNA creëert eiwit, eiwitten gaan verder om leven te vormen.

Dit hele proces, zo ingewikkeld, zo verfijnd, zo magisch als het lijkt, is volledig gebaseerd op chemie. Het kan worden bestudeerd, het kan worden begrepen.


DNA: replicatie, recombinatie en reparatie

Deoxyribonucleïnezuur (DNA) is een macromolecuul dat genetische informatie van generatie op generatie overdraagt. Het is verantwoordelijk voor het behoud van de identiteit van de soort gedurende miljoenen jaren. DNA kan worden beschouwd als een reservebank van genetische informatie of een geheugenbank.

Een enkele foetale cel van een zoogdier bevat slechts enkele picogrammen (10-12 g) DNA. Het is verrassend dat deze kleine hoeveelheid DNA informatie opslaat die de differentiatie en elke functie van een volwassen dier zal bepalen.

Waarom is DNA geëvolueerd als genetisch materiaal?

RNA-moleculen kunnen in principe de cellulaire functies uitvoeren die door DNA worden uitgevoerd. In feite bevatten veel virussen RNA als genetisch materiaal. Chemisch gezien is DNA stabieler dan RNA. Vandaar dat in de loop van de evolutie DNA de voorkeur heeft als een geschikter molecuul voor langdurige opslag van genetische informatie.

Het centrale dogma van het leven:

De biologische informatie stroomt van DNA naar RNA en van daaruit naar eiwitten. Dit is het centrale dogma van het leven (fig. 3.1). Het is uiteindelijk het DNA dat elke functie van de cel controleert door middel van eiwitsynthese.

Als drager van genetische informatie moet DNA in een cel worden gedupliceerd (gerepliceerd), onderhouden en nauwkeurig worden doorgegeven aan de dochtercellen. Hiervoor zijn drie verschillende processen ontworpen. De ‘three Rs’ van DNA-replicatie, recombinatie en reparatie. Er zijn bepaalde gemeenschappelijke kenmerken tussen de drie R's.

I. Ze werken op hetzelfde substraat (DNA).

II. Ze houden zich voornamelijk bezig met het maken en verbreken van fosfodiesterbindingen (de ruggengraat van de DNA-structuur).

III. Enzymen die in de drie processen worden gebruikt, zijn meestal vergelijkbaar/vergelijkbaar.

Replicatie van DNA:

DNA is het genetische materiaal. Wanneer de cel zich deelt, ontvangen de dochtercellen een identieke kopie van genetische informatie van de oudercel. Replicatie is een proces waarbij DNA zichzelf kopieert om identieke dochtermoleculen van DNA te produceren. Replicatie wordt uitgevoerd met hoge betrouwbaarheid, wat essentieel is voor het voortbestaan ​​van de soort.

De synthese van een nieuw DNA-molecuul is een complex proces met een reeks stappen. De meest opvallende kenmerken van replicatie in prokaryoten worden eerst beschreven. Dit wordt gevolgd door wat recente informatie over de eukaryote replicatie.

Replicatie in prokaryoten:

Replicatie is semiconservatief:

Het ouder-DNA heeft twee strengen die complementair zijn aan elkaar. Beide strengen ondergaan gelijktijdige replicatie om twee dochtermoleculen te produceren. Elk nieuw gesynthetiseerd DNA heeft de helft van het ouderlijke DNA (één streng van het origineel) en de helft nieuw DNA (Fig. 3.2).

Dit type replicatie staat bekend als semiconservatief omdat de helft van het oorspronkelijke DNA is geconserveerd in het dochter-DNA. Het eerste experimentele bewijs voor de semiconservatieve DNA-replicatie werd geleverd door Meselson en Stahl (1958).

Initiatie van replicatie:

De initiatie van DNA-synthese vindt plaats op een plaats die replicatieoorsprong wordt genoemd. In het geval van prokaryoten is er een enkele plaats, terwijl er bij eukaryoten meerdere oorsprongsplaatsen zijn. Deze plaatsen bestaan ​​meestal uit een korte sequentie van A-T-basenparen. Een specifiek eiwit genaamd dna A (20-50 monomeren) bindt zich aan de plaats van oorsprong voor replicatie. Hierdoor wordt het dubbelstrengs DNA gescheiden.

Replicatie bubbels:

De twee complementaire DNA-strengen scheiden op de plaats van replicatie om een ​​bel te vormen. In eukaryote DNA-moleculen worden meerdere replicatiebellen gevormd, wat essentieel is voor een snel replicatieproces (Fig. 3.3).

Voor de synthese van nieuw DNA is een kort RNA-fragment (ongeveer 5-50 nucleotiden, variabel per soort) als primer nodig. Deze primer wordt op de DNA-matrijs gesynthetiseerd door een specifiek RNA-polymerase dat primase wordt genoemd. Een constante synthese en toevoer van RNA-primers moet plaatsvinden op de achterblijvende DNA-streng. Dit in tegenstelling tot de leidende streng die bijna een enkele RNA-primer heeft.

DNA-synthese is semi-discontinu en bidirectioneel:

De replicatie van DNA vindt gelijktijdig plaats in 5'8242 tot 3'richtingen, op beide DNA-strengen. Op één streng, de leidende (continue of voorwaartse) streng - is de DNA-synthese continu. Aan de andere streng, de achterblijvende (discontinue of retrograde) streng - de synthese van DNA is disconisch en verlegen. Op de lagging strand worden korte stukjes DNA (15-250 nucleotiden) geproduceerd. In de replicatiebel vindt de DNA-synthese plaats in beide richtingen (bidirectioneel) vanaf het punt van oorsprong.

Replicatievork en DNA-synthese:

De scheiding van de twee strengen ouder-DNA resulteert in de vorming van een replicatievork. In dit gebied vindt de actieve synthese van DNA plaats. De replicatievork beweegt langs het ouder-DNA terwijl de dochter-DNA-moleculen worden gesynthetiseerd.

DNA-helicases:

Deze enzymen binden aan beide DNA-strengen bij de replicatievork. Helicases bewegen langs de DNA-helix en scheiden de strengen. Hun functie is vergelijkbaar met een ritssluiting. Helicases zijn voor hun energievoorziening afhankelijk van ATP.

Enkelstrengs DNA-bindende (SSB) eiwitten:

Deze staan ​​ook bekend als DNA-helix-destabiliserende eiwitten. Ze bezitten geen enzymactiviteit. SSB-eiwitten binden alleen aan enkelstrengs DNA (gescheiden door helicases), houden de twee strengen gescheiden en vormen de matrijs voor nieuwe DNA-synthese. Er wordt aangenomen dat SSB-eiwitten ook de enkelstrengs DNA-afbraak door nucleasen beschermen.

DNA-synthese gekatalyseerd door DNA-polymerase III:

De synthese van een nieuwe DNA-streng, gekatalyseerd door DNA-polymerase III, vindt plaats in de richting 5'8217—>3'8242. Dit is antiparallel aan de DNA-streng van de oudertemplate. De aanwezigheid van alle vier de-oxyribo-nucleoside trifosfaten (dATP, dGTP, dCTP en dTTP) is een essentiële voorwaarde voor replicatie.

De synthese van twee nieuwe DNA-strengen vindt tegelijkertijd plaats in de tegenovergestelde richting - de ene is in een richting (5’→3′) naar de replicatievork die continu is, de andere in een richting (5’→3& #8242) weg van de replicatievork die discontinu is (Fig. 3.4).

