Informatie

12.1: Klonen en genetische manipulatie - biologie


Biotechnologie is het gebruik van kunstmatige methoden om het genetisch materiaal van levende organismen of cellen te modificeren om nieuwe verbindingen te produceren of om nieuwe functies uit te voeren. Biotechnologie wordt al sinds het begin van de landbouw gebruikt voor het verbeteren van vee en gewassen door middel van selectieve fokkerij. Sinds de ontdekking van de structuur van DNA in 1953, en vooral sinds de ontwikkeling van instrumenten en methoden om DNA te manipuleren in de jaren zeventig, is biotechnologie synoniem geworden met de manipulatie van het DNA van organismen op moleculair niveau. De primaire toepassingen van deze technologie zijn in de geneeskunde (voor de productie van vaccins en antibiotica) en in de landbouw (voor de genetische modificatie van gewassen). Biotechnologie kent ook veel industriële toepassingen, zoals fermentatie, de behandeling van olielozingen en de productie van biobrandstoffen, evenals vele huishoudelijke toepassingen zoals het gebruik van enzymen in wasmiddelen.

Genetisch materiaal manipuleren

Om de hierboven beschreven toepassingen te realiseren, moeten biotechnologen in staat zijn om nucleïnezuren te extraheren, te manipuleren en te analyseren.

Beoordeling van nucleïnezuurstructuur

Om de basistechnieken te begrijpen die worden gebruikt om met nucleïnezuren te werken, onthoud dat nucleïnezuren macromoleculen zijn die zijn gemaakt van nucleotiden (een suiker, een fosfaat en een stikstofbase). De fosfaatgroepen op deze moleculen hebben elk een netto negatieve lading. Een hele reeks DNA-moleculen in de kern van eukaryote organismen wordt het genoom genoemd. DNA heeft twee complementaire strengen verbonden door waterstofbruggen tussen de gepaarde basen.

In tegenstelling tot DNA in eukaryote cellen verlaten RNA-moleculen de kern. Messenger-RNA (mRNA) wordt het vaakst geanalyseerd omdat het de eiwitcoderende genen vertegenwoordigt die in de cel tot expressie worden gebracht.

Isolatie van nucleïnezuren

Om nucleïnezuren te bestuderen of te manipuleren, moet het DNA eerst uit cellen worden geëxtraheerd. Er worden verschillende technieken gebruikt om verschillende soorten DNA te extraheren (Figuur 10.1.1). De meeste nucleïnezuurextractietechnieken omvatten stappen om de cel open te breken en vervolgens het gebruik van enzymatische reacties om alle ongewenste macromoleculen te vernietigen. Cellen worden opengebroken met behulp van een detergensoplossing die bufferende verbindingen bevat. Om afbraak en besmetting te voorkomen, worden macromoleculen zoals eiwitten en RNA geïnactiveerd met behulp van enzymen. Het DNA wordt vervolgens met alcohol uit de oplossing gehaald. Het resulterende DNA vormt, omdat het is opgebouwd uit lange polymeren, een gelatineuze massa.

RNA wordt bestudeerd om genexpressiepatronen in cellen te begrijpen. RNA is van nature erg onstabiel omdat enzymen die RNA afbreken vaak in de natuur aanwezig zijn. Sommige worden zelfs door onze eigen huid uitgescheiden en zijn zeer moeilijk te inactiveren. Net als bij DNA-extractie, omvat RNA-extractie het gebruik van verschillende buffers en enzymen om andere macromoleculen te inactiveren en alleen het RNA te behouden.

