Informatie

Hoe wordt monoklonaliteit of polyklonaliteit bepaald?


Ik las Kaposi-sarcoom en Robbins Pathology zegt:

... veel kenmerken suggereren dat KS geen kwaadaardige tumor is ondanks de onheilspellende naam ... spoelcellen in veel KS-laesies zijn polyklonaal of oligoklonaal

Dit wordt ook gezien bij multinodulair struma waar de laesies polyklonaal zijn, maar er worden enkele monoklonale knobbeltjes gevonden.

Mijn vraag is, hoe worden deze bepaald? Is het niet zo dat door middel van sequencing, in kankergezwel er talloze mutaties zijn, hoe kun je in kaart brengen of de aanwezige mutaties het gevolg zijn van monoklonale expansie of polyklonale expansie? Zouden bij niet-kankergezwellen niet alle cellen hetzelfde genotype hebben?

Polyklonale en monoklonale expansie in B-cellen is mij duidelijk, aangezien een polyklonale afstamming verschillende vdj-recombs zou hebben, terwijl monoklonale dezelfde zou hebben. Ook hier, wordt het bepaald door genomische sequencing of de Ig-sequentie?


Er zijn een paar manieren om klonaliteit te bepalen. Op sequencing gebaseerde methoden zijn waarschijnlijk de goedkoopste, gezien de huidige kosten van ofwel sequencing, of de nog goedkopere PCR-gebaseerde klonaliteitstest. Andere methoden zijn onder meer histomorfologie, het zoeken naar bekende chromosomale afwijkingen en/of immunofenotypering. Hier is een mooie bespreking van enkele van de klonaliteitstestmethoden.

Sequentiebepaling en PCR zouden de meest definitieve manieren zijn om de klonaliteit van een tumor te bepalen, omdat ze informatie verschaffen over de exacte sequenties van reeksen cellen.

Exome-sequencing zou een goede manier zijn om de klonaliteit te bepalen in een grote groep cellen, waar je niet per se op voorhand weet waarnaar je moet zoeken. PCR is een stuk goedkoper en gerichter en zou een betere keuze kunnen zijn als je een specifiek doelwit hebt om te sequensen, zoals zeer polymorfe genen zoals sommige androgeenreceptoren en de genen die betrokken zijn bij VDJ-recombinatie.


Monoklonaliteit gebruiken in een zin

1. Monoklonaliteit Monoklonale cellen zijn een groep cellen geproduceerd uit een enkele voorouderlijke cel door herhaalde cellulaire replicatie. Men kan dus zeggen dat ze een enkele kloon vormen.

2. Dus demonstratie van Monoklonaliteit is indicatief voor de aanwezigheid van een monoklonale B-celpopulatie en polyklonaliteit is indicatief voor een polyklonale populatie

3. De belangrijkste regelgevende instanties en organisaties, zoals de Food and Drug Administration (FDA), vereisen gedetailleerd bewijs van: Monoklonaliteit van productiecellijnen

4. Het niet leveren van voldoende bewijs van Monoklonaliteit zullen aanvullende productiecontroles vereisen, wat kan leiden tot kostbare vertragingen bij klinische proeven of de lancering van geneesmiddelen.

5. De eerste IND-aanvraag met Monoklonaliteit assurance-gegevens van het Beacon ®-systeem zijn goedgekeurd door de FDA

6. De optofluïdische chiptechnologie en geïntegreerde beeldvorming van het Beacon-systeem leveren direct bewijs van >99% Monoklonaliteit, zonder …

7. Monoklonaliteit is de term die cellen beschrijft die zijn geproduceerd uit een enkele voorouderlijke cel door herhaalde cellulaire replicatie. Zo kan worden gezegd dat "monoklonale cellen" een enkele kloon vormen

8. Er is een uitgebreid verificatieonderzoek uitgevoerd om statistische bevestiging te geven dat klonen die zijn teruggevonden van het Beacon optofluidic-platform een ​​grote kans hebben om >99% te behouden Monoklonaliteit

9. Monoklonaliteit wat betekent Kwaliteit van monoklonaal zijn.

10. Next generation sequencing (NGS) van het gehele genoom is een krachtig hulpmiddel en wordt de methode naar keuze bij het verstrekken van bewijs van Monoklonaliteit voor celbanken

11. Een groot nadeel dat vaak wordt ondervonden, is de moeilijkheid bij het vaststellen van: Monoklonaliteit-een essentiële stap in de productie van therapeutische eiwitten en antilichamen.

12. Bevestigen Monoklonaliteit van een monster - en om ervoor te zorgen dat de afzonderlijke cellen die worden geïdentificeerd levensvatbaar en geschikt zijn voor cellijnontwikkeling - suggereert Molecular Devices het gebruik van enkele van zijn

13. Zekerheid van Monoklonaliteit van recombinante cellijnen is een kritieke kwestie om wettelijke goedkeuring te krijgen in biologische vergunningaanvraag (BLA)

14. Enkele van de vereisten van regelgevende instanties zijn het gebruik van de juiste documentatie en geschikte statistische analyse om aan te tonen: Monoklonaliteit.

15. Visuele bevestiging van Monoklonaliteit Stel een superieur datapakket samen met een eenvoudige, visuele bevestiging van: Monoklonaliteit

16. In tegenstelling tot traditionele well-plate-benaderingen, biedt de Opto CLD-workflow een visueel overzicht van alle klonen – op een geautomatiseerde manier – en maakt een betrouwbare beoordeling van Monoklonaliteit.

