Informatie

9.3: Ionenuitwisselingschromatografie - Biologie


Bij ionenuitwisselingschromatografie bestaat de drager uit kleine bolletjes waaraan chemicaliën zijn bevestigd die een lading hebben. Elk geladen molecuul heeft een tegenion. De afbeelding toont de kralen (blauw) met negatief geladen groepen (rood) eraan bevestigd. In dit voorbeeld is het tegenion natrium, dat positief geladen is. De negatief geladen groepen kunnen de korrels niet verlaten vanwege hun covalente aanhechting, maar de tegenionen kunnen worden "uitgewisseld" voor moleculen met dezelfde lading. Een kationenuitwisselingskolom heeft dus positief geladen tegenionen en positief geladen verbindingen die aanwezig zijn in een mengsel dat door de kolom wordt geleid, wisselen uit met de tegenionen en "kleven" aan de negatief geladen groepen op de korrels. Moleculen in het monster die neutraal of negatief geladen zijn, zullen snel door de kolom gaan. Aan de andere kant zijn bij anionenuitwisselingschromatografie de chemische groepen die aan de kralen zijn bevestigd positief geladen en zijn de tegenionen negatief geladen. Moleculen in het monster die negatief geladen zijn, zullen "plakken" en andere moleculen zullen er snel doorheen gaan. Om de moleculen te verwijderen die "vastzitten" aan een kolom, hoeft u alleen maar een hoge concentratie van de juiste tegenionen toe te voegen om ze te verdringen en vrij te geven . Met deze methode kunnen alle componenten van het mengsel die dezelfde lading delen, worden teruggewonnen.



Fig. 1. Eiwitlading versus pH. Eiwitstabiliteit en binding van ionenuitwisselingsmedia variëren met de totale eiwitlading, die afhangt van de pH.

Ionenuitwisselingschromatografie wordt vaak gebruikt om geladen biologische moleculen zoals eiwitten, peptiden, aminozuren of nucleotiden te scheiden. De aminozuren waaruit eiwitten bestaan, zijn zwitterionverbindingen die zowel positief als negatief geladen chemische groepen bevatten. Afhankelijk van de pH van hun omgeving kunnen eiwitten een netto positieve lading, een netto negatieve lading, of geen kosten. De pH waarbij een molecuul geen netto lading heeft, wordt zijn . genoemd ISO-elektrisch punt, of pi.


Fig. 2. Selectie van ionenwisselaarhars.

De pI-waarde kan worden berekend op basis van de primaire sequentie van het molecuul. De keuze van de buffer-pH bepaalt vervolgens de nettolading van het eiwit van belang.

In een buffer met een pH groter dan de pI van het eiwit van belang, zal het eiwit een netto negatieve lading dragen, dus een positief geladen anionenuitwisseling hars wordt gekozen om dit eiwit te vangen.

In een buffer met een pH lager dan de pI van het eiwit van belang, zal het eiwit een positieve netto lading dragen en dus een negatief geladen kation uitwisseling hars wordt gekozen.

Wanneer een ionenuitwisselingschromatografiekolom wordt geladen met een monster bij een bepaalde pH, zullen alle eiwitten die op de juiste manier zijn geladen aan de hars binden. Als bijvoorbeeld een anionenuitwisselingshars wordt gekozen, zullen alle eiwitten die negatief geladen zijn bij de pH van de laadbuffer binden aan de positief geladen kolomhars. Een goede vuistregel voor het kiezen van een buffer-pH is de volgende:

  • Anionenwisselaar &mdash 0,5&ndash1,5 pH-eenheden groter dan de pI van het eiwit van belang
  • Kationenwisselaar &mdash 0,5&ndash1,5 pH-eenheden minder dan de pI van het eiwit van belang

Biologische geneeskunde

6.07.2.3 Een breed toepasbaar mAb downstream-platform

CEX en AEX voorzien in hun traditionele smaken niet in deze behoefte. Een belangrijke wijziging die in dit opzicht is aangebracht, is het gebruik van multimodale chromatografie als onderdeel van het downstream-platform van mAb. Multimodale chromatografie omvat de opname van een hydrofobe groep in de ligandenstructuur voor AEX of CEX. 28 De verhoogde hydrofobiciteit van de chromatografische hars maakt nu een verbeterde klaring van HMW mogelijk in zowel CEX- als AEX-modi, die aantoonbaar het meest geschikt zijn voor mAb-verwerking. Bovendien zijn beide wijzen van chromatografie ook in staat tot HCP- en DNA-klaring. mAbs verschillen wel wat betreft hun eigen hydrofobiciteit. Als gevolg hiervan wordt het downstreamproces van het platform voor mAbs bij KBI gedefinieerd als AEX (met harshydrofobiciteit die kan variëren van Q Sepharose FF of Capto Q tot Fractogel SO3 tot multimodale chromatografische harsen zoals Captoadhere en Nuvia cPrime). Deze modulatie van hydrofobiciteit maakt het mogelijk om optimale condities op maat te maken voor elk mAb. Evenzo wordt de CEX-bind- en elutiestap ook uitgevoerd op een reeks hydrofobiciteiten variërend van mild tot matig, afhankelijk van de gekozen hars. Hoewel deze benadering enige mate van experimenteel werk met zich meebrengt, wordt een voorkeursbenadering met behulp van multimodale chromatografie voor zowel AEX als CEX gebruikt als het primaire platform met een beroep op minder hydrofobe stationaire fasen als het mAb dit vereist. Deze aanpak wordt geïllustreerd in Afb. 5 en is nuttig geweest in termen van zijn reikwijdte van het bestrijken van een breed scala aan mAb-constructen, cellijnen en celkweekprocessen bij KBI.

Afb. 5 . KBI Biopharma's benadering van mAb-downstreamverwerking voor FIH-productie.

