Informatie

Hoe maakte genoomduplicatie bij gewervelde dieren met kaken genspecialisatie mogelijk?


Ik lees momenteel uit hoofdstuk 15 in Principles of Life, 2e editie:

Veel genduplicaties beïnvloeden slechts één of enkele genen tegelijk, maar in sommige gevallen kunnen hele genomen worden gedupliceerd. Wanneer alle genen worden gedupliceerd, zijn er enorme kansen voor nieuwe functies om te evolueren. Dat is precies wat er lijkt te zijn gebeurd in de loop van de evolutie van gewervelde dieren. De genomen van de gewervelde dieren met kaken hebben vier diploïde sets van veel belangrijke genen, wat biologen ertoe brengt te concluderen dat twee genoombrede duplicatiegebeurtenissen plaatsvonden in de voorouder van deze soorten. Deze duplicaties maakten een aanzienlijke specialisatie mogelijk van individuele genen van gewervelde dieren, waarvan er vele nu zeer weefselspecifiek zijn in hun expressie.

Mijn vraag is: hoe maakt het dupliceren van een genoom nou precies specialisatie van genen mogelijk? Met andere woorden, nadat gewervelde dieren genoomduplicatie hadden ondergaan, hoe werd één kopie van het genoom "zeer weefselspecifiek"?


Met een enkelvoudig gekopieerd gen kunnen mutaties een vitale functie aantasten en zijn daarom vaak schadelijk en negatief geselecteerd. Onmiddellijk na een duplicatiegebeurtenis is er een mate van redundantie in de genfunctie en mutaties in één kopie die aanleiding geven tot nieuwe fenotypes worden gemakkelijker getolereerd omdat de voorouderlijke functie wordt behouden door het paraloge gen.

Wat leesvoer, als je daar zin in hebt:


Wikipedia:

Functionele divergentie

Functionele divergentie is het proces waarbij genen, na genduplicatie, in functie verschuiven van een voorouderlijke functie. Functionele divergentie kan resulteren in subfunctionalisatie, waarbij een paraloog zich specialiseert in een van verschillende voorouderlijke functies, of neofunctionalisatie, waarbij een totaal nieuw functioneel vermogen ontstaat.

Neofunctionalisatie

Na de genduplicatie zijn er twee identieke kopieën van het voorouderlijke gen die precies dezelfde functie vervullen. Door deze redundantie kunnen de kopieën een nieuwe functie krijgen.

Subfunctionalisatie

Specialisatie is een uniek model van subfunctionalisatie, waarbij paralogen zich opsplitsen in verschillende specialismen in plaats van in functie. In dit model vervullen beide genkopieën exact dezelfde voorouderlijke functie. Terwijl het voorouderlijke gen zijn functie bijvoorbeeld in alle weefsels, ontwikkelingsstadia en omgevingsomstandigheden heeft vervuld, worden de paraloge genen specialisten en verdelen ze zich over verschillende weefsels, ontwikkelingsstadia en omgevingsomstandigheden.


Kryuchkova-Mostacci N, Robinson-Rechavi M. 2016. Weefselspecificiteit van genexpressie divergeert langzaam tussen orthologen en snel tussen paralogen. PLoS-comput Biol 12:e1005274.

Het meest algemeen aanvaarde model is dat orthologen langzamer divergeren, en dat het genereren van paralogen door duplicatie leidt tot sterke divergentie en zelfs functieverandering.


Soria PS, McGary KL, Rokas A. 2014. Functionele divergentie voor elke paraloog. Mol Biol Evol 31:984-992.

Omdat genen kunnen worden beperkt door selectie op meer dan één fenotypisch niveau, zorgt de versoepeling van beperkingen na genduplicatie voor functionele divergentie (FD) langs meerdere fenotypische assen.


Evolutionaire analyse van twee complementaire C4-genen: oude duplicatie en conservering tijdens de evolutie van gewervelde kaken

Twee C4-isotypen werden gevonden in verschillende gewervelde dieren met kaken, waaronder haaien en vogels/reptielen.

C4-genduplicatie vond plaats in de vroege dagen van de evolutie van de kaken van gewervelde dieren.

Twee uiteenlopende C4-lijnen, genaamd H-lijn en D-lijn, werden gevonden in benige gewervelde dieren.

De genen van de D-lijn bevonden zich in een syntenisch gebied buiten MHC.

Bij zoogdieren ging de D-lijn verloren vóór soortvorming, maar bij sommige soorten of groepen werd D-type C4 geregenereerd.


Achtergrond

Peulvruchten zijn de op twee na grootste familie van angiospermen en omvatten veel dichtbevolkte soorten. De meeste peulvruchten bevatten symbiotische bacteriën in knobbeltjes in hun wortels die stikstofbinding bemiddelen en een voordeel bieden ten opzichte van concurrerende planten. Peulvruchtenzaden bevatten veel eiwitten en daarom zijn in de loop der jaren veel soorten gebruikt voor menselijke of dierlijke consumptie. Peulvruchten als geheel vormen de op een na grootste klasse van gewassen, waaronder erwten, sojabonen, pinda's en bonen. Gewone boon (Phaseolus vulgaris L.), een belangrijke eiwitbron die een aanvulling vormt op koolhydraatrijke rijst, maïs en cassave, is van fundamenteel belang voor de voeding van meer dan 500 miljoen mensen in ontwikkelingslanden [1]. Ook al is de oorsprong van P. vulgaris aangezien er jarenlang over een soort werd gedebatteerd [2, 3], suggereren recente studies dat het zijn oorsprong vond in Meso-Amerika [4] en vervolgens naar het Andesgebied in Zuid-Amerika migreerde, wat leidde tot twee wilde populaties of genenpools. Met behulp van een beperkt aantal loci werd de splitsing van beide genenpools 111.000 jaar geleden gedateerd [5], maar demografische gevolgtrekkingen met behulp van polymorfe locaties verspreid over het genoom resulteerden in een nauw interval van 146.000-184.000 jaar geleden [6]. Beide analyses geven aan dat de verspreiding van gewone bonen langs Amerika plaatsvond voorafgaand aan menselijke migraties. Meer dan 100.000 jaar na de splitsing van de genenpools van Meso-Amerika en Andes (

8200-8500 jaar geleden [7]), begonnen ten minste twee onafhankelijke domesticatie-evenementen, één per populatie, langzaam vormgevend wat we tegenwoordig kennen als gecultiveerde populaties en landrassen [8, 9]. De leeftijd van de Phaseolus stam clade (

6-8 miljoen jaar geleden [10]), de geschatte leeftijd van diversificatie van de Phaseolus bestaande soorten clades (

2 miljoen jaar geleden [10]), de verstreken tijd na de geografische isolatie van de twee genenpools, de continue domesticatieprocessen die gepaard gaan met populatieknelpunten [11], en het bewijs van genetische uitwisseling tussen wilde en gedomesticeerde subpopulaties [12– 14] openen verschillende vragen met betrekking tot de vorming van het gemeenschappelijke boongenoom (genduplicaties, genfamilie-uitbreidingen en de opkomst van polymorfismen) die uiteindelijk leidden tot de fenotypische eigenschappen die we waarnemen in moderne cultivars. De beschikbaarheid van de genoomsequenties van deze twee genenpools zou zeker bijdragen aan het begrip van deze complexe evolutionaire geschiedenis. In 2014, het eerste genoom van een Andes P. vulgaris landras werd gepubliceerd [6, 15]. Hier bepaalden we de volledige genoomsequentie van de P. vulgaris Meso-Amerikaanse kweeklijn BAT93, vergezeld van een gedetailleerde transcriptomische atlas van de verschillende bonenorganen en -weefsels door de gehele ontwikkeling van de plant. Ten slotte hebben we de evolutionaire geschiedenis van elk gemeenschappelijk boongen gereconstrueerd, over de twee variëteiten waarvan de sequentie is bepaald en andere plantensoorten waarvan de sequentie is bepaald.

Onze analyses maakten de identificatie mogelijk van een reeks peulvruchten- en P. vulgaris-specifieke coderende en niet-coderende genen, waaronder een kernset van geconserveerde lange niet-coderende RNA's van planten (lncRNA's). Door de analyse van de patronen van genexpressie in organen en ontwikkelingsstadia, identificeerden we orgaan- en stadiumspecifieke genen. We ontdekten dat, terwijl orgaanspecifieke eiwitcoderende genen overweldigend tot expressie worden gebracht in de wortels, orgaanspecifieke lncRNA's meestal specifiek zijn voor fruit. Consequent onthult onze analyse van co-expressienetwerken ook een belangrijke rol voor een paar nieuwe lncRNA's bij de ontwikkeling van fruit.

Door evolutionaire informatie over het transcriptionele landschap van BAT93 te leggen, ontdekten we dat genduplicatie weefselexpressie in peulvruchten heeft gevormd, waarbij het niveau van weefselspecialisatie toeneemt met zowel de tijd van divergentie als het aantal behouden duplicaten. Oude genen zonder paralogen hebben de neiging om een ​​brede expressie te hebben en vormen de meest nauw verbonden knooppunten in het co-expressienetwerk, terwijl recentelijk opgekomen genen en genen die behoren tot grote families met meerdere genen de neiging hebben om nauw tot expressie te worden gebracht, minder partners tot co-expressie hebben en worden geassocieerd met gespecialiseerde functies in specifieke weefsels. Gezien het feit dat de meeste boonspecifieke genfamilie-uitbreidingen die hierin zijn gedetecteerd dateren van vóór de splitsing van de Meso-Amerikaanse en Andes-genenpools, stellen we voor dat dit sleutelgebeurtenissen waren die een brede verspreiding van gewone boon in Amerika mogelijk maakten, waardoor deze soort vatbaar is voor menselijke ontdekking en verdere domesticatie . Al met al vormen de genomische, transcriptomische en evolutionaire kenmerken die uit onze studie zijn afgeleid een belangrijke bron om de gemeenschappelijke en specifieke sporen van de P. vulgaris genenpools, en om te begrijpen hoe leden van dezelfde soort zich hebben aangepast aan verschillende omgevingsomstandigheden, zoals die in de Andes- en Meso-Amerikaanse regio's.


Resultaten

Fylogenetische analyse van lamprei Noggin genen

De beschikbare databases van het lampreigenoom (gehele genoomcontigs van de poolprik, Lethenteron camtschaticum, en zeeprik, P. marinus) werden gebruikt om te zoeken naar vermeende lamprei-homologen van bekende Noggin familie genen. We hebben de screening kunnen vereenvoudigen omdat de lamprei Noggin coderende sequenties zouden vermoedelijk geen introns moeten bevatten, aangezien de afwezigheid van introns eerder werd aangetoond voor alle bekende Noggin genen in zowel ongewervelde als gewervelde dieren. Als gevolg hiervan onthulden we in de L. camtschaticum en de P. marinus genoom de volgende vier genen, die inderdaad geen introns hadden, met eiwitproducten die homologie vertoonden met de Noggin1, Noggin2 en Noggin4 beschreven in gnathostomen 9,17,18.

NogginA (L. camtschaticum contig 015835, sequentie-ID: APJL01043027.1 P. marinus isolaat dier nummer 11 contig 46719, Sequence ID: AEFG01046720.1)

NogginB (L. camtschaticum contig 045160, sequentie-ID: APJL01075429.1 P. marinus isolaat dier nummer 11 contig 47771, sequentie-ID: AEFG01047772.1)

NogginC (L. camtschaticum niet-geplaatste genomische scaffold scaffold00115, sequentie-ID: KE993786.1 P. marinus isolaat dier nummer 11 contig 36440, sequentie-ID: AEFG01036441.1) en

NogginD (L. camtschaticum contig 002783, sequentie-ID: APJL01035689.1 P. marinus isoleer diernummer 11 contig 9676, sequentie-ID: AEFG01009677.1).

Op basis van deze sequenties hebben we primers ontworpen en de cDNA's van volledige lengte van vier Noggin genen van rivierprik (Lampetra fluviatilis) Noggin genen. Volgens de beschikbare literatuur en onze eigen gegevens staat deze soort zeer dicht bij L. camtschaticum in termen van genomische sequenties en ontwikkelingskenmerken, terwijl de embryo's ervan veel toegankelijker zijn, althans in onze omstandigheden dan die van de laatste.

