Informatie

Lezing 13: Informatie lezen in het genoom: transcriptie Vertaling en post-translationele processen - Biologie


Lezing 13: Informatie lezen in het genoom: transcriptie Vertaling en post-translationele processen

Post-translationele regulatie van de maternale-naar-zygotische overgang

De maternale-naar-zygotische overgang (MZT) is essentieel voor de ontwikkelingscontrole die wordt overgedragen van maternale producten naar nieuw gesynthetiseerd zygotisch genoom in de vroegste stadia van embryogenese, inclusief afbraak van de maternale component (mRNA's en eiwitten) en zygotische genoomactivering (ZGA). Tijdens de MZT zijn verschillende post-translationele eiwitmodificaties geïdentificeerd, zoals fosforylering, methylering en ubiquitinatie. Precieze post-translationele regulatiemechanismen zijn essentieel voor de tijdige overgang van vroege embryonale ontwikkeling. In deze review vatten we de recente vooruitgang samen met betrekking tot de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan post-translationele regulatie van de afbraak van maternale componenten en ZGA tijdens de MZT en bespreken we enkele belangrijke kwesties in het veld.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Abstract

Analyses op genoomschaal hebben ons in staat gesteld verder te gaan dan het bestuderen van genexpressie op het niveau van individuele componenten van een bepaald proces door globale informatie te verstrekken over functionele verbindingen tussen genen, mRNA's en hun regulerende eiwitten. Dergelijke analyses hebben ons begrip van het samenspel tussen verschillende gebeurtenissen in genregulatie enorm vergroot en hebben eerder niet gewaardeerde functionele verbindingen aan het licht gebracht, waaronder koppeling tussen nucleaire en cytoplasmatische processen. Genoombrede benaderingen hebben ook uitgebreide coördinatie binnen regelgevende niveaus onthuld, zoals de organisatie van transcriptiefactoren in regelgevende motieven. Over het algemeen vergroten deze onderzoeken ons begrip van hoe de vele componenten van de eukaryote cel functioneren als een systeem om zowel coördinatie als veelzijdigheid in genexpressie mogelijk te maken.


Controle van genexpressie in eukaryoten

Eukaryote cellen hebben vergelijkbare mechanismen voor de controle van genexpressie, maar ze zijn complexer. Bedenk bijvoorbeeld dat prokaryotische cellen van een bepaalde soort allemaal hetzelfde zijn, maar de meeste eukaryoten zijn meercellige organismen met veel celtypen, dus de controle van genexpressie is veel gecompliceerder. Het is niet verrassend dat genexpressie in eukaryote cellen wordt gecontroleerd door een aantal complexe processen die worden samengevat door de volgende lijst.

  • Na de bevruchting worden de cellen in het zich ontwikkelende embryo steeds meer gespecialiseerd, grotendeels door sommige genen aan te zetten en vele andere uit te schakelen. Sommige cellen in de pancreas zijn bijvoorbeeld gespecialiseerd in het synthetiseren en afscheiden van spijsverteringsenzymen, terwijl andere pancreascellen (β-cellen in de eilandjes van Langerhans) gespecialiseerd zijn in het synthetiseren en afscheiden van insuline. Elk type cel heeft een bepaald patroon van tot expressie gebrachte genen. Deze differentiatie in gespecialiseerde cellen vindt grotendeels plaats als gevolg van het uitschakelen van de expressie van de meeste genen in de celrijpe cellen die mogelijk slechts 3-5% van de genen in de celkern gebruiken.
  • Genexpressie in eukaryoten kan ook worden gereguleerd door veranderingen in de pakking van DNA, die de toegang van de transcriptie-enzymen van de cel (bijv. RNA-polymerase) tot DNA moduleert. De afbeelding hieronder laat zien dat chromosomen een complexe structuur hebben. De DNA-helix is ​​gewikkeld rond speciale eiwitten die histonen worden genoemd, en deze zijn gewikkeld in strakke spiraalvormige vezels. Deze vezels worden vervolgens gelust en gevouwen tot steeds compactere structuren, die, wanneer ze volledig opgerold en gecondenseerd zijn, de chromosomen hun karakteristieke uiterlijk in metafase geven.

  • Net als de operons die hierboven zijn beschreven voor prokaryoten, gebruiken eukaryoten ook regulerende eiwitten om transcriptie te regelen, maar elk eukaryoot gen heeft zijn eigen set controles. Daarnaast zijn er nog veel meer regulerende eiwitten in eukaryoten en de interacties zijn veel complexer.
  • In eukaryoten vindt transcriptie plaats binnen de membraangebonden kern, en het initiële transcript wordt gemodificeerd voordat het van de kern naar het cytoplasma wordt getransporteerd voor translatie bij het ribosoom. Het initiële transcript in eukaryoten heeft coderende segmenten (exons) afgewisseld met niet-coderende segmenten (introns). Voordat het mRNA de kern verlaat, worden de introns uit het transcript verwijderd door een proces dat RNA-splitsing wordt genoemd (zie afbeelding en video hieronder), en extra nucleotiden worden aan de uiteinden van het transcript toegevoegd. Deze niet-coderende "kapjes" en "staarten" beschermen het mRNA tegen aanval door cellulaire enzymen en helpen bij herkenning door de ribosomen.

  • Variatie in de levensduur van mRNA biedt nog een andere mogelijkheid voor controle van genexpressie. Prokaryotisch mRNA is van zeer korte duur, maar eukaryote transcripten kunnen uren of soms zelfs weken duren (bijv. mRNA voor hemoglobine in de rode bloedcellen van vogels).
  • Het translatieproces biedt extra mogelijkheden voor regulatie door veel eiwitten. De translatie van hemoglobine-mRNA wordt bijvoorbeeld geremd tenzij ijzerbevattend heem in de cel aanwezig is.
  • Er zijn ook mogelijkheden voor "post-translationele" controles van genexpressie in eukaryoten. Sommige getranslateerde polypeptiden (eiwitten) worden door enzymen gesneden tot kleinere, actieve eindproducten. zoals geïllustreerd in de onderstaande figuur die de post-translationele verwerking van het hormoon insuline weergeeft. Insuline wordt aanvankelijk vertaald als een grote, inactieve voorloper, een signaalsequentie wordt verwijderd uit de kop van de voorloper en een groot centraal deel (de C-keten) wordt weggesneden, waardoor twee kleinere peptideketens overblijven die vervolgens aan elkaar worden gekoppeld door disulfidebruggen. De kleinere uiteindelijke vorm is de actieve vorm van insuline.
  • Genexpressie kan ook worden gewijzigd door de afbraak van de eiwitten die worden geproduceerd. Sommige van de enzymen die betrokken zijn bij het celmetabolisme worden bijvoorbeeld afgebroken kort nadat ze zijn geproduceerd. Dit biedt een mechanisme om snel te reageren op veranderende metabolische behoeften.
  • Genexpressie kan ook worden beïnvloed door signalen van andere cellen. Er zijn veel voorbeelden waarin een signaalmolecuul (bijvoorbeeld een hormoon) van een cel bindt aan een receptoreiwit op een doelcel en een reeks biochemische veranderingen (een signaaltransductieroute) initieert die leiden tot veranderingen in de doelcel. Deze veranderingen kunnen verhoogde of verlaagde transcriptie omvatten, zoals geïllustreerd in de onderstaande afbeelding.

  • Het RNA-interferentiesysteem (RNAi) is nog een ander mechanisme waarmee cellen genexpressie regelen door de translatie van mRNA uit te schakelen. RNAi kan ook worden gebruikt om de translatie van virale eiwitten af ​​te sluiten wanneer een cel is geïnfecteerd met een virus. Het RNAi-systeem heeft ook het potentieel om therapeutisch te worden benut.

