Informatie

12.5: Voorbeelden van gebruik van aminozuren als biosynthetische voorloper - Biologie


12.5: Voorbeelden van gebruik van aminozuren als biosynthetische voorloper

Aminozuurhomeostase en signalering in zoogdiercellen en organismen

Cellen hebben een constante omzet van eiwitten die in de loop van de tijd de meeste aminozuren recyclen. Nettoverlies is voornamelijk te wijten aan aminozuuroxidatie. Homeostase wordt bereikt door uitwisseling van essentiële aminozuren met niet-essentiële aminozuren en de overdracht van aminogroepen van geoxideerde aminozuren naar aminozuurbiosynthese. Deze homeostatische toestand wordt in stand gehouden door een actief mTORC1-complex. Bij uitputting van aminozuren wordt mTORC1 geïnactiveerd. Dit verhoogt de afbraak van cellulaire eiwitten door autofagie en vermindert de eiwitbiosynthese. De niet-derepresseerbare 2/ATF4-route van algemene controle kan bovendien worden geactiveerd, wat resulteert in transcriptie van genen die betrokken zijn bij aminozuurtransport en biosynthese van niet-essentiële aminozuren. Het metabolisme wordt automatisch gereguleerd om de oxidatie van aminozuren te minimaliseren. Systemische aminozuurniveaus zijn ook strak gereguleerd. Voedselinname verhoogt kortstondig de plasma-aminozuurspiegels, wat de insulineafgifte en mTOR-afhankelijke eiwitsynthese in spieren stimuleert. Overtollige aminozuren worden geoxideerd, wat resulteert in een verhoogde ureumproductie. Kortdurend vasten resulteert niet in uitputting van plasma-aminozuren als gevolg van verminderde eiwitsynthese en het begin van autofagie. Omdat de helft van alle aminozuren essentieel is, zijn vermindering van de eiwitsynthese en aminozuuroxidatie de enige twee maatregelen om de vraag naar aminozuren te verminderen. Langdurige ondervoeding veroorzaakt uitputting van plasma-aminozuren. Het CZS lijkt een eiwitspecifieke respons te genereren bij aminozuurdepletie, wat resulteert in het vermijden van een ontoereikend dieet. Een hoog eiwitgehalte draagt ​​daarentegen samen met andere voedingsstoffen bij aan een vermindering van de voedselinname.


Wat zijn aminozuren?

Nou, aminozuren in voedsel vormen eiwitten. Wanneer eiwit wordt verteerd, wordt het weer afgebroken tot specifieke aminozuren, die vervolgens selectief worden samengesteld voor verschillende toepassingen. Deze nieuwe eiwitten die in het lichaam worden gevormd, vormen de meeste vaste stoffen in het lichaam: huid, ogen, hart, darmen, botten en natuurlijk spieren.

Daarom kan het heel nuttig zijn om te begrijpen wat elk van deze aminozuren kan doen en om er meer van in uw dieet te krijgen, om specifieke doelen te bereiken, zoals spieropbouw. Natuurlijk moet je niet overdrijven, want een goede eiwitbalans zorgt voor gezondheid en stabiliteit, zonder dat een van de aminozuren giftig kan worden.

Een kwestie die aan de orde is gesteld in het geval van fenylalanine, maar geldt voor alle aminozuren. Om mogelijke schadelijke effecten tegen te gaan, is het belangrijk om voldoende vitamines en mineralen binnen te krijgen, omdat ze zorgen voor een goede omzetting van eiwit naar amino en vice versa.

Afhankelijk van met wie je praat, zijn er ongeveer 20 tot 22 standaard aminozuren. Van die 20-22 worden er 8 tot 10 als essentieel beschouwd, wat betekent dat je een bepaalde hoeveelheid van hen in je dieet moet krijgen om goed te kunnen functioneren - ons lichaam kan ze niet synthetiseren uit andere materialen, dus we krijgen ze alleen uit voedsel .

Aangezien aminozuren de bouwstenen van eiwitten zijn, weet ik zeker dat je ze allemaal in overvloed binnenkrijgt, maar dit artikel zal je de voordelen laten zien van het aanvullen met extra vrije vorm aminozuren, waarbij dieper wordt ingegaan op wat te veel of te weinig is. van een aantal van hen kunnen doen, wat ze in het lichaam doen en hoeveel en wanneer u ze moet gebruiken.

Naast de 8 essentiële aminozuren zijn er ongeveer 14 niet-essentiële aminozuren en een hele reeks andere metabolieten geclassificeerd als aminozuren die zijn afgeleid van de 8 essentiële aminozuren. Naast de 8 essentiële aminozuren, zal ik proberen een aantal van hen te bespreken die de laatste tijd de krantenkoppen hebben gehaald: L-Glutamine, L-Arginine, L-Carnitine, L-Cysteïne en HMB.


Aminozuren in planten: regulering en functies bij ontwikkeling en stressverdediging

Onderzoek naar het aminozuurmetabolisme kreeg lange tijd slechts beperkte aandacht op het gebied van plantenfysiologie en biochemie. Vanwege de essentiële functie van aminozuren bij de eiwitsynthese was het verleidelijk om aan te nemen dat planten aminozuren op dezelfde manier gebruiken en metaboliseren als .

Onderzoek naar het aminozuurmetabolisme kreeg lange tijd slechts beperkte aandacht op het gebied van plantenfysiologie en biochemie. Vanwege de essentiële functie van aminozuren in de eiwitsynthese, was het verleidelijk om aan te nemen dat planten aminozuren op dezelfde manier gebruiken en metaboliseren als micro-organismen of mensen. Als volledig autotrofe organismen staan ​​planten echter voor fundamenteel andere uitdagingen dan organismen die leven van door planten (of algen) geproduceerde biomassa. Bovendien produceren planten letterlijk honderden niet-proteïnogene aminozuren of van aminozuren afgeleide secundaire metabolieten en hebben ze dus een zeer duidelijk regulerend systeem nodig om de behoeften van het primaire en secundaire metabolisme te coördineren. De verdeling van het aminozuurmetabolisme tussen wortels en bovengrondse organen of tussen de verschillende subcellulaire compartimenten voegt een ander niveau van complexiteit toe dat planten verder onderscheidt van prokaryoten of dieren.

Vanuit het perspectief van menselijke voeding zijn de aminozuren die we niet zelf kunnen synthetiseren het meest interessant. Dienovereenkomstig hebben de inspanningen om de routes en regulatie van de biosynthese van Lys, Met en Trp te begrijpen, het aminozuuronderzoek in planten gestimuleerd, aangezien deze drie aminozuren vaak in beperkte hoeveelheden aanwezig zijn in stapelgewassen. Vanuit een agrarisch perspectief werden biosyntheseroutes van aminozuren die uitsluitend in planten voorkomen, geanalyseerd en gebruikt voor de ontwikkeling van herbiciden.

Op dit moment vragen de dreigingen van klimaatverandering en grondwaterverontreiniging door overmatige stikstofbemesting om een ​​heroriëntatie van onze inspanningen. Optimale productiviteit wordt momenteel bereikt door massale toepassing van stikstofhoudende meststoffen en wordt toch beperkt door de efficiëntie van de planten bij het opnemen, distribueren, opslaan en assimileren van de stikstof, waarbij al deze processen worden bepaald door aminozuurmetabolisme en -transport. Evenzo omvatten veel afweerreacties van planten tegen biotische of abiotische stress metabole aanpassingen in het aminozuurmetabolisme om schadelijke milieueffecten direct tegen te gaan of om voorlopers voor verdedigingsverbindingen te verschaffen. Verschillende aminozuren komen naar voren als belangrijke signaalmoleculen die de groei en ontwikkeling van planten orkestreren door de metabole status van de plant te integreren met omgevingssignalen, vooral in stressvolle omstandigheden. Onze kennis over het aminozuurmetabolisme, de mechanismen die de niveaus van vrije aminozuren reguleren en de diverse functies van aminozuren in planten is echter verre van compleet.

Dit onderzoeksonderwerp heeft tot doel bijdragen te verzamelen van verschillende facetten van aminozuurmetabolisme, transport of signalering om de nieuwste ontwikkelingen in ons begrip van de meerdere functies van aminozuren in planten samen te brengen en te integreren in een uitgebreid overzicht. Alle soorten artikelen met betrekking tot dit gebied van plantenfysiologie, inclusief origineel onderzoek, recensies, minirecensies, methoden, commentaren en meningen zijn welkom.

