Informatie

Worden specifieke primers of detectoren, of beide, gebruikt in COVID-19-tests?


Ik probeer meer te weten te komen over de rRT-PCR-testprocedure die wordt gebruikt om te testen op COVID-19, maar op één punt ben ik een beetje in de war. Worden zeer specifieke primers gebruikt bij een niet-specifieke detector, of worden zeer specifieke detectoren gebruikt, of worden zowel specifieke primers als detectoren gebruikt? Sommige bronnen zeggen dat multiplex-PCR wordt gebruikt, wat wijst op een specifieke detector, maar aangezien ik nog een beginner ben op dit gebied, weet ik het niet zeker. Ik zou het ook erg op prijs stellen als iemand ook naar een bron zou kunnen verwijzen die enkele testprocedures beschrijft.

Bedankt


Wanneer u een PCR-reactie uitvoert, maakt u kopieën van een DNA-sequentie van belang (cDNA in het geval van retrotranscriptie, aangezien retrovirussen RNA als genetisch materiaal hebben). De volgorde van interesse wordt verondersteld te zijn in een monster, dat u van de patiënt neemt, of een of ander organisme (ik zeg 'verondersteld' omdat de PCR juist is om dit te bevestigen). Deze kopieën worden gemaakt door een groep 'generalistische' enzymen, polymerasen genaamd, en met generalisten bedoel ik dat ze niet discrimineren op welke DNA-sequentie ze kopiëren. Maar ze kunnen geen DNA kopiëren de novo (vanaf het begin). Het kopieerproces moet worden 'geprimed' door een korte sequentie van nucleotiden die complementair is aan het DNA van belang. Dit worden primers genoemd en ze dienen in feite als sondes om het kopiëren van de specifieke sequentie die u moet amplificeren te richten. En dit is waar wetenschappers veel zorg aan besteden: primerontwerp. Slechte primers zullen niet erg specifiek zijn, of zullen niet erg efficiënt zijn tijdens het amplificatieproces. Wat betreft de 'machine' die de kopieën daadwerkelijk detecteert, zijn er vele varianten. De meest gebruikte methode in onderzoeks- en diagnostische laboratoria is het kleuren van het geamplificeerde DNA met een molecuul dat bindt aan nucleïnezuren (die er veel zijn), en het visualiseren via DNA-elektroforese. Wat je visualiseert is een populatie van DNA-kopieën (via de kleuring die je maakt), dus je moet van tevoren weten wat je kunt verwachten. Verwacht je bijvoorbeeld een klein fragment (een paar honderd basenparen) of een groot fragment (enkele duizenden?). Je hebt een 'ladder' (ook wel marker genoemd) die je een referentie geeft om te vergelijken, zoals in deze afbeelding:

Mensen weten wat ze kunnen verwachten omdat ze de DNA- (of RNA-) sequentie die ze amplificeren al kennen (anders hadden ze de doelprimers niet kunnen ontwerpen). Ze kennen de sequentie omdat ze een of andere vorm van nucleïnezuursequencing hebben gedaan (laboratoria, gezondheidsinstituten, enzovoort, doen dit de hele tijd en deponeren de sequenties op een of ander platform, bijvoorbeeld GeneBank).

Een 'positieve' amplificatie geeft u een band in het verwachte groottebereik en geen andere banden (omdat uw primers zijn gericht op een bepaalde DNA-sequentie). Maar zoals je al zei, bestaat er ook een multiplex PCR-reactie. Daarin ontwerp je meerdere primers om verschillende sequenties te targeten (met hetzelfde DNA-monster -bijvoorbeeld van een patiënt of organisme-), maar het verificatieproces is in principe hetzelfde. Hier zijn mensen extra voorzichtig om kruisinteracties te vermijden tussen de primers die aan de reactie worden toegevoegd.

PCR is een familie van technieken, niet één. Er zijn variaties in het eigenlijke proces, en ook in de 'detectie' (bijvoorbeeld qPCR gebruikt echte tijd detectie van kopienummers). Maar het algemene principe is hetzelfde: primers zijn specifiek, terwijl het 'detectieapparaat' dat niet echt is.


Bekijk de video: LASIK Surgery and its Risks (December 2021).