De uitlijning van de eiwitsequenties die door deze genen worden gecodeerd, toonde aan dat ze allemaal geconserveerde cysteïne-residuen hebben waarvan bekend is dat ze belangrijk zijn voor de vorming van functionele Noggin-dimeren 16,22 (aanvullende figuur 1).

Zoals we ook hebben onthuld, leek NogginA volgens maximale waarschijnlijkheid (ML) eiwitanalyse dichter bij gnathostome Noggin1 te liggen, terwijl NogginB en NogginC dichter bij Noggin2 leken te zijn. Aangezien de bootstrap-waarde die dergelijke clustering rechtvaardigt naar onze mening echter vrij laag is (<50%), zou het juister zijn om te spreken van een cluster- of wolkenhomologie van enerzijds de lamprei NogginA/B/C-eiwitten en gewervelde dieren met kaken. Noggin1/2 aan de andere kant. (Fig. 1a). Toevoegen van Echinodermata Noggin genen naar de boom of het gebruik van het Neighbor-joining (NJ) algoritme, maakt het beeld niet duidelijk (aanvullende figuur 2). Tegelijkertijd werd NogginD vol vertrouwen gegroepeerd met Noggin4. Bovendien had NogginD, de lamprei-ortholoog van Noggin4, aminozuursubstituties op posities die cruciaal zijn voor de binding van BMP, wat vermoedelijk de binding ervan met deze liganden zou voorkomen (aanvullende Fig. 1) 16,22.

EEN - Fylogenetische boom van Noggins is geconstrueerd met behulp van het Maximum Likehood-algoritme. AC Anolis carolinensis, vriendje Branchiostoma floridae, CI Ciona intestinalis, Dr. Danio rerio, GG Gallus gallus, HS Homo sapiens, LF Lampetra fluviatilis, LC Lethenteron camtschaticum, PM Petromyzon marinus XL Xenopus laevis, XT Xenopus tropicalis. B - syntenie van Noggin genen van zeeprik P. marinus (PM) en westerse klauwkikker X. tropicalis (XT).

In de hoop de fylogenetische relatie tussen lamprei en gewervelde dieren met kaken te verduidelijken Noggin genen, analyseerden we hun lokale genomische syntenie in de genomen van de lamprei P. marinus en de kikker Xenopus tropicalis. Als resultaat vonden we dat NogginA van P. marinus en Noggin1 van X. tropicalis beide hebben ten minste twee gemeenschappelijke genen die hun 3'-uiteinde flankeren, en in de' X. tropicalis genoom, ze zijn aangewezen C17ORF67 (ENSXETG00000007759) en synaptogyrine (Syngr2, ENSXETG00000007946). Deze bevinding geeft aan dat beide Noggin genen kunnen voortkomen uit een gemeenschappelijke voorouder, zoals voorspeld door de clusteranalyse.

Tegelijkertijd, NogginB en NogginC hebben ook naburige genen gemeen met X. tropicalis Noggin1, maar flankerend het 5'-uiteinde. Interessant, hoewel NogginC heeft twee genhomologen van X. tropicalis ANKFN (XM_018097804) en mmd (ENSXETG00000007598), NogginB grenst aan met alleen ANKFN. Met name de paraloog van de laatste, ANKFN1L (XM_002932447.4), werd gevonden nabij het 5'-uiteinde van X. tropicalis Noggin2. Alles bij elkaar genomen suggereren deze resultaten dat: NogginB en NogginC van P. marinus, net zoals Noggin2 van X. tropicalis, hebben waarschijnlijk een gemeenschappelijke voorouder met Noggin1 en NogginA maar ze vormen waarschijnlijk een andere tak van genen die van deze voorouder is afgeleid. Deze conclusie komt overeen met de resultaten van een clusteranalyse die enigszins aantrekt NogginA tot Noggin1 in één cluster en NogginB, NogginC tot Noggin2 in een ander cluster.

In contrast met NogginA, B en C, lamprei NogginD geen proximale genen heeft die homoloog zijn aan de genen naast Noggin1 in X. tropicalis. Echter, ten minste twee genen, homoloog aan nubp2 (ENSXETG00000010354) en KCNJ4 (ENSXETG00000010341) die flankeren X. tropicalis Noggin4, ook flankprik NogginD. Op basis van de gegevens van de ML-eiwitanalyse en het feit dat, vergelijkbaar met Noggin4, NogginD kenmerkende aminozuursubstituties heeft die vermoedelijk zijn binding aan BMP verhinderen, kan men met vertrouwen concluderen dat de lamprei NogginD is inderdaad de ortholoog van Noggin4 in gnathotomen.

De uitdrukking van lamprei Noggins in vroege ontwikkeling

Om de lamprei te vergelijken Noggins met hun homologen van gnathotomen en om hun fysiologische rol in de vroege ontwikkeling te voorspellen, onderzochten we hun temporele en ruimtelijke expressiepatronen.

De analyse van de temporele patronen van noggins' expressie werd uitgevoerd door real-time qPCR in de vroege stadia van Europese rivierprik (L. fluviatilis) ontwikkeling, beginnend vanaf fase 9 en doorlopend tot fase 26, volgens ref. 23 .

Als resultaat hebben we vastgesteld dat NogginA, NogginB en NogginC worden na bevruchting op zeer lage niveaus tot expressie gebracht, maar hun expressie begint toe te nemen vanaf het late neurulastadium - stadium 20 (Fig. 2). In tegenstelling tot, NogginD wordt uitgedrukt op ongeveer gelijke niveaus in alle geteste stadia (Fig. 2).

Stagenummers zijn aangegeven volgens ref. 24 .

De ruimtelijke expressiepatronen van Noggins werden geanalyseerd door hele berg ter plaatse hybridisatie. In deze experimenten analyseerden we Noggin expressie beginnend vanaf stadium 11 (late blastula-stadium volgens ref. 23 ) en tot het stadium van pre-ammocoete-larven (stadium 29), met behulp van anti-sense DIG-gelabelde mRNA-probes voor elk van Noggin genen van L. fluviatilis. Sense DIG-gelabeld Noggin mRNA's werden gebruikt als de controles.

Met name geen van de lamprei Noggin genen werden tot expressie gebracht in de blastula- of gastrula-stadia. In latere stadia leverde de analyse de volgende resultaten op.

een In stadium 17 NogginA is uitgedrukt in het caudale chordamesoderm. B, C In stadium 19 is de expressie in het gehele chordamesoderm behalve het meest voorste deel en in het dorsale gebied van de vermoedelijke hersenen, met uitzondering van het meest voorste deel. NS In stadium 22 vindt expressie plaats in de vloer en dakplaat van de neurale buis, in het notochord, in de somieten, in de processus wang en in het diencephalon, middenhersenen en achterhersenen. e–j In de stadia 23-25 ​​omvat het expressiepatroon somieten (l, J), boven- en onderlip (G), notochord, in verschillende hersengebieden: op de grens van telencephalon en diencephalon, in zona limitans intrathalamica, op de grens van het midden van de achterhersenen en in de achterhersenen (G, l). k, ik In stadium 18 NogginC wordt uitgedrukt in de 2 chordamesoderm-regio's: het voorste deel en het caudale deel. m In stadium 22 NogginC wordt gevonden in de notochord, neurale buis, faryngeale bogen, otic pits, wang proces en somieten. N In stadia 24 de uitdrukking van NogginC verschijnt in de voorhersenen en oogvisikels, boven- en onderlip. OQ In stadia 25 komen ook de cellen van de pijnappelklier (dwarsdoorsnede op P) tot expressie NogginC. R NogginC expressie in somieten in stadium 25. s, t In stadium 17 NogginD komt tot uiting in de neurale buis. jij, v In stadium 17 de uitdrukking van NogginD ontwikkelt zich door het hele neurale systeem op een diffuse manier en zwak in somieten. als anterieure intra-encefalische sulcus, ch optic chiasma di diencephalon, e oog, fb voorhersenen, h achterhersenen, hb habenula, hpt hypothalamus, ll onderlip, ul bovenlip, mes mesencephalon, MHB midden-achterhersenen grens, n notochord, ncc neurale lijstcellen , np neurale plaat, nt neurale buis, oc otische cup, op olfactorische placode, pg pijnappelklier, pha faryngeale boog, tel telencephalon, ZLI zona limitans intrathalamica.

een In stadium 25 NogginA wordt uitgedrukt in somieten, vooral in dorsale en ventrale hoeken, notochord, hypochord, neurale buis. B, C Dwarsdoorsneden, de doorsnedeniveaus worden weergegeven in (een). NS Gehele berguitdrukking van NogginA in fase 27. eG Saggitale doorsnede van embryo van stadium 27 onthult de expressie van NogginA op de grens van telencephalon en diencephalon langs de anterieure intra-encefale sulcus, in zona limitans intrathalamica en halverwege de hersengrens en in de ogen. HJ In de staartknop de uitdrukking van NogginA neemt toe in het notochord van de groeiende staart. De niveaus van dwarsdoorsneden worden weergegeven in (H). km In stadium 25 NogginC wordt uitgedrukt in somieten, notochord, neurale buis en premigrerende neurale lijstcellen. ik, m Dwarsdoorsneden, de doorsnedeniveaus worden weergegeven in (k). N Gehele berguitdrukking van NogginC in stadium27. OQ Saggitale secties onthullen de sterkere expressie in het ventrale deel van het telencephalon en zwakke expressie in ZLI en in otic cups. Rt in stadium 27 NogginC wordt uitgedrukt in somieten, notochord, neurale buis op rompniveau (s), maar in de groeiende staart (t) het onthult op een hoog niveau in de centrale (ventriculaire) zone van de neurale buis. De niveaus van dwarsdoorsneden worden weergegeven in (R). Voor afkortingen zie Fig. 3.

NogginA expressie werd voor het eerst gedetecteerd in het vroege neurula-stadium (st. 17) in het caudale chordamesoderm (figuur 3a). In het late neurula-stadium (st. 19-20) werd de expressie van dit gen gevonden in het gehele chordamesoderm, behalve in het meest voorste gebied (figuur 3b, c). In aanvulling, NogginA expressie werd waargenomen in het dorsale gebied van de vermoedelijke hersenen, met uitzondering van het meest voorste deel (figuur 3b).

In het stadium van hoofduitgroei (st. 22) is de uitdrukking duidelijk zichtbaar in de bodemplaat van de neurale buis, in het notochord, in de somieten, in het wangproces en in het diencephalon, middenhersenen en achterhersenen (Fig. 3d ).

Het expressiepatroon stabiliseert in de stadia 23-25 ​​en omvat somieten, boven- en onderlip, notochord (behalve het voorste deel) en hypochord (figuren 3e-h, 4b, c). Zoals waargenomen bij dwarsdoorsneden, is de expressie in deze stadia gelokaliseerd aan de dorsale en ventrale randen van de somieten. In het ruggenmerg zijn de cellen van de ventriculaire zone gekleurd (Fig. 4a-c). In de hersenen, de expressie van NogginA komt voor in verschillende gebieden: op de grens van telencephalon en diencephalon, in de regio van zona limitans intrathalamica (ZLI) die de ventrale en dorsale delen van het diencephalon en aan de rand van de middenhersenen en achterhersenen scheidt (figuren 3i, 4d, e). Belangrijk is dat, aangezien bekend is dat ZLI en de grens van het midden van de achterhersenen secundaire organisatoren zijn van de zich ontwikkelende hersenen, men kan veronderstellen dat NogginA speelt een rol als een van de factoren die door deze organisatoren worden uitgescheiden. Bovendien is de uitdrukking van NogginA wordt gezien in de randen van sommige rhombomeren in de achterhersenen. In al deze hersengebieden wordt expressie gevonden in cellen van het dak en de vloerplaten van de neurale buis. In stadium 27 verschijnt de uitdrukking in de zich ontwikkelende ogen en in de faryngeale bogen (figuur 4f, g).

