Informatie

Hoe waarschijnlijk is het om een ​​infectie te ontwikkelen door een enkel virion dat een enkele cel binnendringt?


Is er enig onderzoek (inclusief wiskundige of computationele modellering) met betrekking tot hoe waarschijnlijk het is om een ​​organisme te infecteren vanaf een enkel virion dat een enkele cel binnenkomt?

Ik ben geïnteresseerd in elk virus en elk meercellig organisme (inclusief immuungecompromitteerd).


Dit is een geweldige biologische vraag! Het vraagt ​​veel over hoe empirische wetenschap wordt gedaan op het gebied van moderne biologie! Ik ben blij dat we dergelijke vragen aanmoedigen van nieuwsgierige mensen die meer willen weten.


Dit wordt de onafhankelijke actiehypothese genoemd, die hier wordt beschreven:

De Independent Action Hypothesis (IAH) stelt dat pathogene individuen (cellen, sporen, virusdeeltjes etc.) zich onafhankelijk van elkaar gedragen, zodat elk een onafhankelijke kans heeft om systemische infectie of overlijden te veroorzaken.

Zwart et al. (2009) test deze theorie en hun resultaten ondersteunen de hypothese dat een enkel virusdeeltje een cel kan infecteren:

De 'onafhankelijke actiehypothese' (IAH) stelt dat elk pathogeen individu een niet-nul kans heeft om gastheerdood te veroorzaken en dat pathogene individuen onafhankelijk handelen. IAH is niet grondig getest. In dit artikel ontwikkelen we (i) een probabilistisch raamwerk voor het testen van IAH en (ii) laten we zien dat in twee van de zes geteste virus-insectenpathosystemen IAH wordt ondersteund door de gegevens.

De modellering die in dit document wordt gedaan, is wellicht de moeite van het bekijken waard.


Sleutelneuscellen geïdentificeerd als waarschijnlijke toegangspunten voor het COVID-19-virus

Twee specifieke celtypen in de neus zijn geïdentificeerd als waarschijnlijke initiële infectiepunten voor COVID-19-coronavirus. Wetenschappers ontdekten dat slijmbekercellen en trilhaarcellen in de neus hoge niveaus van de toegangseiwitten bevatten die het COVID-19-virus gebruikt om in onze cellen te komen. De identificatie van deze cellen door onderzoekers van het Wellcome Sanger Institute, Universitair Medisch Centrum Groningen, University Cote d'Azur en CNRS, Nice en hun medewerkers, als onderdeel van het Human Cell Atlas Lung Biological Network, zou de hoge transmissiesnelheid van COVID-19.

Vandaag (23 april) gemeld in Natuurgeneeskunde, maakt deze eerste publicatie met het Lung Biological Network deel uit van een voortdurende internationale inspanning om Human Cell Atlas-gegevens te gebruiken om infectie en ziekte te begrijpen. Het laat verder zien dat cellen in het oog en sommige andere organen ook de virale eiwitten bevatten. De studie voorspelt ook hoe een sleuteleiwit wordt gereguleerd met andere genen van het immuunsysteem en onthult mogelijke doelen voor de ontwikkeling van behandelingen om de overdracht te verminderen.

Nieuwe coronavirusziekte -- COVID-19 -- tast de longen en luchtwegen aan. De symptomen van de patiënt kunnen griepachtig zijn, waaronder koorts, hoesten en keelpijn, terwijl sommige mensen geen symptomen ervaren maar toch een overdraagbaar virus hebben. In het ergste geval veroorzaakt het virus een longontsteking die uiteindelijk tot de dood kan leiden. Men denkt dat het virus wordt verspreid via ademhalingsdruppeltjes die worden geproduceerd wanneer een geïnfecteerde persoon hoest of niest, en lijkt gemakkelijk te worden overgedragen binnen de getroffen gebieden. Tot nu toe heeft het virus zich verspreid naar meer dan 184 landen en meer dan 180.000 levens geëist.

Wetenschappers over de hele wereld proberen precies te begrijpen hoe het virus zich verspreidt, om overdracht te helpen voorkomen en een vaccin te ontwikkelen. Hoewel bekend is dat het virus dat de ziekte COVID-19 veroorzaakt, bekend als SARS-CoV-2, een soortgelijk mechanisme gebruikt om onze cellen te infecteren als een gerelateerd coronavirus dat de SARS-epidemie van 2003 veroorzaakte, hadden de exacte celtypen die bij de neus betrokken waren niet eerder vastgesteld.

Om te ontdekken welke cellen betrokken kunnen zijn bij de overdracht van COVID-19, analyseerden onderzoekers meerdere Human Cell Atlas (HCA) consortium-datasets van single cell RNA-sequencing, van meer dan 20 verschillende weefsels van niet-geïnfecteerde mensen. Deze omvatten cellen uit de longen, neusholte, oog, darm, hart, nier en lever. De onderzoekers zochten naar welke individuele cellen beide van de twee belangrijkste entry-eiwitten tot expressie brachten die door het COVID-19-virus worden gebruikt om onze cellen te infecteren.

Dr. Waradon Sungnak, de eerste auteur van het artikel van het Wellcome Sanger Institute, zei: "We ontdekten dat het receptoreiwit - ACE2 - en de TMPRSS2-protease die de toegang tot SARS-CoV-2 kan activeren, tot expressie worden gebracht in cellen in verschillende organen, inclusief de cellen aan de binnenkant van de neus. Vervolgens onthulden we dat slijmproducerende slijmbekercellen en trilhaarcellen in de neus de hoogste niveaus van deze beide COVID-19-viruseiwitten hadden, van alle cellen in de luchtwegen. Dit maakt deze cellen de meest waarschijnlijke initiële infectieroute voor het virus."

Dr. Martijn Nawijn, van het Universitair Medisch Centrum Groningen in Nederland, zei namens het HCA Lung Biological Network: "Dit is de eerste keer dat deze specifieke cellen in de neus in verband worden gebracht met COVID-19. Hoewel er veel factoren zijn die bijdragen aan de overdraagbaarheid van virussen, onze bevindingen komen overeen met de snelle infectiepercentages van het virus die tot nu toe zijn waargenomen.De locatie van deze cellen op het oppervlak van de binnenkant van de neus maakt ze zeer toegankelijk voor het virus en kan ook helpen bij de overdracht Naar andere mensen."

De twee sleuteleiwitten ACE2 en TMPRSS2 werden ook gevonden in cellen in het hoornvlies van het oog en in het slijmvlies van de darm. Dit suggereert een andere mogelijke infectieroute via de oog- en traankanalen, en onthulde ook een potentieel voor fecaal-orale transmissie.

Wanneer cellen beschadigd raken of een infectie bestrijden, worden verschillende immuungenen geactiveerd. De studie toonde aan dat de productie van ACE2-receptoren in de neuscellen waarschijnlijk tegelijk met deze andere immuungenen wordt ingeschakeld.

Het werk werd uitgevoerd als onderdeel van het wereldwijde Human Cell Atlas-consortium dat tot doel heeft referentiekaarten te maken van alle menselijke cellen om gezondheid en ziekte te begrijpen. Meer dan 1.600 mensen in 70 landen zijn betrokken bij de HCA-gemeenschap en de gegevens zijn openlijk beschikbaar voor wetenschappers over de hele wereld.

Dr. Sarah Teichmann, senior auteur van het Wellcome Sanger Institute en co-voorzitter van het HCA Organizing Committee, zei: "Terwijl we de menselijke celatlas bouwen, wordt deze al gebruikt om COVID-19 te begrijpen en te identificeren welke van onze cellen zijn van cruciaal belang voor de eerste infectie en overdracht. Deze informatie kan worden gebruikt om beter te begrijpen hoe het coronavirus zich verspreidt. Weten welke exacte celtypen belangrijk zijn voor de overdracht van virussen, biedt ook een basis voor het ontwikkelen van mogelijke behandelingen om de verspreiding van het virus te verminderen."

Het wereldwijde HCA Lung Biological Network blijft de gegevens analyseren om meer inzicht te krijgen in de cellen en doelwitten die waarschijnlijk bij COVID-19 betrokken zijn, en om ze te relateren aan patiëntkenmerken.

Professor Sir Jeremy Farrar, directeur van Wellcome, zei: "Door de exacte kenmerken van elk afzonderlijk celtype vast te stellen, helpt de menselijke celatlas wetenschappers om ziekten, waaronder COVID-19, op een geheel nieuwe manier te diagnosticeren, op te volgen en te behandelen. Onderzoekers over de hele wereld wereld werken in een ongekend tempo om ons begrip van COVID-19 te verdiepen, en dit nieuwe onderzoek is daar het bewijs van.Samenwerken over de grenzen heen en openlijk delen van onderzoek is cruciaal om snel effectieve diagnostiek, behandelingen en vaccins te ontwikkelen, zodat geen enkel land achterblijft ."