De binnenkomende deoxyribonucleotiden worden de een na de ander toegevoegd aan het 3'-uiteinde van de groeiende DNA-keten (Fig. 3.5). Een molecuul pyrofosfaat (PPi) wordt verwijderd met de toevoeging van elk nucleotide. De matrijs-DNA-streng (de ouder) bepaalt de basenvolgorde van het nieuw gesynthetiseerde complementaire DNA.

Polariteit probleem:

De DNA-streng (leidende streng) met het 3'8242-uiteinde (3'8242-OH) gericht naar de vork kan worden verlengd door opeenvolgende toevoeging van nieuwe nucleotiden. De andere DNA-streng (achterblijvende streng) met het 5'8242-uiteinde levert een probleem op, aangezien er geen DNA-polymerase-enzym (in welk organisme dan ook) is dat de toevoeging van nucleotiden aan het 5'8242-uiteinde kan katalyseren (dwz 3'8217→5& #8242 richting) van de groeiende keten. Dit probleem wordt echter opgelost door deze streng te synthetiseren als een reeks kleine fragmenten. Deze stukken zijn gemaakt in de normale 5'8217→3'8242 richting en later samengevoegd.

De kleine fragmenten van het discontinu gesynthetiseerde DNA worden Okazaki-stukjes genoemd. Deze worden geproduceerd op de achterblijvende streng van het ouder-DNA. Okazaki-stukken worden later samengevoegd om een ​​doorlopende DNA-streng te vormen. DNA-polymerase I en DNA-ligase zijn verantwoordelijk voor dit proces (details worden later gegeven).

Proefleesfunctie van DNA-polymerase III:

De betrouwbaarheid van de replicatie is het belangrijkste voor het bestaan ​​van een organisme. Naast zijn 5'8217→3'8242 gerichte katalytische functie, heeft DNA-polymerase III ook een proefleesactiviteit. Het controleert de binnenkomende nucleotiden en laat alleen de correct gematchte basen (d.w.z. complementaire basen) toe aan de groeiende DNA-streng. Verder bewerkt DNA-polymerase zijn fouten (indien aanwezig) en verwijdert het de verkeerd geplaatste nucleotidebasen.

Vervanging van RNA-primer door DNA:

De synthese van een nieuwe DNA-streng gaat door totdat deze dicht bij de RNA-primer is. Nu komt het DNA-polymerase I in beeld. Het verwijdert de RNA-primer en neemt zijn positie in. DNA-polymerase I katalyseert de synthese (5'8217→3'8242 richting) van een fragment van DNA dat de RNA-primer vervangt (Fig. 3.6).

Het enzym DNA-ligase katalyseert de vorming van een fosfodiesterbinding tussen het DNA dat is gesynthetiseerd door DNA-polymerase III en de kleine DNA-fragmenten geproduceerd door DNA-polymerase I. Dit proces - nick-sealing - vereist energie, geleverd door de afbraak van ATP tot AMP en PPi . Een ander enzym, DNA-polymerase II, is geïsoleerd. Het neemt deel aan het DNA-herstelproces.

Supercoils en DNA-topoisomerasen:

Terwijl de dubbele helix van DNA zich van de ene kant scheidt en de replicatie voortgaat, worden aan de andere kant supercoils gevormd. De vorming van supercoils kan beter worden begrepen door DNA-helix te vergelijken met twee gedraaide touwen die aan één uiteinde zijn vastgemaakt. Houd de touwen aan het vastgebonden uiteinde in een vaste positie. En laat je vriend de touwen aan de andere kant uit elkaar trekken. De vorming van supercoils wordt duidelijk waargenomen.

Het probleem van supercoils dat DNA-replicatie in de weg staat, wordt opgelost door een groep enzymen die DNA-topoisomerasen worden genoemd. Type I DNA-topoisomerase knipt de enkele DNA-streng (nuclease-activiteit) om het probleem van supercoils te overwinnen en sluit de streng vervolgens weer af (ligase-activiteit). Type II DNA-topoisomerase (ook bekend als DNA-gyrase) knipt beide strengen en sluit ze opnieuw om het probleem van supercoils te overwinnen.

Replicatie in eukaryoten:

Replicatie van DNA in eukaryoten lijkt sterk op die van prokaryoten. Er zijn echter bepaalde verschillen. Meerdere oorsprongen van replicatie is een kenmerkend kenmerk van eukaryote cellen. Verder zijn in eukaryoten ten minste vijf verschillende DNA-polymerasen bekend.

Griekse letters worden gebruikt om deze enzymen te nummeren:

1. DNA-polymerase is verantwoordelijk voor de synthese van RNA-primer voor zowel de leidende als de achterblijvende strengen van DNA.

2. DNA-polymerase is betrokken bij het herstel van DNA. Zijn functie is vergelijkbaar met DNA-polymerase I die in prokaryoten werd gevonden.

3. DNA-polymerase dit enzym neemt deel aan de replicatie van mitochondriaal DNA.

4. DNA-polymerase is verantwoordelijk voor de replicatie op de leidende streng van DNA. Het beschikt ook over proeflezen activiteit.

5. DNA-polymerase is betrokken bij de DNA-synthese op de achterblijvende streng en de proefleesfunctie.

De verschillen in de DNA-replicatie tussen bacteriën en menselijke cellen, toegeschreven aan de enzymen, worden met succes gebruikt in antibacteriële therapie om pathogene (bacteriële) replicatie aan te pakken en de gastheer (menselijke) cellen te sparen.

Replicatieproces in eukaryoten:

De replicatie op de leidende (continue) stand van DNA is vrij eenvoudig, waarbij DNA-polymerase δ en een glijdende klem genaamd proliferating cell nucleair antigeen (PCNA) betrokken zijn. PCNA wordt zo genoemd omdat het voor het eerst werd gedetecteerd als een antigeen in de kernen van replicerende cellen. PCNA vormt een ring rond DNA waaraan DNA-polymerase S bindt. De vorming van deze ring vereist ook een andere factor, namelijk replicatiefactor C (RFC).

De replicatie op de achterblijvende (discontinue) streng in eukaryoten is complexer in vergelijking met prokaryoten of zelfs de leidende streng van eukaryoten. Dit is weergegeven in Fig. 3.7 en wordt hieronder kort beschreven.

De ouderstrengen van DNA worden gescheiden door het enzym helicase. Een enkelstrengs DNA-bindend eiwit genaamd replicatie-eiwit A (RPA) bindt aan de blootgestelde enkelstrengs matrijs. Deze streng is geopend door de replicatievork (een eerder gevormd Okazaki-fragment met een RNA-primer wordt ook getoond in Fig. 3.4).

Het enzym primase vormt een complex met DNA-polymerase dat de synthese van Okazaki-fragmenten initieert. De primase-activiteit van het pol α-primase-complex is in staat om een ​​RNA-primer van 10 bp te produceren. De enzymactiviteit wordt dan omgeschakeld van primase naar DNA-polymerase α, dat de primer verlengt door toevoeging van 20-30 deoxyribonucleotiden. Dus door de werking van het pol α-primase-complex wordt een kort stuk DNA dat aan RNA is gehecht, gevormd. En nu dissocieert het complex van het DNA.