Interessant is dat in de loop van de ontwikkeling het patroon van NogginA uitdrukking in het notochord verandert op de volgende manier. In de vroege stadia (st. 17-21) wordt dit gen door het hele notochord tot expressie gebracht. Daarna, vanaf stadium 22, verdwijnt de expressie in het voorste deel van het notochord terwijl het sterk blijft in het gebied van de achterhersenen en geleidelijk verzwakt naar het caudale deel van het embryo. Ten slotte wordt, beginnend bij het stadium van de staartknop (st. 26-27), een toename van de expressie in het notochord van de groeiende staart waargenomen (figuur 4d, h-j). Het laatste expressiepatroon wordt gehandhaafd tot stadium 29.

een, e In stadium 17 NogginB wordt uitgedrukt in het voorste uiteinde van de neurale buis. B, F In stadium 18 zijn uitdrukking wordt versterkt in de vermoedelijke voorhersenen en achterhersenen en verzwakt in het dorsale deel van de vermoedelijke middenhersenen. C, NS, G, H In etappe 19-21 de NogginB uitdrukking richt zich op de vermoedelijke voorhersenen (C, G) en in de meest dorsale cellen van de neurale buis (D, H) vermoedelijk - premigrerende neurale lijstcellen. lR In stadium 22-25 NogginB expressie blijft bestaan ​​in het telencephalon en in het ventrale diencephalon en zoals te zien is op transversale secties (Q, R) in de premigrerende neurale lijstcellen. s Gehele berguitdrukking van NogginB in fase 27. t Saggitale doorsnede van embyo van stadium 27 onthullen NogginB expressie in de dorsale en ventrale delen van het telencephalon en in het preoptische gebied van de hypothalamus. jijmet wie horizontale doorsnede van het embryo van stadium 27. De sectieniveaus worden getoond in S. x, ja NogginB uitdrukking in stadium 28. Voor afkortingen zie Fig. 3.

De eerste uitdrukking van NogginB werd onthuld door ter plaatse hybridisatie in het vroege neurulastadium (st. 17) in het voorste uiteinde van de neurale buis (Fig. 5a, e). Vermoedelijk zullen deze cellen zich ontwikkelen tot de neurale lijst of telencephalon. In het middelste neurula-stadium (st. 18) wordt de expressie versterkt in de gehele vermoedelijke voorhersenen en achterhersenen en blijft in het ventrale deel van de vermoedelijke middenhersenen (figuur 5b, f). Tegen het late neurulastadium (st. 19-20), de expressie van NogginB neemt toe in de voorhersenen, terwijl de expressie ervan in het dorsale deel van de achterhersenen zich naar het achterste deel uitbreidt en verzwakt (figuur 5c, g).

In het hoofduitgroeistadium (st. 21-23), NogginB wordt uitgedrukt in het gebied van de vermoedelijke voorhersenen en in individuele cellen aan de dorsale zijde van de neurale buis van de kop tot de staart, vermoedelijk - premigrerende neurale lijstcellen (Fig. 5d, h, n). In de stadia 24-29 blijft sterke expressie bestaan ​​​​in de dorsale en ventrale delen van het telencephalon en in het preoptische gebied van de hypothalamus (Fig. 5s-w).

In de neurale lijstcellen aan de dorsale zijde van de neurale buis, NogginB wordt symmetrisch uitgedrukt in stadium 27 in individuele cellen in het midden van de achterhersenen en in het ruggenmerg (Fig. 5o-y)

Samenvattend kan men zeggen dat: NogginB komt voornamelijk tot uiting in de evolutionair jongere structuren, namelijk in cellen van de neurale lijst en het telencephalon, die tijdens de evolutie voor het eerst verschenen bij gewervelde dieren.

In het neurula-stadium (st. 18-19), de expressie van NogginC verschijnt in twee chordamesoderm-domeinen: één in het toekomstige hoofd en één in het caudale gebied (Fig. 3k, l). Vervolgens wordt in het late neurulastadium (st. 20) de expressie gedetecteerd in het chordomesoderm van de romp, in het achterhersengebied en in de cellen van de neurale lijst.

In het hoofduitgroeistadium (st. 22), NogginC wordt gevonden in het rompgedeelte van het notochord, vooral in de cellen van het staartgebied, in de somieten, faryngeale bogen, wangproces, otic pits en cellen van de neurale lijst (Fig. 3m, 4l, m). Later, in stadia 24-25, wordt de uitdrukking van NogginC verschijnt in de voorhersenen en in de pijnappelklier (Fig. 3n-r). Zwakke kleuring werd ook waargenomen in het ZLI-gebied van het diencephalon.

In het stadium van de staartknop (st. 27), de uitdrukking van NogginC in het telencephalon wordt meer uitgesproken in het ventrale deel en neemt geleidelijk af naar het dorsale deel (Fig. 4o). Expressie in de oren werd gedetecteerd, maar het endolymfatische kanaal was niet gekleurd (figuur 4p, q). In de groeiende staart werd een hoog expressieniveau waargenomen in de centrale (ventriculaire) zone van de neurale buis, waarvan bekend is dat neurale cellen actief prolifereren (Fig. 4r-t). Dit expressiepatroon wordt gehandhaafd tot stadium 29.

Het is dus opmerkelijk dat het expressiepatroon van NogginC overlapt gedeeltelijk de expressiepatronen van NogginA en NogginB. De expressie in unieke structuren van gewervelde dieren - telencephalon en neurale lijstcellen - was vergelijkbaar voor NogginC en NogginB.

De uitdrukking van NogginD, vergelijkbaar met de uitdrukking van andere lamprei Noggin genen, wordt voor het eerst gedetecteerd vanaf het vroege neurula-stadium (st. 17), maar in tegenstelling tot het laatste heeft het een diffuus karakter, waardoor het gelijkmatig over de neurale plaat wordt verdeeld (Fig. 3s, t). In de volgende ontwikkelingsstadia, tot aan het pre-ammocoete-stadium (st. 29), observeerden we ook zwakke diffuse kleuring door het hele neurale systeem en somieten (Fig. 3u, v). Er werd geen expressie gevonden in het notochord.

In het algemeen kan worden opgemerkt dat de expressiepatronen van de lamprei Noggin genen hebben veel overeenkomsten met de expressiepatronen van hun homologen in andere gewervelde dieren, met name die van X. laevis 17 . Dus de uitdrukking van NogginA in het diencephalon, middenhersenen en achterhersenen, evenals in de mesodermderivaten, notochord en somieten, lijkt vergelijkbaar te zijn met de expressie van Xenopus Noggin1. De uitdrukking van NogginB in de voorhersenen is vergelijkbaar met die van Noggin2. Tegelijkertijd is het expressiepatroon van NogginC heeft veel overlappende kenmerken met de expressiepatronen van NogginA en NogginB. Eindelijk, de uitdrukking van NogginD, met zijn karakteristieke diffuse patroon, lijkt sterk op dat van Noggin4.

Lamprey Noggins induceren secundaire lichaamsassen in X. laevis embryo's

Om te begrijpen in hoeverre de fysiologische functies van de lamprei Noggins vergelijkbaar zijn met die van eerder beschreven Noggins bij andere gewervelde dieren, hebben we hun vermogen onderzocht om de vorming van een extra lichaamsas te induceren in X. laevis embryo's ventraal geïnjecteerd in het 8-cellige blastomeerstadium met mRNA's die coderen voor deze vier lamprei's Noggins. Het vermogen om extra axiale structuren te vormen in het geval van ventrale expressie in de X. laevis embryo's werd eerder getoond voor Xenopus Noggin1 en Noggin2 15,24,25 . Daarentegen heeft Noggin4 dit vermogen niet vanwege het onvermogen om BMP16 te binden.

Als gevolg hiervan ontdekten we dat NogginA, NogginB en NogginC de vorming van extra lichaamsassen veroorzaakten, wat in veel gevallen leidde tot een voorhersenen met ogen (Fig. 6, Aanvullende Fig. 2). Interessant is dat terwijl NogginB in het hoogste percentage van de gevallen de ontwikkeling van een voorhersenen met ogen induceerde (13%, N = 92), genereerde NogginC secundaire assen met een voorhersenen en ogen in het laagste percentage gevallen (2%, N = 98), terwijl NogginA volgens dit criterium de middenpositie innam (5%, N = 87). Deze bevindingen bevestigen het vermogen van de lamprei Noggins om secundaire assen te induceren en zijn consistent met de waargenomen homologie van deze eiwitten met de gewervelde Noggin1 en Noggin2, die vergelijkbare eigenschappen hebben, zoals eerder beschreven 15 .

Micro-injecties van mRNA's van lamprei NogginA (een, B), NogginB (C, NS) en NogginC (e, F) in embryo's van X. laevis veroorzaakt de vorming van secundaire assen, inclusief voorhoofdige structuren zoals mRNA van X. laevis Noggin2 (l, J). Zie aanvullende figuur 3 voor het percentage secundaire as- en secundaire hoofdstructuren. NogginD (G, H) induceert geen secundaire assen.

Tegelijkertijd was NogginD, de vermoedelijke ortholoog van Noggin4, niet in staat secundaire assen te induceren, vergelijkbaar met de laatste 16 (Fig. 6g, h).


Discussie

De "2R"-hypothese, gewijzigd van Ohno (1970), kan worden samengevat door het idee dat grote duplicatiegebeurtenissen specifiek plaatsvonden in chordaatgenomen vóór de opkomst van benige gewervelde dieren. Deze hypothese voorspelt dat duplicaties zich in een korte periode hadden moeten voordoen, in veel grotere aantallen dan in de voorgaande of volgende perioden. Deze voorspelling wordt gedeeld door recentere hypothesen dat er mogelijk één genoomduplicatie en één grote golf van segmentale duplicaties is geweest (Gu, Wang en Gu 2002 McLysaght, Hokamp en Wolfe 2002 Panopoulou et al. 2003). De begintijd is relatief goed vastgesteld, met onderzoeken die aantonen dat genduplicaties optraden na de cephalochordaat/gewervelde splitsing en zowel voor als na de gnathostome/kaakloze gewervelde splitsing (Penisi 2001 Wolfe 2001 Abi-Rached et al. 2002 Escriva et al. 2002 Gu, Wang en Gu 2002 McLysaght, Hokamp en Wolfe 2002 Panopoulou et al. 2003), maar deze studies gaven geen eindtijd aan deze gebeurtenissen. Gezien de prevalentie van genduplicaties bij actinopterygische vissen (Wittbrodt, Meyer en Schartl 1998 Robinson-Rechavi et al. 2001 Taylor et al. 2001), roept dit de vraag op of er werkelijk iets specifieks is gebeurd aan de oorsprong van gewervelde dieren of dat genduplicaties zijn een veelvoorkomend fenomeen geweest in de evolutionaire geschiedenis van chordaten, met uitzondering van sarcopterygiërs.

Het is inderdaad opmerkelijk dat er geen melding is gemaakt van genoomduplicaties die voorouderlijk zijn voor sarcopterygiërs (Penisi 2001 Wolfe 2001 Durand 2003) of voor een van de goed bestudeerde groepen daarin (bijv. Tetrapoden, zoogdieren of sauropsiden). Onze eigen gegevens komen overeen met eerdere waarnemingen ( Robinson-Rechavi et al. 2001 Taylor et al. 2001) dat dubbele genen significant minder overvloedig zijn bij sarcopterygiërs dan bij actinopterygiërs. Analyse van chordaatgegevens van ongewervelde dieren geeft ook aan dat genduplicaties niet overvloedig voorkomen in deze geslachten (Dehal et al. 2002 Panopoulou et al. 2003).

Vergelijking van MHC-geassocieerde genen gaf beperkt bewijs voor duplicaties voordat de chondrichthyan/teleostoom zich splitste van twee genen (Abi-Rached et al. 2002). Onze resultaten laten zien dat dit patroon algemeen is, waarbij bijna alle vertebraatspecifieke genduplicaties plaatsvinden vóór de chondrichthyan/teleostome-splitsing (tabel 1). Dit, toegevoegd aan al het eerder gepubliceerde bewijsmateriaal, impliceert drie golven van gen- of genoomduplicaties, twee tussen de cephalochordaat-splitsing en de chondrichthyan-splitsing en de andere in actinopterygische vissen, gescheiden door een periode van "duplicatierust" van ongeveer 45 Myr (die voortgezet voor 400 Myr in tetrapoden), wat, hoewel kort, significant is. Een belangrijke voorspelling van Ohno's (1970) oorspronkelijke hypothese, die van intense gen- of genoomduplicatieactiviteit vóór de oorsprong van gewervelde dieren, wordt dus bevestigd door de studie.