Hoe waarschijnlijk is het om een ​​infectie te ontwikkelen door een enkel virion dat een enkele cel binnendringt? - Biologie

Misschien is geen ziekte sterker geïdentificeerd met het einde van de twintigste eeuw dan het verworven immunodeficiëntiesyndroom, algemeen bekend als AIDS. Maar volgens een rapport van de Verenigde Naties uit 2004 over de toestand van de wereldwijde aids-epidemie is de ziekte nog niet begonnen haar greep op de wereldbevolking te verminderen, ondanks het feit dat aids over het algemeen niet dezelfde hoeveelheid publieke aandacht krijgt als vroeger deed. Integendeel, in veel landen nemen de infecties toe, ook in landen met een hoog inkomen zoals de Verenigde Staten. In 2003 liepen bijna vijf miljoen mensen het humaan immunodeficiëntievirus (hiv) op dat aids veroorzaakt, het grootste aantal nieuwe infecties in één jaar sinds aids voor het eerst officieel als een ziekte werd erkend in 1981.

Het virus dat verantwoordelijk is voor hiv werd voor het eerst geïsoleerd in 1983 door Robert Gallo uit de Verenigde Staten en de Franse wetenschapper Luc Montagnier. Sinds die tijd is er enorm veel onderzoek gedaan naar de veroorzaker van AIDS en is er veel geleerd over de structuur van het virus en zijn typische manier van handelen. HIV behoort tot een groep atypische virussen die retrovirussen worden genoemd en die hun genetische informatie in de vorm van ribonucleïnezuur (RNA) behouden. Door het gebruik van een enzym dat bekend staat als reverse transcriptase, zijn HIV en andere retrovirussen in staat om deoxyribonucleïnezuur (DNA) uit RNA te produceren, terwijl de meeste cellen het tegenovergestelde proces uitvoeren, door het genetische materiaal van DNA in RNA te transcriberen. Door de activiteit van het enzym kan de genetische informatie van HIV permanent worden geïntegreerd in het genoom (chromosomen) van een gastheercel.

De primaire gastheren voor HIV zijn de witte bloedcellen die afwisselend helper-T-lymfocyten, helper-T-cellen of CD4+-T-cellen worden genoemd. Deze cellen zijn belangrijke componenten van het immuunsysteem die normaal gesproken verantwoordelijk zijn voor het activeren van de reacties van veel andere immuuncellen. Helper-T-cellen die geïnfecteerd raken met HIV sterven snel af. Kort na de primaire infectie is het lichaam gewoonlijk in staat om het verlies van geïnfecteerde T-cellen te compenseren door ze in grotere hoeveelheden aan te maken, waarna met HIV geïnfecteerde personen asymptomatisch zijn. Na verloop van tijd wordt het virus echter steeds acuter en is er een langzame afname van helper-T-cellen. Dientengevolge wordt het aantal helper-T-cellen in het lichaam (de CD4-telling genoemd) over het algemeen gebruikt om de voortgang van het virus te meten. Een CD4-telling van minder dan ongeveer 200 cellen per microliter bloed kan gepaard gaan met een verscheidenheid aan opportunistische infecties en wordt beschouwd als het laatste stadium van infectie. Het aanhoudende spervuur ​​van dergelijke infecties leidt doorgaans tot de dood van AIDS-patiënten.

HIV is een relatief complex virus dat in staat is om helper-T-cellen te infecteren, voornamelijk vanwege een glycoproteïne dat is ingebed in zijn envelop, gp120 genaamd (zie figuur 1) en dat hecht aan CD4, een eiwit dat op de oppervlakken van de T-cellen wordt aangetroffen. Er wordt ook gedacht dat het binnendringen van HIV in een gastheercel een co-receptor op het celoppervlak omvat, ofwel CCR5 of CXCR4, die typisch functioneren als receptoren van chemokinen. De envelop van het HIV-virus is een derivaat van het plasmamembraan van een gastheercel, verkregen via knopvorming. Wanneer HIV een cel probeert binnen te dringen, zorgen interacties tussen celoppervlaktemoleculen en virale envelopeiwitten ervoor dat de envelop samensmelt met het celmembraan. Het is bekend dat het envelopeiwit gp41 een belangrijke rol speelt in dit proces.

In een geïnfecteerde cel ondergaat HIV reverse transcriptie, waarbij dubbelstrengs DNA uit zijn RNA wordt geproduceerd met behulp van reverse transcriptase, een gespecialiseerd virusspecifiek enzym dat DNA van een RNA-template transcribeert. Eenmaal in DNA-vorm wordt de genetische informatie van HIV als een provirus opgenomen in het DNA van de gastheercel. Het provirale genoom kan vervolgens worden getranscribeerd in viraal RNA dat fungeert als mRNA voor translatie in HIV-eiwitten en als genomen voor de daaropvolgende generatie van het virus. Capsiden vormen zich rond de virale genomen en eiwitten voordat ze uit het celmembraan worden ontkiemd, waardoor het materiaal verder wordt ingekapseld in enveloppen.

Het replicatieproces van HIV gaat gepaard met een zeer hoge mutatiesnelheid omdat reverse transcriptie geen correctie van fouten in de opname van nucleotiden mogelijk maakt. HIV evolueert een miljoen keer sneller dan de evolutie van het menselijk genoom, waardoor het voor het immuunsysteem extreem moeilijk is om het te herkennen en effectief te bestrijden. Om soortgelijke redenen is de ontwikkeling van medicijnen of vaccins voor HIV een gecompliceerde onderneming, het virus verschilt niet alleen sterk van patiënt tot patiënt, maar vertoont zelfs significante genomische discrepanties bij individuen. Een remedie voor hiv blijft ongrijpbaar, maar aanzienlijke vooruitgang heeft de kwaliteit van de zorg die patiënten kunnen ontvangen aanzienlijk verbeterd. Zeer actieve antiretrovirale therapie (HAART), waarbij meerdere reverse transcriptase- en proteaseremmers worden gebruikt, is voor veel patiënten een zeer gunstige vorm van behandeling gebleken, maar de kosten van de therapie hebben het wijdverbreide gebruik ervan in veel delen van de wereld verhinderd. getroffen door hiv en aids.


Hoe waarschijnlijk is het om een ​​infectie te ontwikkelen door een enkel virion dat een enkele cel binnendringt? - Biologie

Naast de gewone verkoudheid is griep of "griep" misschien wel de meest bekende luchtweginfectie ter wereld. Alleen al in de Verenigde Staten krijgen jaarlijks ongeveer 25 tot 50 miljoen mensen griep. De symptomen van griep zijn vergelijkbaar met die van verkoudheid, maar zijn meestal ernstiger. Koorts, hoofdpijn, vermoeidheid, spierzwakte en pijn, keelpijn, droge hoest en een loopneus of verstopte neus komen vaak voor en kunnen zich snel ontwikkelen. Gastro-intestinale symptomen die gepaard gaan met griep worden soms door kinderen ervaren, maar voor de meeste volwassenen worden ziekten die zich uiten in diarree, misselijkheid en braken niet veroorzaakt door het griepvirus, hoewel ze vaak onnauwkeurig worden aangeduid als de 'buikgriep'. Een aantal complicaties, zoals het ontstaan ​​van bronchitis en longontsteking, kunnen ook optreden in combinatie met griep en komen vooral veel voor bij ouderen, jonge kinderen en iedereen met een onderdrukt immuunsysteem.

Influenza is zeer besmettelijk en komt vaker voor tijdens de koudere maanden van het jaar. In tegenstelling tot wat traditioneel wordt gedacht, is het klimaat zelf niet direct verantwoordelijk voor de toename van de incidentie, maar eerder toe te schrijven aan de grotere hoeveelheid tijd die binnenshuis wordt doorgebracht in de nabijheid van andere individuen tijdens slecht weer. Het griepvirus wordt voornamelijk overgedragen via luchtwegsecreties die vrijkomen wanneer een besmet persoon hoest of niest. De incubatie duurt meestal één tot twee dagen vanaf het moment van infectie en de meeste mensen beginnen binnen een week op natuurlijke wijze te herstellen van de symptomen. De overgrote meerderheid van de griepgerelateerde sterfgevallen wordt veroorzaakt door complicaties van de griep en niet door het eigenlijke griepvirus.

Er zijn drie verschillende typen influenzavirus geïdentificeerd, genaamd A, B en C. Samen vormen deze virussen, die antigeen van elkaar verschillen, hun eigen virale familie, Orthomyxoviridae. De meeste gevallen van griep, vooral die bij epidemieën of pandemieën, worden veroorzaakt door het influenza A-virus, dat een verscheidenheid aan diersoorten kan treffen, maar het B-virus, dat normaal alleen bij mensen voorkomt, is verantwoordelijk voor veel plaatselijke uitbraken. Het influenza C-virus is morfologisch en genetisch verschillend van de andere twee virussen en is over het algemeen niet-symptomatisch, dus van weinig medisch belang.