17. Vertrouwen hebben in Monoklonaliteit in dergelijke toepassingen is essentieel vanuit zowel onderzoeks- als commerciële perspectieven, bijvoorbeeld om ervoor te zorgen dat de gegevens van hoge kwaliteit zijn en dat aan de wettelijke vereisten wordt voldaan

18. Daarom zijn er verschillende benaderingen ontwikkeld om het vertrouwen in Monoklonaliteit.

19. Monoklonaliteit is eerder in verband gebracht met het phyllodes-fenotype, maar niet met fibroadenomen, behalve 3 fibroadenomen die terugkeerden als phyllodes-tumor

20. We melden dat Monoklonaliteit kan ook af en toe worden gezien bij complexe fibroadenomen en werd gevonden in tumoren met gemengde fibroadenoom/phyllodes-kenmerken zonder klinisch recidief voor

21. Monoklonaliteit is een term die in de biologie en geneeskunde wordt gebruikt en verwijst naar een monoklonale cel of een stof

22. de frequentie van Monoklonaliteit was hoger voor laesies >5 cm groot (100%) en voor de stromarijke variant (91%)

23. Monoklonaliteit analyse van de vier JPEG-afbeeldingen van hoge kwaliteit voor elk putje moet duidelijk niet meer dan een enkele cel weergeven die duidelijk en in focus was, mag geen groot vuil bevatten dat een andere cel zou kunnen verduisteren, en mag geen celgroot puin hebben dat kan worden aangezien voor een cel

24. Deze video-tutorial beschrijft statistische modellen die kunnen worden gebruikt om de kans op Monoklonaliteit voor het beperken van verdunningsklonen en halfvaste klonen

25. Na Monoklonaliteit er is gedocumenteerd dat cellen 3 tot 6 dagen groeien in een incubator tot 20 tot 75 cellen per kloon

26. Monoklonaliteit zijn moeilijk aan te tonen[4], ook al is er een grote kans op Monoklonaliteit kan worden berekend[7]

27. (2015), Zekerheid van Monoklonaliteit in één ronde van klonen door celsortering voor depositie van één cel in combinatie met celbeeldvorming met hoge resolutie

28. De Monoklonaliteit van hybridoma-afgeleide antilichamen moet worden verzekerd voordat conclusies worden getrokken over hun functionele betekenis

29. Typen van subklassen (en lichte ketens) en elektroforetisch gedrag kunnen vermoedelijk bewijs leveren van: Monoklonaliteit, maar de eerste lijdt aan het beperkte aantal mogelijkheden dat er is en de laatste aan de moeilijkheid om onderscheid te maken tussen

30. Het Advanced Workflow Engineering Solutions-team kan de Monoklonaliteit systeem en bieden toegevoegde diensten zoals geïntegreerde verificatie van Monoklonaliteit

31. en bewijs van Monoklonaliteit Inleiding De verificatie dat een nieuwe productiecellijn die is ontwikkeld om een ​​therapeutisch eiwit te produceren, is afgeleid van een enkele cel (d.w.z

32. macroscopisch Monoklonaliteit in normale weefsels is een fundamentele overweging gebleken in studies van baarmoederfibromyomaten 18, in de cirrotische lever 19 en andere weefsels, zoals blaasurothelium 20 en de gladde spieren en intima van de aorta

33. Tumor Monoklonaliteit was aantoonbaar bij 6 van de 16 informatieve patiënten (38%) met primaire bijschildklierhyperplasie

34. Zekerheid van Monoklonaliteit kan leiden tot minder werk onderweg

35. Monoklonaliteit van zoogdiercellijnen die worden gebruikt voor de productie van biologische geneesmiddelen is een regelgevende verwachting en een van de kenmerken die worden beoordeeld als onderdeel van een groter proces om een ​​consistente kwaliteit van de biologische

36. historisch, Monoklonaliteit is aangetoond door middel van statistieken die zijn gegenereerd op basis van klonen met beperkte verdunning of via geverifieerde flowcytometriemethoden.

37. In dit artikel rapporteren we over onze nieuwe Cyto-Mine Single Cell Analysis en Monoklonaliteit Assurance System, dat de beperkingen van de huidige technologieën overwint door honderdduizenden individuele cellen te screenen op uitgescheiden doeleiwitten, en vervolgens de hoogste producenten te isoleren en af ​​te geven in microtiterplaatwells (MTP).

38. Monoklonaliteit in normaal epitheel en bij hyperplastische en neoplastische laesies van de borst

39. De rol van beeldvorming in Monoklonaliteit Zekerheid Dus wat vereist de FDA op het gebied van? Monoklonaliteit? Het blijkt dat het vrij losjes gedefinieerd is

40. Verifiëren Monoklonaliteit en volg klonen Nadat afzonderlijke cellen in GRID-kamers zijn uitgeplaat, worden cellen afgebeeld met isoHub

41. Hele GRID-kamers worden afgebeeld in de afwezigheid van optische randeffecten die typisch worden geassocieerd met conventionele cultuurkunststof, waardoor absoluut vertrouwen in Monoklonaliteit.

42. wij hebben beoordeeld Monoklonaliteit in fibroadenomen en correleerde de resultaten met histologische analyse

43. Monoklonaliteit is niet compatibel met de onderzoeken waarin heterogene p53-mutaties zijn gekarakteriseerd uit multifocale tumoren

44. Van deze acht adenomen hadden er zes het DNA-hybridisatiepatroon van Monoklonaliteit, en twee hadden een dubbelzinnig patroon


Toegangsopties

Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

Alle prijzen zijn NET prijzen.
De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

Alle prijzen zijn NET prijzen.


Perifeer bloed T-celklonaliteit zonder cutaan T-cellymfoom diagnostische waarde

Ik dank Dr Dippel en zijn collega's voor hun commentaar op ons rapport over de diagnostische waarde van perifere bloed (PB) T-celklonaliteit bij klinische verdenking van CTCL. We hebben betoogd dat het aantonen van T-celklonaliteit in PB van onbekende betekenis is (niet "van geen betekenis") en, meer precies, dat het geen diagnostische waarde voor CTCL heeft zolang dezelfde kloon niet in de huid is geïdentificeerd ( in tegenstelling tot Gene Scan-analyse, hangt DGGE-migratie van PCR-producten af ​​van CDR3-sequenties en niet alleen van CDR3-grootte). Daarentegen is identificatie van dezelfde kloon in huid en bloed van grote diagnostische waarde.