Gelelektroforese

Omdat nucleïnezuren negatief geladen ionen zijn bij neutrale of alkalische pH in een waterige omgeving, kunnen ze worden verplaatst door een elektrisch veld. Gelelektroforese is een techniek die wordt gebruikt om geladen moleculen te scheiden op basis van grootte en lading. De nucleïnezuren kunnen worden gescheiden als hele chromosomen of als fragmenten. De nucleïnezuren worden in een sleuf aan het ene uiteinde van een gelmatrix geladen, er wordt een elektrische stroom aangelegd en negatief geladen moleculen worden naar het andere uiteinde van de gel getrokken (het uiteinde met de positieve elektrode). Kleinere moleculen bewegen sneller door de poriën in de gel dan grotere moleculen; dit verschil in migratiesnelheid scheidt de fragmenten op basis van grootte. De nucleïnezuren in een gelmatrix zijn onzichtbaar totdat ze worden gekleurd met een verbinding waardoor ze zichtbaar zijn, zoals een kleurstof. Verschillende fragmenten van nucleïnezuren verschijnen als banden op specifieke afstanden van de bovenkant van de gel (het negatieve elektrode-uiteinde) die zijn gebaseerd op hun grootte (Figuur 10.1.2). Een mengsel van vele fragmenten van verschillende groottes verschijnt als een lang uitstrijkje, terwijl ongeknipt genomisch DNA gewoonlijk te groot is om door de gel te lopen en een enkele grote band vormt aan de bovenkant van de gel.

Polymerasekettingreactie

DNA-analyse vereist vaak focus op een of meer specifieke regio's van het genoom. Ook gaat het vaak om situaties waarin slechts één of enkele kopieën van een DNA-molecuul beschikbaar zijn voor verdere analyse. Deze hoeveelheden zijn onvoldoende voor de meeste procedures, zoals gelelektroforese. Polymerasekettingreactie (PCR) is een techniek die wordt gebruikt om het aantal kopieën van specifieke DNA-gebieden snel te verhogen voor verdere analyses (Figuur 10.1.3). PCR maakt gebruik van een speciale vorm van DNA-polymerase, het enzym dat DNA repliceert, en andere korte nucleotidesequenties, primers genaamd, die basenparen vormen voor een specifiek deel van het DNA dat wordt gerepliceerd. PCR wordt in laboratoria voor veel doeleinden gebruikt. Deze omvatten: 1) de identificatie van de eigenaar van een DNA-monster dat op een plaats delict is achtergelaten; 2) vaderschapsanalyse; 3) de vergelijking van kleine hoeveelheden oud DNA met moderne organismen; en 4) het bepalen van de sequentie van nucleotiden in een specifiek gebied.

Klonen

In het algemeen betekent klonen het creëren van een perfecte replica. Meestal wordt het woord gebruikt om de creatie van een genetisch identieke kopie te beschrijven. In de biologie wordt de herschepping van een heel organisme 'reproductief klonen' genoemd. Lang voordat er pogingen werden ondernomen om een ​​heel organisme te klonen, leerden onderzoekers hoe ze korte stukken DNA konden kopiëren - een proces dat moleculair klonen wordt genoemd.

Moleculair klonen

Klonen maakt het mogelijk meerdere kopieën van genen te maken, genen tot expressie te brengen en specifieke genen te bestuderen. Om het DNA-fragment in een bacteriële cel te krijgen in een vorm die wordt gekopieerd of tot expressie wordt gebracht, wordt het fragment eerst in een plasmide ingebracht. Een plasmide (in deze context ook wel vector genoemd) is een klein circulair DNA-molecuul dat zich onafhankelijk van het chromosomale DNA in bacteriën repliceert. Bij het klonen kunnen de plasmidemoleculen worden gebruikt om een ​​"vehiculum" te verschaffen waarin een gewenst DNA-fragment kan worden ingevoegd. Gemodificeerde plasmiden worden gewoonlijk opnieuw in een bacteriële gastheer geïntroduceerd voor replicatie. Terwijl de bacteriën zich delen, kopiëren ze hun eigen DNA (inclusief de plasmiden). Het ingevoegde DNA-fragment wordt samen met de rest van het bacteriële DNA gekopieerd. In een bacteriële cel wordt het DNA-fragment van het menselijk genoom (of een ander organisme dat wordt bestudeerd) vreemd DNA genoemd om het te onderscheiden van het DNA van de bacterie (het gastheer-DNA).