De volgende stap is de binding van replicatiefactor C (RFC) aan de langwerpige primer (kort RNA-DNA). RFC dient als een klemlader en katalyseert de assemblage van prolifererende celnucleaire antigeen (PCNA) moleculen. Het DNA-polymerase 8 bindt aan de glijdende klem en verlengt het Okazaki-fragment tot een uiteindelijke lengte van ongeveer 150-200 bp. Door deze verlenging nadert het replicatiecomplex de RNA-primer van het vorige Okazaki-fragment.

De verwijdering van de RNA-primer wordt uitgevoerd door een paar enzymen, namelijk RNase H en flap endonuclease I (FEND. Deze leemte die wordt gecreëerd door de verwijdering van RNA wordt opgevuld door voortdurende verlenging van het nieuwe Okazaki-fragment (uitgevoerd door polymerase 8, hierboven beschreven). kleine inkeping die overblijft wordt uiteindelijk verzegeld door DNA-ligase.

Eukaryotisch DNA is stevig gebonden aan histonen (basiseiwitten) om nucleosomen te vormen die zich op hun beurt organiseren in chromosomen. Tijdens de replicatie worden de chromosomen ontspannen en komen de nucleosomen los. De DNA-strengen scheiden zich voor replicatie en de ouderlijke histonen associëren met een van de ouderstrengen.

Naarmate de synthese van een nieuwe DNA-streng vordert, worden tegelijkertijd histonen geproduceerd op de ouderstreng. Aan het einde van de replicatie, van de twee dochters gevormde chromosomale DNA's, bevat de ene de ouderlijke histonen, terwijl de andere de nieuw gesynthetiseerde histonen heeft.

Remmers van DNA-replicatie:

Bacteriën bevatten een specifiek type II topoisomerase, namelijk gyrase. Dit enzym knipt en sluit het circulaire DNA (van bacteriën) weer af en overwint zo het probleem van supercoils. Bacteriële gyrase wordt geremd door de antibiotica ciprofloxacine, novobiocine en nalidixinezuur. Deze worden veel gebruikt als antibacteriële middelen, omdat ze de replicatie van DNA en de vermenigvuldiging van cellen effectief kunnen blokkeren. Deze antibacteriële middelen hebben bijna geen effect op menselijke enzymen.

Bepaalde verbindingen die menselijke topo-isomerases remmen, worden gebruikt als middelen tegen kanker, b.v. adriamycine, etoposide, doxorubicine. De nucleotide-analogen die DNA-replicatie remmen, worden ook gebruikt als geneesmiddelen tegen kanker, b.v. 6-mercaptopurine, 5-fluorouracil.

Celcyclus en DNA-replicatie:

De celcyclus bestaat uit vier verschillende fasen in hogere organismen: mitotisch, G1, S en G2 fasen (Fig. 3.8). Wanneer de cel niet groeit, bevindt deze zich in een slapende of niet-delende fase (G0). G1 fase wordt gekenmerkt door actieve eiwitsynthese.

Replicatie van DNA vindt slechts één keer plaats in de S-fase en de chromosomen worden verdubbeld, d.w.z. het diploïde genoom wordt omgezet in tetraploïde. Het hele proces van nieuwe DNA-synthese vindt plaats in ongeveer 8-10 uur en een groot aantal DNA-polymerasen (500-1.000) zijn tegelijkertijd bij dit proces betrokken. Er wordt aangenomen dat methylering van DNA dient als een marker om replicatie te remmen. De G2 fase wordt gekenmerkt door vergroting van het cytoplasma en dit wordt gevolgd door de eigenlijke celdeling die plaatsvindt in de mitotische fase.

Cyclines en celcyclus:

Cyclines zijn een groep eiwitten die nauw verbonden zijn met de overgang van de ene fase van de celcyclus naar de andere, vandaar dat ze zo worden genoemd. De belangrijkste cyclinen zijn cycline A, B, D en E. De concentraties van cyclinen nemen toe of af in de loop van de celcyclus. Deze cyclinen werken op cycline-afhankelijke kinasen (CDK's) die bepaalde stoffen fosforyleren die essentieel zijn voor de overgang van de ene cyclus naar de andere.

Cyclinen en cycline-afhankelijke kinasen (CDK1, CDK2, CDK4 en CDK6) zijn nauw verbonden met de voortgang van de celcyclus. De cycline D-spiegels stijgen bijvoorbeeld in de late G1-fase die CDK4 en CDK6 activeren. Dit resulteert in de assemblage van nucleaire eiwitten in een complexe vorm in de late G1-fase.

Controlepunten celcyclus:

Zoals weergegeven in Fig. 3.8, vindt er een continue monitoring van de celcyclus plaats met betrekking tot DNA-replicatie, chromosoomsegregatie en integriteit. Als er schade aan het DNA wordt gedetecteerd in de G1- of G2-fase van de cyclus, of als er een defecte spindel wordt gevormd (d.w.z. onvolledige chromosomale segregatie), zal de celcyclus niet verder gaan totdat deze op de juiste manier is gecorrigeerd. Als het niet mogelijk is om de aangerichte schade te herstellen, ondergaan de cellen apoptose (geprogrammeerde celdood).

Kanker en celcyclus:

Kanker staat voor een overmatige celdeling. Bij kanker bevindt een grote hoeveelheid cellen zich in mitose en de meeste in de S-fase. De meeste geneesmiddelen die worden gebruikt voor kankertherapie zijn ontworpen om DNA-replicatie te blokkeren of de enzymen te remmen die deelnemen aan replicatie (direct of indirect). Methotrexaat (remt dihydrofolaatreductase) en 5-fluorouracil (remt thymidylaatsynthase) blokkeren de nucleotidesynthese. De laatste jaren worden topoisomeraseremmers gebruikt. Ze blokkeren het afwikkelen van ouderlijke DNA-strengen en voorkomen replicatie.

Telomeren en telomerase:

Er zijn bepaalde problemen bij de replicatie van lineaire DNA's (of chromosomen) van eukaryote cellen. De leidende DNA-streng kan volledig worden gesynthetiseerd tot het einde van zijn sjabloon. Dit is niet mogelijk met de achterblijvende streng, omdat de verwijdering van het primer-RNA een kleine opening laat die niet kan worden opgevuld (Fig. 3.9A).

Bijgevolg zullen de dochterchromosomen verkorte DNA-moleculen hebben. Dit wordt significant na verschillende celcycli waarbij replicatie van chromosomen betrokken is. Het resultaat is dat de chromosomen na verloop van tijd bepaalde essentiële genen kunnen verliezen en de cel sterft. Dit wordt echter grotendeels vermeden.

Telomeren zijn de speciale structuren die het voortdurende verlies van DNA aan het einde van de chromosomen tijdens de replicatie voorkomen. Zo beschermen ze de uiteinden van de chromosomen en zijn ze er ook verantwoordelijk voor om te voorkomen dat de chromosomen met elkaar versmelten. Telomeren zijn veel herhalende sequenties van zes nucleotiden die aanwezig zijn aan de uiteinden van eukaryote chromosomen. Menselijke telomeren bevatten duizenden herhaalde TTACGC-sequenties, die tot 1500 bp lang kunnen zijn.

De rol van telomerase:

Telomeren worden onderhouden door het enzym telomerase, ook wel telomere terminale transferase genoemd. Telomerase is een ongebruikelijk enzym omdat het is samengesteld uit zowel eiwitten als RNA. In het geval van mensen is de RNA-component 450 nucleotiden lang en aan de 5'8242-terminus en bevat deze de sequentie 5'8242-CUAACCCUAAC-3'8242.