Sommige RNA-virussen zullen cellen binnendringen en dubbelstrengs RNA introduceren dat de celmachinerie zal gebruiken om nieuwe kopieën van viraal RNA en virale eiwitten te maken. Het RNA-interferentiesysteem (RNAi) van de cel kan voorkomen dat het virale RNA zich vermenigvuldigt. Ten eerste hakt een enzym met de bijnaam "Dicer" elk dubbelstrengs RNA dat het vindt in stukjes van ongeveer 22 nucleotiden lang. Vervolgens binden eiwitcomplexen genaamd RISC (RNA-geïnduceerde Silencing Complex) zich aan de fragmenten van dubbelstrengs RNA, winden het op en geven dan een van de strengen vrij, terwijl de andere wordt vastgehouden. Het RISC-RNA-complex zal dan binden aan elk ander viraal RNA met nucleotidesequenties die overeenkomen met die op het RNA dat aan het complex is gehecht. Deze binding blokkeert de translatie van virale eiwitten ten minste gedeeltelijk, zo niet volledig. Het RNAi-systeem kan mogelijk worden gebruikt om behandelingen te ontwikkelen voor defecte genen die ziekten veroorzaken. De behandeling omvat het maken van een dubbelstrengs RNA van het zieke gen en het inbrengen ervan in cellen om de expressie van dat gen tot zwijgen te brengen. Zie voor een geïllustreerde uitleg van RNAi de korte, interactieve Flash-module op http://www.pbs.org/wgbh/nova/body/rnai-explained.html

Het RNA-interferentiesysteem wordt ook vollediger uitgelegd in de onderstaande video van Nature Video.

Inhoud �. Alle rechten voorbehouden.
Datum laatst gewijzigd: 2 februari 2018.
Gemaakt door Wayne W. LaMorte, MD, PhD, MPH,


Lezing 13: Informatie lezen in het genoom: transcriptie Vertaling en post-translationele processen - Biologie

Net als transcriptie wordt de translatie gecontroleerd door eiwitten die binden en het proces initiëren. Bij translatie moet de ribosoomassemblage worden voltooid voordat de eiwitsynthese kan beginnen. Dit is een proces met meerdere stappen.

Bij ribosoomassemblage worden de grote en kleine ribosomale subeenheden en een initiator-tRNA (tRNAl) die het eerste aminozuur van de uiteindelijke polypeptideketen bevatten, komen allemaal samen bij het translatiestartcodon op een mRNA om de translatie te laten beginnen. Ten eerste bindt de kleine ribosomale subeenheid aan het tRNAl die methionine in eukaryoten en archaea draagt ​​en N-formyl-methionine in bacteriën draagt. (Omdat het tRNAl draagt ​​een aminozuur, er wordt gezegd dat het geladen is.) Vervolgens de kleine ribosomale subeenheid met het geladen tRNAl nog steeds gebonden scans langs de mRNA-streng totdat het het startcodon AUG bereikt, wat aangeeft waar de translatie zal beginnen. Het startcodon bepaalt ook het leeskader voor de mRNA-streng, wat cruciaal is voor het synthetiseren van de juiste sequentie van aminozuren. Een verschuiving in het leeskader resulteert in een verkeerde vertaling van het mRNA. Het anticodon op het tRNAl bindt vervolgens aan het startcodon via basenparing. Het complex bestaande uit mRNA, geladen tRNAlen de kleine ribosomale subeenheid hecht zich aan de grote ribosomale subeenheid, die de ribosoomassemblage voltooit. Deze componenten worden samengebracht met behulp van eiwitten die initiatiefactoren worden genoemd en die tijdens de initiatie aan de kleine ribosomale subeenheid binden en in alle drie de domeinen van het leven worden aangetroffen. Bovendien besteedt de cel GTP-energie om het initiatiecomplex te helpen vormen. Zodra de ribosoomassemblage is voltooid, wordt het geladen tRNAl is gepositioneerd in de P-site van het ribosoom en de lege A-site is klaar voor het volgende aminoacyl-tRNA. De polypeptidesynthese begint en verloopt altijd van het N-uiteinde naar het C-uiteinde, de N-naar-C-richting genoemd.

In eukaryoten helpen verschillende eukaryote initiatiefactoreiwitten (eIF's) bij de assemblage van ribosoom. De eukaryote initiatiefactor-2 (eIF-2) is actief wanneer het bindt aan guanosinetrifosfaat (GTP). Met GTP eraan gebonden, bindt het eIF-2-eiwit aan de kleine 40S-ribosomale subeenheid. Vervolgens werd het initiator-tRNA geladen met methionine (Met-tRNAl) associeert met het GTP-eIF-2 / 40S-ribosoomcomplex, en zodra al deze componenten aan elkaar zijn gebonden, worden ze gezamenlijk het 43S-complex genoemd.

Eukaryotische initiatiefactoren eIF1, eIF3, eIF4 en eIF5 helpen het 43S-complex naar de 5'8242-m7G-cap van een mRNA te vertalen. Eenmaal gebonden aan de mRNA's 5'8242 m 7 G-cap, begint het 43S-complex door het mRNA te reizen totdat het het initiatie-AUG-codon bereikt aan het begin van het mRNA's leeskader. Sequenties rond de AUG kunnen ertoe bijdragen dat de juiste AUG wordt gebruikt als het startcodon in het mRNA.

Zodra het 43S-complex bij de initiatie AUG is, wordt de tRNAi-Met boven de AUG geplaatst. Het anticodon op tRNAl- Ontmoet baseparen met het AUG-codon. Op dit punt wordt het GTP gebonden aan eIF2 in het 43S-complexx gehydrolyseerd tot GDP + fosfaat en komt er energie vrij. Deze energie wordt gebruikt om de eIF2 (met GDP eraan gebonden) vrij te maken uit het 43S-complex, waardoor de 40S-ribosomale subeenheid en het tRNA achterblijven.l- Ontmoet op de translatiestartplaats van het mRNA.

Vervolgens bindt eIF5 met GTP-gebonden aan de 40S-ribosomale subeenheid gecomplexeerd met het mRNA en het tRNAl-Leerde kennen. De eIF5-GTP zorgt ervoor dat de grote ribosomale subeenheid van de jaren 60 zich kan binden. Zodra de 60S-ribosomale subeenheid arriveert, hydrolyseert eIF5 zijn gebonden GTP tot GDP + fosfaat en komt er energie vrij. Deze energie zorgt voor de assemblage van de twee ribosomale subeenheden in het intacte 80S-ribosoom, met tRNAi-Met in zijn P-plaats, terwijl het ook is gekoppeld aan het initiatie-AUG-codon op het mRNA. De vertaling is klaar om te beginnen.

De binding van eIF-2 aan de 40S ribosomale subeenheid wordt gecontroleerd door fosforylering. Als eIF-2 gefosforyleerd is, ondergaat het een conformationele verandering en kan het niet binden aan GTP. Daarom kan het 43S-complex zich niet goed vormen en wordt de vertaling belemmerd. Wanneer eIF-2 ongefosforyleerd blijft, bindt het de 40S ribosomale subeenheid en vertaalt het actief het eiwit.

Vertaalinitiatiecomplex: Genexpressie kan worden gecontroleerd door factoren die het translatie-initiatiecomplex binden.

Het vermogen om het ribosoom volledig te assembleren, heeft rechtstreeks invloed op de snelheid waarmee translatie plaatsvindt. Maar eiwitsynthese wordt ook op verschillende andere niveaus gereguleerd, waaronder mRNA-synthese, tRNA-synthese, rRNA-synthese en synthese van eukaryote initiatiefactoren. Verandering in een van deze componenten beïnvloedt de snelheid waarmee translatie kan plaatsvinden.