Plasmiden komen van nature voor in bacteriële populaties (zoals Escherichia coli) en genen hebben die gunstige eigenschappen aan het organisme kunnen bijdragen, zoals antibioticaresistentie (het vermogen om niet door antibiotica te worden aangetast). Plasmiden zijn zeer ontwikkeld als vectoren voor moleculaire klonering en voor de daaropvolgende grootschalige productie van belangrijke moleculen, zoals insuline. Een waardevol kenmerk van plasmidevectoren is het gemak waarmee een vreemd DNA-fragment kan worden ingebracht. Deze plasmidevectoren bevatten veel korte DNA-sequenties die kunnen worden geknipt met verschillende algemeen beschikbare restrictie-enzymen. Restrictie-enzymen (ook wel restrictie-endonucleasen genoemd) herkennen specifieke DNA-sequenties en knippen deze op een voorspelbare manier; ze worden van nature door bacteriën geproduceerd als afweermechanisme tegen vreemd DNA. Veel restrictie-enzymen maken verspringende sneden in de twee DNA-strengen, zodat de afgeknipte uiteinden een enkelstrengs overhang van 2 tot 4 nucleotiden hebben. De sequentie die wordt herkend door het restrictie-enzym is een sequentie van vier tot acht nucleotiden die een palindroom is. Net als bij een woord palindroom, betekent dit dat de reeks voorwaarts en achterwaarts hetzelfde leest. In de meeste gevallen leest de sequentie hetzelfde vooruit op één streng en achteruit op de complementaire streng. Wanneer een verspringende snede in een dergelijke volgorde wordt gemaakt, zijn de uitsteeksels complementair (Figuur 10.1.4).

Omdat deze uitsteeksels weer bij elkaar kunnen komen door waterstofbinding met complementaire uitsteeksels op een stuk DNA dat met hetzelfde restrictie-enzym is geknipt, worden deze "kleverige uiteinden" genoemd. Het proces van het vormen van waterstofbruggen tussen complementaire sequenties op enkele strengen om dubbelstrengs DNA te vormen, wordt annealing genoemd. Toevoeging van een enzym genaamd DNA-ligase, dat deelneemt aan DNA-replicatie in cellen, verbindt permanent de DNA-fragmenten wanneer de plakkerige uiteinden samenkomen. Op deze manier kan elk DNA-fragment worden gesplitst tussen de twee uiteinden van een plasmide-DNA dat is geknipt met hetzelfde restrictie-enzym (Figuur 10.1.5).

Plasmiden waarin vreemd DNA is ingebracht, worden recombinante DNA-moleculen genoemd omdat ze nieuwe combinaties van genetisch materiaal bevatten. Eiwitten die worden geproduceerd uit recombinante DNA-moleculen worden recombinante eiwitten genoemd. Niet alle recombinante plasmiden zijn in staat genen tot expressie te brengen. Plasmiden kunnen ook worden gemanipuleerd om eiwitten alleen tot expressie te brengen wanneer ze worden gestimuleerd door bepaalde omgevingsfactoren, zodat wetenschappers de expressie van de recombinante eiwitten kunnen controleren.

Reproductief klonen

Reproductief klonen is een methode die wordt gebruikt om een ​​kloon of een identieke kopie van een volledig meercellig organisme te maken. De meeste meercellige organismen ondergaan seksuele voortplanting, waarbij DNA van twee individuen (ouders) wordt ingebracht, waardoor het onmogelijk is om een ​​identieke kopie of een kloon van een van beide ouders te genereren. Recente ontwikkelingen in de biotechnologie hebben het mogelijk gemaakt om zoogdieren reproductief te klonen in het laboratorium.

Natuurlijke seksuele voortplanting omvat de vereniging, tijdens de bevruchting, van een sperma en een ei. Elk van deze gameten is haploïde, wat betekent dat ze één set chromosomen in hun kernen bevatten. De resulterende cel, of zygote, is dan diploïde en bevat twee sets chromosomen. Deze cel deelt zich mitotisch om een ​​meercellig organisme te produceren. De vereniging van slechts twee cellen kan echter geen levensvatbare zygote produceren; er zijn componenten in het cytoplasma van de eicel die essentieel zijn voor de vroege ontwikkeling van het embryo tijdens de eerste paar celdelingen. Zonder deze bepalingen zou er geen verdere ontwikkeling zijn. Om een ​​nieuw individu te produceren, zijn daarom zowel een diploïde genetisch complement als een eicelcytoplasma vereist. De benadering voor het produceren van een kunstmatig gekloond individu is om de eicel van één individu te nemen en de haploïde kern te verwijderen. Vervolgens wordt een diploïde kern uit een lichaamscel van een tweede individu, de donor, in de eicel geplaatst. Het ei wordt dan gestimuleerd om te delen zodat de ontwikkeling doorgaat. Dit klinkt eenvoudig, maar in feite zijn er vele pogingen nodig voordat elk van de stappen met succes is voltooid.