Bovendien laten onze resultaten zien dat deze genduplicaties alle gewervelde dieren met kaken karakteriseren en een vergelijkbare genetische complexiteit voorspellen in haaien en roggen als in tetrapoden. Er worden consistente resultaten gevonden voor de evolutie van hox-clusters, die een direct verband tussen blokduplicaties en morfologische aanpassingen mogelijk maken. Hoewel hox-genen zeer slechte fylogenetische markers zijn, zoals geïllustreerd door de moeilijkheid bij het oplossen van de gebeurtenissen die hebben geleid tot de verschillende clusters van gnathostomes en prikken (Force, Amores en Postlethwait 2002 Irvine et al. 2002), duiden gedeeltelijke sequenties van de hoornhaai op dat de duplicaties die leidden tot vier hox-clusters in teleostomen plaatsvonden vóór de chondrichthyan / teleostome-divergentie (Kim et al. 2000). Bovendien zijn hoornhaaien en menselijke hoxA-clusters opmerkelijk geconserveerd (Chiu et al. 2002). Hox-clusteranalyse en onze fylogenetische resultaten zijn dus consistent in het vaststellen van geen verband tussen genduplicaties en de grotere diversiteit van benige gewervelde dieren dan van kraakbeenachtige gewervelde dieren.

Hoewel de basale vertakking van chondrichthyans bij gewervelde dieren met kaken als buitengewoon goed wordt ondersteund door morfologische en paleontologische gegevens (Janvier 1996), suggereert de analyse van volledige mitochondriale sequenties een heel andere fylogenie, met vertakkingen van chondrichthyans bij vissen met beenstraalvin (Actinopterygii) ( Rasmussen en Arnason 1999). Dit verrassende resultaat is door geen enkele andere gegevensbron bevestigd, en moleculaire fylogenieën op basis van nucleair gecodeerde genen zijn ofwel niet informatief (Martin 2001 deze studie) of ondersteunen sterk de conventionele vertakkingspositie van chondrichthyans (Takezaki et al. 2003). In ieder geval laten onze resultaten zien dat verdubbeling van gewervelde genen plaatsvond vóór de divergentie tussen chondrichthyans, actinopterygians en sarcopterygians, ongeacht de volgorde van deze laatste gebeurtenissen.

Onze resultaten staan ​​haaks op een recente studie die een vergelijkbare benadering gebruikte, waarbij genduplicaties werden bepaald op basis van hun fylogenetische positie ten opzichte van soortvorming (Friedman en Hughes 2003). Er zijn verschillende verschillen tussen onze methodologie en die van Friedman en Hughes, maar het belangrijkste verschil is het criterium voor het classificeren van genduplicaties binnen speciatie-intervallen. We beschouwen genen alleen als gedupliceerd binnen een bepaald interval (dwz tussen chordaatdiversificatie en de chondrichthyan/teleostome-splitsing) als alle relevante taxonomische groepen (en dus speciaties) in de genenboom zijn vertegenwoordigd (dwz een urochordaat of een cephalochordaat, een chondrichthyan en een teleostoom). Friedman en Hughes (2003) classificeren duplicaties zodra ze kunnen worden gedateerd voor of na één soortvorming. Bovendien gebruikten ze zeer verre dateringspunten (d.w.z. de primaat/knaagdier, amniote/amfibie en deuterostome/protostome splitsingen). Het is onduidelijk waarom ze geen duplicaties hebben gedateerd ten opzichte van de actinopterygische / sarcopterygische splitsing, omdat deze soortvorming relevanter zou zijn geweest voor de "2R" -controverse, terwijl ze profiteerden van genoomgegevens. Aangezien amfibieën de enige betrokken lijn zijn waarvoor geen genoomsequentie beschikbaar is, kan dit ertoe leiden dat ze in de categorie "vóór primaten/knaagdieren" genduplicaties opnemen die plaatsvonden vóór de splitsing van amfibieën / amniote, maar waarvoor ze geen amfibiesequenties hebben in de boom. Dit kan op zijn beurt een vooroordeel introduceren in hun argument dat de overvloed aan duplicaties "vóór primaten/knaagdieren" versus "vóór amniote / amfibieën" bewijs is tegen een piek van genduplicaties bij de oorsprong van gewervelde dieren. Wij zijn van mening dat in onze studie, de verdeling van de sequenties in belangrijke taxonomische eenheden en onze scheiding van de resultaten volgens de gebruikte outgroup-sequenties (tabel 1), onze resultaten beschermen tegen dergelijke vooroordelen. De verschillen in de conclusies tussen die studie (Friedman en Hughes 2003) en de onze weerspiegelen dus waarschijnlijk verschillende steekproefstrategieën.

Een interessante nevenobservatie van onze dataset is dat waarnemingen van genduplicaties bij de oorsprong van gewervelde dieren, en meer recentelijk in de actinopterygische of sarcopterygische lijn, gecorreleerd lijken. Dit kan het resultaat zijn van bijvoorbeeld bemonstering, betere detectie van duplicaties in meer bestudeerde genen. Als alternatief kan het erop wijzen dat de functie van bepaalde genen ze vatbaarder maakt voor persistentie als dubbele kopieën. Een dergelijke tendens is inderdaad recentelijk aangetoond in gisten, waar bepaalde genen onafhankelijk worden behouden als duplicaten in verschillende soorten (Hughes en Friedman 2003).

Deze studie en andere recente studies schetsen een steeds nauwkeuriger beeld van gen- of genoomduplicatiegolven in chordaten (fig. 3), hoewel er nog vragen blijven. Van de zes takken van de akkoordboom waarvoor voldoende gegevens beschikbaar zijn, worden er drie gekenmerkt door overvloedige bewaring van dubbele genen, allemaal bij gewervelde dieren.Op basis van chromosoomtellingen is ook gesuggereerd dat polyploïdie een belangrijke rol speelde in de evolutie van de lamprei (Potter en Rothwell 1970). Natuurlijk is het waarschijnlijk dat er continu kleinschalige duplicaties zijn geweest op alle takken van de boom (Lynch en Conery 2000 Gu, Wang en Gu 2002). Grootschalige duplicaties lijken echter vaak voor te komen in de evolutie van gewervelde dieren, en de takken waar ze afwezig zijn, zoals de oorsprong van benige gewervelde dieren, lijken eerder uitzondering dan regel.

Huidig ​​adres: Joint Center for Structural Genomics, University of California, San Diego, La Jolla.


Conclusie

Positieve correlaties tussen paraloge genverrijking en cel- of weefseldiversificatie zoals waargenomen bij metazoa-soorten werden voorgesteld om de opkomst van multicellulariteit te verklaren (Lynch en Conery 2003). In overeenstemming, onze resultaten laten zien dat RTK-amplificaties plaatsvonden tijdens de WGD's van gewervelde dieren, wat mogelijk de basis vormt voor specifieke evolutionaire innovaties. Aangezien RTK's betrokken zijn bij celproliferatie, overleving, adhesie, migratie en differentiatie en meer in het algemeen ontwikkeling via regulerende netwerken, biedt ons werk een basis voor vergelijkende expressie en functieanalyse voor een beter begrip van de diversificatie van celmetabolisme en de ontwikkelingscomplexiteit in gewervelde dieren.


Methoden:

Volgorde aanbrengen in

ENO- en FBA-cDNA's voor bichir Polypterus ornatipinnis, steur Acipenser baerii en caeciliaans Typhlonectes natans werden gesequenced met behulp van gedegenereerde primers ontworpen op basis van aminozuuruitlijningen van eerder bekende sequenties en de snelle amplificatie van cDNA-uiteinde (RACE) methode om volledige coderende sequenties te verkrijgen. Totaal RNA werd uit spierweefsel geëxtraheerd, vers ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80°C. Extracties werden uitgevoerd met Trizol (Gibco, Duitsland). cDNA-syntheses van de eerste streng werden uitgevoerd met behulp van de First Strand-synthesekit volgens de handleiding van de fabrikant (Gibco, Duitsland). Een c-tailing stap werd toegevoegd om 5' RACE mogelijk te maken. Fragmenten werden geamplificeerd met behulp van gedegenereerde primers op basis van de aminozuursequenties van eerder gerapporteerde sequenties. Zie tabel 1 voor sequenties van gedegenereerde primers. Amplificatie werd uitgevoerd in reacties van 50 l met 0,5 eenheden RedTaq (Sigma, Duitsland), RedTaq-reactiebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,1 mM MgCl2, 0,01% gelatine), 0,2 μM van elke primer (MWG-Biotech AG, Duitsland, 0,4 mM dNTP's (Peqlab Biotechnology, Duitsland) en 0,5 mM MgCl2. Cyclusomstandigheden omvatten een initiële denaturatiestap van 94°C, daarna 35 cycli van 94°C gedurende 10 seconden, 42°C gedurende 1 minuut en 72°C gedurende 2 minuten. De laatste verlenging werd gedurende 5 minuten bij 72 °C uitgevoerd. PCR-producten werden ofwel direct ofwel, in het geval van meerdere banden, gezuiverd door banden van 1% agarosegels te knippen en met behulp van het QIAGEN-spinsysteem. 3' RACE-reacties werden uitgevoerd met geneste benaderingen van twee sequentiespecifieke primers en de korte Not-I-primer (AAC TGG AAG AAT TCG CGG CC). 5'RACE werden voorgevormd met geneste sequentiespecifieke primers en de oligo-G-primer die de c-staart aan het 5'-uiteinde van het cDNA bindt (CTA GTA CGG GII GGG IIG GG). Sequenties werden bevestigd door amplificatie en sequentiëring van beide strengen van de volledige coderende sequenties door specifieke primers die zich in de 5'- en 3'-niet-coderende gebieden bevinden. Cyclussequencing werd uitgevoerd met behulp van de ABI-sequencingmix en 35 cycli van 94°C gedurende 10 seconden, 42°C - 50°C gedurende 10 seconden en 68°C gedurende 4 minuten. Sequenties werden uitgevoerd op een ABI3100 capillaire sequencer. Sequenties werden proefgelezen en geassembleerd met behulp van Sequence Navigator [102].

Databasezoekopdrachten en sequentieanalyses

Eiwitsequenties van kogelvissen (Tetraodon nigroviridis, Takifugu rubripes) zebravis (Danio rerio), menselijk (Homo sapiens), muis (Mus musculus), Rat (Bruine rat) kip (Gallus gallus), klauwkikkers (Xenopus laevis, Xenopus tropicalis), steur (Acipenser baerii), blindedarm (Typhlonectes natans), bichir (Polypterus sp.), lamprei (Lethenteron sp, Eptatretus burgeri), haai (Cephaloscyllium umbratile), en straal (Potamotrygon motor) werden verkregen uit de Ensembl-database [103] of door het uitvoeren van BLAST (BLASTp en vertaalde BLAST) zoekopdrachten [104] tegen GenBank. Alle toetredingsnummers staan ​​vermeld in de aanvullende gegevens. Sequenties werden uitgelijnd met Clustal X [105]. Voor elke alignering werd een voorlopige boom getekend. Deze boom vergemakkelijkte de identificatie van identieke sequenties, sequenties die alleen in lengte varieerden, en meerdere sequenties binnen soorten die slechts enkele aminozuren verschilden, die allemaal uit de uitlijning werden verwijderd. Ontwerpbomen werden gereconstrueerd uit de resterende sequenties met behulp van Poisson-gecorrigeerde genetische afstanden en het algoritme voor het samenvoegen van buren [106] in MEGA 3.0 [107]. Als daaropvolgende fylogenetische onderzoeken een indicatie gaven voor visspecifieke genduplicatie, werden aanvullende BLAST-zoekopdrachten uitgevoerd om meer vermeende actinopterygische kopieën te vinden. Op enkele uitzonderingen na werden menselijke "referentiesequenties" [108] gebruikt als zoekreeksen voor de BLAST-zoekopdrachten. Soorten werden één voor één onderzocht om de identificatie van een daling in sequentie-overeenkomst te verbeteren, die werd gebruikt als een "cut-off" -criterium.