De structuur van het influenzavirus (zie figuur 1) is enigszins variabel, maar de viriondeeltjes zijn meestal bolvormig of eivormig en hebben een diameter van 80 tot 120 nanometer. Soms komen filamenteuze vormen van het virus ook voor en komen deze vaker voor bij sommige influenzastammen dan bij andere. Het influenzavirion is een omhuld virus dat zijn lipidedubbellaag ontleent aan het plasmamembraan van een gastheercel. Twee verschillende varianten van glycoproteïne spikes zijn ingebed in de envelop. Ongeveer 80 procent van de spikes zijn hemagglutinine, een trimeer eiwit dat functioneert bij de aanhechting van het virus aan een gastheercel. De resterende 20 procent van de glycoproteïnepieken bestaat uit neuraminidase, waarvan wordt gedacht dat het voornamelijk betrokken is bij het vergemakkelijken van de afgifte van nieuw geproduceerde virusdeeltjes uit de gastheercel. Aan de binnenkant van de envelop die een influenzavirion omringt, bevindt zich een voering van antigeen matrixeiwit. Binnen de envelop bevindt zich het influenzagenoom, dat is georganiseerd in acht stukken enkelstrengs RNA (A- en B-vormen, alleen influenza C heeft 7 RNA-segmenten). Het RNA is verpakt met nucleoproteïne in een spiraalvormige ribonucleoproteïnevorm, met drie polymerasepeptiden voor elk RNA-segment.

Mutaties in de antigene structuur van het influenzavirus hebben geleid tot een aantal verschillende subtypes en stammen van influenza. Specifieke varianten van het virus worden over het algemeen genoemd volgens de specifieke antigene determinanten van hemagglutinine (13 hoofdtypen) en neuraminidase (9 hoofdtypen) oppervlakte-eiwitten die ze bezitten, zoals in influenza A(H2N1) en A(H3N2). Nieuwe stammen van het influenzavirus ontstaan ​​als gevolg van een geleidelijk proces dat bekend staat als antigene drift, waarbij mutaties in de antilichaambindingsplaatsen van het virus zich in de loop van de tijd ophopen. Door dit mechanisme is het virus in staat om het immuunsysteem van het lichaam grotendeels te omzeilen, dat mogelijk niet in staat is om een ​​nieuwe griepstam te herkennen en immuniteit te verlenen, zelfs als een persoon al immuniteit heeft opgebouwd tegen een andere stam van het virus. Zowel A- als B-influenzavirussen ondergaan voortdurend antigene drift, maar de jaarlijkse herformulering van influenzavaccins stelt wetenschappers vaak in staat rekening te houden met eventuele nieuwe stammen die zijn ontstaan.

Influenza A ervaart ook een ander type mutatie, antigene verschuiving genaamd, die resulteert in een nieuw subtype van het virus. Antigene shift is een plotselinge verandering in antigeniciteit veroorzaakt door de recombinatie van het influenzagenoom, die kan optreden wanneer een cel gelijktijdig wordt geïnfecteerd door twee verschillende stammen van type A influenza. Het ongewoon brede scala van gastheren die vatbaar zijn voor influenza A lijkt de kans te vergroten dat deze gebeurtenis zal plaatsvinden. Vooral het mengen van stammen die vogels, varkens en mensen kunnen infecteren, wordt verantwoordelijk geacht voor de meeste antigene verschuivingen. Met name in sommige delen van de wereld leven mensen dicht bij zowel varkens als gevogelte, zodat menselijke stammen en vogelstammen gemakkelijk tegelijkertijd een varken kunnen infecteren, wat resulteert in een uniek virus. Nieuwe subtypes van influenza A ontwikkelen zich abrupt en onvoorspelbaar, zodat wetenschappers niet van tevoren vaccins kunnen maken die ertegen effectief zijn. Bijgevolg kan de opkomst van een nieuw subtype van het virus in zeer korte tijd een wereldwijde pandemie veroorzaken.

Naast vaccins zijn er nog een paar andere wapens ontworpen om de griep te bestrijden. De antivirale medicijnen amantadine en rimantadine kunnen de ernst van de ziekte helpen verminderen bij personen met griep die de medicijnen binnen twee dagen na het begin van de symptomen beginnen te gebruiken. Deze medicijnen werken door de verandering in pH te belemmeren die nodig is voor het griepvirion om zijn inhoud af te geven in het cytosol van een gastheercel. Twee aanvullende antivirale middelen, zanamavir en oseltamivir, zijn effectief tegen zowel het A- als het B-type influenza. In plaats van de pH-verschuivingen te verstoren, blokkeren zanamavir en oseltamivir het glycoproteïne neuraminidase, zodat de afgifte van nieuwe virusdeeltjes wordt geremd en hun verspreiding wordt tegengegaan. Het is belangrijk op te merken dat antibiotica niet in staat zijn om het influenzavirus zelf te bestrijden, maar soms aan patiënten met griep worden gegeven om aanvallen van opportunistische micro-organismen die verantwoordelijk zijn voor veel influenzacomplicaties, af te wenden.

Hoewel wijdverbreide bekendheid met de griep het voor een groot deel van de algemene bevolking relatief goedaardig doet lijken, kan het virus verwoestend zijn. In 1918 en 1919 stierven meer dan 20 miljoen mensen aan een virusstam die algemeen bekend staat als de Spaanse griep en die door bijna alle bewoonde delen van de wereld circuleerde. Sindsdien zijn er veel andere uitbraken geweest, hoewel geen enkele zo dodelijk was. Desalniettemin behoort griep, samen met complicaties van het virus, consequent tot de tien meest voorkomende doodsoorzaken in de Verenigde Staten, hoger dan sommige andere veel meer gepubliceerde moordenaars, zoals het hiv-virus dat aids veroorzaakt.


Essentiële menselijke virologie

Essentiële menselijke virologie is geschreven voor het niet-gegradueerde niveau met case studies geïntegreerd in elk hoofdstuk. De structuur en classificatie van virussen komen aan bod, evenals strategieën voor virusoverdracht en virusreplicatie op basis van het type viraal nucleïnezuur. Verschillende hoofdstukken zullen zich richten op opmerkelijke en herkenbare virussen en de ziekten die daardoor worden veroorzaakt, waaronder griep, hiv, hepatitisvirussen, poliovirus, herpesvirussen en opkomende en gevaarlijke virussen.

Bovendien zal tijdens de bespreking van elke virusfamilie worden belicht hoe virussen ziekte of pathogenese veroorzaken, en zal een hoofdstuk over de immuunrespons op virussen worden opgenomen. Verder zullen onderzoekslaboratoriumtesten en virale diagnosetesten worden besproken, evenals vaccins, antivirale geneesmiddelen, gentherapie en het gunstige gebruik van virussen. Door zich te concentreren op algemene virologieprincipes, huidige en toekomstige technologieën, bekende menselijke virussen en de effecten van deze virussen op mensen, zal dit leerboek een solide basis in virologie bieden terwijl de interesse van niet-gegradueerde studenten behouden blijft.

Essentiële menselijke virologie is geschreven voor het niet-gegradueerde niveau met case studies geïntegreerd in elk hoofdstuk. De structuur en classificatie van virussen komen aan bod, evenals strategieën voor virusoverdracht en virusreplicatie op basis van het type viraal nucleïnezuur. Verschillende hoofdstukken zullen zich richten op opmerkelijke en herkenbare virussen en de ziekten die daardoor worden veroorzaakt, waaronder griep, hiv, hepatitisvirussen, poliovirus, herpesvirussen en opkomende en gevaarlijke virussen.

Bovendien zal tijdens de bespreking van elke virusfamilie worden belicht hoe virussen ziekte of pathogenese veroorzaken, en zal een hoofdstuk over de immuunrespons op virussen worden opgenomen. Verder zullen onderzoekslaboratoriumtesten en virale diagnosetesten worden besproken, evenals vaccins, antivirale geneesmiddelen, gentherapie en het gunstige gebruik van virussen. Door zich te concentreren op algemene virologieprincipes, huidige en toekomstige technologieën, bekende menselijke virussen en de effecten van deze virussen op mensen, zal dit leerboek een solide basis in virologie bieden terwijl de interesse van niet-gegradueerde studenten behouden blijft.


HCV-levenscyclus

  • Bartenschlager R, Lohmann V, Penin F. De moleculaire en structurele basis van geavanceerde antivirale therapie voor hepatitis C-virusinfectie. Nat Rev Microbiol. 201311:482-96.

