Informatie

1.2.6: Beoordeling - Biologie


Samenvatting

Na het voltooien van dit hoofdstuk zou je in staat moeten zijn om...

  • Beschrijf het doel van wetenschap.
  • Maak onderscheid tussen objectieve en subjectieve waarnemingen.
  • Maak onderscheid tussen kwantitatieve metingen en kwalitatieve waarnemingen.
  • Maak onderscheid tussen inductief en deductief redeneren en relateer ze aan beschrijvende en op hypothesen gebaseerde wetenschap.
  • Geef een overzicht van de stappen van de wetenschappelijke methode en leg het cyclische karakter ervan uit.
  • Maak onderscheid tussen manipulatieve experimenten en observationele studies.
  • Identificeer de soorten variabelen, controlegroepen en replica's in een wetenschappelijk onderzoek.
  • Bespreek het belang van peer review.
  • Maak onderscheid tussen basiswetenschap en toegepaste wetenschap en geef voorbeelden van de waarde van basiswetenschap.

Wetenschap is een middel om systematisch informatie over de natuurlijke wereld te verzamelen. Wetenschap is gebaseerd op doelstelling observaties, en het volgen van de wetenschappelijke methode helpt wetenschappers om te beperken vooroordeel. Beide inductie en aftrek zijn belangrijk voor de wetenschappelijke methode. Observaties leiden tot een vraag en hypothese, een voorbeeld van inductief redeneren. Maken falsifieerbare voorspellingen gebaseerd op de hypothese en deze door middel van testen manipulatieve experimenten of observatie studies vereist deductief redeneren. Eindelijk, de resultaten worden verzameld en wetenschappers concluderen of de gegevens de hypothese ondersteunen. De wetenschappelijke methode is een cyclisch proces, waarbij de laatste stappen van het proces terug kunnen leiden naar eerdere stappen.

Wetenschappers publiceren hun bevindingen in wetenschappelijke tijdschriften, die vereisen peer review.

Toegepaste wetenschap richt zich op het oplossen van moderne problemen, maar fundamentele wetenschap richt zich simpelweg op het uitbreiden van kennis. De bevindingen van de basiswetenschap kunnen later echter nuttige toepassingen hebben.


Verkort oxidatieve stress telomeren? in vivo? Een recensie

De lengte van telomeren, de beschermende kapjes van chromosomen, wordt steeds vaker gebruikt als biomarker voor de individuele gezondheidstoestand, omdat is aangetoond dat het de overlevingskansen van een reeks endotherme soorten, waaronder de mens, voorspelt. Oxidatieve stress wordt verondersteld een belangrijke oorzaak te zijn van telomeerverkorting, maar het meeste bewijs tot nu toe komt van: in vitro gekweekte cellen. Het belang van oxidatieve stress als determinant van telomeerverkorting in vivo blijft minder duidelijk en is onlangs in twijfel getrokken. We hebben daarom correlatieve en experimentele onderzoeken beoordeeld die de verbanden tussen oxidatieve stress en telomeerverkorting hebben onderzocht in vivo. Hoewel correlatieve studies twijfelachtige ondersteuning bieden voor een verband tussen oxidatieve stress en telomeerverlies (10 van 18 studies), ondersteunen de meeste experimentele studies die tot nu toe zijn gepubliceerd (zeven van acht studies) deze hypothese gedeeltelijk of volledig. Toch lijkt deze link in sommige gevallen weefselafhankelijk te zijn, of in andere gevallen beperkt tot bepaalde categorieën van individuen (bijv. geslachtsafhankelijk). Meer experimentele studies, vooral die welke de bescherming van antioxidanten verminderen of de productie van pro-oxidanten verhogen, zijn nodig om ons begrip van het belang van oxidatieve stress bij het bepalen van de telomeerlengte te vergroten. in vivo. Studies die groeiende versus volwassen individuen, of proliferatieve versus niet-proliferatieve weefsels vergelijken, zouden bijzonder belangrijke inzichten opleveren.