Auteurs informatie

Voorkeuren

Proteome Center Tübingen, Universiteit van Tübingen, Tübingen, Duitsland

Organismische interacties, Universiteit van Tübingen, Tübingen, Duitsland

PISSARO Proteomic Platform, Universiteit van Rouen, Rouen, Frankrijk

Instituut voor Moleculaire Biologie en Biofysica, ETH Zürich, Zürich, Zwitserland

Laboratorium voor moleculaire microbiologie en structurele biochemie, CNRS UMR 5086, Universiteit van Lyon, Lyon, Frankrijk

Systemen en synthetische biologie, Chalmers University of Technology, Göteborg, Zweden

Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technische Universiteit van Denemarken, Kongens Lyngby, Denemarken

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

Bijdragen

BM onderzocht gegevens voor het artikel, ontwierp het overzicht en beoordeelde en bewerkte het manuscript voordat het werd ingediend. B.M., K.F., J.H, E.W.-B., C.G. en I.M. droegen substantieel bij aan de discussie over de inhoud en schreven het artikel.

Corresponderende auteur


Achtergrond

Veel aspecten van modern biologisch onderzoek zijn afhankelijk van nauwkeurige identificatie van de eiwitcoderende genen in elk genoom, evenals van de aard van de rijpe functionele eiwitproducten, een proces dat gewoonlijk wordt aangeduid als genoomannotatie. Met de exponentiële toename van het aantal prokaryotische genomen waarvan de sequentie is bepaald, mogelijk gemaakt door de vooruitgang in technologieën voor genoomsequencing in het afgelopen decennium, is de huidige prokaryotische genoomannotatie in wezen een geautomatiseerd proces met hoge doorvoer dat sterk afhankelijk is van de novo genvoorspellingsprogramma's [1-3].

Terwijl de novo genvoorspellingsprogramma's zijn aanzienlijk verbeterd voor prokaryotische genomen er blijven aanzienlijke uitdagingen [4], zoals het bepalen van de precieze start- en stopplaats van een gen, het nauwkeurig voorspellen van korte genen en het bepalen van een stopcodon dat een alternatief aminozuur vertegenwoordigt in plaats van een echte stop plaats. Naarmate de inspanningen om meer takken van de levensboom te sequensen toenemen, zal het nauwkeurigheidsniveau van de huidige genvoorspellingsprogramma's die zijn getraind op proteobacteriëndatasets aanzienlijk afnemen, wat leidt tot een toename van onjuiste voorspellingen van eiwitcoderende genen [4]. Het probleem wordt nog verergerd door het gebrek aan experimenteel bewijs ter ondersteuning van voorspelde eiwitcoderende regio's voor de overgrote meerderheid van geannoteerde genomen. Waar beschikbaar, is experimenteel bewijs doorgaans gebaseerd op tot expressie gebrachte RNA-sequenties, zoals van microarray- of RNA Seq-experimenten. Deze genoomgerichte analyses bepalen echter niet onafhankelijk en ondubbelzinnig of een voorspeld eiwitcoderend gen wordt vertaald in een eiwit of, belangrijker nog, betrouwbare informatie verschaffen over post-translationele verwerking.

Bottom-up proteomics biedt de mogelijkheid om peptiden die voortkomen uit tot expressie gebrachte eiwitten direct te meten, wat de huidige beste optie is voor het onafhankelijk en ondubbelzinnig identificeren van ten minste een belangrijke subset van de eiwitcoderende genen in een genoom en kan worden gebruikt om genannotaties experimenteel te valideren [4 -9]. Bij een bottom-up benadering worden eiwitten in een complex mengsel typisch verteerd met een protease, waarna de resulterende peptiden worden gescheiden door chromatografische methoden en vervolgens worden geanalyseerd met tandem-massaspectrometrie (MS/MS) [10,11]. Elk MS/MS-spectrum is een maat voor de fragmentmassa's, idealiter van een enkele peptidesequentie van

6-50 aminozuren. Deze reeks massawaarden is analoog aan een 'vingerafdruk' die het peptide identificeert. Interpretatie van MS/MS-peptidespectra wordt bereikt 1) door gebruik te maken van algoritmen zoals X!Tandem [12], SEQUEST [13] of Mascot [14] om gemeten massa's te vergelijken met een reeks theoretische massa's van mogelijke eiwitsequenties of 2) minder vaak, door de novo analyse, die niet afhankelijk is van enige voorkennis van de mogelijke sequenties [15,16]. Vergelijkbaar met het zoeken naar MS/MS-spectra tegen een reeks voorspelde eiwitsequenties, is het ook mogelijk (en haalbaar voor eenvoudige genomen) om de eiwitcoderende genen in een genoom te identificeren door MS/MS-spectra te zoeken tegen een zes-frame translatie van de genomische DNA-sequentie, waardoor de inherente vooroordelen die zijn afgeleid van genvoorspellingsmethoden worden uitgesloten. We merken op dat het opschalen naar een exponentieel grotere database, als gevolg van zes-frame translatie van een genomische DNA-sequentie, zoekopdrachten mogelijk langzamer maakt met mogelijk ordes van grootte. Bovendien resulteert het ook in een grotere kans op fout-positieve identificaties, aangezien de snelheid waarmee valse ontdekkingen worden gedaan, schaalt met de toenemende databasegrootte, waardoor de gevoeligheids-twin-uitdagingen die alleen haalbaar zijn met toegewijde/geavanceerde computerbronnen die op dit moment routinematig gebruik in de weg staan, aanzienlijk worden verminderd.

Bottom-up proteomics biedt ook een mogelijkheid voor het verkrijgen van biologisch relevante informatie over post-translationele modificaties. Zelfs voor relatief eenvoudige biologische systemen zoals prokaryoten, worden post-translationele modificatie (PTM) gebeurtenissen steeds meer als belangrijk erkend, maar worden ze slecht gekarakteriseerd met betrekking tot locaties of functie. Hoewel PTM-informatie verkregen uit MS/MS-datasets op genoomschaal gunstig is voor het biologische begrip van bacteriële organismen, belemmeren aanzienlijke technologische uitdagingen de routinematige opname van deze waardevolle informatie in primaire annotaties. Deze situatie wordt geïllustreerd door slechts een enkel rapport van MS/MS-datasets op genoomschaal die worden gebruikt om post-translationele modificaties in een genoomsequentie uitgebreid te annoteren [17]. De lage resolutie van de MS/MS-gegevenssets maakt de toewijzing van wijzigingen, met inbegrip van cruciaal de plaats van wijziging, echter minder zeker en niet geschikt voor routinematig gebruik. Het massaverschil van 0,036 Dalton tussen Gln (Q) en Lys (K) kan bijvoorbeeld niet worden opgelost in MS/MS-spectra met lage resolutie, waardoor het aantal mogelijke te matchen peptide-kandidaten toeneemt en het vertrouwen in toewijzingen afneemt. Aan de andere kant kan de sequencing-precisie die wordt geboden door MS / MS-spectra met hoge resolutie residuen oplossen met kleine massaverschillen zoals Gln en Lys, wat de zoekruimte en dus de rekenlast vermindert, en het vertrouwen in opdrachten vergroot.

In deze studie hebben we een bottom-up proteomics-benadering toegepast, aangevuld met een recent beschreven de novo sequencing-methodologie met behulp van hoge resolutie en hoge massa-meetnauwkeurigheid MS / MS-gegevens [18,19] om het translationele landschap en post-translationele kenmerken van de bacteriële ziekteverwekker nauwkeurig bloot te leggen Salmonella enterica serovar Typhimurium (STM) 14028. Salmonella Typhimurium is een belangrijke oorzaak van bacteriële gastro-enteritis en wordt veel gebruikt als model om fundamentele genetische mechanismen en de interactie tussen bacteriële pathogenen en zoogdiergastheren te onderzoeken. Ondanks de klinische en fundamentele wetenschappelijke relevantie van Salmonella Typhimurium is er geen uitgebreide analyse uitgevoerd om experimentele ondersteuning te bieden van zijn in silico-gebaseerde genoomannotatie om analyse op systeemniveau te vergemakkelijken. Onze gegevens bieden experimentele validatie op eiwitniveau voor ongeveer de helft van de voorspelde eiwitcoderende genen in STM 14028 en suggereren herzieningen van 47 genen die zijn toegewezen aan onjuiste translationele startplaatsen, waaronder een mogelijk nieuw alternatief startcodon. Bovendien hebben we 12 niet-geannoteerde genen ontdekt die werden gemist door genvoorspellingsprogramma's, evenals bewijs dat een rol suggereert voor een van deze nieuwe ORF's in Salmonella pathogenese. We hebben ook post-translationele kenmerken in het STM 14028-genoom gekarakteriseerd, waaronder chemische modificaties en proteolytische splitsingen. We vinden dat bacteriën een veel groter en complexer repertoire van chemische modificaties hebben dan eerder werd gedacht, waaronder verschillende nieuwe modificaties. Ons in vivo proteolysegegevens identificeerden meer dan 130 signaalpeptide- en N-terminale methioninesplitsingsgebeurtenissen die cruciaal zijn voor de eiwitfunctie.