Afb. 6 toont de klaringsprofielen voor HMW-aggregaten en HCP's via dit platformproces voor een aantal mAbs. Zoals te zien is in de figuur, worden HMW-aggregaatniveaus van < 1% en lage HCP-niveaus < 50 ppm altijd waargenomen met dit platform. Het vermogen om een ​​breed scala aan mAb-constructies te dekken is een sleutel, vooral voor een CDMO-organisatie zoals KBI.

Afb. 6 . Prestaties van de KBI Biopharma platform DSP-aanpak voor verschillende mAbs. (A) HMW-klaring en (B) HCP-klaring.


Zuivering van bacteriofagen met behulp van anionenuitwisselingschromatografie

Bij bacteriofaagonderzoek en therapie vragen de meeste toepassingen om sterk gezuiverde faagsuspensies. De standaardtechniek hiervoor is ultracentrifugatie met behulp van cesiumchloridegradiënten. Deze techniek is omslachtig, ingewikkeld en duur. Bovendien is het ongeschikt voor de zuivering van grote hoeveelheden faagsuspensies. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van anionenuitwisselingschromatografie om fagen aan een stationaire fase te binden. Dit gebeurt met behulp van een FLPC-systeem, gecombineerd met Convective Interaction Media (CIM ® ) monolieten. Daarna wordt de kolom gewassen om onzuiverheden van de CIM®-schijf te verwijderen. Door gebruik te maken van een bufferoplossing met een hoge ionsterkte worden de fagen vervolgens uit de kolom geëlueerd en verzameld. Op deze manier kunnen fagen efficiënt worden gezuiverd en geconcentreerd. Dit protocol kan worden gebruikt om de optimale buffers, stationaire fasechemie en elutieomstandigheden te bepalen, evenals de maximale capaciteit en herstel van de kolommen.

trefwoorden: Bacteriofaagconcentratie CsCl Ionenuitwisselingschromatografie Zuivering.


  • Verwijder eventuele spaties uit catalogusnummers. Probeer bijvoorbeeld in plaats van te zoeken naar "AZ 12345", te zoeken naar "AZ12345".
  • We raden aan om minder woorden te gebruiken. Probeer bijvoorbeeld in plaats van te zoeken naar "Gravin Automated Cell Counter", te zoeken naar "Gravin".
  • We raden aan om bredere of generieke termen te gebruiken. U kunt uw zoekopdracht verfijnen door filters te gebruiken zoals productcategorie, toepassing, merk en meer.
  • Controleer de spelling van het (de) zoekwoord(en) opnieuw of gebruik de automatische suggestiefunctie in het zoekvak.

Gedetailleerde zoektips

Voer een paar beschrijvende woorden, catalogusnummer of productnaam in om een ​​zoekopdracht uit te voeren. Zoeken retourneert alle documenten of webpagina's die een van de woorden uit uw zoekopdracht bevatten. U kunt uw zoekopdracht verfijnen of verfijnen door woorden van uw zoekopdracht af te trekken of door te filteren in de bovenste of linkerkolom.


Bepaling van natrium en kalium, gebruikmakend van ionenuitwisselingsscheiding

Artikelweergaven zijn de COUNTER-conforme som van full-text artikeldownloads sinds november 2008 (zowel PDF als HTML) bij alle instellingen en individuen. Deze statistieken worden regelmatig bijgewerkt om het gebruik in de aanloop naar de afgelopen dagen weer te geven.

Citaties zijn het aantal andere artikelen waarin dit artikel wordt geciteerd, berekend door Crossref en dagelijks bijgewerkt. Vind meer informatie over Crossref citatietellingen.

De Altmetric Attention Score is een kwantitatieve maat voor de aandacht die een onderzoeksartikel online heeft gekregen. Als u op het donutpictogram klikt, wordt een pagina op altmetric.com geladen met aanvullende details over de score en de aanwezigheid op sociale media voor het betreffende artikel. Vind meer informatie over de Altmetric Attention Score en hoe de score wordt berekend.

Opmerking: In plaats van een samenvatting is dit de eerste pagina van het artikel.


Ionenuitwisselingschromatografie Harsselectie

Ionenuitwisselingschromatografieharsen zijn samengesteld uit positief of negatief geladen functionele groepen die covalent zijn gebonden aan een vaste matrix. Gebruikelijke matrices zijn cellulose, agarose, polymethacrylaat, polystyreen en polyacrylamide. De laatste drie matrices maken hogere stroomsnelheden mogelijk.

Verschillende factoren bepalen de keuze van de hars:

Kiezen tussen een anionenwisselaar en een kationenwisselaar

Voor veel workflows voor eiwitzuivering is eiwitvouwing en -stabiliteit een punt van zorg. In deze scenario's hangt de keuze van een anion- of kationenwisselaar af van de stabiliteit van het eiwit van belang.

Sommige eiwitten zijn zowel boven als onder hun pI stabiel. Deze eiwitten kunnen worden gezuiverd met ofwel een anionen- of kationenwisselaar. Andere eiwitten zijn alleen stabiel boven of onder hun pI. Voor deze eiwitten dicteert stabiliteit de keuze van de hars. Als een eiwit bijvoorbeeld alleen stabiel is boven zijn pI, moet een anionenuitwisselingshars worden gekozen. Wanneer eiwitstabiliteit niet van belang is, kan ofwel een anionen- of kationenwisselaar worden gebruikt.

Zwakke versus sterke ionenwisselaars

Ionenuitwisselingsharsen zijn er in twee soorten: sterk en zwak.

Het aantal kosten op a sterke ionenwisselaar blijft constant, ongeacht de buffer-pH. Deze soorten harsen behouden hun selectiviteit en capaciteit over een breed pH-bereik. Voorbeelden van sterke ionenwisselaars zijn quaternaire ammonium (Q), sulfonaat (S) en sulfopropyl (SP) harsen.