1. Inleiding

Vanwege de centrale functie van telomeren bij het beschermen van chromosoomuiteinden en de integriteit van het genoom, heeft hun studie interesse gekregen in verschillende domeinen van de biologie, variërend van celbiologie en epidemiologie tot ecologie en evolutionaire biologie [1,2]. Het is aangetoond dat telomeren korter worden met de leeftijd in een breed scala van organismen [3,4], en wat nog belangrijker is dat de lengte en/of verkortingssnelheid van telomeren latere overleving kan voorspellen [4,5]. Dientengevolge is gesuggereerd dat de lengte en/of uitputting van telomeer werkt als een biomarker van individuele 'biologische leeftijd'. De dynamiek van telomeren is niet alleen in verband gebracht met individuele overlevingsvooruitzichten, groeiomstandigheden in het vroege leven en reproductief succes, maar ook met verschillende fysiologische en psychologische stressoren. Men denkt dus dat telomeren een biomarker zijn voor blootstelling aan milieu-uitdagingen en individuele levensstijl [1,2,6].

Hoewel de centrale rol van telomeren in de biologie van gezondheid en veroudering algemeen wordt erkend, is ons begrip van de fysiologische determinanten van telomeerdynamiek in vivo is nog steeds onvolmaakt. Bijvoorbeeld informatie over de in vivo effecten van oxidatieve stress op telomeerlengte en/of verkortingssnelheid blijven beperkt omdat de meeste tot dusver uitgevoerde onderzoeken een in vitro benadering. Toch gaan de meeste onderzoeken naar de dynamiek van telomeren ervan uit dat, omdat er een in vitro effect van oxidatieve schade op telomeren, is dat ook het geval in vivo. Het recente artikel van Boonekamp et al. [7] benadrukt deze beperking en de kloof die bestaat in de literatuur hierover in vivo Effecten.

Met deze review willen we een duidelijker beeld van de situatie geven door te focussen op wat we wel en niet weten over de in vivo verband tussen oxidatieve stress en telomeren. We geven een korte samenvatting van de telomeerstructuur en de belangrijkste mechanismen waarmee de telomeerlengte wordt gereguleerd. We dekken dan de in vivo aspecten van de impact van oxidatieve stress op de telomeerdynamiek. We inventariseren de literatuur en evalueren kritisch in vivo correlatieve en experimentele studies die het verband tussen oxidatieve stress en telomeerlengte en/of -verkorting onderzoeken. Ten slotte belichten we verschillende belangrijke parameters die waarschijnlijk zullen bijdragen aan de gemengde resultaten die tot nu toe zijn gepubliceerd, en stellen we verschillende experimentele benaderingen voor die moeten helpen om robuuste gegevens te leveren in toekomstige studies.

2. Telomerenstructuur en verkorting

Telomeren, beschermende DNA-eiwitcomplexen aan het einde van eukaryote chromosomen, zijn gemaakt van niet-coderende DNA-sequenties die bestaan ​​uit tandem-herhalingen van een eenvoudige sequentie van nucleotiden die rijk is aan guanine (G) [8]. Hoewel de lengte van telomeren varieert tussen chromosomen en soort, is de sequentie vergelijkbaar in alle eukaryoten, wat aangeeft dat telomeren een sterk geconserveerde en oude structuur zijn met een significante evolutionaire rol bij het beschermen van de integriteit van het genoom [9].

De lengte van telomeren is dynamisch en komt voort uit een balans tussen herstel- en verliesprocessen. Omdat DNA-replicatie een gedeeltelijk onvolledig proces is, gaan elke keer dat een cel zich deelt telomere DNA-sequenties van de chromosomen verloren, een fenomeen dat bekend staat als het 'eindreplicatieprobleem' [10]. Telomeren kunnen 30 tot 200 bp per celdeling verkorten, maar er wordt aangenomen dat slechts 10 bp verlies te wijten is aan het eindreplicatieprobleem in menselijke gekweekte cellen [11]. Oxidatieve stress die leidt tot DNA-schade wordt beschouwd als de belangrijkste factor die verantwoordelijk is voor het resterende verlies [12].