Zoals Dippel et al. ons eraan herinneren, vinden klonale expansies van PB T-cellen plaats in meerdere klinische settings.1-1 Er zijn bijvoorbeeld beschrijvingen van perifere bloedexpansie van CD8+-klonen bij gezonde individuen, evenals bij patiënten met reumatoïde artritis, en hebben aangetoond opmerkelijk stabiel te zijn in de tijd (tot 4 jaar).1-2 Ze namen toe met de leeftijd in zowel de CD45RA+ (naïeve of langlevende geheugencellen) als de CD45RO+ (geheugen) compartimenten.1-3 is onze ervaring dat we met behulp van PCRγ-DGGE een T-celkloon detecteren, dominant over polyklonale achtergrond, in het bloed van 30% tot 40% van de bestudeerde patiënten, of het nu gaat om een ​​huidmaligniteit of een goedaardige ziekte. Bovendien worden dominante T-celklonen in toenemende mate gedetecteerd met de leeftijd, en eenmaal gedetecteerd bij een bepaalde patiënt, bleef de T-celkloon detecteerbaar op alle seriemonsters van 2001 met een follow-up tot 6 jaar (niet-gepubliceerde gegevens, 2001).

Ten slotte, hoewel het concept van "pseudoclonaliteit" van Dippel et al. ons fysiologisch niet relevant lijkt, zijn we het met hen eens dat de studie van perifere bloedmonsters bij patiënten met een verdenking van CTCL nuttig is voor de diagnose zolang dezelfde T-cel kloon is detecteerbaar in zowel huid- als bloedmonsters.


Stambomen met een hoog risico kunnen een krachtig ontwerp zijn voor het ontdekken van ziektegenen. Het begrijpen van het tumorspectrum in stambomen met een hoog risico optimaliseert het vermogen voor ontdekking, maakt een zinvolle beoordeling van segregatie en bepaling van familiaal risico mogelijk. Veel studies hebben waargenomen dat verschillende hematologische maligniteiten samengaan in families. In het bijzonder hebben we eerder genealogische clusteranalyse uitgevoerd in de Utah Population Database en significante co-aggregatie tussen chronische lymfatische leukemie (CLL) en multipel myeloom (MM) geïdentificeerd. We hebben ook vastgesteld dat de frequentie van de preklinische toestand, monoklonale B-cellymfocytose (MBL), verhoogd is in CLL-stambomen met een hoog risico. Hier onderzoeken we bewijs voor monoklonale gammopathieën in CLL-stambomen met een hoog risico met behulp van serumimmunoglobuline (Ig) -biomarkers.

Monoklonale gammopathieën worden gekenmerkt door een klonale expansie van plasmacellen die een monoklonaal Ig afscheiden. We gebruikten twee serumbiomarkertests om het bestaan ​​van klonale Ig-eiwitten aan te geven: Freelite™- en Hevylite™-immunoassays. Deze werden uitgevoerd op 498 ingevroren serummonsters: 163 populatiecontroles 97 MM/MGUS-gevallen 114 CLL-gevallen (91 sporadische CLL en 23 uit hoogrisicostambomen) en 124 verwanten in CLL-stambomen. Freelite detecteert en kwantificeert vrije lichte ketens (κ en λ). Hevylite detecteert en kwantificeert specifieke immunoglobulinen (IgA, IgG of IgM) gebonden aan specifieke lichte ketens. We bepaalden de monoklonaliteit als een van beide assays een abnormale κ/λ-verhouding aangaf (specifiek in combinatie met een verhoogd totaal Ig-type voor Hevylite). De meerderheid van de geïdentificeerde monoklonaliteit (92%) omvatte beperkte vrije lichte ketens. Die waarbij alleen monoklonale Ig-zware ketens betrokken waren, werden allemaal positief bevestigd door standaard serumeiwit en/of immunofixatie-elektroforese.

We observeerden een achtergrond van monoklonale gammopathie in onze controlemonsters (5/163, frequentie = 0,031), consistent met de gevorderde leeftijd van deze vergelijkingsset (gemiddeld 67 jaar). Zoals verwacht was monoklonale gammopathie duidelijk in de MM/MGUS-gevallen (38/97, frequentie=0,392, p=3,5×10 -14), die toenam tot frequentie=0,732, voor een abnormale κ/λ-ratio die werd overwogen zonder dat verhoging van de specifiek Ig-type voor Hevylite. De afwezigheid van volledige identificatie is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat onze monsters afkomstig zijn van veelvoorkomende gevallen in verschillende behandelingsstadia, naast niet-secretoire ziekte. De CLL-gevallen (sporadisch of stamboom) vertoonden zeer vergelijkbare percentages van gesuggereerde monoklonale gammopathie (samen 43/114, frequentie = 0,377, p = 6,5 x 10 -14). Stamboomverwanten vertoonden ook bewijs van klonale Ig-eiwitten (9/124, frequentie = 0,073). De frequentie van alle familieleden was niet statistisch verschillend van de controlegroep, maar de familieleden waren aanzienlijk jonger dan de controles (minimumleeftijd 20 jaar). Wanneer familieleden werden beperkt tot personen ouder dan 49 jaar (met een gemiddelde van 67 jaar), nam de frequentie toe tot 0,095 en nam deze statistisch toe in vergelijking met controles (p=0,028). De 9 familieleden met monoklonaliteit waren: 1 non-Hodgkin-lymfoom NOS, 1 MBL-geval, 2 solide kankergevallen en 5 familieleden zonder bekende kankerdiagnoses.

Concluderend, met behulp van gevoelige Ig-biomarkers vinden we dat individuen in CLL-stambomen met een hoog risico een groter risico lopen op monoklonale gammopathie dan de algemene bevolking. Deze waarneming is consistent met eerdere clusterresultaten die duiden op co-aggregatie en een mogelijke genetische etiologische overlap tussen CLL en MM. Bovendien bieden deze kwantitatieve Ig-metingen gedetailleerde fenotypes voor alle stamboomleden, waardoor meer informatieve stambomen worden gecreëerd, waardoor de kracht voor genidentificatie wordt vergroot. Deze maatregelen bieden een mogelijkheid om overeenkomsten tussen B-celmaligniteiten te benutten en hebben het potentieel om ons vermogen om risicopersonen te identificeren te verbeteren.