Het eerste gekloonde landbouwdier was Dolly, een schaap dat in 1996 werd geboren. Het slagingspercentage van reproductief klonen was in die tijd erg laag. Dolly leefde zes jaar en stierf aan een longtumor (Figuur 10.1.6). Er werd gespeculeerd dat, omdat het cel-DNA dat aanleiding gaf tot Dolly, afkomstig was van een ouder persoon, de leeftijd van het DNA haar levensverwachting kan hebben beïnvloed. Sinds Dolly zijn verschillende diersoorten (zoals paarden, stieren en geiten) met succes gekloond.

Er zijn pogingen geweest om gekloonde menselijke embryo's te produceren als bronnen van embryonale stamcellen. In de procedure wordt het DNA van een volwassen mens ingebracht in een menselijke eicel, die vervolgens wordt gestimuleerd om te delen. De technologie is vergelijkbaar met de technologie die werd gebruikt om Dolly te produceren, maar het embryo wordt nooit geïmplanteerd in een draagmoeder. De geproduceerde cellen worden embryonale stamcellen genoemd omdat ze het vermogen hebben om zich te ontwikkelen tot veel verschillende soorten cellen, zoals spier- of zenuwcellen. De stamcellen kunnen worden gebruikt voor onderzoek en uiteindelijk voor therapeutische toepassingen, zoals het vervangen van beschadigd weefsel. Het voordeel van klonen in dit geval is dat de cellen die worden gebruikt om nieuwe weefsels te regenereren, perfect passen bij de donor van het oorspronkelijke DNA. Een leukemiepatiënt zou bijvoorbeeld geen broer of zus met een weefselmatch nodig hebben voor een beenmergtransplantatie.

KUNSTVERBINDING

Waarom was Dolly een Finn-Dorset en geen Schots Blackface-schaap?

Genetische manipulatie

Het gebruik van recombinant-DNA-technologie om het DNA van een organisme te wijzigen om gewenste eigenschappen te verkrijgen, wordt genetische manipulatie genoemd. Toevoeging van vreemd DNA in de vorm van recombinante DNA-vectoren die worden gegenereerd door moleculaire klonering is de meest gebruikelijke methode van genetische manipulatie. Een organisme dat het recombinante DNA ontvangt, wordt een genetisch gemodificeerd organisme (GGO) genoemd. Als het vreemde DNA dat wordt ingebracht van een andere soort komt, wordt het gastheerorganisme transgeen genoemd. Bacteriën, planten en dieren zijn sinds het begin van de jaren zeventig genetisch gemodificeerd voor academische, medische, landbouwkundige en industriële doeleinden. Deze toepassingen zullen in de volgende module nader worden onderzocht.

CONCEPT IN ACTIE

Bekijk deze korte video waarin wordt uitgelegd hoe wetenschappers een transgeen dier maken.

Hoewel de klassieke methoden voor het bestuderen van de functie van genen begonnen met een bepaald fenotype en de genetische basis van dat fenotype bepaalden, stellen moderne technieken onderzoekers in staat om op DNA-sequentieniveau te beginnen en te vragen: "Wat doet dit gen of dit DNA-element?" Deze techniek, genaamd reverse genetics, heeft geresulteerd in het omkeren van de klassieke genetische methodologie. Een voorbeeld van deze methode is analoog aan het beschadigen van een lichaamsdeel om de functie ervan te bepalen. Een insect dat een vleugel verliest kan niet vliegen, wat betekent dat de functie van de vleugel vluchten is. De klassieke genetische methode vergelijkt insecten die niet kunnen vliegen met insecten die wel kunnen vliegen, en stelt vast dat de niet-vliegende insecten vleugels hebben verloren. Evenzo geeft het muteren of verwijderen van genen in een omgekeerde genetica-aanpak onderzoekers aanwijzingen over de functie van genen. Als alternatief kan omgekeerde genetica worden gebruikt om ervoor te zorgen dat een gen zichzelf tot overexpressie brengt om te bepalen welke fenotypische effecten kunnen optreden.