Zwakke ionenwisselaars, daarentegen, vertonen een pH-afhankelijke functie en leveren dus optimale prestaties over slechts een klein pH-bereik. Wanneer de pH van de buffer niet langer overeenkomt met de zuurdissociatieconstante (pKa) van de functionele harsgroep, lijden deze harsen aan aanzienlijk capaciteitsverlies. Zwakke anionenwisselaars functioneren slecht boven een pH van 9 en zwakke kationenwisselaars beginnen hun ionisatie onder pH 6 te verliezen. Bij het werken met zwakke ionenuitwisselingsharsen zoals diethylaminoëthyl (DEAE) of carboxymethyl (CM) harsen, is het belangrijk om binnen de door de leverancier geleverd werkend pH-bereik.

Steun DEAE Hoge Q CM Hoge S
Type uitwisseling Zwak anion Sterk anion Zwak kation Sterk kation
Functionele groep -N+(C2H5)2 -N+(CH3)3 - COO - -DUS 3 -
pH-bereik* 5&ndash9 0&ndash14 5&ndash9 0&ndash14

* Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor het pH-bereik voor elke afzonderlijke hars. Eiwitten van belang zijn mogelijk niet stabiel over het volledige pH-bereik.

Sterke ionenwisselaars zijn vaak voorkeursharsen voor veel toepassingen omdat hun prestatie niet wordt beïnvloed door de pH. Zwakke ionenwisselaars kunnen echter krachtige scheidingshulpmiddelen zijn in gevallen waarin sterke ionenwisselaars falen omdat de selectiviteiten van zwakke en sterke ionenwisselaars vaak verschillen.

Ionische vorm van IEX-hars:

De ionische vorm van een drager verwijst naar het tegenion dat wordt geadsorbeerd aan de functionele groepen van de hars. Dit ion kan worden gewijzigd door de kolom-equilibratiebuffer om te wisselen. Gebruikelijke tegenionen voor anion- en kationenwisselaars zijn respectievelijk Na+ en Cl-.

De sterkte van de interactie met een bepaalde hars varieert voor verschillende tegenionen. Hoe lager de selectiviteit van een tegenion voor de drager, hoe gemakkelijker het kan worden uitgewisseld voor een ander ion met dezelfde lading (bijvoorbeeld het gewenste eiwit). Evenzo zal elutiebuffer die een tegenion bevat met een relatief lagere selectiviteit voor de drager, tijdens de elutie eiwitten uit de kolomhars minder gemakkelijk verdringen. In sommige gevallen kan dit verschil worden uitgebuit en tegenionen zoals Li + , Br - en SO4 2- worden vaak gebruikt om de harsselectiviteit te verbeteren.

Grootte van harsdeeltjes

De deeltjesgrootte van de hars verwijst naar de grootte van de vaste harsdrager. De deeltjesgrootte heeft geen invloed op de selectiviteit van de hars, maar wel op de resolutie.

Fig. 6. Relatie tussen harsdeeltjesgrootte, druk en resolutie.

Kleinere deeltjes bieden een hogere resolutie, maar vereisen doorgaans ook lagere stroomsnelheden. Media met hoge resolutie worden vaak gebruikt voor analytisch en kleinschalig werk, evenals voor de laatste polijststappen van preparatieve chromatografie. Zeer viskeuze monsters zoals geklaard E coli lysaten of monsters die glycerol bevatten, kunnen vaak niet worden gescheiden met IEX-harsen met kleine deeltjes vanwege de verhoogde tegendruk van harsen met kleine deeltjes, die de bedrijfsdruklimiet van de kolom kan overschrijden.

Grotere deeltjes hogere stroomsnelheden mogelijk maken, maar een lagere resolutie opleveren. Een methode die scherpe, duidelijke pieken oplevert met behulp van een IEX-hars met kleine deeltjes, zal bredere, minder gedefinieerde pieken opleveren wanneer een hars met grotere deeltjes wordt gebruikt. IEX-harsen met grote deeltjes zijn een uitstekende keuze voor grootschalige en voorbereidende werkzaamheden. Grotere deeltjesgroottes zijn ook de beste keuze wanneer monsters viskeus zijn, zoals wanneer IEX wordt gebruikt als een eerste stap in een workflow voor eiwitzuivering.

Stroomsnelheid:

Stroomsnelheid: verwijst naar hoe snel buffer over een hars wordt geleid. De stroomsnelheid bepaalt dus de hoeveelheid tijd waarin eiwitten kunnen interageren met de kolomhars, de zogenaamde verblijftijd van een bepaalde kolom bij een bepaald debiet. In tegenstelling tot de deeltjesgrootte beïnvloedt de stroomsnelheid zowel de resolutie als de capaciteit: langere verblijftijden verhogen zowel de capaciteit als de resolutie van een hars.

Fig. 7. Effect van stroomsnelheid op IEX-resolutie. Scheiding van een monster van 5 ml van myoglobine (piek 1), ribonuclease A (piek 2) en cytochroom c (piek 3) op een 1 x 13 cm (8,7 ml) Macro-Prep & reg High Q kationenuitwisselingskolom.

Stroomsnelheden worden niet alleen beperkt door het verlies aan resolutie en capaciteit bij hogere stroomsnelheden, maar ook door de hars zelf. Naarmate de stroomsnelheden toenemen, neemt de druk op de hars toe. Als de tegendruk te hoog is, kan deze de kolomhars verpletteren. Fabrikanten bieden dus een druklimiet voor al hun harsen.

Over het algemeen wordt de snelste stroomsnelheid gekozen die nog steeds de gewenste capaciteit en resolutie oplevert. Hoewel langzamere stroomsnelheden een nog betere resolutie en capaciteit kunnen bieden, gaat dit vaak ten koste van de eiwitactiviteit, aangezien veel eiwitten na verloop van tijd hun activiteit verliezen onder de omstandigheden in het chromatografiesysteem.