ClonePix FL gebruiken om monoklonaliteit te beoordelen

Omee Ahmed
Julian F. Burke Ph.D.
Christopher J. Mann Ph.D.
Sky Jiang
Kerensa J. Klottrup Ph.D.
Natalie Smithers Ph.D.

Gevestigd systeem probeert screening en selectie van zoogdiercellijnen te vereenvoudigen

Isolatie van kandidaat-zoogdiercelklonen door beperking van verdunning, ringklonen of eenvoudige handmatige verzameling van kolonies is een tijdrovende, arbeidsintensieve en kostbare procedure die vatbaar is voor kruisbesmetting van cellen en gebruikersfouten. Een groot nadeel dat men vaak tegenkomt, is de moeilijkheid om monoklonaliteit tot stand te brengen - een essentiële stap in de productie van therapeutische eiwitten en antilichamen.

Om veel van de nadelen te overwinnen die doorgaans gepaard gaan met het isoleren van klonen van zoogdiercellen, heeft Genetix het ClonePix™ FL-systeem ontwikkeld voor het screenen en selecteren van secretoire cellijnen. Het nut van ClonePix FL ligt in het vermogen om eiwitten die door duizenden klonen in situ worden uitgescheiden te visualiseren en te kwantificeren, en om alleen de secretoren met de hoogste waarde te selecteren en nauwkeurig te isoleren, waardoor de tijdschalen worden verkort en de downstream-cultuur wordt vereenvoudigd.

De ClonePix FL-oplossing is gevalideerd voor specifieke detectie van uitgescheiden antilichamen en monomere eiwitten, celoppervlakte-eiwitten en intrinsieke GFP-fusie-eiwitten. Het is compatibel met een reeks celtypen, waaronder hybridoma, myeloom, HEK293 en zowel aan de suspensie aangepaste als hechtende CHO-cellen.

Een fundamentele eerste stap in de workflow (Figuur 1) is het kweken van zoogdiercellijnen in halfvaste media, zodat cellen afzonderlijke kolonies vormen, elk afkomstig van een enkele oudercel. Heterogene populaties van duizenden cellen worden gekweekt tot klonale kolonies in microplaten met één putje of zes putjes. De cellen worden vervolgens snel gescreend, gebruikmakend van wit licht om de kolonies te detecteren en fluorescentie om uitgescheiden eiwit in situ te kwantificeren.

De uitgescheiden eiwitdetectietest vereist dat het uitgescheiden product rond de kolonie wordt geïmmobiliseerd met behulp van een fluorescerende detectiesonde. Toegewijde ClonePix FL-software kwantificeert de fluorescentie die bij elke kolonie hoort en stuurt het automatisch plukken van alleen de meest wenselijke klonen in bestemmingsplaten met 96 putjes. Figuur 2 toont voorbeeldafbeeldingen die de best producerende klonen identificeren. Een verscheidenheid aan verschillende eiwitten kan gelijktijdig worden gedetecteerd en geïsoleerd door detectiemiddelen te gebruiken die zijn gelabeld met verschillende fluoroforen (multiplexing).

Voor hybridoomfusies kunnen klonen worden geselecteerd op basis van antigeenspecificiteit door daarnaast antigeen toe te voegen als de detectieprobe, dit kan direct worden geconjugeerd met fluorescentie of via een secundair detectiemiddel. Platen van geplukte kolonies worden vervolgens tot samenvloeiing gekweekt ter voorbereiding op kloonexpansie en opschaling.


Afbeelding 1. ClonePix FL-workflow

Monoklonaliteit beoordelen: statistieken

Klonaliteit van hybridoma's verzameld uit halfvast medium werd eerder geëvalueerd en er werd geconcludeerd dat, bij een geschikte zaaidichtheid, de waarschijnlijkheid van toeval (niet-klonaliteit) 4% is. Genetix heeft ook een statistische berekening gegenereerd die een correlatie laat zien tussen de kans op monoklonaliteit en de zaaidichtheid/grootte van de kolonie.

In een typisch experiment worden CHO-cellen uitgeplaat in halfvast medium om 25 kolonieuitgroeiingen per putje met een diameter van 35 mm te produceren (d.w.z. een microtiterplaatputje met zes putjes). Op dag 14 hebben de kolonies een diameter van ongeveer 0,75 mm. Gebruikmakend van de formule (0.25 x Pi x (0.75+0.75) 2 x (n-1)) / (0.25 x Pi x 35 2 ), waarbij koloniegetal n=25, is de kans op toeval 4,4%, dus de kans op monoklonaliteit voor één klonenronde moet 95,6% zijn. Dit ligt zeer dicht bij de eerder vastgestelde waarde.


Figuur 2. Fluorescerende detectie van een uitgescheiden IgG van een NSO-myeloomcellijn

Monoklonaliteit beoordelen: experimenteren

Om de statistische theorie experimenteel te testen, combineerden we twee IgG-afscheidende hybridoma-cellijnen, één die IgG1 afscheidt en de andere die IgG2a uitscheidt. Kolonies werden gekweekt in op CloneMatrix gebaseerde halfvaste media in aanwezigheid van fluorescent-gelabelde isotype-specifieke antilichamen tegen IgG1 en IgG2a. AlexaFluor 488-geconjugeerd anti-IgG1 werd gevisualiseerd in het FITC-kanaal van ClonePix FL en AlexaFluor546-geconjugeerd anti-IgG2a werd gevisualiseerd in het rhodamine-kanaal. Representatieve afbeeldingen worden getoond in figuur 3.

De kolonies werden geanalyseerd met behulp van ClonePix FL-software en differentieel geselecteerd op basis van het feit of ze een hoge uitwendige gemiddelde intensiteit van FITC met lage Rhodamine-intensiteit (voor IgG1-secretoren) of lage FITC met hoge Rhodamine (voor IgG2a-secretoren) vertoonden.