Als outgroup-reeksen gebruikten we gegevens van Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster en Ciona intestinalis. In één geval (GAPDH) gebruikten we gegevens van: Schistosoma mansoni en Crassostrea gigas als outgroup-sequenties. In een ander geval (PGK) hebben we de dataset uitgebreid met eiwitsequenties van Oryzias latipes, Lepisosteus osseus, Rana sylvatica, Equus caballus, Sus scrofa, Bos Stier en Macropus eugenii. Aminozuurgegevens werden geanalyseerd met behulp van PHYML [109] en het maximum-waarschijnlijkheidsmodel (ML), en parameters werden gekozen op basis van ProtTest [110]-analyses. Het vertrouwen in geschatte relaties van ML-boomtopologieën werd geëvalueerd door een bootstrap-analyse met 500 replica's [111] en Bayesiaanse methoden voor fylogenie-inferentie. Bayesiaanse analyses werden gestart met willekeurige zaadbomen en werden gedurende 200.000 generaties uitgevoerd. De Markov-ketens werden bemonsterd met tussenpozen van 100 generaties met een inbranding van 1000 bomen. Bayesiaanse fylogenetische analyses werden uitgevoerd met MrBayes 3.1.1 [112].


Resultaten

Transcriptoom van de kleine gevlekte kathaai

Ion Proton-sequencing leverde 134.841.605 reads op, waaruit drie Trinity-assemblies op basis van steeds complexere kwaliteitsfilterstrategieën werden gegenereerd: RAW, MCF en HTMCF, die respectievelijk 623.430, 621.635 en 167.255 contigs bevatten (zie tabel 1 voor uitgebreide statistieken voor contigs > 300 bp ). Vergeleken met de MCF- en RAW-datasets produceerde de HTMCF-dataset een verminderd aantal contigs (Tabel 1), een groter aantal complete single-copy BUSCO's (Tabel 2) en een hogere N50 contig-lengte (Tabel 1), wat suggereert dat meer strenge filtering van lees- en basiskwaliteit verbetert de contiguïteit van de assemblage. De RAW- en MCF-assemblages bevatten echter minder ontbrekende BUSCO's, wat suggereert dat nieuwe gegevens verloren zijn gegaan van de HTMCF-assemblage (tabel 2).

Vergelijking met bestaande catshark-datasets suggereerde dat het totale aantal transcripties en bases in onze assemblages groter is dan elders gegenereerd (tabel 1). Alle assemblages missen enkele BUSCO's, maar de MEA-assemblage bevat de minste ontbrekende BUSCO's. Zowel de MEA (lever, pancreas en hersenen [30]) als KEA (gepoolde embryo [6]) datasets werden gesequenced op het Illumina-platform, wat de mogelijkheid vergroot dat het verhoogde aantal transcripten in onze assemblages is gekoppeld aan de verhoogde foutenpercentages onder Ion Torrent-sequencing [91, 92]. Bovendien is de schijnbare verhoogde contiguïteit van de MEA-assemblage waarschijnlijk te wijten aan het gebruik van gepaarde uitlezingen, wat hier niet is gedaan. Biologische verklaringen zijn ook mogelijk voor de verschillen, zoals de introductie van extra sequenties en splitsingsvarianten uit meerdere weefsels [93], of de opname van zeer laag tot expressie gebrachte transcripten, als gevolg van normalisatie.

Over het algemeen zullen een combinatie van sequentiebenaderingen en biologische verschillen waarschijnlijk de geninhoud van elke assemblage aanzienlijk beïnvloeden. Om deze reden werden alle vijf assemblages overgedragen om een ​​robuuste zoektocht naar T-cel-geassocieerde genen in kraakbeenvissen mogelijk te maken.

CD4+ T-cel-subset-definiërende genen in kraakbeenvissen

Om de T-celbiologie in kraakbeenvissen beter te begrijpen, gebruikten we op BLAST en HMM gebaseerde zoekopdrachten van alle vijf kleine gevlekte kathaai-assemblages, evenals transcriptomen van blauwe haai en doornhaai, en het voorspelde proteoom van walvishaai, voor de IL's en IL-R's het definiëren van die T-cel-subsets die zijn gerapporteerd als vermist in olifantshaai [5]. Deze zoekopdrachten konden vermeende homologen van IL-2 of zijn receptor IL-2R, IL-5, IL-9 of RORC niet identificeren. We hebben echter vermeende sequenties geïdentificeerd voor IL-4/IL-13, IL-21, IL-23, IL-27 (p28), IL-6Rα, IL-23R en FOXP3. De aanwezigheid van de IL- en IL-R-sequenties was variabel tussen soorten en tussen catshark-transcriptoomdatasets (tabel 3). Om de orthologie van deze sequenties te verifiëren, verzamelden we uitgebreide datasets voor elk gen samen met verwante familieleden en voerden we uitgebreide fylogenetische analyses uit.

Site heterogene mengselmodellen leggen plaatsspecifieke evolutionaire processen vast in immuungenen waar standaardmodellen falen

De relatieve fit van empirische mengselmodellen werd getest voor elk van de verzamelde datasets, omdat deze modellen mogelijk beter passen bij de complexe evolutionaire geschiedenis van snel evoluerende genen. Eenvoudige empirische CAT-modellen waren nooit beter passend dan standaard site-homogene modellen voor elke dataset volgens de BIC (tabel 4). Wanneer deze echter werden gecombineerd met een standaardmodel (d.w.z. JTT, WAG of LG), resulteerde dit in een verbeterde pasvorm ten opzichte van standaardsubstitutiemodellen voor de IL-6-superfamilie, klasse-1 groep-2-cytokinereceptor en FOXP-datasets.

Om de bovenstaande bevindingen beter te begrijpen, vergeleken we ook de absolute fit van standaard substitutiemodellen en mengselmodellen met behulp van PPS (Fig. 2) [44]. Specifiek, voor elke dataset die beter past bij een gepaard standaard en empirisch CAT-model, hebben we het vermogen getest van standaardmodellen en niet-empirische op CAT-gebaseerde modellen (dit was JTT + CAT in alle gevallen hier) om te anticiperen op evolutionaire procesvariatie tussen locaties . PPS van het aantal aminozuren per site onthulde dat standaardmodellen er niet in slaagden om de biochemische diversiteit van de site adequaat vast te leggen in alle geteste datasets, maar in plaats daarvan consequent het aminozuuralfabet per site overschatten (Z-score > 1.96 P-waarde < 0,05) (Fig. 2). Dit betekent dat het vermogen van standaardmodellen om homoplasie in deze datasets nauwkeurig af te leiden, wordt aangetast, wat de fylogenetische gevolgtrekking zou kunnen misleiden en kan resulteren in fouten in taklengtes en evolutionaire relaties [44]. Aan de andere kant vingen op CAT gebaseerde modellen adequaat de diversiteit van het aminozuuralfabet per site in elke dataset (1,96 > Z-score > − 1,96 P-waarde > 0,05) (Fig. 2), en zou als zodanig robuuster moeten zijn voor fouten voor deze datasets.

Posterior voorspellende simulaties tonen aan dat standaardmodellen, maar geen plaats-heterogene mengselmodellen, de plaatsspecifieke biochemische diversiteit in alle geteste immuungenen van gewervelde dieren onvoldoende vastleggen

Fylogenetische analyses van CD4+ T-cel-geassocieerde genen

IL-2 superfamilie

De IL-2-superfamilie bestaat uit drie subfamilies, de IL-2-familie, de IL-4/13-familie en de IL-7/9-familie, en deze werden hier geverifieerd door fylogenetische analyse (Fig. 3). Binnen de IL-2-subfamilie zijn er twee CD4+ T-cel-geassocieerde cytokinen. IL-2 is een belangrijke inductor van Treg cellen, die immuunresponsen moduleren, foeto-maternale tolerantie bevorderen en allergie en auto-immuniteit helpen voorkomen [17], terwijl IL-21 het effector-cytokine van T isFH cellen, die bijdragen aan de rijping van de antilichaamaffiniteit en het immuungeheugen [8]. Dijkstra [18] identificeerde vermeende orthologen van zoogdieren IL-2 en IL-21 in olifantshaai, ondanks dat aanvankelijk werd gedacht dat ze afwezig waren [5]. Onze fylogenetische analyses van de IL-2-superfamilie zijn consistent met deze bevindingen, hoewel de ondersteuning zwak was (BEAST posterieure kans [BPP] = 0,69 en ultrasnelle bootstrap [UB] = 62 voor IL-21 en UB = 0,61 voor IL-2) ( Afb. 3). We identificeerden ook kraakbeenvissen-orthologen van IL-15 (BPP = 0,8 UB = 83), het andere lid van de IL-2-familie, terwijl de vermeende IL-21 die in onze homologie-onderzoeken werd geïdentificeerd in plaats daarvan bleek te groeperen met de recent geïdentificeerde IL -15L (UB = 56) [94]. Meer gerichte analyses van de IL-2-familie leverden geen verbeterde fylogenetische resolutie op (resultaten niet getoond), maar dit was niet het geval voor de IL-7/9- en IL-4/13-families.

Fylogenetische analyse van de IL-2-superfamilie. Takken zijn gekleurd volgens de taxonomische sleutel in de figuur. Statistische ondersteuning wordt getoond voor sleutelknooppunten volgens het bijbehorende vak, waarbij de vetgedrukte analyse de weergegeven topologie is. Wortel posterieure kansen (RPP) > 0,05 van de BEAST-analyse worden getoond

IL-7/9 familie

IL-9 is het kenmerkende effector-cytokine geproduceerd door zoogdier TH9 cellen, een subtype met een rol in mucosale immuniteit, waaronder de verdrijving van darmwormen [9, 14]. IL-7 wordt beschouwd als de naaste verwant van IL-9 [65, 66], wat betekent dat hoewel we geen vermeende IL-9-ortholoog hebben gevonden in de kleine gevlekte kathaai, de aanvankelijke op BLAST gebaseerde toewijzing van een IL-7-gen in olifantshaai [5] impliceerde ofwel dat IL-9 afweek van IL-7 na de divergentie van kraakbeenachtige vissen van andere gewervelde kaken, of dat IL-9 verloren was gegaan of nog moet worden gevonden in kraakbeenvissen. Om dit te beoordelen, hebben we fylogenetische analyse van de IL-7/9-familie uitgevoerd, met behulp van zowel outgroup- als ontspannen klok-rooting-benaderingen, om de wortelplaatsing onafhankelijk te verifiëren (wortel posterieure waarschijnlijkheid [RPP] = 0,99). De vermeende IL-7-sequenties van kraakbeenvissen vormen een clade met IL-7 van andere gewervelde dieren (BPP = 1,00 UB = 97%) (figuur 4a). Deze resultaten ondersteunen een scenario waarin IL-7 en IL-9 beide bestonden in de voorouder van gewervelde dieren met kaken, waarbij IL-9 vervolgens verloren ging of nog moet worden ontdekt in kraakbeenvissen. Deze hypothese wordt ondersteund door de grotere IL-2-superfamilieanalyse (Fig. 3).

Fylogenetische analyses van de (een) IL-7/9-familie en de (B) IL-4/IL-13-familie. Outgroup-sequenties zijn van de mens. BPP- en RPP-waarden zijn afkomstig uit analyses zonder de outgroups. Andere details volgens Fig. 3

IL-4/13 familie

De IL-4/13-familie van cytokinen zijn de effectorcytokinen geproduceerd door TH2-cellen bij zoogdieren, een subtype dat centraal staat in antilichaam-gemedieerde immuniteit en de klaring van extracellulaire pathogenen [95]. Bewijs voor vermeende IL-4/13-achtige sequenties in olifantshaai werd geleverd door Dijkstra [18] na Venkatesh et al. [5] rapporteerde oorspronkelijk de afwezigheid van deze genen van kraakbeenachtige vissen. Onze resultaten geven aan dat twee IL4/13-achtige lijnen aanwezig zijn en uitgedrukt worden in kleine gevlekte kathaai (IL-4/13A en IL4/13B), die gedupliceerd zijn in de voorouder van kraakbeenvissen (BPP = 0,88 UB = 77%), maar ondersteunen geen duidelijke orthologie van deze genen, of die van teleosten, tot zoogdier IL-4 of IL-13 (Fig. 4b). De IL-2-superfamilieanalyse was ook congruent met deze bevindingen (Fig. 3).