Verbindend

  • Agnello V, Abel G, Elfahal M, Knight GB, Zhang QX. Hepatitis C-virus en andere flaviviridae-virussen komen de cellen binnen via een lipoproteïne-receptor met lage dichtheid. Proc Natl Acad Sci U S A. 199996:12766-71.

Endocytose

  • Blanchard E, Belouzard S, Goueslain L, et al. Het binnendringen van het hepatitis C-virus hangt af van door clathrine gemedieerde endocytose. J Virol. 200680:6964-72.

Fusie en Uncoating

  • Koutsoudakis G, Kaul A, Steinmann E, et al. Karakterisering van de vroege stappen van hepatitis C-virusinfectie met behulp van luciferasereportervirussen. J Virol. 200680:5308-20.

Vertaling

  • Fraser CS, Doudna JA. Structurele en mechanistische inzichten in de initiatie van virale translatie van hepatitis C. Nat Rev Microbiol. 20065:29-38.

Proteolytische verwerking

  • Bartenschlager R, Ahlborn-Laake L, Mous J, Jacobsen H. Kinetische en structurele analyses van de verwerking van polyproteïne van het hepatitis C-virus. J Virol. 199468:5045-55.

RNA-replicatie

  • Appleby TC, Perry JK, Murakami E, et al. Virale replicatie. Structurele basis voor RNA-replicatie door het hepatitis C-viruspolymerase. Wetenschap. 2015347:771-5.

Samenkomst

  • Bartenschlager R, Penin F, Lohmann V, André P. Assemblage van infectieuze hepatitis C-virusdeeltjes. Trends Microbiol. 201119:95-103.

Rijping

  • Coller KE, Heaton NS, Berger KL, Cooper JD, Saunders JL, Randall G. Moleculaire determinanten en dynamiek van de secretie van hepatitis C-virus. PLoS Pathog. 20128:e1002466.

Uitgave

  • Coller KE, Heaton NS, Berger KL, Cooper JD, Saunders JL, Randall G. Moleculaire determinanten en dynamiek van de secretie van hepatitis C-virus. PLoS Pathog. 20128:e1002466.

Delen via email

Over HCV-biologie

De biologiepagina van het hepatitis C-virus (HCV) biedt een zeer visueel leerformaat om basisconcepten met betrekking tot de biologie van HCV te verkennen. Conceptueel is het belangrijk om te begrijpen dat translatie van het HCV-RNA resulteert in de productie van structurele en niet-structurele eiwitten en dat deze niet-structurele eiwitten alleen in hepatocyten worden aangetroffen. Klik op een van de bovenstaande links voor meer informatie over de HCV-structuur, eiwitten of levenscyclus.

Editors
David H. Spach, MD
H. Nina Kim, MD

Illustratoren
Jared Travnicek, CMI, Cognition Studio
David Ehlert, CMI, Cognition Studio

Recensenten
Shyamasundaran Kottilil, PhD
Stephen J. Polyak, PhD


Maar het vaccin-epitooprepertoire is waardeloos! Ik wil MOARE bescherming, geef mij maar Covid!

Wacht, laat me dit rechtzetten. U loopt liever het risico om aan Covid te overlijden ter bescherming tegen het een tweede keer krijgen in plaats van een vaccin te krijgen en niet het risico te lopen te overlijden aan Covid? Dat heeft geen enkele zin.

En alleen omdat het epitooprepertoire van een "natuurlijke" Covid-infectie breder is dan dat van een spike-specifiek vaccin, maakt het niet automatisch beter voor bescherming tegen daaropvolgende infectie. Sterker nog, het kan het zelfs erger maken. Lees verder.

Wat is precies een epitooprepertoire? Het is de verzameling van verschillende korte fragmenten van virale eiwitten die het immuunsysteem is getraind om te herkennen en aan te vallen na een natuurlijke infectie of een vaccin. Wanneer onze immuuncellen het natuurlijke virion tegenkomen, zullen ze de verschillende eiwitten in deze korte fragmenten opdelen en uiteindelijk legers van B-cellen en T-cellen op de been brengen, bedoeld om antilichamen tegen die fragmenten te produceren of geïnfecteerde cellen te doden die die fragmenten vertonen.

Zoals ik echter al zei, zijn niet alle antilichamen gelijk gemaakt. Om te beschermen tegen toekomstige infecties, zijn de meest bruikbare antilichamen neutraliserende antilichamen, die voorkomen dat het virus onze cellen binnendringt. Helaas weet ons immuunsysteem niet welke antilichamen zullen neutraliseren en welke niet, omdat het blindelings antilichamen zal uitpompen tegen de epitopen die het tegenkomt. Maar wij, mensen, gewapend met onze hersenen, weten dat alleen antilichamen die aan het spike-eiwit blijven kleven neutraliserend kunnen werken, omdat het spike-eiwit het enige is waar het virus uit steekt en alle andere eiwitten erin verborgen zijn. Dus voor de doeleinden van een vaccin kunnen we het immuunsysteem gewoon de piek geven en zijn middelen niet gebruiken voor het produceren van nutteloze antilichamen, zoals bijvoorbeeld tegen het N-eiwit (nucleocapside). Vooral omdat werd waargenomen dat hogere N-antilichaamtiters geassocieerd waren met slechtere ziekteprogressie:


Resultaten

ViscRNA-Seq herstelt mRNA en viraal RNA uit afzonderlijke cellen

viscRNA-Seq is gewijzigd van de veelgebruikte Smart-seq2 voor eencellige RNA-Seq (Picelli et al., 2014). In het kort worden enkele menselijke cellen gesorteerd in platen met 384 putjes die vooraf zijn gevuld met lysisbuffer (Figuur 1C). Naast ERCC (External RNA Controls Consortium) spike-in RNA's en het standaard poly-T-oligonucleotide (oligo-dT) dat het gastheer-mRNA vangt, bevat de lysisbuffer een DNA-oligo die omgekeerd complementair is aan het positieve-strengs virale RNA (Figuur 1D). De toevoeging van een virusspecifieke oligo overwint beperkingen van andere benaderingen en maakt het mogelijk om virussen te bestuderen die niet gepolyadenyleerd zijn (Russell et al., 2018). Omgekeerde transcriptie en template-switching wordt vervolgens uitgevoerd zoals in Smart-seq2, maar met een 5'-geblokkeerde template-switching oligonucleotide (TSO) die de vorming van artefactproducten (TSO-concatemeren) sterk vermindert. Het cDNA wordt vervolgens geamplificeerd, gekwantificeerd en gescreend op aanwezigheid van virussen via een qPCR-assay (Figuur 1E). Omdat veel cellen niet zijn geïnfecteerd, stelt dit ons in staat om putjes te kiezen die zowel lage als hoge vRNA-niveaus bevatten en vervolgens hun cDNA te sequensen op een illumina NextSeq op een diepte van ∼ 400.000 reads per cel (Figuur 1F). Deze benadering biedt een hoge dekking van transcriptoom en maakt hoogwaardige kwantificering van genexpressie en intracellulaire virusovervloed in een relatief groot aantal cellen mogelijk.

ViscRNA-Seq kwantificeert genexpressie en virus-RNA van dezelfde cel.

. (A tot F) Experimenteel ontwerp: (EEN) menselijke hepatoomcellen (Huh7) worden geïnfecteerd met dengue- of Zika-virus op tijdstip 0 op multipliciteit van infectie (MOI) 0 (controle), 1 of 10, dan (B) geoogst op verschillende tijdstippen, (C) gesorteerd en gelyseerd in enkele putjes. (NS) Zowel mRNA als viraal RNA (vRNA) worden omgekeerd getranscribeerd en geamplificeerd vanuit elke cel, vervolgens (E) cellen worden gescreend op virusinfectie door qPCR. (F) Bibliotheken worden gemaakt en gesequenced op een illumina NextSeq 500 met een dekking van

400.000 leest per cel. (G) De fractie cellen met meer dan 10 virusaflezingen neemt toe met MOI en tijd, en verzadigt 48 uur na infectie. (H) Verdelingen van het aantal virusuitlezingen (links) en expressie van een voorbeeld van een stressresponsgen (rechts) in afzonderlijke cellen, die de verschillende dynamieken van de replicatie van pathogenen en de respons van de gastheer laten zien. Terwijl het virusgehalte 1000-voudig kan toenemen en geen verzadiging vertoont, verzadigt de expressie van DDIT3/CHOP na een 10-voudige toename.