In tegenstelling tot de overgrote meerderheid van proteonomica-analyses die proteomics-gegevens gebruiken om de kwaliteit en volledigheid van eerder geannoteerde genomen te verbeteren, vertegenwoordigt deze studie een van de eerste die proteomics-gegevens gebruikt "als onderdeel van een grotendeels geautomatiseerd, high-throughput annotatieproces direct bij de primaire fase van genoomannotatie" [20].


M 6 A moduleert mRNA-metabolisme

N 6-adenosinemethylering beïnvloedt bijna elk stadium van het mRNA-metabolisme, van verwerking in de kern tot translatie en verval in het cytoplasma. Er zijn twee verschillende werkingsmodi geïdentificeerd voor m 6 A-lezers: indirecte lezing en directe lezing. Indirecte aflezing omvat m6A-wijzigingen in secundaire RNA-structuren, waardoor het RNA toegankelijk wordt voor een unieke set RNA-bindende eiwitten (RBP's). Directe aflezing houdt in dat m6A selectief bindt aan RBP's met diverse cellulaire functies (TABEL 1).

M 6 A verandert de vouwing en structuur van RNA

De methylgroep aan de N6-positie van m 6 A verandert de basenparing van Watson'x02013Crick A'x02022U niet, maar verzwakt duplex-RNA met maximaal 1,4 kcal per mol 68 . In ongepaarde posities stapelt m6A zich beter op dan een niet-gemodificeerde base, waardoor de omringende RNA-structuren worden gestabiliseerd 69, 70 of het vouwen van aangrenzende RNA-sequenties 71 wordt bevorderd. Transcriptoombrede RNA-structuurmapping heeft bevestigd dat gemethyleerde RNA-regio's enkelstrengs structuren verkiezen boven dubbelstrengs structuren 70,72� . Bovendien onthulde een recent rapport dat m6A in coderende gebieden sterische beperkingen zou kunnen induceren die de koppeling tussen codons en tRNA-anticodons destabiliseren, waardoor de translatiedynamiek wordt beïnvloed 75 .

Vanwege deze thermodynamische effecten kan m6A-getriggerde structurele hermodellering de toegankelijkheid van RBP-interactiemotieven voor RNA veranderen, een fenomeen dat de m6A-schakelaar wordt genoemd 67 . De methylering van een RRACH-motief in een stamstructuur in verschillende genen, bijvoorbeeld in metastase-geassocieerd longadenocarcinoom transcript 1 (MALAT1) en CDP-diacylglycerolsynthase 2 (CDS2), veroorzaakt de destabilisatie en de opening van de duplex. Een enkelstrengs U-kanaal wordt vervolgens blootgesteld, dat door HNRNPC kan worden herkend om de splitsing van deze transcripten te reguleren 67,76 (FIG. 2a). m6A-schakelaars kunnen wijdverspreid zijn over het transcriptoom en kunnen daarom een ​​belangrijke rol spelen bij het mediëren van interacties tussen RNA en RBP's 67,76.

een| Na te zijn afgezet door de katalytische componenten van de methyltransferasekern, methyltransferase-like 3 (METTL3) en METTL14, N 6-methyladenosine (m6A) wordt herkend door verschillende afleeseiwitten. In de kern functioneert heterogeen nucleair ribonucleoproteïne C (HNRNPC) als een indirecte m6A-lezer door ongestructureerde m6A-schakelgebieden te binden en splicing te reguleren, terwijl YT521-B homologie (YTH) domeinbevattende 1 (YTHDC1) alternatieve splicing reguleert door m6A direct binden en de splitsingsfactoren serine en argininerijke splitsingsfactor 3 (SRSF3) aanwerven, terwijl binding door SRSF10 wordt geblokkeerd. HNRNPA2B1 bemiddelt ook alternatieve splicing op een manier die vergelijkbaar is met YTHDC1. In het cytoplasma medieert YTHDF1 de translatie-initiatie van m6A-bevattende transcripten door direct te binden aan m6A en eukaryote initiatiefactor 3 (eIF3) te rekruteren, waardoor het laden van de eukaryote kleine ribosomale subeenheid (40S) wordt vergemakkelijkt. YTHDF2 bevordert het verval van mRNA door te binden aan CCR4'x02013NOT transcriptiecomplex subeenheid 1 (CNOT1), waardoor de rekrutering van het CCR4'x02013NOT-complex wordt vergemakkelijkt en versnelde deadenylatie wordt geïnduceerd. B | Gemethyleerde transcripten kunnen door reader-eiwitten worden gesorteerd in een fast track (rechts) voor verwerking, translatie en verval. Deze fast-tracking groepeert effectief transcripten met anders duidelijk verschillende eigenschappen om hun tijdige en gecoördineerde vertaling en degradatie te verzekeren, waarbij mogelijk een scherpe puls van genexpressie wordt gegenereerd om te voldoen aan een behoefte aan translationele bursts en daaropvolgende klaring van deze transcripten.

M6A beïnvloedt mRNA-rijping

De verwerking van pre-mRNA tot rijp mRNA bestaat uit drie hoofdstappen: 5′ capping, 3′ polyadenylatie en splicing. Aanvankelijk werd voorgesteld dat m6A zou functioneren als een splitsingsregulator, aangezien vroege studies vonden dat het meer aanwezig was in pre-mRNA dan in rijp mRNA 77 , met veel m6A-plaatsen geconcentreerd in introns 78,79 . mRNA's die alternatieve splicing ondergaan, hebben ook meer METTL3-bindingsplaatsen en meer N 6-adenosine methyleringsplaatsen 39,49. Schrijvers en gummen van m6A lokaliseren voornamelijk in nucleaire spikkels 39,43,44,63, die plaatsen zijn van mRNA-splitsing en opslag. PAR-CLIP-gegevens (photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation) toonden aan dat de meeste METTL3-bindingsplaatsen zich in introns bevinden 39 en de uitputting van Mettl3 in embryonale stamcellen van muizen (muis-ES-cellen) geeft over het algemeen de voorkeur aan exon-skipping en intronretentie 80 . Deze resultaten geven aan dat de rekrutering van METTL3 naar pre-mRNA een co-transcriptionele gebeurtenis is, waarbij methylering mogelijk voorafgaat aan en de splitsing beïnvloedt. FTO moduleert ook alternatieve splitsing door m6A rond splitsingsplaatsen te verwijderen en door binding van serine- en argininerijke splitsingsfactor 2 (SRSF2) te voorkomen 81 . m 6 A-lezers hebben ook invloed op splicing. YTHDC1 rekruteert SRSF3 terwijl het binding door SRSF10 blokkeert, wat leidt tot exon-opname 63 (FIG. 2a). HNRNPA2B1 en HNRNPC zijn ook actieve splitsingsregelaars 67,82,83. HNRNPA2B1 reguleert alternatieve splitsingsgebeurtenissen op een vergelijkbare manier als METTL3 (REF. 66 ), evenals microRNA (miRNA) biogenese van intronische sequenties, wat een proces is dat nauw is gekoppeld aan splitsing 66,84 (aanvullende informatie S2 (box)).