Dynamische bindingscapaciteit van hars

De dynamische bindingscapaciteit van een hars verwijst naar de hoeveelheid eiwit die de hars kan binden bij een gegeven stroomsnelheid. Het wordt over het algemeen gerapporteerd als mg/ml eiwit gebonden bij een bepaalde stroomsnelheid. Deze waarde varieert van hars tot hars en kan belangrijk zijn wanneer snelle stroomsnelheden vereist zijn om de eiwitactiviteit te behouden.


Boraatcomplex-ionuitwisselingschromatografie met fluorimetrische detectie voor bepaling van saccharide-ethyleendiamine

Artikelweergaven zijn de COUNTER-conforme som van full-text artikeldownloads sinds november 2008 (zowel PDF als HTML) bij alle instellingen en individuen. Deze statistieken worden regelmatig bijgewerkt om het gebruik in de aanloop naar de afgelopen dagen weer te geven.

Citaties zijn het aantal andere artikelen waarin dit artikel wordt geciteerd, berekend door Crossref en dagelijks bijgewerkt. Vind meer informatie over Crossref citatietellingen.

De Altmetric Attention Score is een kwantitatieve maat voor de aandacht die een onderzoeksartikel online heeft gekregen. Als u op het donutpictogram klikt, wordt een pagina op altmetric.com geladen met aanvullende details over de score en de aanwezigheid op sociale media voor het betreffende artikel. Vind meer informatie over de Altmetric Attention Score en hoe de score wordt berekend.

Opmerking: In plaats van een samenvatting is dit de eerste pagina van het artikel.


Materialen en methodes

Inrichting

Het Hitachi (Tokyo, Japan) L-8500A-systeem wordt gedistribueerd door Sciencetec (Les Ulis, Frankrijk). Monsters werden geplaatst in zelfsluitende flesjes op het autosamplerrek (60 posities) dat op 4 ± 2 °C werd gehouden. Na het spoelen van de naald werd een volume van het monster door de monsterlus opgezogen. Een nauwkeurig volume (20 L gemeten met een precisiespuit van 0,5 ml) werd via de injectieklep op de analytische kolom geïnjecteerd. De chromatografische kolom was een matrix van een hoogmoleculaire organische component, bestaande uit polystyreen verknoopt door divinylbenzeen, met sulfon (SO3 − ) groepen als actieve uitwisselingssites. De kolom [60 mm x 4,6 mm (i.d.)] was gepakt met deeltjes van 3 m en uitgerust met een bewakingskolom van 40 mm x 4,6 mm (i.d.) (ammoniakfilter). AA's werden gescheiden met vier citraatbuffers (Tabel 1). Het gebruikte elutieprogramma (Tabel 2) was enigszins gewijzigd ten opzichte van dat van Hitachi om de scheiding van specifieke AA's te verbeteren. De scheiding van Asn, Glu en Gln werd verbeterd door de kolomtemperatuur te verlagen met 5 °C na 9 min en met 4 °C na 20 min, die van Gly, Ala, citrulline (Cit) en α-aminoboterzuur (α -ABA) door de verhoogde stroom van buffer 2 eerder te starten (op 31,5 min in plaats van 33,5 min), en die van Val door de stap van 100% buffer 2 later te starten (aan op 44,1 min in plaats van 43,0 min). Een verbeterde scheiding van Trp en ethanolamine werd verkregen door de concentratie van benzylalcohol in buffer 3 te verhogen. Een correcte scheiding van basische AA's werd verkregen door de stroom van buffer 4 eerder te starten (aan op 74,1 min in plaats van 77,0 min) en 10% buffer toe te voegen 2 na 79 min, en het verlagen van de kolomtemperatuur met 10 °C na 86 min.

Detectie was door spectrofotometrie bij 570 en 440 nm met de ninhydrinereactie.

Vóór de volgende monsterinjectie werd de kolom 19 min met 100% buffer 1 in evenwicht gebracht (totale looptijd 149 min).

Buffers

Alle buffers kunnen worden gekocht (Mitsubishi, Japan) als een geheel pakket of worden voorbereid. We hebben de buffers bereid met HPLC-kwaliteit water gegenereerd met een Milli-Q waterzuiveringssysteem (Millipore, Molsheim, Frankrijk). De chemicaliën en oplosmiddelen waren van analytische kwaliteit. Trilithiumcitraattetrahydraat, lithiumchloride, citroenzuurmonohydraat, lithiumhydroxidemonohydraat en benzylalcohol werden gekocht bij Merck (Darmstadt, Duitsland). Pure ethanol werd geleverd door Farmitalia Carlo Erba (Milano, Italië), thiodiglycol werd gekocht bij Prolabo (Parijs, Frankrijk) en caprylzuur van Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, Frankrijk). Chemicaliën werden nauwkeurig gewogen zodat pH-meting niet nodig was. Elke buffer werd vóór gebruik door een filter van 0,22 m (Millipore) gefiltreerd en in het apparaat onder stikstof gehouden. Gedurende het hele elutieprogramma was de stroomsnelheid voor bufferoplossingen 0,35 ml/min.

Ninhydrinereagens

Het ninhydrinereagens, geleverd door Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan), bestond uit 1 L ninhydrine-oplossing (bevat ninhydrine, natriumboorhydraat en propyleenglycolmonomethylether) en 1 L bufferoplossing (bevat dihydraat lithiumacetaat, ijsazijn zuur en propyleenglycolmonomethylether). Tijdens het lopen van het monster mengt de afgiftepomp voor het ninhydrinereagens automatisch de twee oplossingen die in het apparaat onder stikstof worden bewaard. De stroomsnelheid voor ninhydrine-oplossing was 0,30 ml/min.