We hebben viscRNA-Seq toegepast op een infectietijdverloop in gekweekte cellen. We infecteerden humane hepatoomcellen (Huh7) met DENV (serotype 2, stam 16681) bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 1 en 10. Om de reproduceerbaarheid te beoordelen, voerden we een onafhankelijk experiment uit op DENV-infectie op kleinere schaal (1/5e van de celaantallen) en kreeg consistente resultaten (zie figuur 2 - figuurbijlage 1). In een afzonderlijk experiment werden Huh7-cellen geïnfecteerd met ZIKV (Puerto Rico-stam, PRVABC59) met een MOI van 1. Niet-geïnfecteerde cellen uit dezelfde cultuur werden gebruikt als controles (Figuur 1A). Op vier verschillende tijdstippen na infectie - 4, 12, 24 en 48 uur - werden cellen geoogst, gesorteerd en verwerkt met viscRNA-Seq (Figuur 1B). Herstel van de ERCC-spikes en het aantal tot expressie gebrachte genen per cel bevestigde dat de bibliotheken van hoge kwaliteit waren (Figuur 1 - figuursupplement 1, panelen A-B). Van elke experimentele conditie werden 380 cellen gescreend op virus en

100 daarvan werden gesequenced. In totaal

7500 enkele cellen werden gescreend en

Overvloed aan intracellulaire virussen en genexpressie zijn heterogeen over cellen

Ten eerste hebben we ons gericht op infectie door DENV. Zoals verwacht vertoonde qPCR in de loop van de tijd een toename van de fractie geïnfecteerde cellen met beide MOI's (Figuur 1G). Terwijl de meeste genen vrij homogeen tot expressie werden gebracht, varieerden zowel de hoeveelheid intracellulair virus (aantal vRNA-lezingen per miljoen transcripten) als de expressie van een subset van genen sterk over geïnfecteerde cellen (Figuur 1H). Over het algemeen is tussen nul en een kwart van alle metingen van elke cel (d.w.z.

105 reads) zijn afgeleid van vRNA, vandaar dat het dynamische bereik voor de overvloed aan intracellulaire virussen extreem groot is. Gemiddeld nam de hoeveelheid intracellulair virus toe met de tijd en het traagheidsmoment. The distribution of both intracellular virus abundance and gene expression are rather symmetric in logarithmic space (Figure 1H) as a consequence, mean expression as measured in a bulk assay is higher than the median and over-represents highly infected cells. The high coverage sequencing enables a quantitative measurement of the variation in the expression level of thousands of genes in each cell (Figure 1—figure supplement 1–1B). As a next step, we aimed at identifying which elements of this variation are induced by the infection.

Correlation between intracellular virus abundance and gene expression within single cells tracks infection-triggered host response

In a bulk assay each of the experimental conditions would be an average of all cells, making it difficult to extract clear statistical patterns. Leveraging both single-cell resolution and high throughput, we directly computed Spearman’s rank correlation coefficient between each gene expression and intracellular virus abundance across all cells. This metric does not require an explicit noise model for either expression or virus abundance and is therefore insensitive to outlier cells. To assess uncertainties, we performed 100 bootstraps over cells (see Materials and methods). As expected, most genes do not correlate with vRNA level and the distribution of their correlation coefficients decays rapidly away from zero (Figure 2A). In panels 2B-D examples of strong anticorrelation, strong correlation, and absence of correlation are shown. Both the level of vRNA at which each gene starts to correlate and the slope of the response vary across genes and may reflect different infection stages (see below). Genes with extreme correlation consistently represent specific cellular functions. Most of the top correlated genes (Figure 2A right inset) are involved in the ER unfolded protein response (UPR) (see e.g. DDIT3 in Figure 2C), consistent with ER stress response triggered by flavivirus translation and RNA replication on ER-derived membranes (Medigeshi et al., 2007). Numerous strongly anticorrelated genes (Figure 2A left inset) are components of actin and microtubules, indicating cytoskeleton breakdown (as an example, see ACTB in Figure 2B). Notice that anticorrelated genes appear to react at higher intracellular virus amounts than correlated genes, as exemplified by the higher threshold for ACTB than DDIT3 (see Figure 2B–C, Materials and methods, and Figure 2—figure supplements 2,3). Molecular chaperones are found in both categories suggesting a more nuanced regulation.

Correlation between dengue vRNA and gene expression reveals cellular processes involved in dengue virus infection.

(EEN) Distribution of Spearman correlation coefficients between dengue vRNA and mRNA from the same cell across all human genes. The insets list the top correlated (right) and anticorrelated (left) genes. Response to ER stress and apoptosis is activated as infection proceeds, whereas actin and microtubules pathways are downregulated. (B–E) Examples of correlation patterns observed across the transcriptome, as a scatter plot of vRNA amount versus gene expression. Each dot is a single cell and the green shades indicate the density of cells. Dashed lines indicate least-square piecewise-linear fits in log-log space (see Materials and methods): (B) Anticorrelation at high vRNA content, (C) correlation at medium to high vRNA content, (NS) no correlation, and (E) time-dependent correlation dynamics. (F) Expression versus vRNA content for gene COPE, as shown in panel E but splitting cells by time after infection. Correlation at each time is shown in the top left corner of each plot, and switches from strongly negative to strongly positive as infection proceeds. (G) Correlation between expression and dengue vRNA content switches from negative to positive (< −0.3 to >+0.3) for six genes (left panel) and in the opposite direction for 11 genes (right panel), highlighting potential multiple roles of these genes during dengue virus infection. Error bars and numbers in parentheses are standard deviations of 100 bootstraps over cells (the latter indicates uncertainties on the last digit).

Dengue and Zika virus induce partially overlapping cellular responses.

(EEN) Correlation between gene expression and vRNA during Dengue virus versus Zika virus infection. Each dot is a gene and the contour lines indicate the an estimate of the density of genes. Most genes do not correlate with either virus, but some genes correlate strongly with different degrees of virus specificities. Only cells with 500 or more virus reads per million transcripts are used for this analysis (see main text). (B–E) Examples of genes with different behavior across the two viruses, as a scatter plot of gene expression versus vRNA content. Each dot is a single cell. Dengue plots are indicated by a D, Zika plots by a Z in the top left corner. Numbers in parentheses are standard deviations of 100 bootstraps over cells (uncertainties on the last digit).

To understand whether correlated genes may represent pathways that are important for virus infection, we focused on the top 1% correlated subset of the transcriptome (correlation in excess of 0.3 in absolute value) and performed Gene Ontology (GO) enrichment analysis using the online service PANTHER (Mi et al., 2017). This statistical analysis confirmed the qualitative picture emerging from the top correlates. At 4 hr post-infection upregulation of genes involved in translation and suppression of mRNA processing is demonstrated. At 48 hr post-infection there is an upregulation of UPR, protein degradation via ERAD, and ER-to-Golgi anterograde transport via COPII-coated vesicles, and a downregulation of cytoskeleton organization and cell cycle genes related to both G1-S and G2-M phases (see Supplementary files 1–4). No clear effect of cell cycle genes on infection at early time points is observed, in agreement with previous reports in human cells (see Figure 2—figure supplement 4) (Helt and Harris, 2005).

Several genes switch role during dengue infection

Naturally, cells that are infected for longer tend to harbor more vRNA. To disentangle the effect of time since infection from the vRNA level within each cell, we computed the same correlation coefficient within single time points. We discovered that most correlated genes exhibit either positive or negative correlation, but not both. This behavior is expected for generic stress response genes the sign of the differential expression is a hardwired component of their physiological function. However, a group of 17 ‘time-switcher’ genes show both an anticorrelation of less than −0.3 and a correlation in excess of +0.3 at different time points post-infection, suggesting a more specific interaction with DENV. Of these, six genes transition from anticorrelation to correlation (e.g. COPE, Figure 2E–F), 10 show the opposite trend, and a single gene (PFN1) follows a nonmonotonic pattern (Figure 2G). Since more than two time points were sampled, a consistent increase (or decrease) in correlation likely stems from a biological change rather than a technical noise. Of the six proteins which switch from anticorrelated to correlated, RPN1 and HM13 localize to the ER. RPN1 is a non-catalytic member of the oligosaccharide transfer (OST) complex, which is required for N-linked glycosylation of some ER proteins, whereas HM13 is a protease that cleaves the signal peptide after translocation into the ER. Both of these factors have been shown to be essential for DENV infection (Marceau et al., 2016). Of the other four proteins that show a similar behavior, SQSTM1 is a scaffold protein involved in selective autophagy of polyubiquitinated substrates and has been shown to have a bimodal behavior in DENV infection (Metz et al., 2015), whereas UBC is a major source of ubiquitin. Lastly, GORASP2 and COPE play a role in Golgi assembly and/or membrane trafficking. In particular COPE is a subunit of the coatomer complex (COPI) that mediates both intra-Golgi and Golgi-to-ER retrograde vesicle transport another subunit of this complex, COPB1, has recently been shown to be essential for DENV (Iglesias et al., 2015). Interestingly, COPE also appears to be downregulated during early infection in ‘bystander’ cells i.e. cells that originate from an infected culture but are themselves not infected (Figure 2—figure supplement 5). No uninfected cells were recovered from infected cultures at late time points.