Oxidatieve stress kan het gevolg zijn van de reactieve zuurstofsoorten (ROS) die worden gegenereerd door exogene bronnen (UV-straling en verontreinigende stoffen), maar men denkt dat de meerderheid van de intracellulaire ROS ontstaat als een bijproduct van het aerobe metabolisme en de ATP-productie in de mitochondriën [13]. . ROS zijn zeer reactief en veroorzaken oxidatieve schade aan verschillende biomoleculen. Dergelijke schade kan ofwel worden voorkomen door afweermechanismen die bekend staan ​​als antioxiderende afweermechanismen, of in sommige gevallen worden hersteld nadat ze zich hebben voorgedaan. Oxidatieve stress is dus het resultaat van een disbalans tussen antioxidantafweer en ROS-productie. Vanwege hun hoge guaninegehalte wordt aangenomen dat telomeren bijzonder gevoelig zijn voor oxidatieve schade [14]. Indien niet voorkomen, zal de oxidatieve schade van telomeerregio's leiden tot een opeenhoping van schade aan DNA en telomeerverlies verergeren. Hoewel oxidatieve schade telomeerverkorting kan veroorzaken door dubbelstrengs breuken in DNA, vindt het meeste telomeerverlies als gevolg van oxidatieve stress plaats tijdens DNA-replicatie als gevolg van enkelstrengs DNA-schade [12]. Omdat telomere regio's een lage efficiëntie van enkelstrengs DNA-schadeherstel hebben, zullen telomeren die dergelijke enkelstrengs DNA-schade bevatten niet volledig worden gerepliceerd bij de volgende celdeling. Daarom zullen telomeren die dergelijke DNA-schade bevatten, meer verkorten na de volgende celdeling, omdat de sequentie voorbij de schade verloren gaat [15]. Er bestaan ​​verschillende mechanismen om de lengte van telomeren te behouden of te herstellen, en de belangrijkste is de activiteit van telomerase, een ribonucleoproteïne dat in staat is om telomeren te verlengen [16]. Bij afwezigheid van herstel, wordt de telomeerlengte korter bij elke celdeling wanneer de telomeren een kritische lengtedrempel bereiken, ze veroorzaken een permanente stilstand in de celcyclus die bekend staat als cellulaire senescentie, die kan worden gevolgd door celdood. Gezien hun rol bij cellulaire veroudering, wordt aangenomen dat telomeren ook betrokken zijn bij organische veroudering en veroudering [1].

Het meeste werk naar de effecten van oxidatieve stress op de telomeerdynamiek is uitgevoerd in vitro. Op een paar studies na [17,18] na, zijn de meeste in vitro experimenten hebben aangetoond dat oxidatieve stress de telomeerverkorting versnelt [12,15,19]. Oxidatieve stress wordt daarom verondersteld de effecten van verschillende omgevingsfactoren op de telomeerdynamiek op organismaal niveau te mediëren, maar verrassend genoeg in vivo effecten van oxidatieve stress op de telomeerdynamiek zijn relatief slecht onderzocht, zoals wordt benadrukt in een recente publicatie [7].

3. Wat is het huidige bewijs dat aantoont dat oxidatieve stress telomeren verkort? in vivo?

We doorzochten de gepubliceerde literatuur met behulp van de Web of Science-zoekmachine in mei 2017, met combinaties van de volgende termen: telomeer*, oxidatieve stress, antioxidant*, oxidatieve schade, correlatie*, experiment*. We identificeerden interessante studies die ofwel correlaties rapporteerden tussen oxidatieve stressmarkers (zonder beperking van de aard van de markers) en telomeerlengte en/of verkorting, of experimentele manipulaties van oxidatieve stress (uitputting/suppletie van antioxidanten) en daaropvolgende metingen van telomeerlengte en/of of verkorten.