Kalibrator en monstervoorbereiding

Met commerciële oplossingen (Sigma-Aldrich) werd een 100 mol/L kalibratorvoorraadoplossing met 37 fysiologische AA's bereid. Gln (Sigma-Aldrich) werd in dezelfde concentratie toegevoegd en acetyllysine (Aclys Sigma-Aldrich) werd toegevoegd met 1000 mol/L.

We evalueerden gepoold menselijk plasma van gehospitaliseerde patiënten (precisietests binnen en tussen runs), fysiologische vloeistoffen van verschillende oorsprong, zoals plasma van mensen of ratten, supernatant van homogenaat uit rattenweefsel (regressievergelijking), commerciële kalibratoroplossingen (bereik van lineariteit ), en humaan plasma van gezonde vrijwilligers (bepaling van het fysiologische bereik in plasma). Bovendien werd de urinecontrole-oplossing van Bio-Rad (Ivry-sur-Seine, Frankrijk) gebruikt om AA-concentraties in urine te meten (precisie-assays binnen en tussen runs), met name die van 3-methylhistidine (3MH), een interessante AA om te bestuderen in zowel ondervoeding als hyperkatabole toestanden, aangezien de uitscheiding via de urine het myofibrillaire katabolisme in spieren weerspiegelt( 16).

Onze procedures voldeden aan de Helsinki-verklaring van 1975 voor menselijke proefpersonen, zoals herzien in 1983. Dierenverzorging voldeed aan de richtlijnen van onze instelling, twee van ons (CC-L. en LC) officieel geautoriseerd (nr. 004963 en nr. 005226 ) door het Franse Ministerie van Land- en Bosbouw voor dierproeven.

Bloed werd afgenomen in gehepariniseerde buizen na 5 uur vasten voor ratten, en ofwel in de postabsorptieve toestand voor gehospitaliseerde patiënten of na een nacht vasten voor 100 gezonde vrijwilligers (36 ± 10 jaar 41 mannen, 59 vrouwen). Plasma werd onmiddellijk gescheiden door koude centrifugatie (4 ° C, 3500G), zonder uitstel van eiwitten ontdaan met sulfosalicylzuur (40 g/L), en geanalyseerd of bewaard bij -80 °C tot analyse.

Rattenweefsels (lever, skeletspieren) werden bij opoffering snel verwijderd, afgeveegd, gewogen en ingevroren in vloeibare stikstof. Weefselmonsters werden gehomogeniseerd (4 °C) in 10% trichloorazijnzuur (10 ml/g weefsel), dat 0,5 mmol/L EDTA bevatte, met een Ultra-Turrax T25 weefselverstoorder (Médi Sciences, Saint-Maur-des-Fossés, Frankrijk). De in zuur oplosbare fractie werd gescheiden door koude centrifugatie (4 ° C, 3500G). Vrije AA-concentraties werden gemeten in het supernatant.

Voor analyse werden de controle en monsters verdund (1:1 op vol) in buffer 1 met 1000 mol/L Aclys als interne kalibrator.

De precisie binnen de run werd bestudeerd door 10 opeenvolgende runs van de plasmapool van gehospitaliseerde patiënten en van de Bio-Rad urinecontroleoplossing uit te voeren. Om een ​​breed scala aan waarden voor plasma te hebben, werden drie concentraties bestudeerd: laag (L, plasmapool verdund met buffer 1 1:2 per vol), gemiddeld (M, plasmapool) en hoog (H, plasmapool aangevuld met de AA-kalibratoroplossing geleverd door Sigma 1:1 per vol). De precisie van de retentietijden binnen de run werd bestudeerd door 10 opeenvolgende injecties van de M-concentratieplasmapool en die van de urinecontroleoplossing.

Precisietesten tussen runs werden uitgevoerd met de M-concentratie van de plasmapool en de Bio-Rad-urinecontroleoplossing gemeten in 10 verschillende series. Reeksen werden gedefinieerd door nieuwe kalibratieprocedures wanneer het ninhydrinereagens en (of) een of meer buffers moesten worden vervangen.

Er werd een regressievergelijking uitgevoerd door 77 verschillende fysiologische vloeistoffen [plasma van mens of rat, supernatant van homogenaat van rattenweefsel (lever en skeletspieren)] te analyseren met de Hitachi L-8500A en de Beckman 6300 (Palo Alto, CA), een veelgebruikte systeem voor AA-analyse.

Lineariteits- en detectielimietbepalingen werden uitgevoerd door seriële verdunningen van de ijkoplossingen in buffer 1. Een Gin-oplossing werd op dezelfde manier verdund. De onderzochte concentraties varieerden van 5 tot 2500 mol/L.

De overdracht van monsters werd geanalyseerd zoals aanbevolen door de Franse Vereniging voor Klinische Biologie (17). Er werden twee plasmapools gebruikt: AA bij L- en H-concentraties. We maten de initiële concentratie voor elke AA in elk monster (L1 en H1), dan is de H-concentratie tweemaal (H2, H3), en vervolgens L-concentratie tweemaal (L2, L3). Deze reeks (H2, H3, L2, L3) werd zes keer getest. Voor elke AA gebruikten we de Student's paired t-test om de gemiddelde waarde voor L . te vergelijken2 met die verkregen voor L1, en de gemiddelde waarde van L3 met die van L2.

Statistische analyse

Resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD.

Student gekoppeld t-test en regressie werden toegepast met het PCSM (Programme Conversationnel de Statistiques pour les Sciences et le Marketing) Deltasoft-programma (Grenoble-Meylan, Frankrijk). Verschillen werden als significant beschouwd wanneer: P <0,05.