Een totaal van 312 kolonies (156 van elk type) werden geplukt en vervolgens gedurende vier dagen in platen met 96 putjes gekweekt. De geconditioneerde media werden vervolgens beoordeeld op IgG1 en IgG2a met behulp van isotype-specifieke ELISA-assays (Bethyl Laboratories).

Cellen met ofwel een slechte uitgroei of een negatieve ELISA voor zowel IgG1 als IgG2a werden uitgesloten. De resultaten toonden aan dat van de 143 kolonies die werden uitgekozen op basis van IgG1-specifieke fluorescentie, slechts één een laag niveau van IgG2a vertoonde (klonaliteit = 99,3%). Van de 81 IgG2a-kolonies die werden uitgekozen op basis van IgG2a-specifieke fluorescentie, waren er drie heterogeen (klonaliteit = 96,4%). Monoklonaliteit voor de volledige dataset werd berekend als 98,25%.

Deze experimentele gegevens valideren de statistische evaluatie dat de klonaliteit na een enkele plukronde op het ClonePix FL-systeem >95,6% is bij het plukken van grotere kolonies (0,75 mm diameter). Met dezelfde formule kan worden berekend dat door op een vroeger tijdstip te plukken (wanneer kolonies slechts 0,35 mm in diameter zijn), de kans op monoklonaliteit wordt verhoogd tot 99,0%. Bovendien verhoogt het uitvoeren van een tweede ronde van klonen (de geplukte klonen opnieuw uitplaten en opnieuw plukken) de kans op monoklonaliteit tot 99,9%.


Afbeelding 3. ClonePix FL-afbeeldingen van het mixed hybridoma-experiment

Het ClonePix FL-systeem is aangetoond als een krachtig hulpmiddel voor snelle screening en isolatie van secretoire zoogdiercellijnen die doorgaans worden gebruikt bij de productie van therapeutische eiwitten en monoklonale antilichamen voor onderzoek. Het systeem verhoogt de algehele productiviteit, waardoor er meer tijd overblijft om antilichamen beter te karakteriseren en nieuwe projecten te starten. De gegevens die in deze tutorial worden gepresenteerd, ondersteunen het idee dat het plukken van kolonies zoogdiercellen uit halfvast medium een ​​effectief middel is om klonale cellijnen te isoleren.


Wat zijn polyklonale, monoklonale en recombinante antilichamen?

Belangrijkste verschillen tussen polyklonale, monoklonale en recombinante antilichamen.

Polyklonale antilichamen

Polyklonale antilichamen zijn een heterogene mix van antilichamen, afgeleid van de immuunrespons van meerdere B-cellen, en elk herkent een ander epitoop op hetzelfde antigeen.

Omdat polyklonale antilichamen zijn samengesteld uit een mengsel van antilichamen die de natuurlijke immuunrespons op een antigeen vertegenwoordigen, lopen ze een hoger risico op variabiliteit van batch tot batch dan monoklonale antilichamen.

Monoklonale antilichamen

Monoklonale antilichamen komen van een enkele B-cel ouderkloon en herkennen daarom slechts één epitoop per antigeen. Deze B-cellen worden onsterfelijk gemaakt door fusie met hybridomacellen, waardoor op lange termijn identieke monoklonale antilichamen kunnen worden gegenereerd.

Omdat monoklonale antilichamen specifiek een bepaald epitoop op het antigeen detecteren, is het minder waarschijnlijk dat ze dan polyklonale antilichamen kruisreageren met andere eiwitten.

Recombinante antilichamen

Recombinante monoklonale antilichamen worden ontwikkeld in vitro gebruik van synthetische genen. De coderende sequenties kunnen zorgvuldig worden gecontroleerd, wat een geoptimaliseerde binding en verbeterde reproduceerbaarheid mogelijk maakt ten opzichte van monoklonale antilichamen geproduceerd uit hybridoma.


De huidige processen voor het vinden van nieuwe antilichaamdoelen of het ontwikkelen van stabiele cellijnen zijn tijdrovend en inefficiënt. Of u nu hele B-celrepertoires, hybridoma's, CHO of andere cellen screent, benaderingen zoals celsortering, kloonpicking of beperkende verdunningen hebben hun bijbehorende nadelen - sommige staan ​​geen celsecretieassays toe, sommige zijn vaak hard voor de individuele cellen die van invloed zijn levensvatbaarheid en uitgroei van de cellen. Bestaande benaderingen zijn suboptimaal, kostbaar, vereisen verschillende individuele stappen, waardoor mogelijk menselijke fouten en besmetting worden geïntroduceerd.

Cyto-Mine ® is de nieuwe generatie oplossing waarmee u uw workflows voor het ontdekken van antilichamen en cellijnontwikkeling kunt versnellen, automatiseren en vereenvoudigen.

Gerichte ontdekking. Identificeer en isoleer snel uw zeldzame cellen van belang.

Monoklonaliteitsgarantie. Uitgebreid bewijs van monoklonaliteit voor cellijnontwikkeling.

Tijdlijnen en kosten aanzienlijk verminderen. Op één dag worden tientallen miljoenen cellen in pools of honderdduizenden afzonderlijk gescreend.

Flexibiliteit. Flexibel testontwerp maakt kwantitatieve meting van antilichaamsecretie mogelijk.

Steriliteit. Het hele proces is geautomatiseerd, steriel en Animal Origin Free. Het Benchtop-systeem is compatibel voor gebruik in klasse II bioveiligheidskasten.

Cyto-Mine® - de technologie

Het eerste geïntegreerde apparaat dat automatisch selectieve screening, celisolatie en kloonverificatie uitvoert in één compact systeem.