Opgemerkt kan worden dat het centrale gebied van deze sequentie complementair is aan de telomeer herhalende sequentie 5'8242-TTAGGG-3'8242. De telomerase-RNA-sequentie kan worden gebruikt als een sjabloon voor verlenging van telomeren (Fig. 3.9B).

De telomerase RNA basenparen aan het einde van het DNA-molecuul met telomeren en strekt zich uit tot een kleine afstand. Dan vindt translocatie van telomerase plaats en vindt een nieuwe verlenging van DNA plaats. Dit proces van DNA-synthese en translocatie wordt verschillende keren herhaald totdat het chromosoom voldoende is verlengd. Het verlengingsproces wordt voltooid door de deelname van DNA-polymerase en primase-complex en afdichting van het nieuwe gevormde DNA.

Hierbij kan worden opgemerkt dat als zodanig de telomeren niet coderen voor eiwitten. Daarom hoeven ze, wanneer ze worden verlengd door telomerase, niet dezelfde lengte te houden, en enige verkorting zal geen probleem vormen. In de loop van herhaalde celcycli vindt er progressieve verkorting van telomeren plaats, en dit moet worden voorkomen, wat op de juiste manier wordt uitgevoerd door telomerase.

Telomeer bij senescentie en kanker:

Er komt nu bewijs dat telomerase niet in alle zoogdiercellen actief is. Dit komt vooral doordat cellen die differentiatie hebben ondergaan niet meer of slechts in beperkte mate delen. Telomerase is zeer actief in het vroege embryo en na de geboorte is het actief in de voortplantings- en stamcellen.

Stamcellen delen zich continu gedurende de levensduur van een organisme om nieuwe cellen te produceren. Deze cellen zijn op hun beurt verantwoordelijk voor weefsels en organen in de functionele toestand, b.v. hematopoietische stamcellen van het beenmerg.

Veel biologen brengen het proces van telomeerverkorting in verband met celveroudering (d.w.z. celdood). Dit is voornamelijk gebaseerd op de waarnemingen die zijn gedaan in de in vitro zoogdiercelculturen. Sommige onderzoekers stellen echter vraagtekens bij deze relatie tussen telomeerverkorting en veroudering.

Kankercellen kunnen zich continu delen. Er zijn sterke aanwijzingen dat de afwezigheid van veroudering in kankercellen verband houdt met de activering van het enzym telomerase. Zo blijft de telomeerlengte behouden gedurende meerdere celdelingen. Het is echter niet duidelijk of telomerase-activering een oorzaak of een gevolg van kanker is.

Er zijn echter aanwijzingen dat telomerase-activering in feite de oorzaak is van bepaalde vormen van kanker, b.v. dyskeratosis congenita als gevolg van een mutatie in het gen dat verantwoordelijk is voor de RNA-component van telomerase. Het enzym telomerase is een aantrekkelijk doelwit voor chemotherapie bij kanker. De medicijnen zijn ontworpen om telomerase te inactiveren en bijgevolg veroudering in de kankercellen te induceren. Dit voorkomt op zijn beurt de snelle celproliferatie.

Recombinatie:

Recombinatie omvat in feite de uitwisseling van genetische informatie. Er zijn hoofdzakelijk twee soorten recombinatie's.

1. Homologe recombinatie:

Dit wordt ook wel algemene recombinatie genoemd en vindt plaats tussen identieke of bijna identieke chromosomen (DNA-sequenties). Het beste voorbeeld is de recombinatie tussen de vaderlijke en de moederlijke chromosomale paren (Fig. 3.10).

2. Niet-homologe recombinatie:

Dit wordt beschouwd als onwettige recombinatie en vereist geen speciale homologe sequenties. Transpositie is een goed voorbeeld van niet-verlegen-homologe recombinatie. Willekeurige integratie van externe genen in zoogdierchromosomen is een ander voorbeeld.

Homologe recombinatie:

Het is een bekend feit dat de chromosomen niet intact van generatie op generatie worden doorgegeven. In plaats daarvan worden ze geërfd van beide ouders. Dit is mogelijk door homologe recombinatie. Er zijn drie modellen naar voren gebracht om homologe recombinaties te verklaren.

iii. Dubbelstrengs breukmodel.

Het Holliday-model (voorgesteld door Holliday in 1964) is het eenvoudigste onder de homologe recombinatiemodellen. Het is afgebeeld in Fig. 3.11

De twee homologe chromosomen komen dichter bij elkaar, worden goed uitgelijnd en vormen enkelstrengige breuken. Dit resulteert in twee uitgelijnde DNA-duplexen. Now the strands of each duplex partly unwind and invade in the opposite direction to form a two strands cross between the DNA molecules.

There occurs simultaneous unwinding and rewinding of the duplexes in such a way that there is no net change in the amount of base pairing, but the position of crossover moves. This phenomenon referred to as branch migration, results in the formation of heteroduplex DNA.

The enzyme DNA ligase seals the nick. The two DNA duplexes (4 strands of DNA), joined by a single crossover point can rotate to create a four-standard Holliday junction. Now the DNA molecules are subjected to symmetrical cuts in either of the two directions, and the cut ends are resealed by ligase.

The DNA exchange is determined by the direction of the cuts, which could be horizontal or vertical. If the cross strands are cut horizontally (cut 1), the flanking genes (or markers, i.e. AB/ab) remain intact, and no recombination occurs. On the other hand, if the parental strands are cut vertically (cut 2), the flanking genes get exchanged (i.e. Ab/aB) due to recombination.

Non-Homologous Recombination:

The recombination process without any special homologous sequences of DNA is regarded as non-­homologous recombination.

Transposition primarily involves the movement of specific pieces of DNA in the genome. The mobile segments of DNA are called transposons or transposable elements. They were first discovered by Barbara McClintock (in 1950) in maize, and their significance was ignored for about two decades by other workers.

Transposons are mobile and can move almost to any place in the target chromosome. There are two modes of transposition. One that involves an RNA intermediate and the other which does not involve RNA intermediate.

Transposition involving RNA intermediate represents retro transposition (Fig. 3.12). By the normal process of transcription, a copy of RNA formed from a transposon (also called as retro transposon). Then by the enzyme reverse transcriptase, DNA is copied from the RNA.

The newly formed DNA which is a copy of the transposon gets integrated into the genome. This integration may occur randomly on the same chromosome or, on a different chromosome. As a result of the retro transposition, there are now two copies of the transposon, at different points on the genome.

Some transposons are capable of direct transposition of DNA to DNA. This may occur either by replicative transposition or conservative transposition (Fig. 3.13). Both the mechanisms require enzymes that are mostly coded by the genes within the transposons.

In the replicative transposition, a direct interaction occurs between the donor transposon and the target site to result in copying of the donor element.

In case of conservative transposition, the transposon is excised and reintegrated at a new site.

DNA transposition is less common than retro transposition in case of eukaryotes. However, in case of prokaryotes, DNA transposons are more important than RNA transposons.

Significance of transposition:

It is now widely accepted that a large fraction of the human genome has resulted due to the accumulation of transposons. Short interspersed elements (SINEs) are repeats of DNA sequences which are present in about 500,000 copies per haploid human genome e.g. Alu sequences.