De Kolmogorov-Smirnov-test toonde aan dat de AA-concentraties in menselijk plasma normaal verdeeld waren, in overeenstemming met de literatuur (18).


Inhoud

Ionenchromatografie heeft zich in de loop van vele jaren ontwikkeld door de accumulatie van kennis. Vanaf 1947 gebruikten Spedding en Powell verdringings-ionenuitwisselingschromatografie voor de scheiding van de zeldzame aarden. Bovendien toonden ze de ionenuitwisselingsscheiding van 14N- en 15N-isotopen in ammoniak. Aan het begin van de jaren vijftig demonstreerden Kraus en Nelson het gebruik van veel analytische methoden voor metaalionen, afhankelijk van hun scheiding van hun chloride-, fluoride-, nitraat- of sulfaatcomplexen door anionchromatografie. Automatische in-line detectie werd geleidelijk geïntroduceerd van 1960 tot 1980, evenals nieuwe chromatografische methoden voor metaalionscheidingen. Een baanbrekende methode van Small, Stevens en Bauman van Dow Chemical Co. leidde tot de ontwikkeling van de moderne ionchromatografie. Anionen en kationen konden nu efficiënt worden gescheiden door een systeem van onderdrukte geleidbaarheidsdetectie. In 1979 werd een methode voor anionchromatografie met niet-onderdrukte geleidbaarheidsdetectie geïntroduceerd door Gjerde et al. In 1980 volgde een vergelijkbare methode voor kationchromatografie. [10]

Als gevolg hiervan begon een periode van extreme concurrentie binnen de IC-markt, met aanhangers voor zowel onderdrukte als niet-onderdrukte geleidbaarheidsdetectie. Deze competitie leidde tot een snelle groei van nieuwe vormen en de snelle evolutie van IC. [11] Een uitdaging die moet worden overwonnen bij de toekomstige ontwikkeling van IC is de voorbereiding van zeer efficiënte monolithische ionenuitwisselingskolommen en het overwinnen van deze uitdaging zou van groot belang zijn voor de ontwikkeling van IC. [12]

De opkomst van ionenuitwisselingschromatografie begon voornamelijk tussen 1935 en 1950 tijdens de Tweede Wereldoorlog en het was door het "Manhattan-project" dat toepassingen en IC aanzienlijk werden uitgebreid. Ionenchromatografie werd oorspronkelijk geïntroduceerd door twee Engelse onderzoekers, landbouwkundige Sir Thompson en chemicus JT Way. De werken van Thompson en Way omvatten de werking van in water oplosbare mestzouten, ammoniumsulfaat en kaliumchloride. Deze zouten konden door de regen niet gemakkelijk uit de grond worden gehaald. Ze voerden ionenmethoden uit om klei met de zouten te behandelen, wat resulteerde in de extractie van ammoniak naast het vrijkomen van calcium. [13] [ onbetrouwbare bron? ] Het was in de jaren vijftig en zestig dat theoretische modellen voor IC werden ontwikkeld voor meer begrip en pas in de jaren zeventig werden continue detectoren gebruikt, die de weg vrijmaakten voor de ontwikkeling van lagedrukchromatografie naar high-performance chromatografie. Pas in 1975 werd "ionchromatografie" als naam voor de technieken ingevoerd en werd daarna als naam voor marketingdoeleinden gebruikt. Tegenwoordig is IC belangrijk voor het onderzoeken van waterige systemen, zoals drinkwater. Het is een populaire methode voor het analyseren van anionische elementen of complexen die helpen bij het oplossen van milieurelevante problemen. Evenzo heeft het ook geweldige toepassingen in de halfgeleiderindustrie.

Vanwege de overvloedige scheidingskolommen, elutiesystemen en detectoren die beschikbaar zijn, heeft chromatografie zich ontwikkeld tot de belangrijkste methode voor ionenanalyse. [14]

Toen deze techniek in eerste instantie werd ontwikkeld, werd deze voornamelijk gebruikt voor waterbehandeling. Sinds 1935 manifesteerde ionenuitwisselingschromatografie zich snel in een van de meest gebruikte technieken, waarbij de principes ervan vaak worden toegepast op de meeste chemische gebieden, waaronder destillatie, adsorptie en filtratie. [15]

Ionenuitwisselingschromatografie scheidt moleculen op basis van hun respectievelijke geladen groepen. Ionenuitwisselingschromatografie houdt analytmoleculen op de kolom vast op basis van coulombische (ionische) interacties. De ionenuitwisselingschromatografiematrix bestaat uit positief en negatief geladen ionen. [16] In wezen ondergaan moleculen elektrostatische interacties met tegengestelde ladingen op de stationaire fasematrix. De stationaire fase bestaat uit een immobiele matrix die geladen ioniseerbare functionele groepen of liganden bevat. [17] Het oppervlak van de stationaire fase vertoont ionische functionele groepen (R-X) die interageren met analytionen van tegengestelde lading. Om elektroneutraliteit te bereiken, koppelen deze inerte ladingen met uitwisselbare tegenionen in de oplossing. Ioniseerbare moleculen die gezuiverd moeten worden, concurreren met deze uitwisselbare tegenionen voor binding aan de geïmmobiliseerde ladingen op de stationaire fase. Deze ioniseerbare moleculen worden vastgehouden of geëlueerd op basis van hun lading. Aanvankelijk worden moleculen die niet of zwak binden aan de stationaire fase eerst weggespoeld. Veranderde omstandigheden zijn nodig voor de elutie van de moleculen die aan de stationaire fase binden. De concentratie van de uitwisselbare tegenionen, die concurreert met de moleculen voor binding, kan worden verhoogd of de pH kan worden gewijzigd. Een verandering in pH beïnvloedt de lading op de specifieke moleculen en verandert daarom de binding. De moleculen beginnen dan uit te elueren op basis van de veranderingen in hun ladingen van de aanpassingen. Verdere dergelijke aanpassingen kunnen worden gebruikt om het van belang zijnde eiwit vrij te maken. Bovendien kan de concentratie van tegenionen geleidelijk worden gevarieerd om geïoniseerde moleculen te scheiden. Dit type elutie wordt gradiëntelutie genoemd. Aan de andere kant kan stap-elutie worden gebruikt waarbij de concentratie van tegenionen in één stap wordt gevarieerd. [1] Dit type chromatografie is verder onderverdeeld in kationenuitwisselingschromatografie en anionenuitwisselingschromatografie. Positief geladen moleculen binden aan kationenuitwisselingsharsen, terwijl negatief geladen moleculen binden aan anionenuitwisselingsharsen. [18] De ionische verbinding bestaande uit de kationische soorten M+ en de anionische soort B- kan worden vastgehouden door de stationaire fase.