Cyto-Mine ® is een instrument met hoge doorvoer dat picodruppeltechnologie en microfluïdica gebruikt om tot 40 miljoen heterogene zoogdiercellen (in pools) in minder dan een dag te verwerken. Cellen zijn ingekapseld in picodruppeltjes die groeimedia bevatten, die fungeren als een bioreactor om cellen te compartimenteren en ze te laten groeien, waarbij uiteindelijk uitgescheiden moleculen zoals antilichamen worden gevangen. De unieke workflow maakt selectieve screening van afzonderlijke cellen mogelijk om zeldzame leadkandidaten te vinden. Hoewel het voornamelijk is ontworpen voor het ontdekken van antilichamen en de ontwikkeling van cellijn, maakt de flexibiliteit van het platform het geschikt voor een verscheidenheid aan toepassingsgebieden.

Wanneer afzonderlijke cellen worden gecompartimenteerd in afzonderlijke picodruppeltjes, is monoklonaliteit gegarandeerd en kunt u nieuwe tests uitvoeren om de eiwitsecretiesnelheid, titer en antigeenspecificiteit te bepalen. Het vastleggen van afzonderlijke cellen in picodruppeltjes zorgt ook voor een zachte verwerking in de hele workflow.

Elke run vindt plaats op een wegwerpbare Cyto-Cartridge ® die u vertrouwen geeft in steriliteit en het risico van crossover minimaliseert. Automatisering van het systeem vermindert de personeelsbehoefte en het eenvoudige 'load-and-go'-formaat maakt het gemakkelijk te gebruiken door iedereen in het lab. Cyto-Mine ® , Cyto-Cartridge ® en onze specialistische chemicaliën en bioreagentia zijn allemaal vrij van dierlijke oorsprong en voldoen aan de GLP-normen.

We hebben vastgesteld dat Cyto-Mine® cellijnen kan genereren met een hoge productiviteit en een sterke zekerheid van monoklonaliteit na een enkele screeningronde zonder afbreuk te doen aan de productkwaliteit.

Thomas Kelly, Janssen R&D


Klonaliteit van cellijnen bewijzen met een waarschijnlijkheid van 99,9%

Het aantonen van de klonaliteit van productiecellijnen is een belangrijk onderwerp op het gebied van cellijnontwikkeling. De belangrijkste regelgevende instanties en organisaties, zoals de Food and Drug Administration (FDA), vereisen gedetailleerd bewijs van monoklonaliteit van productiecellijnen.

Als er niet voldoende bewijs van monoklonaliteit wordt geleverd, zijn aanvullende productiecontroles nodig, wat kan leiden tot kostbare vertragingen bij klinische onderzoeken of de lancering van geneesmiddelen. Met toenemende druk om de tijdlijnen te verkorten en de veiligheid van geneesmiddelen te verbeteren, heeft Cellcavista vastgesteld: technologisch geavanceerde methoden met behulp van zowel fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en automatische beeldvorming van de hele put om ervoor te zorgen dat productiecellijnen zijn afgeleid van een enkele voorlopercel.

Dit artikel is geplaatst op onze Sartorius Blog.

Methoden voor het bewijzen van monoklonaliteit tijdens cellijnontwikkeling

Om de monoklonaliteit van cellijnen te bewijzen, gebruikt Cellcavista eerst de Door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), waarmee een enkele cel kan worden gescheiden van een celsuspensie en celaggregaten met een hoge mate of zuiverheid op basis van deeltjesgrootte (betekent cel). Klonen van één cel wordt uitgevoerd met behulp van een FACSAria™ Fusion-celsorteerder na kleuring van het celoppervlak met DyLight 650 geconjugeerd proteïne A. De FACSAria™ Fusion-celsorteerder maakt de singularisatie van cellen mogelijk door één cel in één putje te zaaien (384 putjesplaten).

Het onderstaande schema toont de procedure voor het klonen van één cel bij Cellcavista:

Om monoklonaliteit verder te ondersteunen en te bewijzen, gebruiken we geautomatiseerde microscopische beeldvorming van hele putten voor fotodocumentatie direct na het sorteren. In dit experiment voerden we beeldvorming uit met behulp van Cellcavista op dag 0, 1, 2 en op één dag tussen dag 5 en 7. De onderstaande resultaten tonen een kloon die is bevestigd als monoklonaal (A) versus een kloon die is gedetecteerd als niet-monoklonaal (B) .

Er werd een experiment opgezet met behulp van een verscheidenheid aan celpools gegenereerd uit Cellcavista's CHO DG44-gastheercellijn om de waarschijnlijkheid van monoklonaliteit te evalueren. Na het experiment kan Cellcavista de monoklonaliteit van bevestigen cellijnen met een waarschijnlijkheid van ≥99%.


Hoe wordt monoklonaliteit of polyklonaliteit bepaald? - Biologie

Kankervorming in het mondveld: het onzichtbare volgen

Harsha Mallegowda 1 , Ruthushree Theresa 2 , Vikram S Amberkar 1
1 Afdeling Orale Pathologie, CODS, Davangere, Karnataka, India
2 Afdeling Microbiologie, CODS, Davangere, Karnataka, India

Datum van webpublicatie17-mei-2019

Correspondentie adres:
Dr. Harsha Mallegowda
Hoofddocent, afdeling Orale Pathologie, KLR'S Lenora Institute of Dental Sciences, Rajahmahendravaram, Andhra Pradesh
India

Bron van ondersteuning: Geen, Belangenverstrengeling: Geen

DOI: 10.4103/ijohs.ijohs_34_18

Kanker is een van de meest voorkomende ziekten die mensen wereldwijd treft, ondanks de nieuwste ontwikkelingen in de moleculaire en celbiologie, is het nog steeds twijfelachtig hoe kankercellen door carcinogenese vorderen en hun metastatisch vermogen verwerven. De mondholte is een van de meest voorkomende plaatsen voor potentieel kwaadaardige aandoeningen. Deze premaligne pathologieën kunnen evolueren naar dysplastische laesies en vervolgens naar invasieve carcinomen. De aanwezigheid van een of meer mucosale gebieden bestaande uit epitheelcellen met kanker-geassocieerde genetische of epigenetische veranderingen. De prognose van patiënten met plaveiselcelcarcinoom wordt nadelig beïnvloed door de ontwikkeling van een nieuwe tumor. Deze recensie benadrukt de pathofysiologische veranderingen tijdens veldkanker

trefwoorden: Carcinoom, veldkanker, tweede veld


Hoe dit artikel te citeren:
Mallegowda H, Theresa R, Amberkar VS. Orale kankervorming: het onzichtbare volgen. Int J Mondgezondheid Sci 20199:28-35