Alternatieve polyadenylatie (APA) is gekoppeld aan splitsing van het laatste intron 85 en geassocieerd met mRNA N 6-adenosine methylering. Tweederde van de m 6 A-sites in het laatste exon zijn te vinden op de 3ʹ UTR, waar APA-sites zich bevinden 56 , en het uitschakelen van m 6 A-schrijvers kan APA 56 veroorzaken. Recente studies van APA-mRNA-isovormen hebben onthuld dat isovormen met m6A de neiging hebben om proximale APA-plaatsen te gebruiken en kortere 3′ UTR's hebben in vergelijking met niet-gemethyleerde isovormen 86 . Gezamenlijk tonen deze resultaten aan dat m6A-methylering nauw verbonden is met vroege mRNA-verwerking.

M 6 A verbetert nucleaire verwerking en export van mRNA's

Nucleaire export van mRNA is een sleutelproces dat transcriptie en verwerking in de kern verbindt met translatie in het cytosol, en dat selectief genexpressie kan moduleren 87 . N 6 -adenosinemethylering werd gesuggereerd om mRNA-export te bevorderen: uitputting van METTL3 remde mRNA-export 88 , terwijl uitputting van ALKBH5 verbeterde mRNA-export naar het cytoplasma 44 . Mechanistische details moeten nog worden gerapporteerd, maar het is denkbaar dat nucleaire lezers een actieve rol spelen in dit proces. Het vergemakkelijken van mRNA-export naar het cytoplasma zou een belangrijk mechanisme kunnen zijn waardoor m6A genexpressie reguleert.

M6A bevordert mRNA-translatie

Vertaling wordt gepromoot door N 6 -adenosine methylering via verschillende mechanismen. YTHDF1 bevordert globaal de translatie van m6A-gemethyleerde mRNA's door binding van m6A-gemodificeerd mRNA en rekrutering van translatie-initiatiefactoren, waardoor de efficiëntie van cap-afhankelijke translatie aanzienlijk wordt verbeterd 61 . YTHDF1 koppelt niet alleen gemethyleerde transcripten aan ribosomen, maar werft ook het translatie-initiatiefactorcomplex eukaryote initiatiefactor 3 (eIF3) (FIG. 2a) om de snelheidsbeperkende stap van translatie te bevorderen. Van METTL3 is onlangs aangetoond dat het ook functioneert als een m6A-lezer door de eIF4E-afhankelijke translatie in een specifieke subset van mRNA's te verbeteren door eIF3 te rekruteren tijdens de translatie-initiatie 89 . Dit effect was onafhankelijk van de methyltransferase-activiteit of de YTHDF1𠄾IF3-route 89 . Twee recente studies hebben verder aangetoond dat de aanwezigheid van m6A op de 5′ UTR de cap-onafhankelijke translatie 52,90 verbetert, en er werd voorgesteld dat eIF3 interageert met m6A en ribosoombelading vergemakkelijkt90. Gezamenlijk suggereren deze bevindingen verschillende verschillende mechanismen waardoor m6A mRNA-translatie bevordert.

M 6 A markeert mRNA voor verval

Verval is de laatste stap in het mRNA-metabolisme, waarbij mRNA wordt gedestabiliseerd en afgebroken. m6A is in verband gebracht met verminderde mRNA-stabiliteit, als knockdown van METTL3 en METTL14 in menselijke en muizencellen is aangetoond dat dit leidt tot een toename van de expressie van hun respectieve doelwit-mRNA's 37,38. Hoewel de meeste m6A-plaatsen het verval van mRNA lijken te versnellen, kan de impact op het transcriptoom, met inbegrip van zowel gemethyleerde als niet-gemethyleerde transcripten, complexer zijn. Deze redenering is omdat veel mRNA's die coderen voor transcriptierepressoren doelwitsubstraten zijn van het methyltransferasecomplex, verminderde methylering van deze transcripten zou transcriptierepressie kunnen veroorzaken.

Mechanistische studies van de cytoplasmatische m6A-lezer YTHDF2 (REFS 49,60) leverden het eerste directe bewijs van een m6A-afhankelijke mRNA-vervalroute 60 . Net als YTHDF1 is YTHDF2 een eiwit met twee domeinen: het carboxy-terminale YTH-domein bindt selectief gemethyleerde transcripten, terwijl het amino-terminale functionele domein de YTHDF2-gebonden transcripten levert aan cytoplasmatische RNA-vervalmachines voor toegewijde afbraak 60 . Knockdown van YTHDF2 verlengde de stabiliteit van zijn doelwit-mRNA's, wat aangeeft dat het mRNA-verval van N 6-adenosine methylering. Het is aangetoond dat YTHDF2 associeert met CCR4–NOT transcriptiecomplex subeenheid 1 (CNOT1) 60 , wat de rekrutering van het CCR4–NOT-complex vergemakkelijkt en versnelde deadenylatie van YTHDF2-gebonden mRNA 91 induceert. De YTHDF2-afhankelijke degradatie van N 6-adenosine-gemethyleerde mRNA's vertegenwoordigen een cruciale rol voor m6A, wat in overeenstemming is met de verhoogde genexpressie die werd waargenomen bij het uitschakelen van m6A-schrijvers 37,38.

Bovendien kunnen de YTHDF2-gebonden m6A-plaatsen ook worden herkend door andere effectoren van mRNA-stabiliteit, zoals ELAV-achtig RNA-bindend eiwit 1 (ELAV1 ook bekend als HuR) 38,92, miRNA's 93 en de Toll-achtige receptor ( TLR) familie eiwit leden TLR3 en TLR7 (REF. 94). Gezien de voorgestelde rol van m6A in miRNA-biogenese (aanvullende informatie S2 (box)), zouden deze routes elkaar kunnen kruisen om samen de stabiliteit van doel-mRNA's te regelen. Het verval van gemethyleerde transcripten lijkt een belangrijke factor te zijn bij het bevorderen van muis-ES-celdifferentiatie en het vergemakkelijken van muisembryogenese 80 . Samengevat functioneert m6A in het algemeen als een destabilisator van mRNA's en vergemakkelijkt het de afbraak van gemethyleerde transcripten in verschillende biologische contexten.

M 6 A sorteert transcripten in een snel pad voor mRNA-metabolisme

De levenscyclus van mRNA's wordt gereguleerd door transcriptionele en post-transcriptionele regulerende processen, waaronder verwerking, export, translatie en verval. Recent studies have revealed that m 6 A and its related factors influence each of these steps. As these processes are generally coupled, we propose that mediators of N 6 -adenosine methylation may work in concert to shape the methylation pattern and protein binding of specific transcripts, thereby affecting their metabolism. One example of such cooperation is the co-regulation of translation and decay by YTHDF1 and YTHDF2 of their shared targets 61 . Both the translation efficiency and the degradation of these mRNAs are reduced by double knockdown of YTHDF1 and YTHDF2. The combined function of the YTHDF1-dependent translation promotion and YTHDF2-dependent decay may result in a spike in protein production 61 ( FIG. 2b ). This effect, along with other m 6 A-mediated effects such as accelerated export of certain methylated mRNA, suggests a critical function for m 6 A-based gene regulation: writers and erasers dictate the levels of target-specific m 6 A. In turn, readers decode these messages and may functionally sort methylated mRNAs into distinct functional groups. During cell differentiation and development, when the translation of groups of transcripts is accomplished within a short time span, methylation could sort these transcript groups into a fast track for processing, translation and decay. Methylation could be particularly beneficial in grouping and synchronizing the expression of hundreds to thousands of mRNAs that otherwise may possess markedly different properties with varied stabilities and translation efficiencies. Such a mechanism may also help in generating translation ‘pulses’ to satisfy the need for bursts of protein synthesis as well as rapid decay to regulate cell differentiation during early development ( FIG. 2b ).


Lecture 13: Reading information in the genome: transcription Translation and post-translational processes - Biology

C2006/F2402 '11 OUTLINE OF LECTURE # 12

(c) 20 11 Dr. Deborah Mowshowitz, Columbia University, New York, NY . Last update 03/02/2011 11:49 AM

Handouts: 12A -- mRNA-verwerking
12B
-- Alternative processing of mRNA
12C
-- Signal Hypothesis -- Co-translational Import
12
NS -- How proteins insert into ER membrane.