Host response difference between DENV and ZIKV infections

Next we sought to address the question of which elements of the host response are common between DENV and ZIKV, and therefore potentially common with other evolutionarily related viruses as well. To do so, we replicated the time course experiment with ZIKV at MOI 0 (control) and 1. Although Huh7 cells were also infected at an MOI of 10, cell death precluded sorting. Figure 3A shows the correlations between gene expression (each dot represents a human gene) and vRNA for both experiments and represents the two-dimensional equivalent of Figure 2A. We discovered that the majority of genes are not correlated with either virus (contour lines indicate density of genes). Nevertheless, a clear pattern with genes along the positive diagonal emerged, such as ATF3 (Figure 3C) and ACTG1 (Figure 3D), demonstrating a similar behavior upon infection with either virus. A minority of genes are scattered away from the diagonal, indicating discordant behavior between DENV or ZIKV infection. For instance, ID2 expression decreases at high DENV level but increases at high ZIKV RNA level (Figure 3B), while the opposite trend is observed with the chaperone HSPA5 (Figure 3E and see below). A number of genes at the outskirts of the correlation plot are labeled and highlighted in red as they exhibit noteworthy expression patterns upon infection: i.e. either an extremely strong correlation with both viruses or a high degree of virus specificity. These outliers include two subunits of the SEC61 complex (B, and G), several subunits of the TRAP complex and the OST, previously shown to be essential for DENV and/or WNV infection (Marceau et al., 2016 Zhang et al., 2016), and other genes that may be relevant to infection with either virus.

To understand how these correlated genes shape the heterogeneity of infected cells, we selected all genes with a correlation coefficient above 0.4 or below −0.4 and performed t-SNE dimensionality reduction (Maaten and Hinton, 2008), coloring each cell by its intracellular virus abundance (Figure 4A, left) or by time post-infection (right). Although uninfected cells form a mixed, heterogeneous cloud, infection pushes cells into more stereotypic states that are distinct for DENV and ZIKV infection (black arrows indicate average positions for cells at increasing intracellular virus abundance). t-SNE visualization represents global trends contributed by many genes plotting gene expression dynamics on top of these visualizations enables one to connect single genes to these widespread changes defined by virus infection (Figure 4B). Remarkably, the temporal behavior of a few genes is inconsistent with the global transcriptomics shifts: for instance the expression of HSPA5 increases until 24 hr after ZIKV infection, but is then sharply decreased at 48 hr post-infection and with higher intracellular virus abundance. To compare the temporal dynamics of gene expression during DENV and ZIKV infection, we identified ‘time switchers’ for Zika infection (Figure 4C). Although the number of genes that show both correlation and anticorrelation is similar between the two viruses, the 11 Zika time switchers exhibit no correlation at 4 hr post-infection, followed by a non-monotonic behavior as time passes. HSPA5 is included in this list, in agreement with its t-SNE visualization this gene is therefore not only subject to opposite regulation in DENV versus ZIKV infection, but may play different roles at different times during the same infection. Among the other temporally regulated genes in ZIKV infection, is the circadian clock gene PER2 that resembles HSPA5 (Moni and Lio', 2017).

Temporally complex expression patterns during dengue and Zika infection.

(EEN) t-SNE dimensionality reduction using all genes that correlate with at least one virus (<−0.4 or >0.4). Each dot is a cell and is colored by intracellular virus abundance (left panel) and time post-infection (right panel). Colors are shades of red for the dengue experiment, shades of blue for the Zika one. Arrows in the left panel indicate the average position of cells at increasing intracellular virus abundance. (B) Expression of four example genes as in Figure 3B–E on top of the t-SNE visualization. (C) Correlation between expression and Zika vRNA content switches from negative to positive (< −0.3 to >+0.3) for one gene (left panel) and in the opposite direction for 10 genes (right panel). Error bars are standard deviations of 100 bootstraps over cells. Unlike in dengue virus infection (Figure 2G), the temporal traces of Zika infection do not show a simple increase or decrease but rather complex dynamics.

Validation of proviral and antiviral host factors

To probe the functional relevance of genes demonstrating correlations with DENV abundance, we first conducted loss-of-function screens. We measured the effects of siRNA-mediated depletion of 32 individual genes in Huh7 cells on DENV infection and on cellular viability (Figure 5A and Figure 5—figure supplement 1A). Using a cutoff of greater than 40% inhibition of viral infection as measured by luciferase assays normalized to cell viability in two independent screens, we identified multiple host factors that severely affect viral infection. These include a few components of the translocon previously shown to be essential for DENV: HM13 (Marceau et al., 2016) or WNV: SPCS2 (Zhang et al., 2016) as well as two novel components of the ER translocon: RPL31 and TRAM1 (Ng et al., 2010). Depletion of two proteins involved in membrane trafficking, TMED2 (secretory pathway) and COPE (retrograde, Golgi to ER) as well as the ER-resident chaperone and ERAD protein HSPA5 and the multifunctional transcription factor in ER stress, DDIT3 also reduced DENV infection.

Validation of DENV proviral and antiviral candidate genes via siRNA-mediated knockdown and ectopic expression.

DENV infection relative to NT siRNA (A) or empty plasmid (B) controls following siRNA-mediated knockdown (A) or overexpression (B) of the indicated host factors measured by luciferase assays at 48 hr post-infection of Huh7 cells and normalized to cell viability. Both data sets are pooled from two independent experiments with three replicates each. The dotted lines represent the cutoffs for positivity. Cellular viability measurements are shown in Figure 2—figure supplement 2.

In contrast, siRNA-mediated depletion of two genes that anticorrelate with intracellular virus abundance, ID2 and CTTNB1 (β-catenin), increased DENV infection, indicating that these proteins function as antiviral restriction factors, as previously reported in HIV (Kumar et al., 2008). Notably, ID2 and CTTNB1 are known interacting partners (Rockman et al., 2001), which may be acting via the interferon I pathway (Hillesheim et al., 2014). Suppression of another subset of overexpressed or underexpressed genes demonstrated no effect on DENV infection, suggesting that they were either non-essential or not restricting (possibly due to redundancy in host factors requirement) or that the level of knockdown was insufficient to trigger a phenotype.

To determine whether host factors found to be proviral are also rate limiting for infection, next we conducted gain-of-function screens. Huh7 cells ectopically expressing 30 of the 32 individual gene products were infected with DENV. Using a cutoff of greater than 30% increase in viral infection normalized to cell viability in two independent screens, we identified HSPA5, TMED2, SPCS2, and DDIT3 as factors whose overexpression increased DENV infection (Figure 5B and Figure 5—figure supplement 1B), indicating rate limitation associated with these important proviral factors. In contrast, overexpression of ID2 decreased DENV infection, indicating that ID2 has an antiviral function. Overexpression of other proviral factors, such as COPE and TRAM1, decreased DENV infection, suggesting that DENV might be evolutionarily optimized for the natural expression level of these genes or that the observed correlation of these genes is not causative.


Invoering

Human papillomaviruses (HPVs) are small, non-enveloped double-stranded DNA viruses that belong to the Papovaviridae family [1, 2]. Scientific evidence accumulated from virological, molecular, clinical and epidemiological studies has identified HPV as the primary etiological agent in cervical cancer [1, 3, 4].

Like other viruses, HPVs are obligatory intracellular parasites and must deliver their genome and accessory proteins into host cells and subsequently make use of the biosynthetic cellular machinery for viral replication [5, 6]. The journey of a HPV particle from the cell surface to the cytosol and nucleus consists of a series of consecutive steps that move it closer to its site of replication. The viral capsid plays a key role in the establishment of the viral infection [5, 7].

By analyzing virus-cell interactions and uptake mechanisms, much can be learned about the biology of HPV replication and entry pathways, providing a means to discover unique ways for exploiting or interfering with the viral pathogenesis [5, 6].

The HPV genome is surrounded by an icosahedral capsid (T = 7) of 55 nm in diameter composed by two structural proteins, the major protein L1 and the minor capsid protein L2 [8]. The L1 proteins are highly conserved and form 72 five-fold capsomers. The L2 protein is an internally located multifunctional protein with roles in genome encapsidation [9–11], L1 interaction and capsid stabilization [12, 13], endosomal escape of virions [14, 15] and nuclear transport of the HPV genome [15, 16]. Viral capsids have evolved to fulfil numerous roles that are critical to the establishment of viral infection. For non-enveloped viruses, such as HPVs, the proteinaceous coat encases and protects the viral nucleic acid and provides the initial interaction site of the viral particle with the host cell. After receptor engagement the virus is internalized and its coat is disassembled to allow the encapsidated genome access to the cellular transcription and replication machinery [17].