Long interspersed elements (LINEs) are also repeated DNA sequences and are present in about 50,000 copies in the human genome e.g. L1 elements. Some of the diseases caused by mutations are due to insertion of transoms into a genes.

Damage and Repair of DNA:

Being the carrier of genetic information, the cellular DNA must be replicated (duplicated), maintained, and passed down to the daughter cells accurately. In general, the accuracy of replication is extremely high. However, there do occur replication errors. It is estimated that approximately one error is introduced per billion base pairs during each cycle of replication. The cells do possess the capability to repair damages done to DNA to a large extent.

Consequences of DNA Damage:

Despite an efficient repair system for the damaged DNA, replication errors do accumulate that ultimately result in mutations. The human body possesses 10 14 nucleated cells, each with 3 × 10 9 base pairs of DNA. It is estimated that about 10 16 cell divisions occur in a lifetime. If 10 -10 mutations per base pair per cell generation escape repair, this results in about one mutation per 10 6 base pairs in genome.

Besides the possible errors in replication, the DNA is constantly subjected to attack by both physical and chemical agents. These include radiation, free radicals, and chemicals etc., which also result in mutations.

It is fortunate that a great majority of the mutations probably occur in the DNA that does not encode proteins, and consequently will not have any serious impact on the organism. This is not, however, all the time true, since mutations do occur in the coding regions of DNA also. There are situations in which the change in a single base pair in the human genome can cause a serious disease e.g. sickle-cell anemia.

Types of DNA Damages:

The damage done to DNA by physical, chemical and environmental agents may be broadly classified into four categories with different types (Table 3.1).

The DNA damage may occur due to single-base alterations (e.g. depurination, deamination), two- base alterations (e.g. pyrimidine diamer) chain breaks (e.g. ionizing radiation) and cross-linkages (e.g. between bases). Some selected DNA damages are briefly described. The occurrence of spontaneous deamination bases in aqueous solution at 37°C is well known. Cytosine gets deaminated to form uracil while adenine forms hypoxanthine.

Spontaneous depurination, due to cleavage of glycosyl bonds (that connect purines to the backbone) also occurs. It is estimated that 2000-10,000 purines may be lost per mammalian cell in 24 hours. The depurinated sites are called as abasic sites. Originally, they were detected in purines, and called apurinic sites (AP sites) which represent lack of purine. Now, the term AP sites is generally used to represent any base lacking in DNA.

The production of reactive oxygen species is often associated with alteration of bases e.g. formation of 8-hydroxy guanine. Free radical formation and oxidative damage to DNA increases with advancement of age. Ultraviolet radiations result in the formation of covalent links between adjacent pyrimidine’s along the DNA strand to form pyrimidine dimers. DNA chain breaks can be caused by ionizing radiations (e.g. X-rays).

Mutaties:

The genetic macromolecule DNA is highly stable with regard to its base composition and sequence. However, DNA is not totally exempt from gradual change. Mutation refers to a change in the DNA structure of a gene. The substances (chemicals) which can induce mutations are collectively known as mutagens. The changes that occur in DNA on mutation are reflected in replication, transcription and translation.

Types of mutations:

Mutations are mainly of two major types—point mutations, frame shift mutations (Fig. 3.14).

The replacement of one base pair by another results in point mutation. They are of two sub-types.

In this case, a purine (or a pyrimidine) is replaced by another.

These are characterized by replacement of a purine by a pyrimidine or vice versa.

2. Frame-shift mutations:

These occur when one or more base pairs are inserted in or deleted from the DNA, respectively, causing insertion or deletion mutations.

Consequences of point mutations:

The change in a single base sequence in point mutation may cause one of the following (Fig. 3.15).

The codon (of mRNA) containing the changed base may code for the same amino acid. For instance, UCA codes for serine and change in the third base (UCU) still codes for serine. This is due to degeneracy of the genetic code. Therefore, there are no detectable effects in silent mutation.

In this case, the changed base may code for a different amino acid. For example, UCA codes for serine while ACA codes for threonine. The mistaken (or missense) amino acid may be acceptable, partially acceptable or unacceptable with regard to the function of protein molecule. Sickle-cell anemia is a classical example of missense mutation.

Sometimes, the codon with the altered base may become a termination (or nonsense) codon. For instance, change in the second base of serine codon (UCA) may result in UAA. The altered codon acts as a stop signal and causes termination of protein synthesis, at that point.

Consequences of frame shift mutations:

The insertion or deletion of a base in a gene results in an altered reading frame of the mRNA (hence the name frame shift). The machinery of mRNA (containing codons) does not recognize that a base was missing or a new base was added. Since there are no punctuations in the reading of codons, translation continues. The result is that the protein synthesized will have several altered amino acids and/or prematurely terminated protein.

Mutaties en kanker:

Mutations are permanent alterations in DNA structure, which have been implicated in the etiopathogenesis of cancer.

Repair of DNA:

As already stated, damage to DNA caused by replication errors or mutations may have serious consequences. The cell possesses an inbuilt system to repair the damaged DNA. This may be achieved by four distinct mechanisms (Table 3.2).

2. Nucleotide excision-repair

4. Double-strand break repair.

1. Base excision-repair:

The bases cytosine, adenine and guanine can undergo spontaneous depurination to respectively form uracil, hypoxanthine and xanthine. These altered bases do not exist in the normal DNA, and therefore need to be removed. This is carried out by base excision repair (Fig. 3.16).

A defective DNA in which cytosine is deaminated to uracil is acted upon by the enzyme uracil DNA glycosylase. This results in the removal of the defective base uracil. An endonuclease cuts the backbone of DNA strand near the defect and removes a few bases. The gap so created is filled up by the action of repair DNA polymerase and DNA ligase.

2. Nucleotide excision-repair:

The DNA damage due to ultraviolet light, ionizing radiation and other environmental factors often results in the modification of certain bases, strand breaks, cross-linkages etc. Nucleotide excision-repair is ideally suited for such large-scale defects in DNA. After the identification of the defective piece of the DNA, the DNA double helix is unwound to expose the damaged part.

An excision nuclease (exinuclease) cuts the DNA on either side (upstream and downstream) of the damaged DNA. This defective piece is degraded. The gap created by the nucleotide excision is filled up by DNA polymerase which gets ligated by DNA ligase (Fig. 3.17).

Xeroderma pigmentosum (XP) is a rare autosomal recessive disease. The affected patients are photosensitive and susceptible to skin cancers. It is now recognized that XP is due to a defect in the nucleotide excision repair of the damaged DNA.

Mismatch reparatie:

Despite high accuracy in replication, defects do occur when the DNA is copied. For instance, cytosine (instead of thymine) could be incorporated opposite to adenine. Mismatch repair corrects a single mismatch base pair e.g. C to A, instead of T to A.

The template strand of the DNA exists in a methylated form, while the newly synthesized strand is not methylated. This difference allows the recognition of the new strands. The enzyme GATC endonuclease cuts the strand at an adjacent methylated GATC sequence (Fig. 3.18). This is followed by an exonuclease digestion of the defective strand, and thus its removal. A new DNA strand is now synthesized to replace the damaged one.

Hereditary non-polyposis colon cancer (HNPCC) is one of the most common inherited cancers. This cancer is now linked with faulty mismatch repair of defective DNA.