Trefwoorden: aminozuurmetabolisme, aminozuurtransport, stressreacties, stikstofdetectie, signalering en assimilatie, efficiëntie van stikstofgebruik, gewasverbetering

Belangrijke notitie: Alle bijdragen aan dit onderzoeksonderwerp moeten vallen binnen de reikwijdte van de sectie en het tijdschrift waaraan ze worden voorgelegd, zoals gedefinieerd in hun missieverklaringen. Frontiers behoudt zich het recht voor om een ​​manuscript dat buiten het bereik valt in elk stadium van peer review naar een meer geschikte sectie of tijdschrift te leiden.


Resultaten

Initiële evaluatie van urinaire excretiepatronen

Aanvankelijk werden 172 deelnemers (18 jaar of ouder) gerekruteerd uit het grote publiek voor fase 1 van het onderzoek. Een laatste studiegroep van 151 proefpersonen leverde urinemonsters en volledige antwoorden op vragenlijsten en was naar verluidt vrij van enige significante medische aandoening. De deelnemersgroep bestond uit 99 mannen met een gemiddelde leeftijd van 29,5 ± 11,8 (gemiddelde ± SD) en 52 vrouwen met een gemiddelde leeftijd van 35 ± 13,7. De eerste fase van het onderzoek omvatte het beoordelen van de pre-suppletie-urine-excretieprofielen van de 151 rekruten. De aminozuursamenstellingen werden bepaald door middel van GC-FID-analyses en gebruikt om een ​​dataset te genereren van relatieve percentage-abundanties van 29 aminozuren en aminozuurderivaten. Deze gegevens werden beoordeeld met behulp van k-means-clusteringstechnieken om te bepalen dat de deelnemers aan de studie konden worden verdeeld in drie clusters op basis van de relatieve aminozuur-abundanties met een minimaal clusterlidmaatschap van N > 10. Vervolgens werd standaard discriminantfunctie-analyse toegepast om te bepalen of elk van de clusters significant verschillende aminozuurprofielen had (Wilks’ Lambda = 0,13, F(46,252) = 9,85, P < 0,0001), zoals weergegeven in de canonieke grafiek (Fig. 2), waarbij glycine- en histidineniveaus het belangrijkste onderscheid tussen de groepen vormen. De leden in elke cluster waren nauw gegroepeerd op basis van hun urine-excretieprofielen en elke subgroep was duidelijk gescheiden van de andere subgroepen met minimale overlap.

Discriminerende functie canonieke plot van subgroepen gegenereerd via k-means clustering

Zeventien aminozuren droegen bij aan het differentiëren van de samenstellingsprofielen van de clusters door significante verschillen in relatieve abundanties voor de subgroepen te vertonen en de concentraties van de belangrijkste componenten zijn samengevat in Tabel 2. Histidine en glycine waren de meest voorkomende aminozuren in de urineprofielen en vertoonden verschillende relatieve abundanties voor elk van de drie clusters. Cluster 1 werd gekenmerkt door een hoge histidine tot glycine-verhouding van 2,0, cluster 2 vertoonde een lage verhouding van 0,4 en cluster 3 had equivalente niveaus, resulterend in een verhouding van 1,0. Cluster 1 had de hoogste totale urineconcentratie van uitgescheiden aminozuren, waarbij de histidinespiegels 2,4 - 3,6 keer hoger waren dan die in respectievelijk clusters 3 en 2. Cluster 1 had ook significant hogere concentraties van glutamine, tyrosine en de vertakte aminozuren in vergelijking met beide clusters 2 en 3. Bovendien waren serine en alanine hoger in cluster 1 in vergelijking met cluster 3 (Tabel 2). Cluster 2 was in deze parameters gelijk aan cluster 3, maar onderscheidde zich duidelijk door de hoge mate van glycine-excretie in de urine.

De objectieve verdeling door k-betekent clustering van onderwerpen op basis van overeenkomsten in hun urinaire excretieprofiel verwijderde gebruikersbias bij groepstoewijzing. Cluster 3 had de hoogste frequentie van lidmaatschap (46%) gevolgd door cluster 1 (32%) en vervolgens cluster 2 (22%) zoals weergegeven in tabel 2. De drie subgroepen binnen het onderzoekscohort hadden vergelijkbare BMI-waarden en waren voornamelijk blank. Clusters 1 en 3 hadden vergelijkbare gemiddelde leeftijden, maar cluster 2 had een significant hogere gemiddelde leeftijd dan beide clusters 1 en 3. Het geslacht was niet gelijk verdeeld over de drie groepen waar cluster 2 voornamelijk vrouwen bevatte (P < 0,05). Zestien van de 27 mannen die zichzelf als atleten identificeerden, werden toegewezen aan cluster 1, tien aan cluster 3 en slechts één aan cluster 2. Er waren geen significante verschillen in totale aminozuurconcentraties tussen de geslachten in het hele studiecohort waar mannen (N = 99) had een gemiddeld niveau van 5185 ± 290 μmol/L (gemiddelde ± SEM) en vrouwen (N = 52) 4955 ± 452 mol/L. Vergelijkingen tussen de urinesamenstellingen van aminozuren bij mannen en vrouwen lieten significante verschillen zien voor glutaminezuur (mannen 16,7 ± 2 versus vrouwen 25,0 ± 3 μmol/L, P < 0,05), glycine-proline dipeptide (78,0 ± 5 vs 54,7 ± 6 μmol/L, P < 0,01), proline-hydroxyproline dipeptide (234,3 ± 15 vs 154,7 ± 19 mol/L, P < 0,01) en tyrosine (96,8 ± 7 vs 72,8 ± 9 mol/L, P < 0,05).

Vermoeidheidsniveaus werden beoordeeld met behulp van de Chalder-vermoeidheidsschaal [26], waar de gemiddelde totale vermoeidheidsscore werd berekend op 13,6 ± 5,9 (gemiddelde ± SD) voor de hele groep. Uit evaluatie van de clusters bleek echter dat cluster 2 een significant hoger niveau van totale vermoeidheid had in vergelijking met cluster 1, terwijl clusters 1 en 3 vergelijkbare scores hadden (tabel 2). De resultaten van de Chalder-vermoeidheidsschaal werden weerspiegeld door de vermoeidheidsindexresultaten afgeleid van de algemene gezondheidsvragenlijst. Cluster 2 rapporteerde ook hogere niveaus van symptomen beoordeeld door de slaapindex in vergelijking met cluster 1.

Er werden correlatieanalyses uitgevoerd om mogelijke associaties tussen de niveaus van urinemetabolieten en de verschillende symptoomindexen voor elk van de clusters te evalueren. Er waren onderscheidende reeksen correlaties opgemerkt voor elk van de clusters met enkele sterke positieve associaties (R > .50) genoteerd voor cluster 1 vrouwtjes (Tabel 3). Het was duidelijk voor vrouwen die behoren tot cluster 1 (N = 13) dat hogere urineconcentraties van glutaminezuur, hydroxylysine, methionine, ornithine, proline en valine allemaal positief gecorreleerd waren met de waarden van de Chalder-score voor lichamelijke vermoeidheid (R >.55, P < 0,05). In dezelfde groep waren toenemende scores in de gastro-intestinale index zeer sterk geassocieerd met hogere urinespiegels van proline (R = .92), methionine (R = .82) en valine (R = 0,70). Deze aminozuren waren ook gecorreleerd met een reeks andere symptomen, zoals weergegeven in Tabel 3. Vrouwen in Cluster 2 vertoonden slechts positieve correlaties voor twee aminozuren, waarbij de urineconcentratie voor asparagine geassocieerd was met de gastro-intestinale index en proline geassocieerd was met alle vier. vermoeidheidsmetingen en de gastro-intestinale index. Daarentegen vertoonden Cluster 3-vrouwen negatieve associaties tussen algemene vermoeidheid en alanine, asparaginezuur, isoleucine, fenylalanine en tyrosine. De mannen in cluster 1 vertoonden negen negatieve correlaties tussen aminozuren en symptomen, waarvan zeven associaties met de gastro-intestinale index (Tabel 4). De mannen uit cluster 2 hadden positieve associaties tussen α-aminoboterzuur en de vier vermoeidheidsindexen. De mannen uit cluster 3 hadden zes symptoomindexen (alle vier vermoeidheidsmaten, pijn en vitaliteit) positief geassocieerd met β-aminoisoboterzuur en vertoonden geen negatieve correlaties.