Infectious HPV particles entry appears to occur specifically in the basal keratinocytes of the mucosal epithelium subsequent to the binding of virions to the basement membrane of the disrupted epithelium [9, 18]. Since HPV replication and assembly requires infected basal keratinocytes to undergo the stepwise differentiation program of the epithelium [19, 20], HPV propagation in cell culture is a major challenge. The production of infectious virus particles or virions was impossible until the development of organotypic raft cultures based on keratinocytes harbouring HPV genomes. However, these methods are technically demanding, time-consuming and they only produce relatively limited amounts of virions. These limitations were partially overcome by the use of DNA-free virus-like particles (VLPs) and by pseudovirions (PsVs) harbouring reporter plasmids, which were generated using heterologous expression systems [21, 22]. These VLPs and PsVs have very similar structural and immunological characteristics to native HPV virions [8]

Condon optimization of capsid genes yielded high-level expression of capsid proteins and the development of packaging cell lines harboring high copy numbers of packaging plasmids finally allowed the large-scale production of PsVs and, subsequently, quasivirions (QVs), which are "quasi" identical to the authentic HPV virions [8, 21–23]. This has prompted many researchers to study the HPV-host cell interaction by using VLPs, PsVs or QVs.

HPV-host cell interactions

Cell surface binding: receptors

Host cell entry of HPV is initiated by binding of the virus particle to cell surface receptors (Figure 1). It has been suggested that virions bind initially to the basement membrane prior to transfer to the basal keratinocyte cell surface [18]. It is important to note that the entry of HPV in vitro is initiated by binding to a cell surface receptor in contrast to the in vivo situation where the basement membrane has recently been identified as the primary site of virus binding [18, 21].

Putative model of interaction of HPV capsids with the ECM and cell surface. 1) HSPG, a widely expressed and evolutionary conserved cell surface receptor, is suggested as the initial attachment receptor for HPVs and is frequently found in the ECM and on the surface of most cells. HPV capsids have also been shown to bind to ECM-resident laminin-5 although this interaction seems to be of lesser importance for a productive infection. 2) Accumulating evidence suggests that a secondary receptor is involved in the infectious entry of HPV subsequent to HSPG interaction. The capsids are transferred to the putative secondary receptor on the cell surface. Whether transfer from primary ECM binding sites to primary cell surface binding sites occurs has not been directly investigated (dotted arrows). Capsid interaction with HSPG results in a conformational change that, in turn, results in the exposure of a furin cleavage site. Following this proteolytic cleavage, an additional conformational change exposes the binding site for the secondary cell surface receptor or lowers the affinity for the primary receptor which results in the hand-off to the second receptor, which then triggers endocytosis 3).

Early work investigating the cell surface receptors found that HPVs bind to a widely expressed and evolutionary conserved cell surface receptor and that the interaction depends primarily on L1 [24–27]. Glycosaminoglycans (GAGs), especially heparan sulfate, were suggested as initial attachment receptors for HPV VLPs [28–31]. Heparan sulfate proteoglycans (HSPG) are frequently found in the extracellular matrix (ECM) and on the surface of most cells. They are involved in several biological functions and because of their location they are appropriate molecules for viral infection [32, 33]. Heparan sulfate is often found on two membrane-bound proteoglycans, syndecans and glypicans [34]. Glypicans are predominantly expressed in the central nervous system, whereas syndecans are the predominant HSPG in epithelial cells, the target cells of HPV. Especially syndecan-1 may serve as the primary attachment receptor in vivo due to its high expression level in the appropriate target cells and upregulation during wound healing [27, 35]. Furthermore, other candidate receptors for HPV have been suggested, such as laminin-5. Meerdere in vitro studies have shown that HPV can also bind to a receptor in the ECM, identified as laminin-5 which is able to mediate binding to the ECM [36–38]. However, laminin-5 interaction seems to be of lesser importance for a productive infection and even though the affinity to laminin-5 is higher than to heparan sulfate, infectious transfer from the ECM seems to require heparan sulfate binding [27, 37, 38].

The classical notion of a virus binding to a single receptor to enter cells through a single defined uptake mechanism is quickly being overtaken by a more complex picture. New findings, such as a specific co-receptor and virus attachment to multiple receptors, have raised the question that viruses known to bind to a non-specific receptor may turn out to also have a more specific co-receptor [39].

Like HPVs, mammalian herpesviruses adsorb strongly to proteoglycans, especially HSPGs. For the herpes simplex virus (HSV) this high affinity attachment step enhances infectivity, although it does not appear to be an absolute requirement for the virus to infect the cell. HSPG is preferred and is considered to be a binding receptor, as opposed to an entry receptor. It is obvious that for cell penetration, HSV usually interacts with co-receptors that are distinct from the proteoglycans attachment receptor [7, 40].

Accumulating evidence suggests that a secondary receptor or co-receptor is also involved in the infectious internalization of HPV subsequent to interaction with HSPG [38, 41]. It appears that HSPG functions as more than a simple attachment factor in HPV infection in that this interaction promotes essential conformational changes in the viral capsid, but HSPGs are clearly not the cell surface receptors that mediate virion internalization or later events in infection [41].

The cell adhesion receptor α6-integrin, which is involved in cell to cell interactions, has been suggested as secondary receptor even though its involvement in HPV infection is rather controversial [29, 35, 37, 42–44]. Given the close association of proteoglycans and integrins as matrix components, it is possible that the experimental association of α6-integrin with HPV binding and entry is a secondary effect due to its interaction with HSPGs [7].

Several studies suggest a role for L2 in facilitating infection via interaction with a secondary receptor(s) [45–48]. Although cell surface interactions predominantly depend on the major capsid protein L1, it seems likely that the secondary cell surface receptor is L1-specific, although, it is possible that L2 may contribute to surface interactions [21].

These observations could indicate that the cell surface binding is indeed mediated by more than one receptor. A reasonable hypothesis is that a productive infection would require an initial low specificity binding mediated by L1, followed by the interaction of a more specific protein component with L2 [7]. A specific region in the L2 protein was proposed to interact with a cell surface molecule after attachment of the virus to a primary receptor. This interpretation suggests a post-attachment conformational change at the cell surface to unmask this specific domain in L2, a process that many other viruses use to trigger downstream events such as secondary receptor interactions [27, 48].

Initial attachment to HSPG moieties functions primarily to facilitate the critical step of L2 proteolytic cleavage which is essential for successful infection [41]. The minor capsid protein L2 is cleaved by furin on the cell surface at a consensus cleavage site that is conserved among all papillomaviruses [17]. These sequences are inaccessible at the surface of mature virions in solution in order to prevent host antibody response to the conserved epitopes [27]. As mentioned above, capsid interaction with HSPG results in a conformational change which results in the exposure of the furin cleavage region. After cleavage, an additional conformational change may expose the binding site for the secondary cell receptor, or it lowers the affinity for the primary receptor, which results in the hand-off to a secondary receptor [27, 41, 49].

Taken together, capsid interaction with HSPG induces conformational changes that result in the exposure of the L2 amino terminus. Exposure of this L2 N-terminus allows access to highly conserved consensus furin convertase recognition site and subsequent furin cleavage which is essential for successful infection. Moreover, the L2 N-terminus is essential for the L2 protein to adopt a correct conformation within the assembled capsid. Correct folding may also require the formation of a disulfide bond between HPV16 L2 cysteine residues Cys22 and Cys28, which was recently identified. Mutation of the contributing cysteine residues rendered mutant virions non-infectious [15, 21, 50, 51].

Even if keratinocytes are the main targets of HPV and only entry in these cells has been shown to result in a productive infection, HPV-VLP are also able to enter other cellular types such as dendritic cells (DC) or Langerhans cells (LC). Interactions between these antigen presenting cells (APCs) and HPV are likely to be important for the establishment of the immune response after a prophylactic vaccination or a natural infection. Bousarghin et al. showed that these APCs differentially interact with HPV16 VLPs. Although DC and LC are able to bind and internalize HPV16 VLPs, there are differences in VLP binding to DC and LC. DC use heparan sulfates to bind HPV16 VLPs in contrast to LC on which heparin does not have any inhibitory effects [52]. Various studies showed that VLPs co-localize with langerin in LC [52, 53]. Although still controversial, the investigation on the immunogenicity of VLPs supports a key contribution for the low-affinity Fcγ receptors, expressed on DC, as an important molecule in a HPV-VLP receptor complex [54, 55].

Internalization

After binding to cell surface receptors HPV must be internalized into the cell to establish an infection. To date, the dynamics of HPV interaction with the cell surface during the initial stages of infection are not completely understood and the entry mechanisms and the molecules involved are contradictory and still a subject of scientific debate (table 1).