Kationenuitwisselingschromatografie behoudt positief geladen kationen omdat de stationaire fase een negatief geladen functionele groep vertoont:

Anionuitwisselingschromatografie behoudt anionen met behulp van positief geladen functionele groep:

Merk op dat de ionsterkte van C+ of A- in de mobiele fase kan worden aangepast om de evenwichtspositie te verschuiven, dus de retentietijd.

Het ionchromatogram toont een typisch chromatogram verkregen met een anionenuitwisselingskolom.

Voordat ionenuitwisselingschromatografie kan worden gestart, moet deze worden geëquilibreerd. De stationaire fase moet in evenwicht zijn met bepaalde vereisten die afhankelijk zijn van het experiment waarmee u werkt. Eenmaal geëquilibreerd, zullen de geladen ionen in de stationaire fase worden gehecht aan de tegengestelde geladen uitwisselbare ionen. Uitwisselbare ionen zoals Cl- of Na+. Vervolgens moet een buffer worden gekozen waarin het gewenste eiwit kan binden. Na equilibratie moet de kolom worden gewassen. De wasfase zal helpen om alle onzuiverheden die niet aan de matrix binden te verwijderen, terwijl het eiwit van belang gebonden blijft. Deze monsterbuffer moet dezelfde pH hebben als de buffer die voor equilibratie wordt gebruikt om de gewenste eiwitten te helpen binden. Ongeladen eiwitten zullen uit de kolom worden geëlueerd met een vergelijkbare snelheid als de buffer die door de kolom stroomt. Zodra het monster op de kolom is geladen en de kolom is gewassen met de buffer om alle niet-gewenste eiwitten eruit te elueren, wordt elutie uitgevoerd om de gewenste eiwitten die aan de matrix zijn gebonden te elueren. Gebonden eiwitten worden eruit geëlueerd door gebruik te maken van een gradiënt van lineair toenemende zoutconcentratie. Met toenemende ionsterkte van de buffer zullen de zoutionen concurreren met de gewenste eiwitten om te binden aan geladen groepen op het oppervlak van het medium. Hierdoor zullen gewenste eiwitten uit de kolom worden geëlueerd. Eiwitten met een lage nettolading zullen als eerste worden geëlueerd naarmate de zoutconcentratie toeneemt, waardoor de ionsterkte toeneemt. Eiwitten met een hoge nettolading hebben een hogere ionsterkte nodig om uit de kolom te worden geëlueerd. [16] Het is mogelijk om ionenuitwisselingschromatografie in bulk uit te voeren, op dunne mediumlagen zoals glas- of plastic platen gecoat met een laag van de gewenste stationaire fase, of in chromatografiekolommen. Dunnelaagchromatografie of kolomchromatografie delen overeenkomsten in die zin dat ze beide werken binnen dezelfde leidende principes, er is een constante en frequente uitwisseling van moleculen terwijl de mobiele fase langs de stationaire fase reist. Het is niet noodzakelijk om het monster in kleine volumes toe te voegen, aangezien de vooraf bepaalde voorwaarden voor de uitwisselingskolom zijn gekozen zodat er een sterke interactie zal zijn tussen de mobiele en stationaire fasen. Bovendien zal het mechanisme van het elutieproces een compartimentering van de verschillende moleculen veroorzaken op basis van hun respectieve chemische eigenschappen. Dit fenomeen is te wijten aan een toename van de zoutconcentraties aan of nabij de bovenkant van de kolom, waardoor de moleculen op die positie worden verplaatst, terwijl lager gebonden moleculen op een later moment worden vrijgegeven wanneer de hogere zoutconcentratie dat gebied bereikt. These principles are the reasons that ion exchange chromatography is an excellent candidate for initial chromatography steps in a complex purification procedure as it can quickly yield small volumes of target molecules regardless of a greater starting volume. [2]

Comparatively simple devices are often used to apply counterions of increasing gradient to a chromatography column. Counterions such as copper (II) are chosen most often for effectively separating peptides and amino acids through complex formation. [19]

A simple device can be used to create a salt gradient. Elution buffer is consistently being drawn from the chamber into the mixing chamber, thereby altering its buffer concentration. Generally, the buffer placed into the chamber is usually of high initial concentration, whereas the buffer placed into the stirred chamber is usually of low concentration. As the high concentration buffer from the left chamber is mixed and drawn into the column, the buffer concentration of the stirred column gradually increase. Altering the shapes of the stirred chamber, as well as of the limit buffer, allows for the production of concave, linear, or convex gradients of counterion.