Evaluatie van aminozuursuppletie

Naleving van de suppletieproef was 51%, waarbij 37 deelnemers de proef met succes voltooiden door het aminozuursupplement gedurende een periode van 25-30 dagen te nemen, evenals algemene gezondheidsvragenlijsten terug te sturen en urinemonsters na het supplement te verstrekken. Het suppletieonderzoek cohort (N = 37) bestond uit 10 vrouwen en had een gemiddelde leeftijd van 33,8 jaar, variërend van 19 tot 65 jaar.

Vermoeidheidsniveaus werden beoordeeld met behulp van zowel de Chalder-vermoeidheidsschaal [26] als een algemene vermoeidheidsindex ontwikkeld door het huidige onderzoeksteam, waarbij lagere scores indicatief waren voor een lager vermoeidheidsniveau voor beide metingen. Na voltooiing van het supplementonderzoek rapporteerden 30 van de groep van 37 deelnemers (81%) een verbetering van hun vermoeidheidsniveau. Een significante vermindering van de gemiddelde totale vermoeidheidsscores voor het gehele cohort werd waargenomen van 13,4 ± 0,8 (gemiddelde ± SEM) tot 8,8 ± 0,6 (Wilcoxon matched pairs-test, P < 0,0001) na suppletie. Algemene gezondheid en welzijn werden ook beoordeeld met behulp van een vragenlijst met 86 items waaruit verschillende indices werden gegenereerd (tabel 1). Scores werden gestandaardiseerd naar waarden op 40, waarbij een score van "0" aangaf dat de proefpersoon geen van de symptomen van die index had, en een score van "40" aangaf dat de proefpersoon alle symptomen in de indexgroep in hoge mate. Na suppletie werden significante reducties gezien in vragenlijstscores die mogelijke verbeteringen vertegenwoordigen in de vermoeidheids-, slaap- en vitaliteitsindices (tabel 5). In antwoord op de vragen over hun ervaring met het gebruik van het supplement, gaven 25 respondenten (68%) aan dat ze vonden dat het supplement hun gezondheid had verbeterd en 28 (76%) verklaarden dat ze het supplement zouden blijven gebruiken als ze de kans kregen.

De zeven deelnemers die geen verbeteringen in vermoeidheid rapporteerden, waren allemaal mannen en hadden een gemiddelde Chalder totale vermoeidheidsscore van 10,0 ± 1,4 (gemiddelde ± SEM) voorafgaand aan suppletie, terwijl de rest van het cohort (n = 30) een significant hoger gemiddelde had. Chaldervermoeidheidsscore van 14,2 ± 0,8 (Mann-Whitney U toets, P < 0,02). De deelnemers die verbeteringen in vermoeidheid vertoonden, hadden dus een hoger niveau van vermoeidheid voordat ze met de suppletie begonnen. De grotere groep die aangaf verlichting van vermoeidheid te hebben ervaren, rapporteerde uiteindelijk vermoeidheidsscores na de suppletie die significant lager waren (8,1 ± 0,6, gemiddelde ± SEM) dan degenen die geen verbeterde vermoeidheid rapporteerden (11,7 ± 1,4, P < 0,04). Zes van de zeven mannen die niet reageerden op de aminozuursuppletie werden geclassificeerd op basis van hun urineprofiel vóór de suppletie als behorend tot cluster 3 en de zevende non-responder werd toegewezen aan cluster 1.


Conclusies

Hierin hebben we codon- en aminozuurgebruik in een cricketmodelsysteem bestudeerd en een significante rol van selectie voorgesteld binnen de meest getranscribeerde genen, op het organisme-brede niveau (tabel 1) en in verschillende weefseltypes (aanvullend bestand 1: tabel S2). Toekomstig onderzoek zou de directe kwantificering van tRNA's in verschillende weefseltypen [39, 48, 74, 113] moeten omvatten, om te beoordelen of die resultaten ondersteuning bieden voor de conclusie van vergelijkbare relatieve tRNA-abundanties over weefseltype en geslacht in deze krekel. Een dergelijke benadering zal ook helpen te onderscheiden waarom deze krekelsoort mogelijk minder geneigd is tot weefselgerelateerde optimale codons dan andere tot nu toe bestudeerde organismen [20, 36, 38, 40]. Hoewel onze gegevens suggereren dat mutatie-AT-bias gedeeltelijk kan bijdragen aan genoombrede codongebruikspatronen in G. bimaculatus, en we sluiten een rol van BGC in de variatie in GC / AT-gehalte tussen genen niet uit, de collectieve patronen zijn consistent met de hypothese dat translationele selectie aanzienlijk bijdraagt ​​​​aan optimaal codongebruik onder hoge transcriptie. Verdere studies zouden de mogelijke rollen van BGC in codongebruik bij deze krekelsoort [85] grondig moeten evalueren, inclusief benaderingen die rekening houden met meiotische recombinatiesnelheden, expressieniveau in meiotische cellen en hun relaties met GC (en dus AT) inhoud (cf. [ 83, 114, 115]), naarmate meer genomische, populatiegegevens en recombinatiegegevens in dit taxon naar voren komen.

Een andere betekenisvolle richting voor toekomstig onderzoek kan de identificatie zijn van de toename van codons in CDS [116], wat een vertraging in de vertaling kan veroorzaken, vooral aan het begin van CDS, en mogelijk de translationele efficiëntie stroomafwaarts van de helling kan verhogen [26, 45, 51, 52, 116]. In het bijzonder hellingen met behulp van de codons met Nonopt-codontRNA's en Opt-codonwiebelen de hierin geïdentificeerde status (Tabel 1) zijn kandidaten om een ​​rol te spelen bij het reguleren van de verlengingssnelheden van translaties met behulp van ramping in CDS, en kan variëren met hoge versus lage expressie. Bovendien suggereert recent onderzoek dat codongebruik en waterstofbindingshellingen een rol kunnen spelen bij het afwikkelen van dsDNA en transcriptionele regulatie, zoals afgeleid in Bacteria and Archaea (maar niet Fungi) [117], en dus biedt dit ook een zinvolle weg voor verder onderzoek in deze cricketmodel en andere meercellige dieren. Ten slotte moeten verdere studies worden uitgevoerd naar de frequenties van zowel optimale als niet-optimale codons en hun relaties met tRNA-abundanties en genfunctionaliteiten in een breder scala van meercellige organismen. Dergelijk onderzoek zal uitwijzen of de verschijnselen die hierin worden waargenomen, worden gedeeld door uiteenlopende systemen.


Wat u moet weten over essentiële aminozuren

Het lichaam heeft 20 verschillende aminozuren nodig om een ​​goede gezondheid en normaal functioneren te behouden. Mensen moeten negen van deze aminozuren, de essentiële aminozuren, binnenkrijgen via voedsel. Goede voedingsbronnen zijn vlees, eieren, tofu, soja, boekweit, quinoa en zuivel.

Aminozuren zijn verbindingen die samen eiwitten vormen. Wanneer een persoon voedsel eet dat eiwitten bevat, breekt hun spijsverteringsstelsel het eiwit af in aminozuren. Het lichaam combineert de aminozuren vervolgens op verschillende manieren om lichaamsfuncties uit te voeren.

Een gezond lichaam kan de andere 11 aminozuren aanmaken, dus deze hoeven meestal niet via de voeding het lichaam binnen te komen.

Aminozuren bouwen spieren op, veroorzaken chemische reacties in het lichaam, transporteren voedingsstoffen, voorkomen ziekte en voeren andere functies uit. Aminozuurtekort kan leiden tot verminderde immuniteit, spijsverteringsproblemen, depressie, vruchtbaarheidsproblemen, lagere mentale alertheid, vertraagde groei bij kinderen en vele andere gezondheidsproblemen.

Elk van de essentiële aminozuren speelt een andere rol in het lichaam en de symptomen van een tekort variëren dienovereenkomstig.

Er zijn veel soorten essentiële aminozuren, waaronder:

Lysine

Lysine speelt een vitale rol bij het opbouwen van spieren, het behouden van de botsterkte, het helpen bij het herstel van een blessure of operatie en het reguleren van hormonen, antilichamen en enzymen. Het kan ook antivirale effecten hebben.