(a) Correlatieve studies

Achttien studies rapporteerden correlatieve informatie over het verband tussen oxidatieve stress en telomeren (tabel 1) acht bij mensen en 10 bij vogelsoorten. In totaal rapporteren 10 van de 18 onderzoeken significante correlaties tussen een verscheidenheid aan oxidatieve stressmarker(s) en telomeerlengte en/of uitputtingsslag. Studies bij mensen (zes van de acht) hadden iets meer kans om significante resultaten te rapporteren dan studies bij vogels (vier van de 10). De methodologie die werd gebruikt voor het meten van telomeer had geen groot effect op de uitkomst, waarbij twee van de vijf onderzoeken met gebruikmaking van terminale restrictiefragmenten (TRF) en zeven van de 12 onderzoeken met kwantitatieve PCR (qPCR) significante resultaten rapporteerden. Verrassend genoeg waren markers van oxidatieve schade niet waarschijnlijker (zes van 14) geassocieerd met telomeerlengte dan markers van antioxidantafweer (vijf van 12). Bij vogels hadden onderzoeken naar telomeerverkorting iets meer kans om significante resultaten te vinden dan onderzoeken naar telomeerlengte per se (vier van acht versus één van acht). Over het algemeen blijft het correlatieve bewijs twijfelachtig bij het ondersteunen van de veronderstelling dat oxidatieve stress bijdraagt ​​​​aan telomeerverkorting in vivo.

Tabel 1. Samenvatting van uitgevoerde correlatieve onderzoeken in vivo en het testen van de relaties tussen oxidatieve stressmarkers en telomeerlengte (TL) en/of telomeerverkorting (ΔTL). De richtingen van de correlaties worden niet weergegeven in de tabel, omdat ze altijd in de voorspelde richting waren, namelijk dat hoge oxidatieve schade geassocieerd was met kortere telomeren of snellere telomeerverkorting, terwijl hoge antioxidantniveaus geassocieerd waren met langere telomeren of verminderde telomeerverkorting. Methode voor het meten van de telomeerlengte wordt aangegeven als kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), terminaal restrictiefragment (TRF) of kwantitatieve fluorescentie ter plaatse hybridisatie (qFISH). RBC's, TAC van rode bloedcellen, totale antioxidantcapaciteit SOD, antioxidant-enzym superoxide dismutase glutathion, een belangrijke intracellulaire antioxidant-ROM, reactieve zuurstofmetabolieten, een marker van algehele vroege oxidatieve schade.

a Behalve een significante correlatie tussen eiwitschade en TL alleen bij patiënten met de ziekte van Parkinson.

(b) Experimentele studies

In totaal gebruikten acht studies een gecontroleerde experimentele benadering (d.w.z. manipulatie van oxidatieve stress) om de verbanden tussen oxidatieve stress en telomeren te onderzoeken (tabel 2). Twee studies gebruikten behandeling met l-buthioninesulfoximine (BSO) om selectief de endogene niveaus van glutathion, een belangrijke intracellulaire antioxidant, te verlagen. De zes andere onderzoeken gebruikten suppletie met verschillende antioxidanten, alleen of in combinatie, zoals vitamine C en E, co-enzym Q10 of methionine. In totaal bieden zeven van de acht onderzoeken gedeeltelijke of totale ondersteuning voor een significant effect van oxidatieve stress op de telomeerlengte en/of verkortingssnelheid. De enige studie die deze hypothese niet ondersteunde [45] werd uitgevoerd tijdens de embryonale ontwikkeling, wanneer de telomerase-activiteit hoog zou moeten zijn, en liet ook geen duidelijk effect zien op de niveaus van oxidatieve schade. Toch is het vermeldenswaard dat de effecten van oxidatieve stress op de telomeerlengte waarschijnlijk weefselafhankelijk zijn [38], en in sommige gevallen beperkt tot bepaalde groepen dieren die mogelijk gevoeliger zijn voor veranderingen in de antioxidantafweer dan andere [43] ,44]. Van de zes onderzoeken die de impact van de behandeling op de oxidatieve schade meetten, kregen er vijf resultaten die grotendeels consistent waren tussen de effecten van de behandeling op oxidatieve schade enerzijds en op telomeerlengte en/of -verkorting anderzijds . Over het algemeen ondersteunt het tot nu toe verzamelde experimentele bewijs grotendeels de veronderstelling dat oxidatieve stress bijdraagt ​​​​aan telomeerverkorting in vivo.