Double-strand break repair:

Double-strand breaks (DSBs) in DNA are dangerous. They result in genetic recombination which may lead to chromosomal translocation, broken chromosomes, and finally cell death. DSBs can be repaired by homologous recombination or non-homologous end joining. Homologous recombination occurs in yeasts while in mammals, non-homologous and joining dominates.

Defects in DNA Repair and Cancer:

Cancer develops when certain genes that regulate normal cell division fail or are altered. Defects in the genes encoding proteins involved in nucleotide-excision repair, mismatch repair and re-combinational repair are linked to human cancers. For instance, HNPCC is due to a defect in mismatch repair.


The 9-1-1 DNA Clamp Is Required for Immunoglobulin Gene Conversion

Afb. 1 . Expression level of AID in DT40 cells. (A) Reverse transcriptase PCR analysis of the AID transcripts in total RNA from the indicated cells. Primers for the AID transcripts were designed based on the conserved sequences of mouse and chicken cDNAs. Relative values were calculated by dividing the level of AID by that of β-actin (internal control). AID o/e, AID overexpression. (B) Quantification of the expression level of chicken AID by Western blotting. Cdk2 is shown as a loading control. Afb. 2 . Analysis of Vλ sequences following overexpression of mouse AID transgene. (A) Comparison of Ig gene conversion (Ig GC) rates in untreated, TSA-treated, and AID-overexpressing wild-type DT40 cells. (B) Ig gene conversion and single-base substitution events in wild-type parental DT40 cells, TSA-treated cells, and AID-overexpressing cells. Each horizontal line represents the rearranged Vλ gene (450 bp) with mutations classified, as described in the text, as nontemplated base substitution (lollipop shape), long-tract GC (horizontal bar above line), or single-nucleotide substitutions that could be the result of PMs or gene conversion (Amb, vertical bar). Deletions, duplications, and insertions are excluded. (C) Proportion of nontemplated single-base substitution (PM), long-tract GC, and Amb mutations. Segment sizes are proportional to the number of sequences, with the numbers of mutations indicated around the outsides of the pie charts. The total number of Vλ sequences analyzed is indicated in the center of each chart. (D) Proportion of ψV donor segments used in TSA-treated and AID-overexpressing wild-type cells. Data in panels B, C, and D are pooled from the analyses of more than four independent clones. Afb. 3 . Point mutations at A/T base pairs are caused by short-tract gene conversion. (A) Rate of nontemplated single-base substitution (PM) compared to that of single-base substitution of Amb origin in wild-type and pseudo-V gene-deleted (ψVPCNA +/+ /AID −/− /rAID/v-myb/ψV − in Table 1) DT40 cells. Cells were clonally expanded for 2 weeks. Two clones were analyzed from each data set. (B) Nucleotide substitution preferences (as a percentage of the total mutations) deduced from the Vλ sequence analysis of the clones shown in panel A. Preference is shown for mutations categorized as nontemplated base substitution (PM) and those categorized as Amb. Data are from reference 40. Afb. 4 . Templated point mutations at A/T and gene conversion promoted by polymerase η, Rad9, and Rad17. (A) Rates are shown for nontemplated single-base substitution (PM), Amb point mutation, and Ig gene conversion (GC) in the indicated genotypes with AID overexpression. Clones were expanded for 2 weeks. More than two clones were analyzed from each data set. (B) Nucleotide substitution preference was deduced from Vλ sequence analysis of cells deficient in Polη, PCNA ubiquitylation, Xrcc3, Rad54, Rad9, and Rad17, as shown in Fig. 3B. Let daar op PCNA K164R /ψV − (PCNA K164R/K164R /AID −/− /rAID/v-myb/ψV − in Table 1) cells lack the whole pseudo-V genes on the rearranged allele. Afb. 5 . Monoubiquitylation of PCNA promotes Ig gene conversion. Comparison of gene conversion rates and tracts in parental wild-type (A) and PCNA K164R (B) cells. Results are the same as those shown in Fig. 2. Cells were cultured for 6 weeks. Let daar op PCNA K164R /AID −/− R (PCNA K164R/K164R /AID −/− /rAID/v-myb) cells contain pseudo-V genes and were generated from the parental wild-type/AID −/− R (PCNA +/+ /AID −/− /rAID/v-myb) cells shown in Table 1. Afb. 6 . HR-mediated DSB repair compromised in RAD9 −/− , RAD17 − / − and PCNA K164R cellen. (A) HR-mediated DSB repair was measured in cells containing the DR-GFP substrate inserted in the OVALBUMIN plaats. GFP-positive fractions were determined by flow cytometry. (B) Colony survival in asynchronous populations of cells exposed to camptothecin, a topoisomerase I toxin. The left panel shows genotypes of the wild-type and PCNA K164R cells as PCNA +/+ /AID − / − /rAID/v-myb/ψV en PCNA K164R/K164R /AID − / − /rAID/v-myb/ψV − , respectively. Error bars show the means ± standard deviations for at least three separate experiments. (C) Spontaneous (Spont.)- and cisplatin (CDDP)-induced SCE in RAD9 − / − and RAD17 − / − cells.

Kunstverbinding

A replication fork is formed when helicase separates the DNA strands at the origin of replication. The DNA tends to become more highly coiled ahead of the replication fork. Topoisomerase breaks and reforms DNA’s phosphate backbone ahead of the replication fork, thereby relieving the pressure that results from this “supercoiling.” Single-strand binding proteins bind to the single-stranded DNA to prevent the helix from re-forming. Primase synthesizes an RNA primer. DNA polymerase III uses this primer to synthesize the daughter DNA strand. On the leading strand, DNA is synthesized continuously, whereas on the lagging strand, DNA is synthesized in short stretches called Okazaki fragments. DNA polymerase I replaces the RNA primer with DNA. DNA ligase seals the gaps between the Okazaki fragments, joining the fragments into a single DNA molecule. (credit: wijziging van het werk van Mariana Ruiz Villareal)

Vraag: Je isoleert een celstam waarbij de samenvoeging van Okazaki-fragmenten verstoord is en vermoedt dat er een mutatie is opgetreden in een enzym dat zich bij de replicatievork bevindt. Welk enzym is het meest waarschijnlijk gemuteerd?

De replicatievork beweegt met een snelheid van 1000 nucleotiden per seconde. Topoisomerase voorkomt dat de dubbele DNA-helix vóór de replicatievork wordt gewikkeld terwijl het DNA zich opent, door tijdelijke inkepingen in de DNA-helix te veroorzaken en deze vervolgens opnieuw af te sluiten. Because DNA polymerase can only extend in the 5' to 3' direction, and because the DNA double helix is antiparallel, is er een klein probleem bij de replicatievork. De twee template-DNA-strengen hebben tegengestelde oriëntaties: one strand is in the 5' to 3' direction and the other is oriented in the 3' to 5' direction. Only one new DNA strand, the one that is complementary to the 3' to 5' parental DNA strand, can be synthesized continuously towards the replication fork. Deze continu gesynthetiseerde streng staat bekend als de leidende streng. The other strand, complementary to the 5' to 3' parental DNA, is extended away from the replication fork, in small fragments known as Okazaki fragments, each requiring a primer to start the synthesis. Nieuwe primersegmenten worden in de richting van de replicatievork gelegd, maar wijzen er elk van af. (Okazaki-fragmenten zijn genoemd naar de Japanse wetenschapper die ze voor het eerst ontdekte. De streng met de Okazaki-fragmenten staat bekend als de lagging strand.)