Er is niet veel onderzoek beschikbaar naar lysinedeficiëntie, maar een onderzoek bij ratten geeft aan dat lysinedeficiëntie kan leiden tot stress-geïnduceerde angst.

Histidine

Delen op Pinterest Eiwitrijke voedingsmiddelen, zoals tofu en quinoa, bevatten aminozuren.

Histidine vergemakkelijkt de groei, de aanmaak van bloedcellen en weefselherstel. Het helpt ook om de speciale beschermende laag over zenuwcellen te behouden, die de myelineschede wordt genoemd.

Het lichaam zet histidine om in histamine, wat cruciaal is voor de immuniteit, reproductieve gezondheid en spijsvertering. De resultaten van een onderzoek waarbij vrouwen met obesitas en metabool syndroom werden gerekruteerd, suggereren dat histidinesupplementen de BMI en insulineresistentie kunnen verlagen.

Een tekort kan bloedarmoede veroorzaken en lage bloedspiegels lijken vaker voor te komen bij mensen met artritis en nieraandoeningen.

Threonine

Threonine is noodzakelijk voor een gezonde huid en tanden, omdat het een bestanddeel is van tandglazuur, collageen en elastine. Het helpt het vetmetabolisme te ondersteunen en kan gunstig zijn voor mensen met indigestie, angst en milde depressie.

Een studie uit 2018 wees uit dat een tekort aan threonine bij vissen ertoe leidde dat deze dieren een verminderde weerstand tegen ziekten hadden.

Methionine

Methionine en het niet-essentiële aminozuur cysteïne spelen een rol bij de gezondheid en flexibiliteit van huid en haar. Methionine helpt ook om de nagels sterk te houden. Het helpt de juiste opname van selenium en zink en de verwijdering van zware metalen, zoals lood en kwik.

Valine

Valine is essentieel voor mentale focus, spiercoördinatie en emotionele rust. Mensen kunnen valine-supplementen gebruiken voor spiergroei, weefselherstel en energie.

Een tekort kan slapeloosheid en verminderde mentale functie veroorzaken.

Isoleucine

Isoleucine helpt bij wondgenezing, immuniteit, bloedsuikerregulatie en hormoonproductie. Het is voornamelijk aanwezig in spierweefsel en reguleert het energieniveau.

Oudere volwassenen kunnen meer vatbaar zijn voor isoleucinedeficiëntie dan jongere mensen. Dit tekort kan spierverlies en trillen veroorzaken.

Leucine

Leucine helpt bij het reguleren van de bloedsuikerspiegel en helpt bij de groei en het herstel van spieren en botten. Het is ook nodig voor wondgenezing en de aanmaak van groeihormoon.

Leucine-tekort kan leiden tot huiduitslag, haaruitval en vermoeidheid.

Fenylalanine

Share on Pinterest Sommige light frisdranken bevatten zoetstoffen met fenylalanine.

Fenylalanine helpt het lichaam om andere aminozuren, eiwitten en enzymen te gebruiken. Het lichaam zet fenylalanine om in tyrosine, wat nodig is voor specifieke hersenfuncties.

Fenylalanine-tekort, hoewel zeldzaam, kan leiden tot een slechte gewichtstoename bij zuigelingen. Het kan bij volwassenen ook eczeem, vermoeidheid en geheugenproblemen veroorzaken.

Fenylalanine zit vaak in de kunstmatige zoetstof aspartaam, die fabrikanten gebruiken om light frisdranken te maken. Grote doses aspartaam ​​kunnen het gehalte aan fenylalanine in de hersenen verhogen en kunnen angst en zenuwachtigheid veroorzaken en de slaap beïnvloeden.

Mensen met een zeldzame genetische aandoening die fenylketonurie (PKU) wordt genoemd, zijn niet in staat fenylalanine te metaboliseren. Als gevolg hiervan moeten ze het eten van voedsel vermijden dat een hoog gehalte aan dit aminozuur bevat.

Tryptofaan

Tryptofaan is nodig voor een goede groei bij zuigelingen en is een voorloper van serotonine en melatonine. Serotonine is een neurotransmitter die de eetlust, slaap, stemming en pijn regelt. Melatonine reguleert ook de slaap.

Tryptofaan is een kalmerend middel en het is een ingrediënt in sommige slaapmiddelen. Eén studie geeft aan dat suppletie met tryptofaan de mentale energie en emotionele verwerking bij gezonde vrouwen kan verbeteren.

Een tekort aan tryptofaan kan een aandoening veroorzaken die pellagra wordt genoemd en die kan leiden tot dementie, huiduitslag en spijsverteringsproblemen.

Veel onderzoeken tonen aan dat lage niveaus van eiwitten en essentiële aminozuren de spierkracht en trainingsprestaties beïnvloeden.

Volgens een onderzoek uit 2014 kan het niet krijgen van voldoende essentiële aminozuren een lagere spiermassa veroorzaken bij oudere volwassenen.

Een aanvullend onderzoek toont aan dat aminozuursupplementen sporters kunnen helpen herstellen na inspanning.

Artsen geloofden eerder dat mensen voedsel moesten eten dat alle negen essentiële aminozuren in één maaltijd bevatte.

Als gevolg hiervan was het, tenzij een persoon vlees, eieren, zuivelproducten, tofu of ander voedsel met alle essentiële aminozuren at, noodzakelijk om twee of meer plantaardig voedsel te combineren dat alle negen bevat, zoals rijst en bonen.

Vandaag is die aanbeveling echter anders. Mensen die vegetarisch of veganistisch eten, kunnen hun essentiële aminozuren de hele dag door uit verschillende plantaardige voedingsmiddelen halen en hoeven ze niet per se allemaal tegelijk in één maaltijd te eten.

Hoewel 11 van de aminozuren niet-essentieel zijn, kunnen mensen sommige van hen nodig hebben als ze onder stress staan ​​of een ziekte hebben. Gedurende deze tijden is het lichaam mogelijk niet in staat om genoeg van deze aminozuren aan te maken om de toegenomen vraag bij te houden. Deze aminozuren zijn "voorwaardelijk", wat betekent dat een persoon ze in bepaalde situaties nodig kan hebben.

Soms willen mensen essentiële aminozuursupplementen nemen. Het is het beste om eerst advies in te winnen bij een arts over veiligheid en dosering.

Hoewel het mogelijk is om een ​​tekort aan essentiële aminozuren te hebben, kunnen de meeste mensen er voldoende van binnenkrijgen door een dieet te volgen dat eiwitten bevat.

De voedingsmiddelen in de volgende lijst zijn de meest voorkomende bronnen van essentiële aminozuren:

  • Lysine zit in vlees, eieren, soja, zwarte bonen, quinoa en pompoenpitten.
  • Vlees, vis, gevogelte, noten, zaden en volle granen bevatten grote hoeveelheden histidine.
  • Kwark en tarwekiemen bevatten grote hoeveelheden threonine.
  • Methionine zit in eieren, granen, noten en zaden.
  • Valine zit in soja, kaas, pinda's, champignons, volle granen en groenten.
  • Isoleucine is overvloedig aanwezig in vlees, vis, gevogelte, eieren, kaas, linzen, noten en zaden.
  • Zuivel, soja, bonen en peulvruchten zijn bronnen van leucine.
  • Fenylalanine zit in zuivel, vlees, gevogelte, soja, vis, bonen en noten.
  • Tryptofaan zit in de meeste eiwitrijke voedingsmiddelen, waaronder tarwekiemen, kwark, kip en kalkoen.

Dit zijn slechts enkele voorbeelden van voedingsmiddelen die rijk zijn aan essentiële aminozuren. Alle voedingsmiddelen die eiwitten bevatten, of ze nu plantaardig of dierlijk zijn, zullen ten minste enkele van de essentiële aminozuren bevatten.

Het consumeren van essentiële aminozuren is cruciaal voor een goede gezondheid.

Elke dag een verscheidenheid aan voedingsmiddelen eten die eiwitten bevatten, is de beste manier voor mensen om ervoor te zorgen dat ze voldoende essentiële aminozuren binnenkrijgen. Met het moderne dieet van vandaag en toegang tot een grote verscheidenheid aan voedingsmiddelen, is een tekort zeldzaam voor mensen die over het algemeen in goede gezondheid verkeren.