Hoe deze URL te citeren:
Mallegowda H, Theresa R, Amberkar VS. Orale kankervorming: het onzichtbare volgen. Int J Oral Health Sci [serie online] 2019 [geciteerd 24 juni 2021]9:28-35. Beschikbaar op: https://www.ijohsjournal.org/text.asp?2019/9/1/28/258571

Kanker is een van de meest voorkomende ziekten die mensen wereldwijd treft. Ondanks de laatste vooruitgang die is geboekt in de moleculaire en celbiologie, is het nog steeds twijfelachtig hoe kankercellen door carcinogenese gaan en hun metastatisch vermogen verwerven. De mondholte is een van de meest voorkomende plaatsen voor potentieel kwaadaardige aandoeningen. Deze premaligne pathologieën kunnen zich ontwikkelen tot dysplastische laesies en vervolgens tot invasieve carcinomen.

  1. Een van de meest voorkomende maligniteiten bij de mens
  2. Omvat ongeveer 5'37 van de gediagnosticeerde gevallen van kanker in de ontwikkelde landen [1]
  3. De gemiddelde 5-jaarsoverleving van HNSCC is een van de laagste onder agressieve kankers [1]
  4. Wereldwijd is er een prevalentie van ongeveer 20 hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) gevallen per 100.000 personen per jaar [1]
  5. HNSCC staat op nr. 5 op de lijst van de meest voorkomende kankersoorten
  6. De prognose van patiënten met plaveiselcelcarcinoom wordt nadelig beïnvloed door de ontwikkeling van een nieuwe tumor.

”Verhoogd risico op kankerontwikkeling in het gehele bovenste deel van het spijsverteringskanaal als gevolg van meerdere genetische afwijkingen, in de hele regio na langdurige blootstelling aan kankerverwekkende stoffen. ”[2]

De aanwezigheid van een of meer mucosale gebieden bestaat uit epitheelcellen die kanker-geassocieerde genetische of epigenetische veranderingen hebben. [3]

De ontwikkeling van lokaal terugkerende kanker en de tweede primaire tumoren is vaak verklaard door het concept van 'veldkanker'.'8221 [4] (Slaughter et al. 1953) gebruikte voor het eerst de term veldkanker. [4]

Veldkanker werd als volgt beschreven: [4]

  1. Mondkanker ontwikkelt zich in de multifocale gebieden van precancereuze verandering
  2. Histologisch abnormaal weefsel omringt de tumor
  3. Mondkanker bestaat vaak uit meerdere onafhankelijke laesies die soms samenvloeien
  4. De persistentie van abnormaal weefsel na de operatie kan tweede primaire tumoren en lokale recidieven verklaren.

The terms “field effect” and field cancerization were used when (pre) neoplastic processes at multiple sites were described, and it was often assumed that these had developed independently. [5]

”Cancer does not arise as an isolated cellular phenomenon but rather as an anaplastic tendency involving many cells at once.” [5]

  • Field cancerization was first described in oral cancers
  • Molecular genetic studies conducted in the head-and-neck tumors to explain the mechanisms and importance of this phenomenon. [5]

The concept has been challenged because some clinically diagnosed second primary tumors distant from the original tumor appeared to derive from the clonal spreading of the original one based on genetic analysis (Bedi et al., 1996). [6]

Oral field cancerization is probably a general phenomenon of epithelial tumors. [5] An important physiologic function of epithelia is their protective role that inevitably exposes them to environmental substances, including carcinogens that can create a vast area of genetically altered cancer fields. [5] Epithelial cells frequently self-renew and can undergo abnormal proliferation. Hyperplastic epithelia could form the basis of neoplastic transformation leading to the formation of the most common types of cancers of the human body. [5],[6]

Like most cancers, HNSCCs are not simply an aggregate of a genetically identical cell population but are composed of cells with marked genetic and cellular heterogeneity.

This unexpectedly high degree of heterogeneity is thought to result from a combination of genomic instability and clonal evolution. [7]

Heterogeneity can arise within tumors through as follows: [7]

  1. The stochastic process of clonal evolution
  2. Extrinsic environmental differences within tumors
  3. The presence of cancer stem cells th'at variably differentiate
  4. Combination.

Chronic exposure to tobacco carcinogens in the upper aerodigestive tract causes genetic and epigenetic damage in epithelial cells explained in [Figure 2]

  1. The development of a field with genetically altered cells plays a central role
  2. This preneoplastic field is of monoclonal origin and expands noninvasively superseding normal epithelium
  3. Clonal divergence and selection within the field ultimately lead to the development of cancer
  4. These fields can be large (ɳ cm diameter) and are often not visible for the surgeon explaining that they may remain after resection of the primary tumor [8]
  5. When not removed, a field is an important risk factor for secondary cancer.

This model is well explained in [Figure 11], emphasising the level of detection and carcinogenesis progression.

The criteria used to diagnose multiple primary carcinomas as originally described by Warren and Gates and modified by Hong were as follows: [10]

  1. Each neoplasm must be anatomically separate and distinct (if the intervening mucosa demonstrates dysplasia, it is considered a multicentric primary neoplasm)
  2. The possibility that the second primary carcinoma represents a metastasis or a local relapse must be excluded. It has to be separated from the first by at least 2 cm of normal epithelium or has to occur at least 3 years after the first diagnosis.

The principle of oral field cancerization

When the mucosa is exposed to carcinogens like tobacco and alcohol, an altered field results in which, the epithelium has many independent foci of abnormal tissue. These tissues can give rise to potentially malignant and malignant lesions.