Tabel 2. Samenvatting van uitgevoerde experimentele onderzoeken in vivo en het testen van de effecten van uitputting of suppletie van antioxidanten op telomeerlengte (TL) en/of telomeerverkorting (ΔTL). Methode voor het meten van de telomeerlengte wordt aangegeven als kwantitatieve PCR (qPCR), terminaal restrictiefragment (TRF) of kwantitatieve fluorescentie ter plaatse hybridisatie (qFISH) en pijlen beschrijven afname (↘), toename (↗) of niet-significante (↔) effecten.

a Alleen in de ‘gerecupereerde’ groep op de leeftijd van drie maanden.

4. Beperkingen van het huidige correlatieve en experimentele bewijs

Verschillende experimentele aspecten kunnen de heterogeniteit verklaren van de resultaten die we vonden in onderzoeken naar in vivo relaties tussen oxidatieve stress en telomeerlengte. Allereerst zijn de bemonsterde weefsels en de timing van de bemonstering belangrijke parameters om te overwegen. Er werd inderdaad aangetoond dat verhoogde telomeerverkorting als reactie op oxidatieve stress waarschijnlijk weefselafhankelijk is [38]. De meeste correlatieve onderzoeken (13 van 18) maten echter oxidatieve stressmarkers en telomeerlengte in verschillende weefseltypes (bijv. oxidatieve stress in plasma en telomeerlengte in DNA geïsoleerd uit bloedcellen). Dit sluit waarschijnlijk het verkrijgen van robuuste informatie uit, omdat zowel variaties in telomeerlengte als oxidatieve stressmarkers weefselafhankelijk kunnen zijn (bijv. [47,48]). Evenzo is het meten van oxidatieve schade aan lipiden/eiwitten maar niet aan DNA niet ideaal bij het testen van het effect van oxidatieve stress op de telomeerlengte, omdat de niveaus van oxidatieve schade aan verschillende biomoleculen niet noodzakelijk gecorreleerd zijn (bijv. [49,50]).

De timing van de bemonstering om zowel oxidatieve stress als telomeerlengte te meten, is ook een belangrijke parameter om rekening mee te houden. Inderdaad, oxidatieve stressniveaus zullen waarschijnlijk veel sneller variëren dan de telomeerlengte. Bovendien wordt verondersteld dat de meeste effecten van oxidatieve stress op de telomeerlengte pas zichtbaar zijn na de volgende cellulaire replicatie, omdat enkelstrengige schade eerder optreedt dan dubbelstrengige breuken, en dergelijke enkelstrengige schade zal de telomeren alleen verkorten. tijdens replicatie [12]. Daarom zijn de effecten op telomeerverkorting van een toename van oxidatieve stress op een bepaald tijdstip mogelijk pas later zichtbaar. Dit houdt niet alleen in dat experimentele studies lang genoeg naar de telomeerlengte moeten kijken om replicatie te laten plaatsvinden nadat de manipulatie heeft plaatsgevonden, maar ook dat correlatieve studies verstandig hun bemonsteringstijdstip moeten kiezen. Een mogelijke bemonsteringsstrategie zou bijvoorbeeld kunnen zijn om de 'initiële' telomeerlengte en oxidatieve stress te meten, de 'uiteindelijke' telomeerlengte later te meten (idealiter rekening houdend met de timing van de celdeling in het doelweefsel), en vervolgens telomeerverkorting te correleren met de initiële oxidatieve stress levels. Omdat de telomeerlengte waarschijnlijk grotendeels wordt bepaald door overerving en omstandigheden in het vroege leven [51,52], zal het gebruik van de snelheid van telomeerverkorting deze 'achtergrondruis' in verband met oxidatieve stressniveaus vermijden. Dienovereenkomstig laten we in elektronisch aanvullend materiaal S1 en S2 zien, gebruikmakend van een van onze eigen datasets (gegevens beschikbaar in elektronisch aanvullend materiaal, S3), dat een dergelijke benadering de enige was die een significant verband aan het licht bracht tussen oxidatieve schade aan DNA en telomeren in steenkool mees (Periparus ater) nestvogels (informatie over oxidatieve stress en telomeermetingen werden eerder afzonderlijk gepubliceerd in [32,33]).