Zodra het chromosoom volledig is gerepliceerd, verplaatsen de twee DNA-kopieën zich tijdens de celdeling naar twee verschillende cellen.

Het proces van DNA-replicatie kan als volgt worden samengevat:

  1. DNA wikkelt zich af bij de oorsprong van replicatie.
  2. Helicase opent de DNA-vormende replicatievorken, deze worden bidirectioneel verlengd.
  3. Enkelstrengs bindende eiwitten omhullen het DNA rond de replicatievork om terugspoelen van het DNA te voorkomen.
  4. Topoisomerase bindt in het gebied vóór de replicatievork om supercoiling te voorkomen.
  5. Primase synthetiseert RNA-primers die complementair zijn aan de DNA-streng.
  6. DNA polymerase III starts adding nucleotides to the 3'-OH end of the primer.
  7. Verlenging van zowel de achterblijvende als de leidende streng gaat door.
  8. RNA-primers worden verwijderd door exonuclease-activiteit.
  9. Hiaten worden opgevuld door DNA pol I door dNTP's toe te voegen.
  10. De opening tussen de twee DNA-fragmenten wordt afgesloten door DNA-ligase, wat helpt bij de vorming van fosfodiesterbindingen.

Table summarizes the enzymes involved in prokaryotic DNA replication and the functions of each.

Prokaryotische DNA-replicatie: enzymen en hun functie
Enzym/eiwitSpecifieke functie:
DNA-pol IVerwijdert RNA-primer en vervangt deze door nieuw gesynthetiseerd DNA
DNA pol IIIMain enzyme that adds nucleotides in the 5'-3' direction
helicaseOpent de DNA-helix door waterstofbruggen tussen de stikstofbasen te verbreken
ligaseDicht de openingen tussen de Okazaki-fragmenten af ​​om één doorlopende DNA-streng te creëren
PrimaseSynthetiseert RNA-primers die nodig zijn om replicatie te starten
SchuifklemHelpt de DNA-polymerase op zijn plaats te houden wanneer nucleotiden worden toegevoegd
topoisomeraseHelpt het DNA te ontlasten bij het afwikkelen door breuken te veroorzaken en vervolgens het DNA opnieuw af te sluiten
Enkelstrengs bindende eiwitten (SSB)Bindt aan enkelstrengs DNA om te voorkomen dat DNA terugspoelt.


Dankbetuigingen

We thank Xiaoxian Cao, Meindert Lamers, Kyle Simonetta, Brian Kelch, and Jodi Gureasko for valuable discussions and technical assistance, Steven Kazmirski for providing the model of the open clamp, and Kouta Mayanagi and Kosuke Morikawa for sharing the ligase-PCNA-DNA EM reconstruction. This work was supported in part by grants to J.K. from the NIH (GM045547) and NCI (CA092584). The Advanced Light Source is supported by the U.S. Department of Energy under contract DE-AC03-76SF00098 at the Lawrence Berkeley National Laboratory.


A chromosome is a long chain of DNA packaged together with a collection of proteins. The human genome (all the genetic information in your cells) is contained in 23 pairs of chromosomes. Each cell has its own complete compete of your genome. The reason eye-ball cells are different from liver cells is that certain liver genes are turned off in eye-ball cells and vice versa.

When a sexually reproducing plant or animal reproduces, half of its chromosomes are shuffled together with half the chromosomes of its sexual partner. The result is a child with half its DNA from its mother and half from its father.

For Teachers

The content of this video meets criteria in the following Disciplinary Core Ideas defined by Next Generation Science Standards. Use our videos to supplement classroom curriculum.

High School, Life Science 1

From Molecules to Organisms: Structures and Processes.

High School, Life Science 3

Heredity: Inheritance and Variation of Traits.

High School, Life Science 4

Biological Evolution: Unity and Diversity.

Georgia Biology 1

Relationships between structures and functions in living cells.

Georgia Biology 3

How biological traits are passed on to successive generations.

Georgia Biology 6

Bijdragers

Our videos benefit from guidance and advice provided by experts in science and education. This animation is the result of collaboration between the following scientists, educators, and our team of creatives.

Advisors

Transcript

A chromosome is a single strand of DNA along with a group of proteins that process and package that DNA.

The purpose of a chromosome, is to carry the genes of a living thing. Genes are special segments of DNA that tell a creature’s body how to grow and function.

Most bacteria just have one chromosome, wolves and dogs have 78, pea plants have 14, and us Humans have 46 chromosomes inside each one of our cells.

Together, your 46 chromosomes contain all the genes or, units of instruction, needed to make you who you are.

For most of a cell’s life, its chromosomes are loosely mixed together sort of like a bowl of spaghetti. This loose packaging of DNA and protein, allow the cell to find and use all of the individual genes it needs.

Cells reproduce through a special process called mitosis. They duplicate each Chromosome, or strand of DNA inside their guts, separate the two copies to either side of their body, and then split in two, right down the middle.

The process of sorting out individual DNA strands and safely moving these delicate structures to either side of the cell is virtually impossible to do when chromosomes are loosely mixed and tangled up in spaghetti form.

For this reason, after DNA is duplicated but before it’s moved to either side of the cell, special packaging proteins called Histones, attach to and gently coil each strand of DNA. They start by forming beads which bunch up to make tubes which clump into loops that eventually condense into a durable, flexible chromosome capsule.

Condensed chromosomes can be easily identified and sorted by the cell. They can be moved and manipulated without breaking.

The 4 legged chromosome shown here, which can be thought of as two spools of yarn, joined together at the hip, Is what we call a duplicated Chromosome. The left side contains the original strand of DNA, all wound up tightly, the right side contains the new copy of DNA that was made before the chromosome condensed.

Before a cell splits in two, protein fibers inside the cell grab the duplicated Chromosome by the hips, and rip it apart, dragging one half to the left, and the other half to the right.

Different Chromosomes come in different shapes and sizes. Scientists discovered that if you organize human chromosomes from longest to shortest, they sort into 23 pairs. One member of each pair came from your Dad, one member of each pair came from your Mom.

Paired Chromosomes are almost identical to each other. They contain the same genes in the same locations. The DNA code in the genes from your mother however, might be a few letters different than the DNA code that came from your father. In other words, chromosome pairs (even though they contain the same genes) may contain slightly different versions of those genes.

For example: Your mom might have given you genes for a long pointy nose, while your dad gave you genes for a wide stubby nose. Depending on who’s nose genes end up being more powerful, you might grow a pointy nose, you might grow a wide nose, or if you’re lucky, your nose might come out wide and pointy.

If you decide to have children of your own, you ‘ll pass on one copy of half of your chromosomes (some of which you originally got from you mom, some from you originally got from your dad). You’ll combine these chromosomes with half of the chromosomes from your partner, and together you’ll create a genetically unique new life.

So just to sum things up a bit, what exactly is a chromosome?

A Chromosome is a single complete strand of DNA, along with an associated group of packaging proteins.

Humans have 46 chromosomes, 23 from mom, 23 from dad. Together these 46 chromosomes contain all the genes needed to make you who you are.