Gevolgen van aminozuur kataboliserende enzymactiviteit op T-celdifferentiatie en functie

De meeste aminozuur-kataboliserende enzymen, waaronder IDO1 en IL4I1, verminderen T-celproliferatie en wijzigen de balans van effector versus regulerende T-celdifferentiatie (Figuur 4). Plasmacytoïde dendritische cellen gestimuleerd door CpG induceren IDO-activiteit, die het suppressorfenotype van Tregs stabiliseert, terwijl ze tegelijkertijd de IL-6-expressie blokkeren die nodig is voor Th17-celdifferentiatie (Baban et al., 2009). Tijdens schimmelinfectie van muizen met Paracoccidioides brasiliensis, wordt de afwezigheid van IDO1 geassocieerd met een verhoogde instroom van Th17-cellen naar de geïnfecteerde long en een gelijktijdige vermindering van het aantal Th1- en Treg-cellen (de Araújo et al., 2017). Van Kyns, die zowel door IDO als TDO worden geproduceerd, is aangetoond dat het bindt aan de aryl-koolwaterstofreceptor (AHR), een sterk geconserveerde, door ligand geactiveerde transcriptiefactor die betrokken is bij het regelen van de balans van Treg- versus Th17-differentiatie (Mezrich et al., 2010 Opitz et al., 2011). Hoewel bepaalde AHR-liganden de differentiatie van Th17-cellen bevorderen, leidt AHR-activering door Kyns tot Treg-generatie (Mezrich et al., 2010). Bovendien kan tryptofaanuitputting de onderdrukkende functies van Tregs versterken door PKCθ uit te sluiten van de immuunsynaps, waardoor de signaalactiviteit ervan wordt geremd (Zanin-Zhorov et al., 2010 Metz et al., 2012).

Figuur 4. Vereenvoudigd schema van de invloed van immunosuppressieve enzymen op de priming, differentiatie en functie van T-cellen in secundaire lymfoïde organen en in de periferie bij mensen. Rijpe dendritische cellen in de T-celzone (bijv. geactiveerd door IFNγ) kunnen antigenen presenteren, evenals cytoplasmatisch IDO produceren en IL4I1 uitgescheiden. IDO degradeert Trp en IL4I1 degradeert Phe en, in mindere mate, Trp. Het niveau van deze twee essentiële aminozuren neemt af in de micro-omgeving van T-cellen, terwijl Kyn, fenylpyruvaat (PP), IAA (indool-3-azijnzuur), H2O2, en NH3 accumuleren. Het gecombineerde effect beperkt de activering van geen enkele T-cellen of, in het geval van CD4 T-cellen, bevordert hun differentiatie tot regulerende T-cellen. Door de activeringsdrempel te verhogen, kan IL4I1 ook het repertoire van geprimede CD8 T-cellen beperken tot de klonen met hoge affiniteit. In ontstoken weefsels kunnen ook Arg-kataboliserende enzymen tot expressie worden gebracht, waardoor de concentratie van beschikbaar Arg (Arg1) wordt verminderd en NO (iNOS) en peroxynitriet wordt geproduceerd. Peroxynitriet (ONOO – ) ontstaat door de reactie van NO met O2 – , die door iNOS wordt geproduceerd onder omstandigheden met lage Arg-niveaus. Het gecombineerde effect van aminozuuruithongering en de productie van de verschillende katabolieten door Trp-, Phe- en Arg-kataboliserende enzymen vermindert de rekrutering, proliferatie en functie van effector CD4- en CD8-T-cellen en verhoogt de remmende functie van regulerende T-cellen . Over het algemeen leidt dit tot een verlaging van de lokale T-celrespons. De enzymatische reacties zijn aangegeven met pijlen. Katabole producten waarvan geen specifiek effect op T-celactivering bekend is, worden weergegeven in lichtgrijs. Sommige van deze producten worden gebruikt voor aminozuurregeneratie (arginine uit citrulline, proline uit ornithine) of de productie van polyaminen (ornithine), die dienen als bouwstenen voor celgroei.

Differentiatie van geen enkele CD4+ T-cellen in de aanwezigheid van IL4I1 vertekent ook hun polarisatie richting Tregs, terwijl het de Th17-differentiatie niet substantieel beïnvloedt. Dit effect lijkt een vermindering van mTORC1-signalering met zich mee te brengen (Cousin et al., 2015). However, it has also been recently observed that IL4I1 degradation of tryptophan [a minor substrate in comparison to phenylalanine (Boulland et al., 2007)] produces indole derivatives that can activate the AHR pathway (Sadik et al., 2020 Zhang et al., 2020). Finally, IL4I1 modulates the priming of CD8 + T cells. Indeed, the absence of IL4I1 lowered the activation threshold of cognate CD8 + T cells in a mouse model of acute infection with the lymphocytic choriomeningitis virus, leading to extension of the responding repertoire to low-affinity clones and increased memory T-cell differentiation. Thus, IL4I1 may represent a mechanism to restrain T-cell activation to high-affinity CD8 + T-cell clones (Puiffe et al., 2020).

Arg1 produced by MDSCs has also been suggested to play a role in Th17 differentiation. Indeed, RORγT and IL-17A expression decrease in T cells cultured with MDSCs treated with the Arg1 inhibitor Nor-NOHA (Wu et al., 2016). Consistent with this observation, mice with a conditional deletion of Arg1 in myeloid cells show decreased expression of IL-17A in the colorectum during experimentally induced colitis (Ma et al., 2020). High concentrations of NO provided by the NO donor NOC-18 can suppress the proliferation and function of polarized murine and human Th17 cells by inhibiting the expression of AHR (Niedbala et al., 2011). In accordance with this result, iNOS-deficient mice exhibit enhanced Th17 cell differentiation but no changes in Th1 or Th2 polarization (Yang et al., 2013). Conversely, the use of NOC-18 induces the proliferation and sustained survival of CD4 + CD25 – T cells, which acquire the expression of CD25 but not Foxp3 and present regulatory functions (Niedbala et al., 2007). In sharp contrast with these findings, physiological NO levels produced by the MDSCs of cancer patients or endogenously by CD4 + T cells expressing iNOS can induce and stabilize the Th17 phenotype (Obermajer et al., 2013). Mouse γδ T cells also express iNOS, in particular following stimulation by inflammatory cytokines (Douguet et al., 2018). The enzyme is essential for promoting optimal IL-2 production and proliferation of γδ T cells, but drives IL-17 production, which is associated with pro-tumor properties in a murine model of melanoma (Douguet et al., 2016a,b). These findings illustrate the dual role of NO on T cell activation at the level of T-cell differentiation, depending on its concentration.


What do amino acids do?

Build, repair, regulate, energise

Amino acids are commonly known for their role in muscle protein synthesis. However, the benefits stretch beyond your workout and muscles.

Amino acids make proteins, which make up about 20% of our bodies. Our skin, hair, muscles, internal organs, red and white blood cells all depend on proteins for structure and function. Amino acids also help regulate and maintain most bodily processes by becoming proteins, enzymes or hormones, and by supplying energy to our cells.

Cognitive function & nervous system

The central nervous system controls most bodily functions and our minds. It consists of two parts: the brain and the spinal cord. To function adequately, the brain and central nervous system need a number of amino acids, including histidine, tryptophan, tyrosine, and arginine. The brain uses these to produce various neurotransmitters and neuromodulators.

Hormone production

Simply put, hormones are signalling molecules and they encourage the body to respond to stimuli. Hormones raise our blood pressure during exercise, allow us to sweat when we're hot and more. Amino acids can either be used as building blocks for specific hormones or to encourage the release of hormones.

There is evidence that the amino acids lysine and arginine help to trigger the release of growth hormones, encouraging the growth and development of cells, which can be particularly useful for children and sports people looking to gain muscle mass.

Digestive system

Amino acids are the major fuel of the small intestine membrane and they are also used to support the intestinal immune and anti-oxidative responses. Glutamate, glutamine and aspartate, in particular, are vital. You may have heard the phrase that your gut is your first line of defence against disease and pathogens and amino acids play a major role in these defenses.

Reproductive system

The availability and metabolism of amino acids, which interact with other macronutrients, is vital for various reproductive processes, including gametogenesis, fertilisation, implantation, placentation, foetal growth and development.

Immuunsysteem

The immune system protects your body from outside invaders, such as bacteria, viruses, fungi, and toxins. The system is made up of different organs, cells and proteins that work together.