De levensfase waarin dieren worden bemonsterd, is ook een belangrijk aspect om te overwegen. Zo is telomerase waarschijnlijk actief tijdens de embryonale ontwikkeling en mogelijk in latere levensstadia in bepaalde weefsels in sommige taxa [3]. Dit is belangrijk om te overwegen, omdat het de ware relatie tussen oxidatieve stress en telomeerverkorting zou kunnen maskeren in vivo. Bovendien is tijdens de groeiperiode het eindreplicatieprobleem tijdens de celdeling waarschijnlijk een belangrijke oorzaak van telomeerverkorting, wat verschillende gevolgen kan hebben waar onderzoekers rekening mee moeten houden. Inderdaad, de snelle celdeling en het bijbehorende eindreplicatieprobleem tijdens de groei zou de kans op het vinden van significante resultaten in correlatieve onderzoeken kunnen verminderen, omdat het het relatieve aandeel van telomeerverkorting dat verband houdt met oxidatieve stress, zal verminderen. Als alternatief zou snelle celdeling gekoppeld aan groei de kans op het detecteren van significante resultaten in experimentele studies kunnen vergroten door snelle enkelstrengige schade om te zetten in daadwerkelijke telomeerverkorting.

De aard van de experimentele manipulatie moet ook zorgvuldig worden overwogen. Inderdaad, hoewel studies naar suppletie met antioxidanten die in tabel 2 worden beschreven, behoorlijk succesvol waren in het vinden van significante gunstige effecten op de telomeerlengte, zou elk niet-significant resultaat van een dergelijke suppletie naar onze mening niet verrassend zijn. Inderdaad, een dergelijke suppletie met antioxidanten is waarschijnlijk alleen gunstig als er behoefte is aan extra antioxidanten, en niet als dieren niet van nature beperkt zijn in hulpbronnen [53]. Dit zou kunnen verklaren waarom suppletie met antioxidanten in sommige gevallen alleen gunstig was voor bepaalde groepen dieren [43,44].

Ten slotte kunnen andere soorten vooroordelen, zoals statistische vooroordelen of publicatiebias, ook ons ​​begrip van de effecten van oxidatieve stress op telomeren scheeftrekken. Inderdaad, rekening houdend met het feit dat 'correlatie geen oorzakelijk verband is', is het ontbreken van een significante correlatie ook absoluut geen goede ondersteuning tegen oorzakelijk verband. Belangrijk is dat de type II statistische fout (dwz 'vals-negatief') dus zorgvuldig moet worden overwogen voordat conclusies worden getrokken over niet-significante relaties (zoals gedaan door [7]), en de steekproefomvang moet over het algemeen erg groot zijn om type II fout. De mogelijke voorkeur voor de publicatie van alleen significante resultaten zal waarschijnlijk ook het algemene beeld dat tot nu toe in de wetenschappelijke literatuur is gevonden, veranderen. Dit is waarschijnlijk met name het geval in experimentele studies, aangezien hun belangrijkste focus ligt op de verbanden tussen oxidatieve stress en telomere verkorting. Correlatiestudies zijn waarschijnlijk minder gevoelig voor deze bias omdat ze vaak de correlatie tussen oxidatieve stress en telomeren rapporteren als onderdeel van andere biologische informatie.