IL-6 superfamilie

IL-27α (p28), vermoedelijk afwezig in kraakbeenvissen [5], vormt de helft van de TR1 subset-inducerende cytokine IL-27. tR1-cellen dempen auto-immuniteit en ontsteking door de expressie van het immunosuppressieve cytokine IL-10 [16] te bevorderen. IL-23 (p19), waarvan ook wordt gedacht dat het niet voorkomt in kraakbeenvissen [5], is een pro-inflammatoire TH17 cel effector cytokine [10, 12]. Fylogenetische analyses van de IL-6-superfamilie, waartoe deze cytokinen behoren [62,63,64], onthullen dat de vermeende IL-27α-sequentie van kraakbeenvissen een zuster is van de tetrapod IL-27α (BPP = 0,99 UB = 84% PPP = 0,69 ), met vermelding van orthologie (Fig. 5). De hier uitgevoerde fylogenetische analyses staan ​​haaks op de eerdere veronderstelling dat IL-27 (p28) nauw verwant is aan pro-inflammatoire IL-23 en de TH1-inducerend cytokine IL-12 (p35) [96, 97]. In plaats daarvan vormen IL-23 (p19) en IL-12 (p35) een subfamilie met het pro-inflammatoire cytokine IL-6 (BPP = 0,99 UB = 97% PPP = 0,98), en, afhankelijk van de wortelplaatsing, IL- 11, die placentatie, botresorptie, bloedplaatjesproductie en immuunresponsen bij zoogdieren moduleert (Fig. 5). Fylogenetische analyse verifieerde de identiteit van kraakbeenvissen IL-23 (BPP = 0,95 UB = 97% PPP = 0,97), en ondersteunde de toewijzing van een kraakbeenachtige vis IL-12 (p35)/IL-23 (p19) ortholoog (BPP = 1,00 UB = 100 PPP = 1,00), wat aangeeft dat deze genen naar voren kwamen in de voorouder van gewervelde dieren (Fig. 5). Hoewel IL-11 niet werd gevonden in olifantshaai door Venkatesh en collega's [19], vonden we bewijs van een kraakbeenachtige visortholoog die een clade vormde met IL-11 van tetrapoden (BPP = 1,00 UB = 96% PPP = 0,88) (Fig. 5). Verder maken kraakbeenachtige vissequenties deel uit van een clade met IL-6 van andere gewervelde dieren (BPP = 0,96 UB = 88% PPP = 0,92), met bewijs van afstammingsspecifieke duplicatie of triplicatie in kraakbeenvissen (Fig. 5). Daarnaast ondersteunen onze analyses de aanwezigheid van orthologen voor OSM/LIF (BPP = 0,59 UB = 85% PPP = 0,85) en CNTF (BPP = 1,00 UB = 100% PPP = 1,00) (Fig. 5). CNTF en CLC vormen een clade (UB = 86% PPP = 0,94), die zuster is van (BPP = 1,00 UB = 94% PPP = 0,93) een andere clade die Ct-1 en Ct-2 bevat (BPP = 1,00 UB > = 92 % PPP = 0,9), wat suggereert dat er een CLC-ortholoog (en een Ct-1/Ct-2-achtige sequentie) bestond in de voorouder van gewervelde dieren (Fig. 5).

Fylogenetische analyse van de IL-6-superfamilie onthult orthologen van IL-23α (p19), IL-27α (p28) en IL-11 in kraakbeenachtige vissen. Details volgens Fig. 3

IL-6Rα-familie

Bij zoogdieren komt IL-6Rα tot expressie op zowel TFH en TH17 subsets TFH cellen zijn belangrijk voor antilichaamproductie, affiniteitsrijping van de antilichaamrespons en geheugen B-celdifferentiatie [8], terwijl TH17 cellen spelen een pro-inflammatoire rol en helpen de integriteit van mucosale barrières bij mensen te behouden [10]. Voor fylogenetische analyses met vermeende IL-6Rα-sequenties van kraakbeenvissen, hebben we de nauw verwante IL-11Rα- en CNTFRa-eiwitten [60] opgenomen en een ontspannen klokwortelbenadering toegepast [87]. De resultaten plaatsen de wortel stevig tussen IL-6Rα en de andere twee eiwitten (RPP = 0,98), wat aangeeft dat IL-11Rα en CNTFα nauwer aan elkaar verwant zijn dan aan IL-6Rα (BPP = 1,00 UB = 99%) ( Afb. 6a).Zowel Bayesiaanse als fylogenetische analyses met maximale waarschijnlijkheid ondersteunen de directe orthologie van IL-6Rα-sequenties van kraakbeenvissen met die in andere gewervelde dieren met kaken (BPP = 0,99 UB = 99%), wat aantoont dat een IL-6Rα gen was aanwezig in de voorouder van gewervelde dieren (Fig. 6a). Bovendien ondersteunt deze benadering ook krachtig het bestaan ​​van kraakbeenachtige visorthologen van IL-11Rα (BPP = 1,00 UB = 92) en CNTFRa (BPP = 1,00 UB = 100) (Fig. 6a).

Fylogenetische analyse van de (een) IL-6Rα-familie, en de (B) IL2Rα/IL-15Rα-familie. Details volgens Fig. 3

IL-2Rα/IL-15Rα-familie

IL-2Rα maakt deel uit van het IL-2R-heterotrimeer, dat cruciaal is voor het onderhoud en de groei van de immunomodulerende Treg afstamming [17], maar wordt verondersteld te ontbreken in kraakbeenvissen [5]. Dijkstra [18] suggereerde dat IL-2Rα zich vroeg in de evolutie van de tetrapoden afscheidde van IL-15Rα en dat IL-15Rα functioneel de rol(len) van IL-2Rα in teleostvissen accommodeert. Onze BLAST- en HMMER-zoekopdrachten identificeerden vermeende orthologen van IL-15Rα, en hoewel er geen geschikte outgroup bekend is, hebben we ontspannen klokgewortelde fylogenetische analyses van IL-2Rα en IL-15Rα uitgevoerd. Dit resultaat lijkt de identiteit van kraakbeenvissen IL-15Rα (BPP = 0,92 UB = 100) te verifiëren (figuur 6b). Interessant is echter dat we geen bewijs vonden voor IL-2Rα dat voortkwam uit IL-15Rα, het lijkt er eerder op dat ze van een gemeenschappelijke voorouder afweken voorafgaand aan de divergentie van kraakbeenachtige vissen en benige gewervelde dieren (RPP ≥ 0,97) (Fig. 6b).

IL-23R en de klasse 1 groep 2 cytokinereceptorfamilie

IL-23R is een cytokinereceptor die specifiek is voor TH17 cellen [8, 10, 12, 15]. Om de vermeende IL-23R geïdentificeerd door BLAST in kraakbeenvissen te verifiëren en om de evolutie van cytokinereceptoren beter te begrijpen, hebben we een fylogenetische analyse uitgevoerd van de klasse 1 groep 2 cytokinereceptorfamilie [61]. Dit onthulde dat vermeende kraakbeenachtige vis IL-23R zuster is van IL-23R van tetrapoden (BPP = 1,00 UB = 99% PPP = 1,00), wat wijst op de aanwezigheid van een IL-23R-ortholoog in kraakbeenvissen (Fig. 7). De analyses ondersteunen de opname van IL-23R in een onderfamilie die ook IL27Rα en IL-12Rβ2 (BPP = 1,00 UB = 100 PPP = 1,00) bevat (Fig. 7). IL27Rα en IL-12Rβ2 zijn betrokken bij TH1-celdifferentiatie en, vanwege hun relaties met benige gewervelde sequenties, suggereren onze gegevens dat er directe orthologen bestaan ​​voor deze genen in kraakbeenvissen (BPP = 1,00 UB = 97% PPP = 1,00 en BPP = 1,00 UB = 93% PPP = 1,00 , respectievelijk) (Fig. 7).

Fylogenetische analyse van klasse 1 groep 2 cytokinereceptoren onthult een IL-23R-ortholoog in kraakbeenvissen. Details volgens Fig. 3

Deze analyse geeft ook inzicht in de evolutie van de andere opgenomen klasse 1 groep 2 cytokinereceptoren. GP-130 (ook bekend als IL-6Rβ of IL-6ST), dat complexen vormt met veel IL-6- en IL-6R-familieleden, speelt een sleutelrol bij zowel het bevorderen als het onderdrukken van ontstekingen en is essentieel voor de overleving van embryo's bij zoogdieren [98]. Er zijn drie kopieën van GP-130 in kraakbeenvissen [5], die duidelijk het gevolg zijn van twee afstammingsspecifieke duplicaties (BPP ≥ 0,97 UB ≥ 72% PPP ≥ 0,9) (Fig. 7). Een GCSFR-clade, die ook kraakbeenvissen bevat (BPP = 1,00 UB = 98% PPP = 1,00), valt zus van GP-130 (BPP = 1,00 UB = 93% PPP = 1,00), die samen zus zijn van de IL-23Rα , IL-27Ra en IL-12Rβ2 clade (BPP = 1,00 UB = 93% PPP = 0,93) (Fig. 7). Buiten deze groep valt een kraakbeenachtige vissequentie binnen een OSMR (multifunctioneel) en LIFR (tumormetastasesuppressor [99]) clade (BPP = 1,00 UB = 1,00% PPP = 1,00) (Fig. 7). Tenslotte bezitten kraakbeenvissen een vermeende ortholoog van leptinereceptor (LEP-R), een hypothalamische eetlustregulerende hormoonreceptor, aangezien deze sequentie een clade vormde met benige gewervelde LEP-R (BPP = 1,00 UB = 100% PPP = 1,00), en ontspannen klokwortelanalyse plaatst de wortel het beste tussen LEP-R en de andere familieleden (RPP = 0,66) (Fig. 7).

ROR-transcriptiefactorfamilie

Na het identificeren van orthologen van twee cytokinereceptoren geassocieerd met de TH17 subset (IL-23R en IL-6R), hebben we een verscheidenheid aan fylogenetische wortelanalyses uitgevoerd om te zoeken naar bewijs van de transcriptiefactor ROR-γ, de hoofdregulator van TH17 cellen [100]. ROR-γ is een lid van de grotere ROR-familie en werd als vermist opgegeven in olifantshaai [5]. We testten een ontspannen klokwortelmethode (Fig. 8a), en twee alternatieve outgroups fruitvlieg HR3 (Fig. 8b), en de menselijke RAR-familie (Fig. 8c), beide nauw verwante nucleaire receptoren [67]. Deze benaderingen boden geen congruente ondersteuning voor enige wortelpositie (Fig. 8), wat het gevolg kan zijn van het grote verschil in evolutionaire snelheid tussen ROR-γ en de andere ROR's (Fig. 8). Onze resultaten zijn echter consistent met twee nieuwe bevindingen: (l) ROR-γ bestond in de voorouder van gewervelde dieren, hoewel het bewijs voor de aanwezigheid ervan in kraakbeenvissen afhangt van wortelplaatsing in ontspannen klokanalyses (Fig. 8a), en (ii) een vierde lid van de gewervelde ROR-familie, die zuster is van ROR-β (BPP = 0,99 UB ≥ 79%), bestaat, maar is mogelijk verloren gegaan bij zoogdieren en teleosten. Voor dit nieuwe gezinslid stellen we de naam ROR-δ voor (Fig. 8).