A deficiency of dietary protein or amino acids impairs immune function and increases susceptibility to infectious disease. That’s because protein is broken down to provide amino acids for the creation of new cells, proteins and peptides, vital for the immune response. Amino acids can be used as fuel by the immune system either directly, or following their conversion to other amino acids (e.g., glutamine) or to glucose for energy.

Mounting evidence shows that giving specific amino acid supplements to animals and humans with malnutrition and infectious disease improves the immune response. Arginine, glutamine and cysteine precursors are the best used examples in recent studies.


Materialen en methodes

Contact for reagent and resource sharing

Further information and requests for resources and reagents should be directed to and will be fulfilled by Kenneth Dyar ([email protected]).

Ethics statement

All experimental procedures were performed according to European Commission guidelines and were reviewed and approved by the local Veterinary Central Service, University of Padova, and the relevant Italian authority (Ministero della Salute, Ufficio VI), in compliance with Italian Animal Welfare Law (Law n 116/1992 and subsequent modifications) and Directive 2010/63/EU of the European Parliament. Accordingly, experiments performed before 2012 were sent to the Italian Ministry of Health (Project# 27/09). Experiments performed after 2012 were approved by the Italian Ministry of Health (Decree# 164/2012-B of 09.08.12).

Dieren

Animals were housed in a temperature-controlled room (22 °C) under a 12-hr light/dark regimen, with lights on at ZT0 (6 AM) and lights off at ZT12 (6 PM), with standard chow diet (Mucedola, Settimo Milanese, Italy) and water provided ad libitum. Muscle-specific inactivation of Bmal1 (mKO) was obtained as described [7] by crossing a floxed Bmal1 C57BL/6 mouse line with a C57BL/6 mouse line carrying a Cre recombinase transgene under control of the Mlc1f promoter (Mlc1f-Cre). In the resulting mKO mice, the region coding for the BMAL1 bHLH DNA binding domain is excised. Cre-negative littermates were used as controls. All mice used in this study were 3–5-mo-old male littermates, unless specified otherwise. Littermates were randomly assigned to experimental groups. Tissues were collected immediately after cervical dislocation at ZT0, 4, 8, 12, 16, and 20, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at −80 °C until subsequent use. S4 Table details the various muscles and tissues used for this paper.

Metabolic phenotyping

Total body fat and lean tissue mass were quantified by nuclear magnetic resonance (EchoMRI). EE, RER (VCO2/VO2), locomotor activity, and feeding behavior were monitored on a TSE system (Bad Homburg, Germany).

Exercise and endurance training experiments

To measure exercise endurance, forced running on a motorized treadmill was used (Harvard Apparatus PANLAB, LE 8710 M). The protocol was based on [135], with some minor modifications. Briefly, mice were first acclimated to low-speed running (22 cm/s and 10% incline) for 10 min each day for 2 d prior to the test. Acclimation was always performed under dim red light around ZT12 (lights off), the normal start of the circadian activity phase. On the day of the endurance test, food was removed 3 hr before starting at ZT12 to ensure consistent baseline blood glucose levels. For the test, mice began running at 22 cm/s and 10% incline under dim red light. Speed was gradually increased by 5 cm/s every 30 min up to 45 cm/s. Mice were encouraged to run by humanely stimulating their tail with a soft brush. The operator was blind to genotype of the mice, and exhaustion was defined by mice refusing to run for 10 sec and confirmed by blood glucose <76 g/dl [75]. Time and running distance were recorded for each mouse. For endurance training, mice trotted on a motorized treadmill 25 cm/s and 0% incline 1 hr daily for 4 wk, starting around ZT12. After humanely encouraging mice to run with a soft brush on their tail during the first few acclimation sessions, mice ran without much need for further encouragement.

Clinical blood chemistry

Sedentary mice were either fed ad libitum, and blood was collected at ZT14 (“fed ZT14”), or fasted for 4 hr late in the afternoon (ZT7–ZT11), and blood was collected at ZT11 (“fasted ZT11”). A separate cohort of endurance-trained WT and mKO littermates was measured after 4 wk training on a motorized treadmill 25 cm/s and 0% incline 1 hr daily, starting around ZT12. Blood was collected after running 25 cm/s and 0% incline for 1 hr. Blood was collected from the orbital sinus in heparin-coated Pasteur pipettes and centrifuged immediately after collection. Plasma samples were kept at −20 °C until dosing. FFAs, β-OH-B, and AcAc were dosed using an automated spectrophotometer, Cobas Fara II (Roche), according to the manufacturer’s instructions. Blood glucose and lactate levels were measured with a YSI 2300 STAT Plus glucose and lactate analyzer (YSI Life Sciences, Yellow Springs, OH) according to the manufacturer’s instructions.

Quantification of serum amino acids

Mice were fasted 6 hr (8 AM–2 PM), and blood was collected at ZT8 (2 PM). Blood was collected from the orbital sinus in Pasteur pipettes, allowed to clot at room temperature (RT) for 30 min, centrifuged, and kept at −20 °C until use. Amino acid concentrations were assessed by GC/MS (HP 5890 Agilent Technologies, Santa Clara, CA), using the internal standard technique, as previously reported [136]. Briefly, known amounts of internal standards (L-[ 15 N]glycine, L-[ 15 N]glutamate, L-[ 15 N]glutamine, L-[1- 13 C, methyl- 2 H3]methionine, L-[3,3- 2 H2]cysteine, L-[ 15 N]alanine, L-[1- 13 C]leucine, L-[1- 13 C]phenylalanine, L-[3,3- 2 H2]tyrosine, L-[ 15 N]threonine, L-[ 15 N]serine, and L-[ 15 N]proline [Cambridge Isotope Laboratories]) were added to plasma samples. Amino acid concentrations were determined considering the following mass-to-charge ratios (m/z): 218/219 for glycine, 432/433 for glutamate, 431/432 for glutamine, 320/324 for methionine, 406/408 for cysteine, 158/159 for alanine, 302/303 for leucine, 336/337 for phenylalanine, 466/468 for tyrosine, 404/405 for threonine, 362/363 for serine, and 184/185 for proline.

In vivo ChIP assays

In vivo skeletal muscle ChIP was performed with sonicated nuclear extract prepared from formaldehyde-cross-linked gastrocnemius muscle according to [137]. For immunoprecipitation, we used anti-BMAL1 (ab93806, Abcam), anti-REV-ERBα (generous gift from Ron Evans), anti-RNA Polymerase II (#MMS-126R clone 8WG1, Biolegends), anti-NCOR1 (#20018-1-AP, Protein Tech), anti-HDAC3 (ab7030, Abcam), or rabbit IgG (2027x, Santa Cruz). DNA was column purified and used for sequencing or real-time qPCR (enrichment expressed as fold-change relative to IgG primer sequences used are listed in S4 Table).

ChIP-seq library prep

Libraries from ChIP and input DNA were prepared with the KAPA Hyperprep Kit (Kapa Biosystems, KK8504) Illumina-compatible adapters were synthesized by Integrated DNA Technologies (IDT) and used at a final concentration of 68 nM. Adapter-ligated libraries were size selected (360–610 bp) in a Pippin Gel station (Sage Science) using 2% dye free gels (Sage Science, CDF2010). Library concentration was estimated by real-time PCR with the KAPA Library Quantification Kit (Kapa Biosystems, KK4873). Library quality was evaluated with the Agilent High Sensitivity DNA Kit on a 2100 Bioanalyzer (Agilent). Libraries were run on a HighSeq2500/HighSeq4000 sequencers (Illumina) at the NGS Core Facility at HMGU.

Bioinformatics pipeline for ChIP-Seq data analysis

Pre-processing.

ChIP-Seq FASTQ files were mapped against the mouse mm10 genome with BWA version 7.12 using MEM algorithm [138]. Duplicate reads were removed using samtools version 0.1.19 [139]. Multi-mapping reads were removed with bamtools version 2.4.0 [140] using read threshold of MAPQ ≥ 24.

Adjusting sequencing depth.

Sequencing read depth was adjusted by down sampling replicate BAM files to the replicate with lowest read count, resulting in about 13 million unique reads for RNAP2 and about 20 million unique reads each for BMAL1 and REV-ERBα replicates (see Table 1 below for further details).

Peak calling.

Macs2 version 2.1.1 [141] peak caller was used to perform peak calling on the replicates using input DNA. Peak calling cutoff was set to P-value 0.05. In addition to narrow peak files, read density distribution (Bedgraphs) was used to visualize ChIP-seq tracks using Integrated Genome Browser [142].