The conflicting data could be due to the "maturity" state of the VLPs and PsVs used. HPV capsids extracted from replicating cultured cells can exist in two forms. "Immature" capsids are larger, less regular and less protease resistant than "mature" capsids indicating a substantial change in conformation during the maturation process [56]. Therefore, it is likely that the omission of a maturation step could result in assay variability due to particle heterogeneity [7]. Moreover, HPVs exhibit promiscuous cell association while only completing their life cycle in differentiating squamous epithelium [57]. Therefore, while the early events of infection may be similar in permissive and non-permissive cell types, there is a restriction of viral replicative functions and virion production that is determined by factors tied to the keratinocyte differentiation program [7].

Productive entry of HPV involves internalization by endocytosis, a process that for HPV occurs slowly and asynchronously over a period of several hours, except for some non-epithelial cells [8, 52, 58]. Multiple studies have shown an unusually extended residence on the cell surface for HPVs [7, 29, 59, 60]. Most ligands, including the majority of viruses, are internalized rapidly, within minutes after the initial receptor encounter and engagement. The reason for the delayed kinetics for HPVs is unknown, although it is noteworthy that syndecans have been reported to have a slow rate of internalization after ligand binding [61]. Alternatively, the conformational changes or the transfer to a secondary receptor that is sparsely arrayed or exhibits particular requirements for endocytosis are a possible explanation for the slow kinetics [8, 27, 58]. Bovendien, in vitro experiments showed that cell surface dynamics of HPV indicated a transport mechanism along actin rich cell protrusions to access the endocytic machinery and thus enhance infectious entry. This transport was facilitated by binding to receptors that were likely to interact with actin filaments to mediate the transport towards the cell body by retrograde flow. This requirement may contribute to the prolonged residence on the cell surface and the impeded kinetics [8].

Several endocytic pathways have been described and clathrin- and caveolae-mediated are two main pathways used by non-enveloped viruses to infect cells [5, 62]. A possible approach to distinguish between the clathrin-dependent and caveolar pathways is the analysis of biochemical inhibition of ligand uptake, although non-specific effects must be considered. The development of molecular inhibitors in the form of dominant-negative molecules has surpassed the use of biochemical inhibitors in terms of decreasing these non-specific effects. Selinka et al. examined a set of biochemical inhibitors for effects on HPV33 PsV infection and found a dependence upon an intact actin cytoskeleton and microtubules. Dag et al. investigated the uptake of bovine papillomaviruses (BPVs) through biochemical inhibitor analysis and co-localization studies with established markers of endocytic compartments. Both studies could not demonstrate the involvement of caveolar endocytosis and concluded that uptake of these viruses occurs via a clathrin-dependent pathway [59, 63]. However, a study utilizing PsVs, generated by mixing VLPs with naked DNA, unexpectedly found that HPV31 was sensitive to caveolar inhibition. In contrast, the entry of HPV16, which phylogenetically, is closely related to HPV31, and HPV58 was found to be blocked by inhibitors of clathrin-mediated uptake [64]. The data on the entry of HPV31 was confirmed by Smith et al. who described a caveolar uptake of HPV31 virions in keratinocytes [65]. However, another study found that biochemical inhibition of clathrin-dependent uptake did prevent HPV31 infection [66]. HPV31 appears to interact with HSPG similarly to HPV16 for in vivo infectie. Possibly HPV31 interacts differently with or has a unique co-receptor that shunts it into a different internalization pathway [67].

Most studies investigating the uptake of HPV16 concluded the involvement of clathrin-dependent endocytosis [63–66]. In contrast to these studies, Spoden et al. observed clathrin- and caveolae-independent internalization of HPV16 PsVs. Entry occurred by a mechanism that was resistant to combined siRNA-mediated down regulation of caveolin-1 and clathrin heavy chain as well as being resistant to over-expression of dominant negative mutants of caveolin-1 and eps-15, which plays a role in clathrin coated vesicle formation [58]. The authors suggested the involvement of tetraspanin-enriched microdomains that serve as a platform for uptake by an uncharacterized internalization mechanism. None of the conducted studies demonstrated an effect of caveolar disruption on HPV16 infection.

Initiation and progression of HPV-associated cervical cancer have been shown to be related to functional alterations of LC within the cervical epithelium. Because of their role in initiating an antiviral immune response, DC and LC represent an ideal target for immune evasion by viruses. The study of the interactions between HPV16 VLPs and DC or LC showed that the entry of virus particles is different as suggested by Fausch et al. and Yan et al. Fausch et al. showed that DC use a clathrin-mediated endocytosis whereas LC use a different pathway which is not associated with clathrin or caveolae [68]. Yan et al. show that LC uptake of HPV6 L1 was blocked by filipin pretreatment confirming a role for caveolin-mediated uptake of VLPs by LC [53]. Another study, however, showed that virus particles use the same clathrin-dependent endocytic pathway to enter DC and LC [52].


Unravelling the mystery that makes viruses infectious

AFBEELDING: Capsid protein pentamers (subunits colour-coded) being recruited to the growing protein shell (brown) during virion assembly by formation of sequence-specific contacts between the genome (packaging signals shown as orange space-filled. view more

Credit: University of Leeds

Researchers have for the first time identified the way viruses like the poliovirus and the common cold virus 'package up' their genetic code, allowing them to infect cells.

The findings, published today (Friday, 8 January) in the journal PLOS-pathogenen by a team from the Universities of Leeds and York, open up the possibility that drugs or anti-viral agents can be developed that would stop such infections.

Once a cell is infected, a virus needs to spread its genetic material to other cells. This is a complex process involving the creation of what are known as virions - newly-formed infectious copies of the virus. Each virion is a protein shell containing a complete copy of the virus's genetic code. The virions can then infect other cells and cause disease.

What has been a mystery until now is a detailed understanding of the way the virus assembles these daughter virions.

Professor Peter Stockley, former Director of the Astbury Centre for Structural Molecular Biology at Leeds, who part supervised the research with Professor Reidun Twarock from York, said: "This study is extremely important because of the way it shifts our thinking about how we can control some viral diseases. If we can disrupt the mechanism of virion formation, then there is the potential to stop an infection in its tracks."

"Our analysis suggests that the molecular features that control the process of virion formation are genetically conserved, meaning they do not mutate easily - reducing the risk that the virus could change and make any new drugs ineffective."

The research at Leeds and York brings together experts in the molecular structure of viruses, electron microscopy and mathematical biology.

The study focuses on a harmless bovine virus that is non-infectious in people, Enterovirus-E, which is the universally adopted surrogate for the poliovirus. The poliovirus is a dangerous virus that infects people, causing polio and is the target of a virus eradication initiative by the World Health Organization.

The enterovirus group also includes the human rhinovirus, which causes the common cold.

The study published today details the role of what are called RNA packaging signals, short regions of the RNA molecule which together with proteins from the virus's casing ensure accurate and efficient formation of an infectious virion.

Using a combination of molecular and mathematical biology, the researchers were able to identify possible sites on the RNA molecule that could act as packaging signals. Using advanced electron microscopes at the Astbury Biostructure Laboratory at the University of Leeds, scientists were able to directly visualise this process - the first time that has been possible with any virus of this type.

Professor Twarock added: "Understanding in detail how this process works, and the fact that it appears conserved in an entire family of viral pathogens, will enable the pharmaceutical industry to develop anti-viral agents that can block these key interactions and prevent disease."

Notes to editors

For further information please contact David Lewis in the press office at the University of Leeds: [email protected] or on 07710 013287

Visualisation caption: Capsid protein pentamers (subunits colour-coded) being recruited to the growing protein shell (brown) during virion assembly by formation of sequence-specific contacts between the genome (packaging signals shown as orange space-filled models) and the Enterovirus-E capsid.

The visualisation can be downloaded by following this link.

University of Leeds

The University of Leeds is one of the largest higher education institutions in the UK, with more than 37,000 students from more than 150 different countries, and a member of the Russell Group of research-intensive universities. The University plays a significant role in the Turing, Rosalind Franklin and Royce Institutes.

We are a top ten university for research and impact power in the UK, according to the 2014 Research Excellence Framework, and are in the top 100 of the QS World University Rankings 2019.

The University was awarded a Gold rating by the Government's Teaching Excellence Framework in 2017, recognising its 'consistently outstanding' teaching and learning provision. Twenty-six of our academics have been awarded National Teaching Fellowships - more than any other institution in England, Northern Ireland and Wales - reflecting the excellence of our teaching. http://www. leeds. ac. uk

Vrijwaring: AAAS en EurekAlert! zijn niet verantwoordelijk voor de juistheid van persberichten die op EurekAlert! door bijdragende instellingen of voor het gebruik van informatie via het EurekAlert-systeem.