Theories of field cancerization

Field cancerization include two main theories based on clonality.

The occurrence of multiple primary tumors (MPTs) could be attributed to independent molecular events affecting multiple cells in the entire field subsequent to exposure to carcinogens. [8]

  1. Tumor-associated mucosa margins associated with smoking harbor altered cells
  2. Field changes such as increase in the nuclear area, proliferation, and p53 mutation, but these changes are seen in tumor-free smokers
  3. Epidemiologically, the risk of developing single primary tumors (SPTs) is higher in smokers/drinkers compared with nonsmokers/drinkers
  4. The risk of development of SPT decreases when the patient quits smoking and alcohol.

The molecular events occur in a single progenitor with widespread expansion or lateral spread across the mucosa two types of migration have been explained as follows:

  1. Migration of tumor cells through saliva – micrometastasis
  2. Intraepithelial migration of the progeny of the initially transformed cells.

Common clonal origin in MPTs and is based on the similarity of genetic changes. [8]

Three theories have tried to explain the same as follows:

  1. Single cell/small clusters of cells migrate through submucosa
  2. The cells are shed in the lumen of an organ at one place and regrow at another
  3. The genetically altered field exists in the epithelium from which multiple clonally related neoplastic lesions develop which help in the lateral clonal spread of cancer and subsequent occurrence of new primaries.

Alterations in as follows:

The pathomechanisms of local tumor spread and relapse formation types include as follows: [12]

  1. ter plaatse recurrences that arise in the residual organ/organ system not involved in the surgery for the primary tumor
  2. Scar recurrences that develop at the site of previous tumor resection.

Whereas field cancerization, the monoclonal or multiclonal displacement of normal epithelium by a genetically altered but microscopically undistinguishable homolog may explain the origin of in situ recurrences.

Oral field cancerization

  1. Describes clinically occult multifocal preneoplastic lesions of the epithelium within an anatomic region exposed to the same carcinogen(s) (e.g., cigarette smoking and human papillomavirus infection) [12]
  2. These lesions may not be apparent at histopathologic investigation but can be detected with molecular analyses for phenotypic or genetic alterations associated with carcinogenesis such as p53 gene mutations, integrated viral DNA, loss of heterozygosity, and microsatellite instability
  3. Both monoclonal and polyclonal lesions have been shown in those fields with genetically altered cells by X-chromosome inactivation analysis and comparison of distinct gene mutations
  4. Polyclonality is explained by multiple genetic lesions produced independently from each other by the same carcinogenic local environment
  5. Monoclonal fields result from the lateral expansion of a “patch” formed by a genetically altered stem cell exhibiting a significant growth advantage over the neighboring stem cells
  6. Cohesive lateral migration of these cells gradually displaces the normal epithelium. After the complete resection of carcinoma preserving part of the organ in which it developed, microscopically normal but genetically altered epithelium may remain in situ and acquire additional mutations or epigenetic alterations that can initiate the development of a second tumor of the same or a different histologic type, representing an in situ recurrence refer [Figure 13]
  7. If the resection margin of the tumor operation is located within this genetically altered epithelium, a scar recurrence could also be a consequence of field cancerization. [12]

Alterations in epithelium and stroma is explained in [Figure 7].

Field precancerization in relation to oral squamous cell carcinoma

  1. Most oral squamous cell carcinomas develop in fields of precancerized epithelium in which there is clonal expansion of phenotypically normal but genetically altered keratinocytes
  2. These genetically unstable precancerous keratinocytes manifest aneuploidy, gain or loss of chromosomal material, or alterations in the sequences of nucleotides
  3. The genomic instability favors further acquisition of genetic alterations leading to the growth of superiority or inferiority of the affected cells
  4. The genetically advantaged cells may ultimately acquire a cancerous phenotype. [13]

DNA methylation is an epigenetic alteration, involved in human cancers. DNA methylation has been proposed as a candidate mediator of this field cancerization. Methylation of MGMT, APC, TIMP3, RAR, ECAD, and p16 was detected in 38%, 33%, 61%, 67%, 29%, and 49% of tumors, respectively. Some of the patients who delivered methylation-positive tumor samples had also methylation-positive adjacent normal tissues. The epigenetic modifications represented by DNA methylation in the adjacent normal tissue in the course of HNSCC point to the usefulness of DNA methylation as a marker of epigenetic cancerization field and of the future risk of cancer development. [16]

  1. The presence of a field with genetically altered cells is a risk factor for cancer
  2. The large number of preneoplastic cells in the proliferating fields is likely to increase cancer risk dramatically
  3. The early genetic events might lead to clonal expansion of premalignant daughter cells in a particular tumor field
  4. Subsequent genomic changes in some of these cells drive them toward the malignant phenotype. A population of daughter cells with early genetic changes (without histological changes) remains in the organ, demonstrating the concept of field cancerization
  5. For early detection of a cancer, one can rely on tumor markers
  6. Identification of molecular signatures in the genetically transformed but histologically normal cells (peritumoral cancer field)
  7. Hence, identification of such tumor-specific biomarkers will have excellent utility in monitoring the tumor progression and if possible, in preventing transformation of premalignant lesions into invasive cancer refer [Figure 14].

The presence of a field with genetically altered cells is a risk factor for cancer.

  • Oral pathologist in this field has a strong potential role to reveal new diagnostic markers for the early detection, modalities to prevent progression, and finally, ways to combat the development of the second primary tumor
  • Finally, not only early detection and management of oral cancer are important but also equally important are early identification and management of a field to have profound implications on cancer prevention and outcome of the treatment.

Field cancerization poses a greater challenge, as it influences the morbidity and mortality of oral cancer patients. The presence of a field with genetically altered cells is a risk factor for cancer. The large number of preneoplastic cells in the proliferating fields is likely to increase cancer risk dramatically. The probability of developing a second primary tumor in a patient who once had HNSCC is around 20%. Early identification and management of field change is a vital determinant for prevention of cancer mortality and morbidity.


Bekijk de video: Wat is immunotherapie? (November 2021).