5. Wat moeten we doen om het veld vooruit te helpen?

Wij zijn van mening dat alleen zorgvuldig ontworpen experimenten een robuust antwoord zullen geven op de vraag naar het belang van oxidatieve stress voor telomeerverkorting in vivo. Directe manipulatie van ROS-productie of downregulatie van antioxidantafweer is ongetwijfeld een krachtigere benadering dan antioxidantsuppletie, omdat suppletie alleen efficiënt is als reactie op een natuurlijke beperking in antioxidantafweer. Echter, het manipuleren van ROS in vivo is zeer uitdagend, zoals blijkt uit een recent overzicht [54]. Toch zijn sommige experimenten met pro-oxidant moleculen succesvol geweest in het induceren van matige oxidatieve schade (bijv. [55]), en het meten van telomeerlengte in een dergelijke context zou nuttige informatie moeten opleveren. De selectieve neerwaartse regulatie van het endogene antioxidant glutathion met behulp van BSO is ongetwijfeld een van de krachtigste instrumenten die onderzoekers ter beschikking staan ​​[38]. Deze manipulatie is zeer selectief omdat BSO alleen de glutathionsynthese remt en geen invloed heeft op andere cellulaire routes. Het is ook vermeldenswaard dat experimentele studies eerder een significante impact van oxidatieve stress op telomeren aan het licht brengen dan correlatieve studies. Het is inderdaad mogelijk dat organismen onder natuurlijke omstandigheden in de meeste gevallen in staat zijn om oxidatieve stress op een drempelniveau te houden dat geen invloed heeft op telomeren, terwijl experimentele manipulatie van oxidatieve stress een dergelijk evenwicht zou kunnen verstoren.

Ongeacht het soort experimentele manipulatie dat wordt gebruikt, is het belangrijk om de impact van de behandeling op oxidatieve schade (bij voorkeur op DNA) te valideren voordat de impact op telomeerlengte en/of -verkorting wordt onderzocht. Indien mogelijk moeten oxidatieve schade en telomeerlengte in exact hetzelfde monstertype worden gemeten. Het effect van de behandeling moet in verschillende weefsels worden onderzocht, omdat in de meest overtuigende studie tot nu toe [38] weefselspecifieke effecten van BSO op de telomeerlengte werden gevonden. Zoals vermeld in de vorige paragraaf, kunnen zowel de levensfase als het weefseltype de effecten van oxidatieve stress op de telomeerdynamiek beperken. Het uitvoeren van hetzelfde experiment bij zowel groeiende als volwassen individuen en het vergelijken van proliferatieve versus niet-proliferatieve weefsels zal dus belangrijk zijn om de gevoeligheid van telomeren voor oxidatieve stress in verschillende levensfasen te beoordelen, evenals het belang van celdeling bij het onthullen van de impact van oxidatieve stress op telomeerlengte. Ten slotte, gezien de verschillende experimentele beperkingen (bijv. herhaalde injecties of continue suppletie in water/voedsel, nauwlettende monitoring van de gezondheidstoestand) en ethische overwegingen, stellen we voor dat dergelijke onderzoeken worden uitgevoerd bij dieren in gevangenschap.

6. Conclusie

Het beperkte aantal onderzoeken naar de in vivo verband tussen oxidatieve stress en telomeerdynamiek benadrukt dat ons begrip van deze link nog steeds onvolledig is. Hoewel de correlatieve onderzoeken twijfelachtige resultaten opleveren, lijken de bevindingen van het beperkte aantal tot nu toe uitgevoerde experimentele onderzoeken erop te wijzen dat oxidatieve stress de telomeerverkorting beïnvloedt in vivo. Toch is de kans groter dat experimentele studies vatbaar zijn voor publicatiebias, zoals hierboven vermeld. De sleutel tot een beter begrip van de impact van oxidatieve stress op telomeerverkorting in vivo zal ongetwijfeld voortkomen uit robuuste experimentele studies, vooral als ze worden uitgevoerd in een breed scala van organismen, omdat er verschillen tussen taxa bestaan ​​in de biologie van telomeren. Ten slotte, wanneer het aantal gepubliceerde onderzoeken voldoende is om beperkingen in verband met heterogeniteit van gegevens te overwinnen, zal het van het grootste belang zijn om een ​​kwantitatieve meta-analyse uit te voeren van de relaties tussen oxidatieve stress en telomeerlengte in vivo.

Toegankelijkheid van gegevens

Gegevens zijn toegankelijk als Excel-bestand in elektronisch aanvullend materiaal S3.