Fylogenetische analyses van de gewervelde ROR-familie laten zien dat ROR-γ bestond in de voorouder van gewervelde dieren en onthullen een nieuwe gewervelde ROR-β-paraloog die niet wordt gevonden bij zoogdieren (die we ROR-δ noemen). Alternatieve rootstrategieën, met behulp van (een) een ontspannen klokmodel, (B) fruitvlieg HR3 als outgroup, of (C) menselijke RAR's als outgroup, laten zien dat de wortel van de ROR-fylogenie niet met vertrouwen kan worden geplaatst. Gene niveau clades zijn samengevouwen in (B) en (C), maar bevatten dezelfde taxa als een Andere details volgens Fig. 3

FOXP-transcriptiefactorfamilie

FOXP3 is de hoofdregelaar van Treg celontwikkeling en functie bij zoogdieren [101]. Een FOXP3-homoloog werd geïdentificeerd in olifantshaai, maar werd verondersteld niet-functioneel te zijn door Venkatesh en collega's [5] op basis van analyse van het DNA-bindende domein. Dijkstra [18] heeft echter gesuggereerd dat deze gevolgtrekking voorbarig zou kunnen zijn. Onze fylogenetische analyses suggereren dat kraakbeenachtige vissen orthologen hebben voor alle vier de zoogdierlijke FOXP-familieleden (Fig. 9). Net als de ROR-familie kunnen de relaties tussen deze genen niet gemakkelijk worden opgelost, omdat verschillende wortelposities de voorkeur hebben wanneer de boom is geworteld met ofwel ontspannen klokken of ongewervelde FOXP-sequenties (Fig. 9). Een ander gemeenschappelijk kenmerk tussen de FOXP- en ROR-families is een opvallende toename in evolutionaire snelheid bij het familielid dat betrokken is bij T-celbiologie (d.w.z. immuunfunctionerend RORC en FOXP3), in vergelijking met de andere familieleden (figuren 8 en 9). We hebben een uitlijning van meerdere sequenties van FOXP3-DNA-bindende domeinen van kraakbeenvissen gegenereerd tegen die van andere gewervelde kaken om de kwestie van FOXP3-functionaliteit in kraakbeenvissen en de voorouder van gewervelde kaken te onderzoeken. Hieruit bleek dat de sites die door Venkatesh et al. voorspeld waren te leiden tot niet-functionaliteit in kraakbeenachtige vissen. [5] verschillen niet merkbaar meer van de mens dan die van andere niet-zoogdieren, en zeker niet meer dan verwacht in de context van soortenfylogenie en divergentietijden [1, 2].

Fylogenetische analyses van de FOXP-familie van gewervelde dieren verifiëren het bestaan ​​van kraakbeenachtige vissen-orthologen voor FOXP1–4, maar alternatieve bewortelingsstrategieën, met behulp van (een) een ontspannen klokmodel, of (B) ongewervelde FOXP-sequenties als een outgroup, laten zien dat de wortel van de FOXP-fylogenie niet met vertrouwen kan worden geplaatst. Andere details voor (een) en (B) volgens Fig. 3 en 6. (C) Uitlijning van het FOXP3-DNA-bindende domein van fylogenetisch representatieve gewervelde dieren suggereert dat kraakbeenachtige vissen FOXP3 niet atypisch zijn


De behandeling van kleine gevlekte kathaai-embryo's volgde alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen (richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschappen van 22 september 2010 [2010/63/UE]): er was geen verdere goedkeuring door een ethische commissie nodig aangezien het biologische materiaal embryonaal en er werden geen levende experimentele procedures uitgevoerd.

MD-T en TH ontwierpen het onderzoek, analyseerden de gegevens en stelden het manuscript op. NL voerde de syntenie- en fylogenetische analyses uit. CM-M genereerde qPCR-expressiegegevens. SV voerde de . uit ter plaatse expressie experimenten. TH voerde de genoomdatamining uit. Alle auteurs hebben bijgedragen aan het artikel en hebben de ingediende versie goedgekeurd.


Teleost-vissen met specifieke genoomduplicatie als unieke modellen van de evolutie van gewervelde dieren

Gehele genoomduplicatie (WGD) wordt beschouwd als een van de belangrijkste evolutionaire gebeurtenissen die de genoomorganisatie van gewervelde dieren hebben gevormd. Hier bespreken we recent onderzoek naar de evolutie van het genoom van gewervelde dieren, met name naar WGD en de gevolgen ervan voor de evolutie van genen en het genoom bij teleosvissen. Recente genoomanalyses bevestigden dat alle gewervelde dieren in het begin van hun evolutie twee ronden van WGD doormaakten, en dat teleosten een daaropvolgende derde ronde (3R)-WGD ervoeren. De 3R-WGD vond naar schatting 320-400 miljoen jaar geleden plaats in een teleost-voorouder, maar na de afwijking van een gemeenschappelijke voorouder met levende niet-teleost actinopterygians (Bichir, Sturgeon, Bowfin en Gar) op basis van de analyses van teleost -specifieke dubbele genen. Deze 3R-WGD werd bevestigd door synteny-analyse en voorouderlijke karyotype-inferentie met behulp van de genoomsequenties van Tetraodon en medaka. De meeste tetrapoden hebben daarentegen geen extra WGD ervaren, maar ze hebben herhaalde chromosomale herschikkingen door het hele genoom ervaren. Daarom hebben verschillende soorten chromosomale gebeurtenissen de genomen van respectievelijk teleosten en tetrapoden gekarakteriseerd. De 3R-WGD is nuttig om de gevolgen van WGD te onderzoeken, omdat het een evolutionair recente WGD is en dus teleostgenomen veel meer WGD-afgeleide duplicaten en "sporen" van hun evolutie behouden. Bovendien kan de opmerkelijke morfologische, fysiologische en ecologische diversiteit van teleosten het begrip van macrofenotypische evolutie op basis van genetische/genomische informatie vergemakkelijken. We benadrukken de teleosten met 3R-WGD als unieke modellen voor toekomstige studies over ecologie en evolutie, gebruikmakend van opkomende genomica-technologieën en systeembiologische omgevingen.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


DISCUSSIE

De Hox-genen hebben ons een ideaal systeem opgeleverd om de evolutie van belangrijke ontwikkelingsgenen na een genoomduplicatie te onderzoeken. Als gevolg van de functionele beperkingen die op deze geconserveerde genen inwerken, kunnen we gemeenschappelijke PG1-genfuncties identificeren over zeer grote evolutionaire afstanden. We hebben echter een aantal interessante verschillen geïdentificeerd in de zebravis PG1-genen in vergelijking met die van de muis, zowel bij de cis-regulerende en de coderende sequentieniveaus. Deze veranderingen omvatten verschillen in genexpressiepatronen, coderende sequenties en functionele capaciteiten. We beschrijven ook een interessant voorbeeld van functie 'shuffling' tussen paralogen, waarbij niet-orthologe genen worden gebruikt voor gelijkwaardige doeleinden in zebravissen en muizen. We bespreken elk van deze verschillen, en hun implicaties, hieronder in detail.

Zebravis Hox-genen hebben een ongebruikelijke expressie in de middenhersenen

Gewervelde Hox-genen vertonen in het algemeen ruimtelijke en temporele colineariteit van expressie (McGinnis en Krumlauf, 1992). Een uitzondering op ruimtelijke colineariteit is dat PG1-genen van muis en kuiken anterieure expressielimieten hebben die achter die van PG2-genen liggen (Frasch et al, 1995 Prince en Lumsden, 1994). zebravis hoxa1a en hoxc1a hebben expressie in kleine discrete populaties van ventrale neuronen in de middenhersenen, wat in principe de ruimtelijke colineariteit herstelt. Deze expressie is echter radicaal anders dan die van andere Hox-genen tijdens de ontwikkeling van het CZS, en is beperkt tot kleine groepen neuronen in plaats van zich uit te strekken over brede domeinen. Dit suggereert dat expressie in de middenhersenen een afgifte van deze Hox-genen uit globale clusterregulering kan weerspiegelen (besproken door Duboule, 1998). Ter ondersteuning van dit alternatief, het late begin van hoxa1a expressie, ongeveer 9 uur na het begin van hoxa2b of hoxa3a uitdrukking, is in strijd met temporele colineariteit. Dissociatie van globale controlemechanismen kan op zijn beurt worden vergemakkelijkt door de locatie van de genen aan de verre 3'-uiteinden van de clusters.

Er zijn precedenten voor een dergelijke ontsnapping aan clusterregulering in Drosophila. Bijvoorbeeld, zen is een Hox-achtig gen dat zich in het homeotische complex bevindt, maar dat niettemin een dorsaal gelokaliseerd extra-embryonale expressiepatroon heeft in tegenstelling tot dat van enig Hox-gen (Falciani et al., 1996). evenzo, fushi tarazu is een Hox-achtig gen (Telford, 2000) dat binnen het Homeotische complex ligt, maar toch tot expressie wordt gebracht met een paarregelpatroon, en later in zich ontwikkelende neuronen (Doe et al., 1988). zebravis hoxa1a en hoxc1a kan op dezelfde manier een rol hebben gespeeld in latere neuronale patronen. Op dit moment laten onze bevindingen ons niet toe om te bepalen of Hox-expressie in de middenhersenen een behoud van ruimtelijke colineariteit vertegenwoordigt, of als alternatief een ontsnapping aan op clusters gebaseerde regulerende mechanismen. Onze gegevens werpen echter enig licht op de evolutionaire oorsprong van de expressie van de middenhersenen van het Hox-gen.

De expressie van de Hox-middenhersenen zou ofwel een afgeleid kenmerk van de zebravis kunnen zijn, of in plaats daarvan een meer primitieve toestand van gewervelde dieren kunnen weerspiegelen. Ter ondersteuning van de hypothese dat expressie in de middenhersenen is afgeleid, is een dergelijke expressie niet gerapporteerd voor muizen-PG1-genen (Frohman et al., 1990 Murphy en Hill, 1991 Wilkinson et al., 1989). We stellen echter voor dat ondanks de muisgegevens, de expressie van de middenhersenen waarschijnlijk een oude oorsprong heeft binnen de gewervelde dieren. We hebben de expressie van de middenhersenen waargenomen van hoxa1a in de verre verwante teleost-medaka (C. Jozefowicz en V.E.P., niet gepubliceerd), wat suggereert dat deze uitdrukking een algemeen kenmerk is van de teleosten. Bovendien is onze bevinding van expressie in de middenhersenen voor PG1-genen van beide hoxa en hoxc clusters suggereert dat middenhersenenachtige expressie mogelijk bestond vóór de initiële Hox-clusterduplicaties geassocieerd met gewervelde oorsprong (Garcia-Fernandez en Holland, 1994). In overeenstemming met de hypothese dat expressie in de middenhersenen een voorouderlijk kenmerk van gewervelde dieren is, is er één melding geweest van expressie in de middenhersenen bij een sarcopterygische gewervelde, Xenopus laevis (Kolm en Sive, 1995). Dit suggereert dat expressie van de middenhersenen aanwezig kan zijn geweest in de gemeenschappelijke voorouder van de sarcopterygiërs (vissen met lobvin) en actinopterygiërs (vissen met straalvin). Opgemerkt moet worden dat de uitdrukking van Xenopus Hoxa1 is nog niet onderzocht met eencellige resolutie, en dus blijft de precieze relatie tussen deze expressie en de discrete neuronale expressiedomeinen die we waarnemen bij zebravissen onduidelijk. Desalniettemin suggereren al deze gegevens dat het ontbreken van expressie in de middenhersenen bij muizen een afgeleid kenmerk kan zijn, en het zal van belang zijn om te onderzoeken Hoxa1 expressie in aanvullende sarcopterygiërs zoals kuikens, evenals in de chondrichthyan-vissen (haaien en roggen) die dateren van vóór de actinopterygische / sarcopterygische kloof.