Peak universe, “high confidence” and “confident” peak tables, and overlapping peaks.

A peak table was created for each sample. Replicate sample tables were then combined into a unified peak universe for each factor with unique ranges across the genome and containing overlapping peaks information including the tag counts (enrichment score). “High confidence” peaks were identified as reproducible peaks common between replicate samples. “Confident” peaks were reproducible peaks common between BMAL1 and REV-ERBα and present in ≥3 of the 4 samples.

To assess overlapping peaks between liver and muscle, liver peak location coordinates for BMAL1 [14] and REV-ERBα [15] were first converted from mm9 to mm10 using UCSC liftOver.

Heatmaps.

Bedgraphs were used to plot the read density map near the universe peak centers using deepTools version 2.2.4 [143]. Replicates for each factor were merged using UCSC tools bedGraphToBigWig and bigWigMerge (http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/macOSX.x86_64/).

Then, deepTools computeMatrix tool was used followed by plotHeatmap tool [143].

Peak annotation.

Peak annotation was performed with HOMER version v4.8 [144]. GENCODE database for mm10 [145] was used as a reference for assigning feature level annotation.

Motif discovery.

To minimize bias, a combination of two different methods was used for motif discovery:

  1. HOMER version v4.8 [144]. For BMAL1 we searched for motifs of 8-, 10-, 12-, 14-, 15-, and 16-mers. For REV-ERBα, we searched for motifs of 8-, 10-, and 12-mers.
  2. Clover version published on Jan 14, 2016 [146], was used with default settings.

Functional enrichment analysis of peaks.

Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT) [16] was used to analyze functional significance of BMAL1 and REV-ERBα peaks using mouse NCBI build 38 genome assembly (mm10), whole genome as background, and associating genomic regions with genes using “basal plus extension” and the following parameters: proximal 20 kb upstream, 2 kb downstream, plus distal up to 500 kb.

Global metabolite profiling

Metabolite profiling, peak identification, and curation were performed by Metabolon using described methods [147]. Briefly, the nontargeted metabolic profiling platform used by Metabolon combines 3 independent platforms: UHPLC/MS/MS optimized for basic species, UHPLC/MS/MS optimized for acidic species, and GC/MS. We analyzed a total of 60 TA muscles from 60 male muscle-specific Bmal1 KO and control littermates (5 × group × time point).

Metabolomics data processing and analysis

Metabolomics data (“origscale”) can be found in supporting file S3 Data. The data were first normalized according to raw area counts and processed according to [148]. Run day correction was performed for each metabolite by setting the run day medians equal to 1. We removed metabolites with more than 50% missing values and transformed data to log10. Data points outside 4 times the standard deviation for each metabolite were considered as outliers and removed. Missing data were imputed by k-nearest-neighbor algorithm. To identify metabolites that show significant change over time and/or genotype, we fit data to a linear mixed effects model. Significant changes were estimated by performing F-test statistics to each fixed effect term (ANOVA) Genotype, Time, Genotype × Time. Calculations were done using MATLAB R2015b, Statistics Toolbox. Heatmaps were generated using the mean of 5 replicates. Hierarchical clustering was performed with squared euclidean distance and Ward’s minimum variance algorithm. Data were sorted by phase according to WT muscle and aligned between groups to show effect in mKO. Metabolites were categorized according to Metabolon superpathways: Amino Acids, Carbohydrates, Cofactors and Vitamins, Energy, Lipids, Nucleotides, Peptides, and Xenobiotics. To identify significantly enriched KEGG pathways in our data, we performed a hypergeometric distribution test on metabolites showing a Genotype effect P < 0.05. To identify 24-hr cycling metabolites, we used the nonparametric test JTK_CYCLE as described in [147], using an adjusted P < 0.05.

Extraction of total lipids

Muscles were weighed and homogenized in 800 μl dH2O. Lipids were extracted twice according to Folch and colleagues [149] using chloroform/methanol/water (2/1/0.6, v/v/v) containing 500 pmol butylated hydroxytoluene, 1% acetic acid, and 100 pmol of internal standards (ISTD, 17:0–17:0 PC, 17:0 LPC, 17:0–17:0–17:0 TG, Avanti Polar Lipids) per sample. Extraction was performed under constant shaking for 90 min at RT. After centrifugation at 1,000 x G for 15 min at RT, the lower organic phase was collected. Then, 2.5 ml chloroform was added to the remaining aqueous phase, and the second extraction was performed as described above. Combined organic phases of the double extraction were dried under a stream of nitrogen and resolved in 900 μl 2-propanol/chloroform/methanol (7/2/1, v/v/v).

Quantitative analysis of TG by HPLC with light scattering detection

For HPLC-ELSD, 20 μl of the resolved extract was evaporated and dissolved in 100 μl chloroform/methanol (2/1, v,v). The chromatographic setup for lipid separation consisted of an Agilent 1100 combining pump, injector, precooled sample manager (4 °C), and column oven (40 °C) (Agilent, Santa Clara, CA). For detection of lipids, a Sedex 85 evaporative light scattering detector (Sedere, Alfortville, France) was used. Data acquisition was performed by the Chemstation software (B 04.01, Agilent, Santa Clara, CA). A ternary gradient with a Betasil Diol column (100 × 4.6 mm, particle size 5 μm, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) was used for chromatographic separation. The solvent system consisted of eluent A (isooctane/ethylacetate, 99.8/0.2, v/v), eluent B (acetone/ethylacetate, 2/1, v/v, containing 0.02% [v/v] acetic acid), and eluent C (isopropanol/water, 85/15, v/v, containing 0.05% [v/v] acetic acid and 0.3% [v/v] ammonium acetate). For external calibration, TG 54:3 (Larodan, Solna, Sweden) was prepared in chloroform:methanol (2:1, v/v), and the final concentration ranged from 1 μM to 2.5 μM. Injection volume for all samples including external calibration was 10 μl.

Qualitative analysis of lipids by ultra-performance liquid chromatography (UPLC) with qTOF detection

For UPLC-qTOF, 120 μl of the resolved extract was transferred to an autosampler vial for analysis. Chromatographic separation was performed using an AQUITY UPLC system (Waters), equipped with a BEH-C18-column (2.1 × 150 mm, 1.7 μm Waters) as previously described [150]. A SYNAPTG1 qTOF HD mass spectrometer (Waters) equipped with an ESI source was used for detection. For positive and negative ionization mode, 5 μl and 10 μl were injected, respectively. Data acquisition was done by the MassLynx 4.1 software (Waters Corporation). Lipid classes were analyzed with the “Lipid Data Analyzer 1.6.2” software [151]. Extraction efficacy and lipid recovery were normalized using ISTD, and lipid classes were expressed as percent composition.

Separation of neutral lipids by thin-layer chromatography

Extracted lipids were spotted on a silica gel 60 (Merck, Darmstadt, Germany). For comparison, a standard solution containing TG 54:3 was used. The silica gel was developed using n-hexane/diethylether/acetic acid (80/20/2, v/v/v) as solvent system, and lipids were visualized by charring using concentrated sulfuric acid.

Palmitate oxidation

Gastrocnemius muscles were immediately removed after cervical dislocation. Tissues were quickly weighed, and placed in ice-cold homogenization buffer (250 mM Sucrose, 10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH = 7.4). Muscles were then thoroughly minced with scissors and transferred to a 10 ml glass homogenization mortar on ice, and ice-cold homogenization buffer was added up to a 20-fold dilution (w/v) suspension. Samples were then homogenized with 10 strokes of a motor-driven, tightly fitting glass mortar/Teflon pestle Potter Elvehjem homogenizer operated at 1,600 rpm. Reactions were initiated by adding 50 μl of muscle homogenates to 450 μl of prewarmed oxidation medium (30 °C 111 mM sucrose, 11.1 mM Tris-HCl, 5.56 mM KH2PO4, 1.11 mM MgCl2, 88.9 mM KCl, 0.222 mM EDTA, 1.11 mM DTT, 2.22 mM ATP, 0.33% fatty acid–free BSA, 2.22 mM Carnitine, 0.056 mM CoA, 0.111 mM Malate, 222 uM cold Palmitate, + 0.5 uCi [1- 14 C]-palmitic acid prepared fresh daily pH 7.4). After incubation for 90 min in a shaking water bath (100 rpm 30 °C), reactions were terminated by addition of 100 μl 1 M perchloric acid, and the CO2 produced during the incubation was trapped in 100 μl NaOH that had been added to a small tube inside the reaction vial. Palmitate oxidation rates were determined by measuring incorporation into 14 CO2 and 14 C-acid-soluble metabolites (ASM) by liquid scintillation counting.