Methoden:

Klonen, eiwitexpressie en zuivering van SARS-CoV-2 M pro

De celkweken werden gekweekt en het eiwit werd tot expressie gebracht volgens de methode in ref. 7 . De celpellets werden opnieuw gesuspendeerd in lysisbuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 5% glycerol), gelyseerd door homogenisatie onder hoge druk en vervolgens gecentrifugeerd bij 25.000G gedurende 30 minuten. Het supernatant werd geladen op een Ni-NTA-affiniteitskolom (Qiagen) en gewassen in lysisbuffer die 20 mM imidazool bevatte. Het His-gelabelde Mpro werd geëlueerd door lysisbuffer die 300 mM imidazool bevatte. Het imidazool werd vervolgens verwijderd door middel van ontzouten. Humaan rhinovirus 3C-protease werd toegevoegd om de C-terminale His-tag te verwijderen. De SARS-CoV-2 M pro werd verder gezuiverd door middel van ionenuitwisselingschromatografie, daarna werd de gezuiverde M pro overgebracht naar 10 mM Tris-HCl pH 8,0 door te ontzouten en bewaard bij -80 °C totdat het nodig was.

Kristallisatie, gegevensverzameling en structuurbepaling

SARS-CoV-2 M pro werd geconcentreerd tot 5 mg ml -1, 1 uur geïncubeerd met 0,3 mM carmofur (Selleck) en vervolgens werd het complex gekristalliseerd door de hangende druppeldampdiffusiemethode bij 20°C. De beste kristallen werden gekweekt met behulp van een putbuffer die 0,1 M MES pH 6,0, 5% polyethyleenglycol 6000 en 3% DMSO bevatte. De cryo-beschermende oplossing was het reservoir maar met 20% glycerol toegevoegd.

Röntgengegevens werden verzameld op bundellijn BL17U1 bij Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF) bij 100 K en bij een golflengte van 0,97918 A met behulp van een Eiger X 16M-opslagplaatdetector. Gegevensintegratie en schaling werden uitgevoerd met het programma XDS 21 . De structuur werd bepaald door moleculaire vervanging (MR) met PHASER 22 en Phenix 1.17.1 23 met SARS-CoV-2 M pro (PDB ID 6LU7) als zoeksjabloon. Het model van MR werd vervolgens onderworpen aan iteratieve cycli van handmatige modelaanpassing met Coot 0.8 24 en verfijning werd voltooid met Phenix REFINE 25. De remmer, carmofur, werd gebouwd volgens de weglatingskaart. De faserings- en verfijningsstatistieken zijn samengevat in aanvullende tabel 1.

Antivirale en cytotoxiciteitstesten voor carmofur

Een klinisch isolaat van SARS-CoV-2 (nCoV-2019BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019) werd vermeerderd in Vero E6-cellen en de virale titer werd bepaald zoals eerder beschreven 20 . Vero E6-cellen werden verkregen van ATCC met authenticatie. Authenticatie werd uitgevoerd door een morfologiecontrole onder een microscoop en analyse van de groeicurve. Alle cellen werden getest als mycoplasma-negatief. Voor de antivirale test werden voorgezaaide Vero E6-cellen (5 x 104 cellen per putje) gedurende 1 uur voorbehandeld met verschillende concentraties carmofur en het virus werd vervolgens toegevoegd (MOI van 0,05) om infectie gedurende 1 uur mogelijk te maken. Vervolgens werd het virus-geneesmiddelmengsel verwijderd en werden de cellen verder gekweekt met vers geneesmiddelbevattend medium. 24 uur na infectie werd het celsupernatant verzameld en vRNA in supernatant werd onderworpen aan qRT-PCR-analyse, terwijl cellen werden gefixeerd en onderworpen aan immunofluorescentie om het intracellulaire NP-niveau te controleren, zoals eerder beschreven 20 . Voor cytotoxiciteitstesten werden Vero E6-cellen gesuspendeerd in groeimedium in platen met 96 putjes. De volgende dag werden geschikte concentraties carmofur aan het medium toegevoegd. Na 24 uur werden de relatieve aantallen overlevende cellen gemeten met behulp van een Cell Counting Kit-8 (CCK8, Beyotime) -assay in overeenstemming met de instructies van de fabrikant. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd en alle infectie-experimenten werden uitgevoerd op bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3).

Rapportageoverzicht

Meer informatie over onderzoeksopzet is beschikbaar in de Nature Research Reporting Summary die aan dit artikel is gekoppeld.


Bekijk de video: Biologie - Basics Grundwissen (December 2021).