Hoxc1a heeft verminderde functionele capaciteiten die correleren met veranderde volgorde

We hebben geconstateerd dat de hoxc1a gen vertoont een verminderd vermogen om sommige, maar niet alle, aspecten van r2-identiteit te transformeren naar een r4-fenotype. In vergelijking met andere PG1-genen is het vermogen van hoxc1a activeren hoxb1a expressie, of het induceren van ectopische RS-neuronen, wordt significant verminderd. Het vermogen om BM-neuronen opnieuw te modelleren is dat echter niet, wat suggereert dat een subset van PG1-functies kan worden gewijzigd in hoxc1a. Transcriptionele activering van hoxb1a heeft waarschijnlijk zowel een Hox PG1-genproduct als een Pbx-cofactor-eiwit nodig. Een Hox/Pbx-heterodimeer bindt waarschijnlijk aan regulerende elementen stroomopwaarts van hoxb1a, naar analogie met muis Hoxb1 regulerende mechanismen (Pöpperl et al., 1995 Studer et al., 1998). De hoxc1a-coderende sequentie heeft significante sequentieverschillen met de andere PG1-genen die waarschijnlijk efficiënte interactie met Pbx-cofactoren uitsluiten. In het bijzonder heeft het hexapeptide-motief, waarvan is aangetoond dat het direct interageert met Pbx-co-factoren (Passner et al., 1999 Piper et al., 1999), twee aminozuurveranderingen in Hoxc1a ten opzichte van alle andere onderzochte PG1-eiwitten van gewervelde dieren. Bovendien heeft het hoxc1a-eiwit een significant verlengde linker tussen het hexapeptide en het homeodomein, en de recentelijk opgeloste structuur van het menselijke Hoxb1-Pbx1-heterodimeer gebonden aan DNA (Piper et al., 1999) heeft geleid tot de expliciete voorspelling dat veranderingen in de lengte van deze linker zal het vermogen van een Hox-eiwit om te interageren met zijn Pbx-cofactor veranderen (Scott, 1999). We stellen dus voor dat het verlies van sommige functionele capaciteiten van Hoxc1a het gevolg is van een verminderd vermogen om te interageren met Pbx-co-factoren. Het behoud van het vermogen om BM-neuronen opnieuw te vormen, kan echter impliceren dat sommige normale functies van Hoxc1a Pbx-onafhankelijk zijn.

Het is interessant op te merken dat de hoxc1a gen van de acanthopterygian teleost kogelvis, Fugu rubripes, codeert geen open leeskader, wat aangeeft dat hoxc1a functie is overbodig in ten minste één teleost (Aparicio et al., 1997). Het is dus mogelijk dat zebravissen hoxc1a, zoals de Fugu gen, aan het verdwijnen is. Samen suggereren deze gegevens dat teleost Hox-gencomplementen nog niet zijn vastgesteld.

Zebravis hoxb1b is het functionele equivalent van muizen Hoxa1

We veronderstellen dat de zebravis hoxb1b vervult de ontwikkelingsrol die in de muis wordt gespeeld door de Hoxa1 gen. De expressiepatronen van deze twee genen zijn opmerkelijk vergelijkbaar: beide hebben een zeer voorbijgaande vroege expressie in vermoedelijke r4, en wijken daarna terug. Verder vinden we dat hoxb1b verkeerde expressie kan r4 identiteit verlenen aan r2. Samen suggereren onze bevindingen dat: hoxb1b speelt een normale rol bij de ontwikkeling van r4.

Mutantanalyses hebben aangetoond dat muis Hoxa1 vereist is voor normale r4- en r5-vorming (Chisaka et al., 1992 Carpenter et al., 1993 Lufkin et al., 1991 Mark et al., 1993), en dat Hoxa1 is vereist om de juiste anterieure grens van Hoxb1 expressie (Barrow et al., 2000). Een keer Hoxb1 wordt geactiveerd in r4, de expressie ervan wordt gehandhaafd door autoregulatie (Pöpperl et al., 1995).Zowel het Hoxa1- als het Hoxb1-eiwit kunnen heterodimeriseren met een Pbx-cofactor om een ​​gedefinieerde Hox/Pbx-bindingsplaats 5' van Hoxb1 om de transcriptie ervan te activeren (Pöpperl et al., 1995 Studer et al., 1998). In overeenstemming met deze regelgevende relaties, wanneer: Hoxa1 wordt wereldwijd verkeerd tot expressie gebracht in transgene muizen, Hoxb1 wordt ectopisch tot expressie gebracht op het r2-niveau (Zhang et al., 1994). We vinden bewijs van een vergelijkbare functionele hiërarchie tussen twee PG1-genen in de zebravis: verkeerde expressie van zebravissen hoxb1b leidt tot buitenbaarmoederlijke activering van hoxb1a in r2. We stellen dus voor dat tijdens normale ontwikkeling Hoxb1b in eerste instantie wordt geactiveerd hoxb1a expressie op het r4-niveau, en dat hoxb1a expressie wordt dan onderhouden door een autoregulerend mechanisme. De hypothese dat de regulatie van Hoxb1 orthologen is geconserveerd tijdens de evolutie wordt verder ondersteund door de aanwezigheid van Hox / Pbx-bindingsplaatsen 5 'van de kip en Fugu Hoxb1 genen (Pöpperl et al., 1995).

De waarneming dat ectopische expressie van hoxb1b zorgt ervoor dat r2 een r4 lot overneemt zonder meer anterior structuren te veranderen, suggereert dat extra factoren, die alleen aanwezig zijn in r2, nodig zijn voor de transformatie. Mogelijke factoren zijn onder meer Pbx en Meis familie co-factor eiwitten. Co-factoren van de Meis-familie binden gedefinieerde regulerende elementen die dicht bij de plaatsen liggen die zijn gebonden door Hox- en Pbx-eiwitten, trimere complexen van Meis, Hox en Pbx vormen vervolgens (beoordeeld door Mann en Affolter, 1998). Interessant is dat Pöpperl et al. (2000) hebben onlangs aangetoond dat de Pbx-eiwitniveaus van de zebravis vóór de r1/2-grens zijn verlaagd. Bovendien hebben we onlangs de expressie van zebravissen beschreven meis2.1 in r2 van embryo's in het vroege somietstadium (Zerucha en Prince, 2001), wat suggereert dat Meis2.1 de co-factor kan bieden die de activiteit van hoxb1b in r2. In overeenstemming met de hypothese dat co-factoren de omvang van de posterieure transformatie beperken als reactie op: hoxb1b, geeft een recent rapport aan dat verkeerde uitdrukking van hoxb1b, samen met meis3, leidt tot veel uitgebreidere posterioriserende transformaties dan die worden bemiddeld door hoxb1b alleen (Vlachakis et al., 2001).

De hoxb1a en hoxb1b duplicaten hebben verschillende functionele capaciteiten

We vinden dat ectopische expressie van lage niveaus van hoxb1a mRNA (concentraties van 25 ng/μl) kan homeotische transformaties veroorzaken die vergelijkbaar zijn met die gemedieerd door hoxb1b, waarbij r2 eigenschappen van r4 aanneemt. We vinden echter ook dat als reactie op hogere niveaus van hoxb1a mRNA (concentraties van 50 ng/μl), structuren anterieur aan r2 worden getransformeerd naar een r4-fenotype. In sommige gevallen is de anterieure van het embryo ernstig afgeknot en nemen alle structuren anterieur aan r4 de identiteit van r4 aan, zoals blijkt uit de enorme expansie van hoxb1a expressie en productie van meerdere Mauthner-neuronen. Interessant is dat deze experimentele embryo's een zeer vergelijkbaar fenotype hebben als embryo's waarin: meis3 en hoxb1b zijn beide verkeerd uitgedrukt (Vlachakis et al., 2001), wat suggereert dat de capaciteit van hoxb1a om meer uitgebreide transformaties te bemiddelen dan hoxb1b kan een verminderde behoefte aan een Meis-familie co-factor weerspiegelen.

Dat vinden wij ook hoxa1a en het enkele amphioxus PG1-gen, AmphiHox-1, hebben vergelijkbare functionele capaciteiten als hoxb1a: ectopische expressie kan anterieure structuren transformeren naar een r4-identiteit. Deze bevindingen suggereren dat, hoewel hoxa1a normaal niet tot expressie wordt gebracht in r4 en amphioxus geen r4-achtige structuur heeft, stellen de vergelijkbare coderende sequenties van deze verschillende PG1-genen hen in staat om dezelfde set stroomafwaartse doelgenen in onze test te reguleren, wat leidt tot een equivalente transformatiegebeurtenis. interessant, AmphiHox-1 mRNA veroorzaakt ernstige posterioriserende transformaties, samen met truncaties van anterieure structuren, bij aanzienlijk lagere concentraties dan hoxb1a of hoxa1a mRNA. Dit kan slechts een gevolg zijn van een grotere eiwitproductie of stabiliteit, maar kan intrinsieke hogere activiteitsniveaus van het enkele amphioxus PG1-eiwit weerspiegelen in vergelijking met een van de vier zebravis-PG1-eiwitten. Als hoxb1a transcriptie wordt geactiveerd als reactie op verkeerde expressie van een van de andere PG1-genen, blijft het onduidelijk of de fenotypische gevolgen van verkeerde expressie van het PG1-gen altijd direct worden gemedieerd door de individuele Hox-eiwitten die door de geïnjecteerde mRNA's worden geproduceerd, of dat sommige effecten worden indirect gemedieerd via Hoxb1a-eiwit. In principe kunnen de effecten van alle ectopische PG1-eiwitten eenvoudigweg het vermogen weerspiegelen om een ​​autoregulerende feedbacklus te activeren die de hoxb1a uitdrukking. Een soortgelijke situatie is beschreven voor de Drosophila vervormd gen, dat kan worden geactiveerd door ectopische expressie van een ortholoog, het menselijke HOXD4-gen, via een regulerend element dat normaal wordt gebruikt voor autoregulatie (McGinnis et al., 1990). Dienovereenkomstig kunnen de geconserveerde regulerende elementen van humaan HOXD4 een misvormd expressiepatroon binnen vliegenembryo's (Maliki et al., 1992).

Onze gain-of-function-test stond geen onderzoek toe van de normale ontwikkelingsrol van hoxa1a. De hoxa1a-positieve middenhersenenneuronen liggen binnen of nabij de HNK-1-positieve nMLF. Gedifferentieerde cellen kunnen voor het eerst in deze kern worden herkend na ongeveer 16 uur ontwikkeling (Wilson et al., 1990), eerder dan het stadium waarin we Hox-genexpressie voor het eerst detecteren in de middenhersenen. Het is dus mogelijk dat Hox-genexpressie een rol speelt bij de rijping van deze kern, maar het is onwaarschijnlijk dat het betrokken is bij neuronale specificatie. In overeenstemming met dit idee hebben we de vorming van ectopische HNK-1-positieve neuronen niet waargenomen als reactie op ectopische Hox PG1-genexpressie.

Zebravis PG1-genevolutie heeft betrekking op 'shuffelen' van functies

Onze gegevens suggereren sterk dat zebravissen hoxb1b en hoxb1a gelijkwaardige functies uitvoeren als muis Hoxa1 en Hoxb1, respectievelijk. Om deze verrassende bevinding te verklaren, stellen we een evolutionair model voor waarin muis en zebravis verschillende genen voor hetzelfde doel hebben gebruikt. We stellen voor dat na verdubbeling van de vier voorouderlijke Hox clusters tot een acht-cluster arrangement, de hoxb duplicaten zouden beide een r4-expressiedomein hebben gehad. Als de coderende regio's van Hoxa1 en Hoxb1 genen lijken erg op elkaar (en mogelijk functioneel uitwisselbaar), kleine veranderingen in de regulatie van een van de twee hoxb1 duplicaten tijdens de evolutie zouden dit gen in staat stellen om de vroege r4-patroonrol te vervullen die in de muis wordt geleverd door Hoxa1. Volgens dit scenario is hoxa1a was toen vrij om zijn r4-expressiedomein te verliezen omdat de vroege r4-patroonrol werd vervuld door hoxb1b.

Een soortgelijk gebruik van verwante genen voor gelijkwaardige doeleinden is beschreven voor de zebravis Bmp-genen de zebravis bmp2b gen lijkt functioneel equivalent te zijn aan het niet-orthologe Xenopus Bmp4 gen in dorsoventrale patronen van de gastrula (Nguyen et al., 1998). Een dergelijke functie 'shuffling' tussen nauw verwante zebravisgenen kan een veelvoorkomend gevolg blijken te zijn van de genoomduplicatie die plaatsvond in een teleost-voorouder. Verdere vergelijkende studies moeten helpen om licht te werpen op hoe genen, en uiteindelijk genennetwerken, zijn geëvolueerd tijdens de bestraling van gewervelde dieren.


Bekijk de video: Hemoglobin structure: Heme: biochemistry (December 2021).