Biologie 171

Aan het einde van dit gedeelte kunt u het volgende doen:

  • Discuss the similarities and differences between DNA replication in eukaryotes and prokaryotes
  • State the role of telomerase in DNA replication

Eukaryotic genomes are much more complex and larger in size than prokaryotic genomes. Eukaryotes also have a number of different linear chromosomes. The human genome has 3 billion base pairs per haploid set of chromosomes, and 6 billion base pairs are replicated during the S phase of the cell cycle. There are multiple origins of replication on each eukaryotic chromosome humans can have up to 100,000 origins of replication across the genome. The rate of replication is approximately 100 nucleotides per second, much slower than prokaryotic replication. In yeast, which is a eukaryote, special sequences known as autonomously replicating sequences (ARS) are found on the chromosomes. These are equivalent to the origin of replication in E coli.

The number of DNA polymerases in eukaryotes is much more than in prokaryotes: 14 are known, of which five are known to have major roles during replication and have been well studied. They are known as pol α, pol β, pol γ, pol δ, and pol ε.

The essential steps of replication are the same as in prokaryotes. Before replication can start, the DNA has to be made available as a template. Eukaryotic DNA is bound to basic proteins known as histones to form structures called nucleosomes. Histones must be removed and then replaced during the replication process, which helps to account for the lower replication rate in eukaryotes. The chromatin (the complex between DNA and proteins) may undergo some chemical modifications, so that the DNA may be able to slide off the proteins or be accessible to the enzymes of the DNA replication machinery. At the origin of replication, a pre-replication complex is made with other initiator proteins. Helicase and other proteins are then recruited to start the replication process ((Figure)).

Difference between Prokaryotic and Eukaryotic Replication
Property prokaryoten Eukaryoten
Origin of replication Single Meerdere
Rate of replication 1000 nucleotides/s 50 to 100 nucleotides/s
DNA polymerase types 5 14
Telomerase Not present Cadeau
RNA primer removal DNA-pol I RNase H
Strand elongation DNA pol III Pol α, pol δ, pol ε
Sliding clamp Sliding clamp PCNA

A helicase using the energy from ATP hydrolysis opens up the DNA helix. Replication forks are formed at each replication origin as the DNA unwinds. The opening of the double helix causes over-winding, or supercoiling, in the DNA ahead of the replication fork. These are resolved with the action of topoisomerases. Primers are formed by the enzyme primase, and using the primer, DNA pol can start synthesis. Three major DNA polymerases are then involved: α, δ and ε. DNA pol α adds a short (20 to 30 nucleotides) DNA fragment to the RNA primer on both strands, and then hands off to a second polymerase. While the leading strand is continuously synthesized by the enzyme pol δ, the lagging strand is synthesized by pol ε. A sliding clamp protein known as PCNA (proliferating cell nuclear antigen) holds the DNA pol in place so that it does not slide off the DNA. As pol δ runs into the primer RNA on the lagging strand, it displaces it from the DNA template. The displaced primer RNA is then removed by RNase H (AKA flap endonuclease) and replaced with DNA nucleotides. The Okazaki fragments in the lagging strand are joined after the replacement of the RNA primers with DNA. The gaps that remain are sealed by DNA ligase, which forms the phosphodiester bond.

Telomere replication

Unlike prokaryotic chromosomes, eukaryotic chromosomes are linear. As you’ve learned, the enzyme DNA pol can add nucleotides only in the 5′ to 3′ direction. In the leading strand, synthesis continues until the end of the chromosome is reached. On the lagging strand, DNA is synthesized in short stretches, each of which is initiated by a separate primer. When the replication fork reaches the end of the linear chromosome, there is no way to replace the primer on the 5’ end of the lagging strand. The DNA at the ends of the chromosome thus remains unpaired, and over time these ends, called telomeren, may get progressively shorter as cells continue to divide.

Telomeres comprise repetitive sequences that code for no particular gene. In humans, a six-base-pair sequence, TTAGGG, is repeated 100 to 1000 times in the telomere regions. In a way, these telomeres protect the genes from getting deleted as cells continue to divide. The telomeres are added to the ends of chromosomes by a separate enzyme, telomerase ((Figure)), whose discovery helped in the understanding of how these repetitive chromosome ends are maintained. The telomerase enzyme contains a catalytic part and a built-in RNA template. It attaches to the end of the chromosome, and DNA nucleotides complementary to the RNA template are added on the 3′ end of the DNA strand. Once the 3′ end of the lagging strand template is sufficiently elongated, DNA polymerase can add the nucleotides complementary to the ends of the chromosomes. Zo worden de uiteinden van de chromosomen gerepliceerd.


Telomerase is typically active in germ cells and adult stem cells. It is not active in adult somatic cells. For their discovery of telomerase and its action, Elizabeth Blackburn, Carol W. Greider, and Jack W. Szostak ((Figure)) received the Nobel Prize for Medicine and Physiology in 2009.


Telomerase and Aging

Cells that undergo cell division continue to have their telomeres shortened because most somatic cells do not make telomerase. Dit betekent in wezen dat telomeerverkorting wordt geassocieerd met veroudering. With the advent of modern medicine, preventative health care, and healthier lifestyles, the human life span has increased, and there is an increasing demand for people to look younger and have a better quality of life as they grow older.

In 2010, scientists found that telomerase can reverse some age-related conditions in mice. This may have potential in regenerative medicine. 1 Telomerase-deficient mice were used in these studies these mice have tissue atrophy, stem cell depletion, organ system failure, and impaired tissue injury responses. Telomerase reactivation in these mice caused extension of telomeres, reduced DNA damage, reversed neurodegeneration, and improved the function of the testes, spleen, and intestines. Reactivering van telomeer kan dus potentieel hebben voor de behandeling van leeftijdsgerelateerde ziekten bij mensen.

Cancer is characterized by uncontrolled cell division of abnormal cells. The cells accumulate mutations, proliferate uncontrollably, and can migrate to different parts of the body through a process called metastasis. Scientists have observed that cancerous cells have considerably shortened telomeres and that telomerase is active in these cells. Interestingly, only after the telomeres were shortened in the cancer cells did the telomerase become active. If the action of telomerase in these cells can be inhibited by drugs during cancer therapy, then the cancerous cells could potentially be stopped from further division.

Section Summary

Replicatie in eukaryoten begint bij meerdere replicatieoorsprongen. The mechanism is quite similar to that in prokaryotes. Er is een primer nodig om de synthese te starten, die vervolgens wordt verlengd door DNA-polymerase omdat het nucleotiden één voor één aan de groeiende keten toevoegt. De leidende streng wordt continu gesynthetiseerd, terwijl de achterblijvende streng wordt gesynthetiseerd in korte stukken die Okazaki-fragmenten worden genoemd. The RNA primers are replaced with DNA nucleotides the DNA Okazaki fragments are linked into one continuous strand by DNA ligase. The ends of the chromosomes pose a problem as the primer RNA at the 5’ ends of the DNA cannot be replaced with DNA, and the chromosome is progressively shortened. Telomerase, an enzyme with an inbuilt RNA template, extends the ends by copying the RNA template and extending one strand of the chromosome. DNA polymerase can then fill in the complementary DNA strand using the regular replication enzymes. Op deze manier worden de uiteinden van de chromosomen beschermd.

Gratis antwoord

How do the linear chromosomes in eukaryotes ensure that its ends are replicated completely?

Telomerase has an inbuilt RNA template that extends the 3′ end, so primer is synthesized and extended. Thus, the ends are protected.

Voetnoten

    Jaskelioff et al., “Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice,” Natuur 469 (2011): 102-7.

Woordenlijst


Bekijk de video: DNA replicatie Geüpdatet (Januari- 2022).