Samenvatting

Nucleïnezuren kunnen voor verdere analyse uit cellen worden geïsoleerd door de cellen open te breken en alle andere belangrijke macromoleculen enzymatisch te vernietigen. Gefragmenteerde of hele chromosomen kunnen worden gescheiden op basis van grootte door gelelektroforese. Korte stukken DNA kunnen worden geamplificeerd door PCR. DNA kan worden geknipt (en vervolgens opnieuw aan elkaar gesplitst) met behulp van restrictie-enzymen. De moleculaire en cellulaire technieken van de biotechnologie stellen onderzoekers in staat om organismen genetisch te manipuleren en ze te modificeren om gewenste eigenschappen te verkrijgen.

Klonen kan het klonen van kleine DNA-fragmenten (moleculair klonen) of het klonen van volledige organismen (reproductief klonen) inhouden. Bij moleculair klonen met bacteriën wordt een gewenst DNA-fragment met behulp van restrictie-enzymen in een bacterieel plasmide ingebracht en het plasmide wordt opgenomen door een bacterie, die vervolgens het vreemde DNA tot expressie zal brengen. Met andere technieken kunnen vreemde genen in eukaryote organismen worden ingebracht. In elk geval worden de organismen transgene organismen genoemd. Bij reproductief klonen wordt een donorkern in een ontkernde eicel geplaatst, die vervolgens wordt gestimuleerd om zich te delen en zich tot een organisme te ontwikkelen.

Bij reverse genetics-methoden wordt een gen op de een of andere manier gemuteerd of verwijderd om het effect ervan op het fenotype van het hele organisme te identificeren als een manier om de functie ervan te bepalen.

Kunstverbindingen

Figuur 10.1.6 Waarom was Dolly een Finn-Dorset en geen Schots Blackface-schaap?

Want hoewel de oorspronkelijke cel afkomstig was van een Schots Blackface-schaap en de draagmoeder een Schotse Blackface was, kwam het DNA van een Finn-Dorset.

Woordenlijst

gloeien
in de moleculaire biologie, het proces waarbij twee enkelstrengs DNA-waterstofbinding op complementaire nucleotiden om een ​​dubbelstrengs molecuul te vormen
biotechnologie
het gebruik van kunstmatige methoden om het genetisch materiaal van levende organismen of cellen te wijzigen om nieuwe verbindingen te produceren of om nieuwe functies uit te voeren
klonen
de productie van een exacte kopie - in het bijzonder een exacte genetische kopie - van een gen, cel of organisme
gelelektroforese
een techniek die wordt gebruikt om moleculen te scheiden op basis van hun vermogen om door een halfvaste gel te migreren als reactie op een elektrische stroom
genetische manipulatie
wijziging van de genetische samenstelling van een organisme met behulp van de moleculaire methoden van biotechnologie
genetisch gemodificeerd organisme (GGO)
een organisme waarvan het genoom kunstmatig is veranderd
plasmide
een klein cirkelvormig DNA-molecuul dat in bacteriën wordt aangetroffen en dat onafhankelijk van het belangrijkste bacteriële chromosoom repliceert; plasmiden coderen voor enkele belangrijke eigenschappen voor bacteriën en kunnen worden gebruikt als vectoren om DNA naar bacteriën te transporteren in toepassingen voor genetische manipulatie
polymerasekettingreactie (PCR)
een techniek die wordt gebruikt om meerdere kopieën van DNA te maken
recombinant DNA
een combinatie van DNA-fragmenten gegenereerd door moleculair klonen die niet in de natuur voorkomen
recombinant eiwit
een eiwit dat tot expressie wordt gebracht uit recombinante DNA-moleculen
restrictie-enzym
een enzym dat een specifieke nucleotidesequentie in DNA herkent en de dubbele DNA-streng op die herkenningsplaats doorknipt, vaak met een verspringende snede waardoor korte enkele strengen of "kleverige" uiteinden achterblijven
omgekeerde genetica
een vorm van genetische analyse die DNA manipuleert om het product van een gen te verstoren of te beïnvloeden om de functie van het gen te analyseren
reproductief klonen
klonen van hele organismen
transgeen
het beschrijven van een organisme dat DNA van een andere soort ontvangt


Bekijk de video: Methoden des Gentransfers - Vektoren, Gentaxis einfach erklärt, Werkzeuge u0026 Grundlagen, Gentechnik 2 (Januari- 2022).