I. Wrap up TFs and Development -- What is the molecular basis of testes cell fate determination? See handout 11A, bottom.

1. Is master regulatory gene for Testes

2. Is expressed in Sertoli cells

3. Gene is on Y chromosome

B. What Sry turns on, either directly or indirectly:

2. Signaling molecules:

A. From Sertoli Cells -- Paracrines

-Paracrine that turns on enzymes for testosterone production in Leydig cells

B. From Leydig cells -- Testosterone (endocrine)


II. Overview of Regulation of Euk. Protein Synthesis

A. If cells make different proteins, how is that regulated? Is the difference due entirely to differences in transcription?

1. Transcription is different in different cells.

A. How could it be otherwise? It could be that all cells transcribe all genes, but only some RNA's are exported to the cytoplasm and the remaining nuclear RNAs are degraded. Dit is niet the case. Only selected genes are transcribed in each cell type, and RNA's from those genes are processed to make mRNA. (For an experiment that shows this, see figure 23-19 in Becker.)

B. A consequence -- cDNA libraries. cDNA = complementary DNA = DNA made in vitro by enzymes (including reverse transcriptase), from an mRNA template. Since mRNA is different in different tissues, you can get tissue specific sequences from a cDNA library. (cDNA library = collection of all cDNA's from a particular cell type.) DNA from each cell type is the same mRNA and therefore cDNA is not. See Becker fig. 23-20.

For a problem about DNA & cDNA libraries, see 14A-6.

2. Processing can be different: Splicing and processing of same primary transcripts can be different (in different cells or at different times). Different mRNA's (& therefore proteins) can be produced from the same transcript by alternative splicing and/or poly A addition. Details & example below.

B. How can amount of protein synthesized be controlled? If cell makes more or less protein, which step(s) are regulated?

1. In prokaryote (for comparison) -- process relatively simple.

A. Most regulation at transcription.

B. Translation in same compartment as transcription translation follows automatically.

C. Most mRNA has short half-life.

2. In eukaryote -- Gene expression has many more steps & complications than in prokaryotes -- more additional points of regulation -- not just at transcription. See Becker fig. 23-11 or Sadava fig. 16.13 (14.12).

A. Transcription is main point of control, but other steps are often regulated too.

B. Transcription & translation occur in separate compartments. Translation does not follow automatically.

(1). 2. Transcript must be processed (capped, spliced, polyadenylated, etc.) -- any of these steps can be regulated, and there is more than one way to process most primary transcripts.

(2). mRNA must be transported to cytoplasm.

(3). Translation can be regulated (independently of transcription) -- can control usage and/or fate of mRNA, not just supply of mRNA. For any particular mRNA, can regulate 1 or both of following:

(a). Rate of initiation -- can control how often ribosomes attach and start translation.

(b). Rate of degradation -- can control half life of mRNA.

C. Different eukaryotic mRNAs have different half-lives. Some mRNA's are long lived and some have a very short half life.

To review regulation, try Problems 4-11 & 4-12.


III. Post Translational Regulation. Don't forget: regulation occurs after translation too -- after proteins are made, their activity can be modulated. Many examples of post translational modification have already come up and more will be discussed later. Here is a summary (mostly review):

A. Covalent Modification. Proteins can be modified covalently either reversibly (for ex. by phosphorylation and dephosphorylation), or permanently (for ex. by removal of N-terminal met., addition of sugars -- glycosylation, etc.)

B. Noncovalent Modification. Proteins can be activated or inhibited by reversible noncovalent binding of other factors -- small molecule allosteric effectors, other proteins such as calmodulin (an important Ca 2+ binding protein to be discussed later), etc.

C. Degradation. Proteins can be selectively destroyed or 'turned over'.

1. Half Lives Vary. Not all proteins have the same half life.

2. Significance: Important example of a family of proteins that all have a short half life = cyclins control progression through cell cycle. Different cyclins control transitions from G1 to S, G2 to M etc. Cyclins are made as needed and degraded immediately after use. (Note: Both mRNA's for cyclins and cyclins themselves are degraded after use. More on this when we cover the details of the cell cycle.)

D. Location. Proteins can activated or inhibited by a change of location. For example, transporters like GLUT4 only work if positioned in the plasma membrane if they are sequestered in vesicles they are inactive. Transport of glucose into the cell can be regulated by moving the GLUT4 in and out of the membrane.


NS. Processing of Eukaryotic mRNA transcripts Once transcription gets started, what does it take to get a functioning eukaryotic mRNA? All necessary details are included here and on handout, but splicing was discussed last term and will be covered only briefly in class.

A. Caps and poly A -- See handout 12A.

Most eukaryotic transcripts that will be used as mRNA must be modified on both ends (as well as spliced) before they can be transported to the cytoplasm and used for translation. A "cap" is usually added to the 5' end and a "poly A tail" to the 3' end. The steps involved are shown on handout 12A. (Numbers below match steps on handout.)

(1) Beginning of transcription.

A. The start of transcription is usually indicated by a bent arrow.

B. The boxed areas of the DNA = exons plain DNA between them = intron.

A. A modified G is added to the 5' end of the transcript shortly after transcription begins, while the transcript is still being made.

B. The G is added "backwards" so there is a 5' to 5' connection. (For the curious: The structure of the cap and how it is connected to the transcript is shown in your texts see fig. Becker 21-18.)

C. The cap is represented on the handout as a filled circle.

(3) Transcription continues to or slightly beyond the end of the gene or transcription unit.

A. There may be no fixed stop for transcription in eukaryotes (for production of most mRNA) the addition of poly A (see below) may determine the exact 3' end of the transcript.

B. Most but not all eukaryote mRNA's contain poly A.

C. Reminder: in eukaryotes production of rRNA & tRNA are carried out by different RNA polymerases which have somewhat different properties. these RNA's do not have poly A. (For details see texts.)

A. A poly A tail -- a string of A's a few hundred long -- is added to the 3' end of the RNA.

B. Growth of AA. is 5' to 3' using ATP, enzyme, and splitting off pyrophosphate as usual. No template is used.

C. The sequence AAUAAA is the signal for the appropriate enzyme to cut the transcript a bit downstream and add the string of A's. (Downstream = in the 3' direction on the mRNA or sense strand.)

NS. Note that the A's on the 3' end and the G of the cap are not encoded in the template DNA.

e. On the handout cleavage of transcript = step 4 addition of poly A = step 5. These two steps may occur simultaneously.

(6) Set up for Splicing. Nothing has happened to the RNA in step 6 except that it has been labeled to indicate exons and introns (so we can explain splicing).

A. By the time the transcript is released from the DNA it already has a cap on the 5' end and a poly A tail on the 3' end. This RNA -- modified on both ends but not spliced -- is usually called the primary transcript or pre-mRNA.

B. Some texts refer to unmodified RNA as the primary transcript, but such a state doesn't really exist, since the pre-mRNA is modified before it is released from the DNA.

C. The RNA is now ready for splicing (steps 7-9 on handout). See also Becker fig. 21-22 (21-23) or Sadava fig. 14.10.

Note: Splicing may begin prior to polyA addition see below.

B. Splicing of Eukaryotic mRNA -- Review from last term

1. A typical picture of a gene with introns and exons (for reference) . The picture below shows a section of the sense strand of the DNA that includes a gene with 3 exons and 2 introns. (The picture on the handout has 2 exons and one intron.) Conventions:

The picture on the handout shows double stranded DNA, but genes are often shown as in the picture below, with only the sense strand actually drawn in.

Transcription would start at the 5' (left) end of exon 1 and go to the right.

Important features of intron: Branch point, 5' splice site (also called the donor site) and 3' splice site (also called acceptor site). These are shown for the first intron only. (See also fig. 21-22 (21-23) in Becker or 14.11 in Sadava.)