Analysis of mitochondrial function

Spectrophotometric activity of mitochondrial respiratory chain complexes CI, CII, CIII, CII+III, CIV, as well as CS, was measured according to [152] using muscle homogenates from frozen vastus lateralis muscles from the same cohort of mice used for gene expression and metabolomics analyses. Mitochondrial membrane potential was measured by epifluorescence microscopy based on the accumulation of TMRM fluorescence in isolated muscle fibers from flexor digitorum brevis (FDB) muscles as previously described [153], with minor modifications. Briefly, fresh FDB muscles from adult mice were digested in type I collagenase at 37 °C for 2 hr and dissociated into single fibers by gentle pipetting. Isolated FDB myofibers were then placed in 1 ml Tyrode’s buffer (Sigma) and loaded with 2.5 nM TMRM (Molecular Probes) supplemented with 1 μM cyclosporine H (a P-glycoprotein inhibitor) for 30 min at 37 °C. At the times indicated by arrows, oligomycin (Olm, 5 μM Sigma) or the protonophore FCCP (4 μM Sigma) was added to the culture medium.

Assessment of muscle protein synthesis

Quantification of muscle protein synthesis rates was performed using the nonradioactive IV-SUnSET technique as described in [78].

Gene expression profiling and analyses

Microarray sample processing, quality control, and data analysis are reported in [7].

SDS-PAGE and western blotting

Muscle lysates were prepared in RIPA buffer (Sigma) supplemented with Halt protease and phosphatase inhibitor cocktail (#78446, Thermo Scientific), protein concentration determined using the bicinchoninic acid assay (Pierce, Rockford, IL, USA), and SDS-PAGE performed using NuPAGE 4%–12% gels (Invitrogen). Proteins were transferred onto a PVDF membrane and incubated with rabbit anti-REV-ERBα (kind gift from Ron Evans), mouse anti-REV-ERBβ (D-8 sc-398252, Santa Cruz), or mouse anti-GAPDH (ab8245, Abcam). Membranes were then incubated with HRP-conjugated donkey anti-rabbit (sc-2317, Santa Cruz) or goat anti-mouse (170–6516, Biorad) secondary antibodies. HRP activity was measured by chemiluminescence (Immobilon Western, Millipore), and bands visualized on CP-BU Medical X-Ray Film (Agfa HealthCare NV, Gevaert, Belgium).

Plasmids

Mouse promoter regions of Rev-erbα (forward, 5′-CCCCTAGTCACCACTAACCTC-3′ reverse, 5′-AGAGACGTGTGCCCTGCTA-3′), Rev-erbβ (forward, 5′-ATGTAGGAGGGAGGCTCGG-3′ reverse, 5′-GCCTCGCGCAGACTATGG-3′), Dgat2 (forward, 5′-AGCTGCTAGGATTGTAGGATTACAG-3′ reverse, 5′-AGAGCTGAGGTAGGTAGCCG-3′), and Coq10b (forward, 5′-GCTAACCAAATGCAGCAGGC-3′ reverse, 5′-TGTGAAGCCGGTAGCCAAC-3′) were amplified using High Fidelity Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen), cloned into pGL3-Basic (Promega), and verified by sequencing. pRL-CMV renilla expression construct was from Promega. pCMV-AC-mKate (mKate2) was from OriGene. Beide mPer2::luc (423-bp mPer2 promoter fragment) and mBmal1::luc (530-bp mBmal1 promoter fragment) reporter plasmids were generous gifts from Kazuhiro Yagita and described in [154]. Mouse full-length Bmal1 en Clock pcDNA3-HA constructs were generous gifts from Marina Antoch (Roswell Park Cancer Institute) and described in [155]. Mouse full-length Rev-erbα ORF (forward, 5′-ATGACGACCCTGGACTCCAA-3′ reverse, 5′-TCACTGGGCGTCCACCCGGA-3′) was amplified using AccuPrime GC-Rich DNA Polymerase (Invitrogen) and shuttled into Gateway pDONR-221 (Invitrogen) with Gateway BP Clonase Enzyme (Invitrogen). Muis Rev-erbα ORF was then shuttled into Gateway pcDNA-Dest47 expression vector with Gateway LR Clonase Enzyme (Invitrogen). The −1 kb and −5 kb MuRF-1 promoter luciferase reporters and c.a.FOXO3A plasmids were generous gifts from Marco Sandri. The mouse GR construct was generated by PCR amplifying a Kpn1/BamH1 PCR fragment from full-length mouse GR ORF (BioScience IMAGE40111802) using forward 5′-GGGGTACCATGGACTCCAAAGAATC-3′ and reverse 5′- CGGGATCCTCATTTCTGATGAAAC-3′ primers and cloning into Kpn1/BamH1-digested pcDNA3.

In vitro transfection and luciferase assays

HEK-293T cells were cultured in DMEM with 10% FBS and penicillin-streptomycin. Cells were seeded in 96-well plates at 100,000 cell/mL for transfection and luciferase measurements. For BMAL1 target validation, cells were cotransfected with 25 ng promoter reporter construct, 25 ng pRL-CMV, and either 25 ng BMAL1-HA + 25 ng CLOCK-HA or 50 ng empty pcDNA3. For REV-ERBα sensor validation, cells were cotransfected with 25 ng mBmal1::luc, 25 ng pRL-CMV, and either 200 ng REV-ERBα or 200 ng empty pcDNA-Dest47. For MuRF-1 reporter experiments, cells were cotransfected with 25 ng MuRF-1 reporter, 25 ng pRL-CMV, and 25 ng each of GR, c.a.FOXO3A, and REV-ERBα. To maintain consistent DNA transfection concentrations across experiments, 50 ng or 25 ng empty pcDNA-Dest47 was supplemented, respectively, when transfecting only one or two transcription factors. Transfection was performed with FuGene HD (Promega) and transfection medium replaced with Phenol Red free DMEM. The next day, cells were lysed, and firefly and renilla luciferase were sequentially measured using Dual-Glo Luciferase assay system (Promega). Firefly raw values were normalized to Renilla raw values for each replicate. Data from 2 independent experiments are expressed as mean fold-change of the test condition normalized to the empty vector ± SEM.

In vivo transfection of adult skeletal muscle

Six-mo-old adult male Bmal1 mKO mice and WT littermates were anesthetized by i.p. injection of a mixture of Zoletil 100 (a combination of Zolazapam and Tiletamine, 1:1, 10 mg/kg, Laboratoire Virbac) and Rompun (Xilazine 2%, 0.06 ml/kg, Bayer). Gene transfer of TA muscles was induced by intramuscular injection of plasmid DNA (40 μg, consisting of 15 μg mBmal1::luc reporter plasmid, 5 μg mKate2 exogenous spike-in control, and 20 μg either REV-ERBα or empty pcDNA-Dest47) followed by electroporation using stainless steel electrodes connected to a ECM830 BTX porator (Genetronics, San Diego, CA).

Optical bioluminescence imaging

In vivo bioluminescence images were acquired with the IVIS 100 system (Perkin-Elmer) under general anesthesia by i.p. injection of a mixture of Zoletil 100 (a combination of Zolazapam and Tiletamine, 1:1, 10 mg/kg, Laboratoire Virbac) and Rompun (Xilazine 2%, 0.06 ml/kg, Bayer) and analysis performed according to [156] with the following parameters: field of view 25 cm, binning factor 8, exposure time 1 min. Living Image software (version 4.3) was used for image capture and analysis.

RNA isolation and qPCR

Total RNA was isolated, purified, and reverse transcribed to cDNA, and RT-qPCR was performed as described in [7]. Analysis was performed using the standard curve method, and all data were normalized relative to 36B4 uitdrukking.

Quantification and statistical analysis

All data are expressed as means ± SEM unless otherwise stated. Statistical analysis was performed using unpaired Student’s t test or 2-way ANOVA. When ANOVA revealed significant genotype differences, further analysis was performed using Bonferroni’s multiple comparison test. Differences between groups were considered statistically significant for P < 0.05.