Also note that the region to the left of exon 1 is NOT an intron -- it is not part of the gene. It is part of a spacer in between this gene and the previous one.


2. Splicing Details -- See bottom of handout 12A.

(1). Splicing out of each intron occurs in 3 steps (see handout 12A, steps 7-9). At each step the parts of the transcript are held in place by the spliceosome. The steps are repeated for splicing of each intron -- many RNA's have many introns. Details are below.

(2). Terminologie The splice junction at the 5' end of an intron is called the 5' or donor site the splice junction at the 3' end of an intron is called the 3' or acceptor site.

B. Steps of splicing. See handout 12A at bottom. See also Becker fig. 21-24 or Sadava 14.11 (14.10). All the steps are catalyzed by the spliceosome. Steps on handout are as follows:

(7) RNA transcript forms loop for removal of intron.

(8). Cut at 5' end of intron

(a). 5' splice site (donor site) is cleaved

(b). loose end of intron (5' end of intron) attaches to branch point in the middle of the intron, forming lariat-shaped structure.

(a). The 5' donor site attaches to the 3' acceptor site, joining the two exons and releasing the intron in the form of lariat.

(b). The lariat will be degraded and the nucleotides will be recycled.

(c). The RNA containing the exons (without the introns) will be transported to the cytoplasm and translated.

C. N.B: Prokaryotes do not have introns and lack the machinery needed to remove them.

3. Do exons and translated regions coincide? See diagram at bottom of 12A. Review from last term:

A. Exons = sections of genes that are represented in the mRNA.

Exons include untranslated 5' and 3' regions as well as the translated regions.

Exons and amino acid coding regions do not coincide, because there are extra untranslated sections in the mRNA.

Exons and mRNA regions do coincide.

B. Exons are not = protein coding sequences , as some texts imply. (The diagram in Sadava fig. 14.7 (14.5) is incorrect.) Exons include protein coding sequences, but also include sequences (UTRs) that are represented in the mRNA but do not code for amino acids. (The Sadava diagrams have no UTRs.)

(1). Leaders. At the 5' end of the mRNA, there is a 5' untranslated region (UTR) or leader before translation begins (before the first AUG). The DNA coding for this region is transcribed, and the RNA is not spliced out, but this region of the mRNA is not translated. The 5' UTR is encoded in one or more exons.

( 2). Trailers. At the 3' end of the mRNA, there is a 3' UTR or trailer that is after the stop codon. The DNA coding for this region is transcribed, and the RNA is not spliced out, but this region of the mRNA is not translated. The 3'UTR is encoded in one or more exons.


V. Regulation at Splicing -- Results of Alternative Processing

A. There are two ways to get a collection of similar proteins

1. Gene families -- multiple, similar genes exist due to duplication and divergence of genes. Example: the globin genes constitute a family. Different family members code for myoglobin, beta-chains, alpha-chains, delta-chains, etc. Other gene families include the GLUT, SGLT, and IF families.

2. Alternative splicing or processing (See below) -- only one gene, but primary transcript spliced in more than one way. Examples: fibronectin, soluble and membrane bound antibodies.

B. The Genome vs the Proteome -- You can get many different mRNAs from a single gene by the processes listed below. Therefore the number of possible proteins (the proteome) greatly exceeds the number of possible genes (the genome).

1. Starting transcription at different points

2. Ending transcription (adding poly A) at different points

3. Splicing out different sections (exons as well as introns) of the primary transcript -- alternative splicing.

C. An example of alternative processing -- Production of antibody (immunogloblin) in B cells. See handout 12B and Becker fig. 23-31 -- how to get either soluble or membrane-bound antibody from alternative processing of the same transcript. (See Sadava fig. 16.22 (14.21) for another example.)

1. Antibody can be membrane bound or secreted. Fate of antibody depends on whether peptide has a hydrophobic sequence near one end or not. Hydrophobic sequence can anchor the protein in the membrane -- becomes a transmembrane (TM) sequence.

A. If Ab has a potential TM sequence : Hydrophobic section locks into membrane of ER as protein is made. Vesicle buds off ER and protein travels through cell as part of vesicle. Protein remains in membrane of vesicle. When vesicle fuses with plasma membrane, Ab stays in membrane.

B. If Ab has no TM : Ab enters lumen of ER as protein is made. Vesicle buds off ER, and protein ends up in lumen of vesicle. When vesicle fuses with plasma membrane, Ab is secreted.

2. Gene has two alternative polyA addition sites. Which one is used determines final location of protein.

A. Optie 1: If poly A addition site #1 (at start of 'intron 4') is used, protein contains no hydrophobic potential TM sequence, and protein is secreted. (Note: 'intron 4' is spliced out in option 2, but the beginning of 'intron 4' is included in the mRNA in option 1.)

B. Optie 2: If other poly A addition site (at end of exon 6) is used, protein contains hydrophobic sequence encoded by exons 5 & 6, and protein stays in plasma membrane.

3. mRNA can be spliced and/or poly A added in two alternate ways. Location of protein (antibody) depends on whether splicing of intron 4 or poly A addition happens first. Think of it as a competition. Of

A. Poly A adding enzymes get there before the spliceosome. In that case, poly A is added to site #1 near end of exon 4, and rest of intron 4 (and rest of gene) is never transcribed, or

B. The spliceosome gets there first . In that case, Intron 4 is transcribed and spliced out before poly A can be added. (In this case, poly A is added at the end of exon 6 instead.)

4. Why are 2 forms of antibody needed?

A. Membrane-bound form of antibody: Serves as receptor for antigen = trap to detect when antigen is present. Binding of antigen (ligand) to antibody (receptor) serves as trigger to start secreting antibody.

B. Secreted (soluble) form: Acts as effector -- carries out major function of immune system -- binds to soluble antigen in body fluids and triggers destruction of antigen in multiple ways.

To review regulation & alternative splicing, try problems 4-13 & 4-14.

VI. Regulation at translation.

A. How to control rate of translation? In principle:

1. Can regulate half life of mRNA (control rate of degradation).

A. In prokaryotes most mRNA's have a short 1/2 life in eukaryotes this is not necessarily so.

B. Different eukaryotic mRNA's have very different half lives.

2. Can regulate rate of initiation of translation (control how effectively translation starts).

B. Some Famous Examples of Regulation of Translation. (The principles are important we will not go into the details.)

  • Function: Ferritin is an intracellular protein that stores excess iron. (Transferrin & its receptor were discussed in the section on RME.)
  • Overall: Regulatory system is similar to induction/repression, but it is translation, not transcription, that is affected by the regulatory protein.
  • This is another example of coordinate control. There is one trans-acting factor here (regulatory protein), but both mRNA's have the same cis acting sequence.
  • See Becker, figs. 23-33 & 23-34 if you are curious about the details.

*A question to think about: Regulatory protein binds to mRNA for protein A at 5' end (blocking initiation) and to mRNA for protein B at 3' end (blocking degradation). Given the information above, which is protein A, and which is protein B? Which one is ferritin and which one is the transferrin receptor? You can check your answer in Becker or using this diagram.

  • In the absence of heme, inhibition occurs, and translation is blocked. No globin produced.
  • Heme blocks the inhibition. Therefore, in the presence of heme translation proceeds. Heme relieves the block in translation, and globin is made.

2. Use of a regulatory RNA -- RNA interference (RNAi)

A. Trans acting factors can be RNA . Not all regulatory factors are protein -- some are short RNA's. (These are usually derived from double stranded RNA -- See Becker figs. 23-35 & 23-36.)

B. How does a short RNA affect translation?

(1). Inhibition (usual case): Small RNA binds to mRNA → Formation of double stranded RNA. This triggers degradation &/or inhibition of translation of the mRNA.

(2). Stimulation: Some recent cases have been discovered in which small RNA binds to mRNA and 'up regulates' translation. Mechanism so far unknown.

C. Use in Regulation: Cells naturally produce micro-RNA's that bind to mRNA's and regulate translation as above. The use of short regulatory RNA's to block translation appears to be important during regulation of development. (See Becker 23-36.)

NS. Use in the Lab as a tool: Called RNAi = RNA interference. The use of artificially added short double stranded (ds) RNA to block transcription * /translation and turn genes off is very common. (See Becker 23-35.) Enzymes of cell convert added ds RNA into short single stranded RNA that interferes with translation and/or transcription* as in b. Same effect as adding antisense RNA (but works better).

* We have concentrated on effects of RNAi on translation. However, some short RNAs inhibit transcription by affecting the state of chromatin -- they stimulate methylation of the histones and/or DNA.

VII. ER -- How does Co-translational Import Work?

A. Signal hypothesis -- How ribosomes get to the ER & Protein enters ER -- See handout 12C. Steps listed below refer to handout. See Becker fig. 22-16 or Sadava fig. 14.21 (12.16).

  • Role: temporarily blocks translation ferries nascent protein to ER.
  • Structure: SRP contains proteins + RNA = Large particle containing both ribonucleic acid & protein like a ribosome or spliceosome .
  • Helps attach ribosome to ER, so growing chain can enter pore (translocon) in ER.

3. How does Growing Chain enter ER? Takes two steps (3 & 4)

een . ER has SRP receptor . Receptor is also called docking protein. SRP binds to SRP receptor/docking protein, not directly to pore. (Step 3.)

B. ER has Translocon (gated pore or channel through membrane) which allows growing chain to pass through membrane as chain is made. Pore is closed until ribosome with growing chain gets into position.

Note on terminology: The term "translocon" is used in (at least) 2 different ways. Sometimes it is used to mean only the channel itself, and sometimes it is used to mean the whole complex of proteins required for translocation of proteins across the membrane -- the channel, SRP receptor, etc. It should be clear from context which usage is meant at any one time.

C . Ribosome/translocon complex formation occurs. (step 4 = complex step involving several events)

  • SRP is released, recycles -- GTP split
  • Ribosome binds to pore/translocon
  • Translocon opens & peptide enters (as loop).
  • Ribosome resumes translation.

NS. Role of Middleman. Middleman needed for entry into ER through translocon or entry into nucleus through nuclear pores. Processes probably similar. In each case there is a protein system with three components -- Protein with LS (NLS or SP) binds to "middle man" or "ferry proteins" (importins or SRP) which bind to pore. Additional proteins (that we will ignore) are required as well, and GTP is used to drive transport in both cases. See Becker fig. 18-30 for a model.

*A middle man protein is required to enter or exit the nucleus, but different ones are used in for entry vs exit. Exportin is needed to get out of the nucleus, while importin is needed to get in.

** This is how oplosbaar nuclear proteins are imported into the nucleus. Integral (transmembrane) proteins of the nuclear membrane (nuclear envelope) are probably made on the ER, and slide laterally into the outer & inner nuclear membranes (continuous with the ER). Once in place, TM proteins are anchored by binding to lamins or other internal nuclear proteins.

4. How does a new protein end up in the lumen?

Now try problem 3-13, especially part D. (If some of the parts are not obvious, wait until later.)

B. How do proteins cross or enter the ER membrane? (See handout 12D and/or fig. 22-17 of Becker)

1 . How proteins enter/pass through the membrane -- important points

A. SP probably forms loop not arrow. Loop enters channel (translocon) in membrane. SP loop is probably what opens (gates) the channel on the cytoplasmic side.

B. Protein enters as it is made. In humans, growing protein chains usually enter the ER as the chains are synthesized (co-translational import).

Note: In unicellular organisms, soluble proteins destined for the ER lumen often enter the ER after they are finished (post-translational import). Post translational import into the ER will be ignored here, but is covered at length in cell biology.

C . How do transmembrane proteins get anchored in the membrane? A hydrophobic sequence may trigger opening of the pore sideways, so protein slides out of pore, laterally, into lipid bilayer. These hydrophobic sequences are usually called 'stop-transfer' sequences and/or 'anchor' sequences.

NS. Where will protein end up? Protein can go all the way through the membrane and end up as a soluble protein in the lumen (as in example above, on 12B) of protein can go part way through and end up as a transmembrane protein. Depends on sequence of protein.

2 . Types of Proteins that can result (see handout 12D)

A. Soluble protein in lumen . Happens if protein passes all the way through the membrane and SP (on amino end) is removed, as above.

B. Integral membrane protein anchored in membrane by SP with no cytoplasmic domain. This happens if SP is on the amino end and is not removed.

C. Single Pass transmembrane protein -- get one of 2 possibilities:

(1). Type 1: Amino end is on lumen side of membrane (on E side) Carboxyl end is in cytoplasm (on P side of membrane)
One way this could happen: If SP is on amino end, and SP removed, and there is a hydrophobic sequence (acting as a stop-transfer or anchor sequence) in the middle of the peptide.

(2). Type 2: Carboxyl end is on lumen side of membrane (on E side) Amino end is in cytoplasm (on P side)
One way this could happen: If SP is in the middle, not on amino end. SP in this case is not removed -- it becomes the transmembrane domain of the protein. (SP doubles as stop-transfer or anchor sequence.)

NS. Multipass transmembrane protein. (Requires one SP and several hydrophobic (start/stop) sequences.

(1). Hydrophobic sequences can stop the process (of moving through pore) and anchor protein in membrane, as explained above.

(2). Hydrophobic sequence s in the middle of the peptide can restart looping → multipass protein. These are usually called "start-transfer" sequences (see 4).

(3). 'Start-transfer' and 'stop-transfer' sequences are probably equivalent. Role depends on where in protein they occur. (Both start- and stop-transfer sequences are also called 'topogenic sequences' as they determine the topology of the finished peptide.)

(4) A sequence that starts or restarts passage of a protein through the translocon is usually called a 'start transfer sequence' even if it also doubles as a stop or anchor in the membrane.

e. Lipid Anchored Proteins (FYI): Proteins to be anchored to lipids on the buiten of the plasma membrane are generally made as follows: Protein is made on RER and inserted into the ER membrane. After the protein reaches the plasma membrane, the extracellular domain is detached from the rest of the protein and attached to lipid. (Proteins to be anchored to the plasma membrane on the binnenkant are made on cytoplasmic ribosomes.) See Becker if you are curious about the details.

By now you should be able to do problems 3-1 to 3-3 & 3-4, A-B.

Next time -- What else happens in/on the ER? What happens in the Golgi?


Transcriptional networks in the nitrate response of Arabidopsis thaliana

Systems analyses allowed for the identification of TGA1/TGA4 and NAC4, important transcription factors controlling root system architecture in response to nitrate.

Nitrate controls rapid changes in transcript levels by post-translational activation of transcription factors including NLP7 and bZIP1.

Nitrate promotes nuclear retention of NLP7 to regulate gene transcriptional changes.

Nitrate induces rapid binding and transient interaction of bZIP1 and its targets.

Root system architecture modification in response to nitrate depends partly on transcriptional changes mediated by a network of nitrate-dependent transcription factors.

Nitrogen is an essential macronutrient for plants and its availability is a key determinant of plant growth and development and crop yield. Besides their nutritional role, N nutrients and metabolites are signals that activate signaling pathways that modulate many plant processes. Because the most abundant inorganic N source for plants in agronomic soils is nitrate, much of the work to understand plant N-signaling has focused on this nutrient. Over the last years, several studies defined a comprehensive catalog of nitrate-responsive genes, involved in nitrate transport, metabolism and a variety of other processes. Despite significant progress in recent years, primarily using Arabidopsis thaliana as a model system, the molecular mechanisms by which nitrate elicits changes in transcript abundance are still not fully understood. Here we highlight recent advancements in identifying key transcription factors and transcriptional mechanisms that orchestrate the gene expression response to changes in nitrate availability in A. thaliana.


Bekijk de video: lezing van broeder Aboe Ismail Ad Dadjaal (December 2021).