A multitude of different mediums are used for the stationary phase. Among the most common immobilized charged groups used are trimethylaminoethyl (TAM), triethylaminoethyl (TEAE), diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl (QAE), aminoethyl (AE), diethylaminoethyl (DEAE), sulpho (S), sulphomethyl (SM), sulphopropyl (SP), carboxy (C), and carboxymethyl (CM). [1]

Successful packing of the column is an important aspect of ion chromatography. Stability and efficiency of a final column depends on packing methods, solvent used, and factors that affect mechanical properties of the column. In contrast to early inefficient dry- packing methods, wet slurry packing, in which particles that are suspended in an appropriate solvent are delivered into a column under pressure, shows significant improvement. Three different approaches can be employed in performing wet slurry packing: the balanced density method (solvent’s density is about that of porous silica particles), the high viscosity method (a solvent of high viscosity is used), and the low viscosity slurry method (performed with low viscosity solvents). [20]

Polystyrene is used as a medium for ion- exchange. It is made from the polymerization of styrene with the use of divinylbenzene and benzoyl peroxide. Such exchangers form hydrophobic interactions with proteins which can be irreversible. Due to this property, polystyrene ion exchangers are not suitable for protein separation. They are used on the other hand for the separation of small molecules in amino acid separation and removal of salt from water. Polystyrene ion exchangers with large pores can be used for the separation of protein but must be coated with a hydrophilic substance. [21]

Cellulose based medium can be used for the separation of large molecules as they contain large pores. Protein binding in this medium is high and has low hydrophobic character. DEAE is an anion exchange matrix that is produced from a positive side group of diethylaminoethyl bound to cellulose or Sephadex. [22]

Agarose gel based medium contain large pores as well but their substitution ability is lower in comparison to dextrans. The ability of the medium to swell in liquid is based on the cross-linking of these substances, the pH and the ion concentrations of the buffers used. [21]

Incorporation of high temperature and pressure allows a significant increase in the efficiency of ion chromatography, along with a decrease in time. Temperature has an influence of selectivity due to its effects on retention properties. The retention factor (k = (tR g − tm g )/(tm g − text)) increases with temperature for small ions, and the opposite trend is observed for larger ions. [23] [24]

Despite ion selectivity in different mediums, further research is being done to perform ion exchange chromatography through the range of 40–175 °C. [25]

An appropriate solvent can be chosen based on observations of how column particles behave in a solvent. Using an optical microscope, one can easily distinguish a desirable dispersed state of slurry from aggregated particles. [20]

A "strong" ion exchanger will not lose the charge on its matrix once the column is equilibrated and so a wide range of pH buffers can be used. "Weak" ion exchangers have a range of pH values in which they will maintain their charge. If the pH of the buffer used for a weak ion exchange column goes out of the capacity range of the matrix, the column will lose its charge distribution and the molecule of interest may be lost. [26] Despite the smaller pH range of weak ion exchangers, they are often used over strong ion exchangers due to their having greater specificity. In some experiments, the retention times of weak ion exchangers are just long enough to obtain desired data at a high specificity. [27]

Resins (often termed 'beads') of ion exchange columns may include functional groups such as weak/strong acids and weak/strong bases. There are also special columns that have resins with amphoteric functional groups that can exchange both cations and anions. [28] Some examples of functional groups of strong ion exchange resins are quaternary ammonium cation (Q), which is an anion exchanger, and sulfonic acid (S, -SO2OH), which is a cation exchanger. [29] These types of exchangers can maintain their charge density over a pH range of 0–14. Examples of functional groups of Weak ion exchange resins include diethylaminoethyl (DEAE, -C2H4N(CH2H5)2), which is an anion exchanger, and carboxymethyl (CM, -CH2-COOH), [30] which is a cation exchanger. These two types of exchangers can maintain the charge density of their columns over a pH range of 5–9. [ citaat nodig ]

In ion chromatography, the interaction of the solute ions and the stationary phase based on their charges determines which ions will bind and to what degree. When the stationary phase features positive groups which attracts anions, it is called an anion exchanger when there are negative groups on the stationary phase, cations are attracted and it is a cation exchanger. [31] The attraction between ions and stationary phase also depends on the resin, organic particles used as ion exchangers.

Each resin features relative selectivity which varies based on the solute ions present who will compete to bind to the resin group on the stationary phase. The selectivity coefficient, the equivalent to the equilibrium constant, is determined via a ratio of the concentrations between the resin and each ion, however, the general trend is that ion exchangers prefer binding to the ion with a higher charge, smaller hydrated radius, and higher polarizability, or the ability for the electron cloud of an ion to be disrupted by other charges. [32] Despite this selectivity, excess amounts of an ion with a lower selectivity introduced to the column would cause the lesser ion to bind more to the stationary phase as the selectivity coefficient allows fluctuations in the binding reaction that takes place during ion exchange chromatography.

Following table shows the commonly used ion exchangers [33]

Sorry. Nee Name Type Functional group
1 DEAE Cellulose (Anion exchanger) Weakly basic DEAE (Diethylaminoethyl)
2 QAE Sephadex (Anion exchanger) Strongly basic QAE (Quaternary aminoethyl)
3 Q Sepharose (Anion exchanger) Strongly basic Q (Quaternary ammonium)
4 CM- Cellulose (Cation exchanger) Weakly acidic CM (Carboxymethyl)
5 SP Sepharose (Cation exchanger) Strongly acidic SP (Sulfopropyl)
6 SOURCE S (Cation exchanger) Strongly acidic S (Methyl sulfate)

A sample is introduced, either manually or with an autosampler, into a sample loop of known volume. A buffered aqueous solution known as the mobile phase carries the sample from the loop onto a column that contains some form of stationary phase material. This is typically a resin or gel matrix consisting of agarose or cellulose beads with covalently bonded charged functional groups. Equilibration of the stationary phase is needed in order to obtain the desired charge of the column. If the column is not properly equilibrated the desired molecule may not bind strongly to the column. The target analytes (anions or cations) are retained on the stationary phase but can be eluted by increasing the concentration of a similarly charged species that displaces the analyte ions from the stationary phase. For example, in cation exchange chromatography, the positively charged analyte can be displaced by adding positively charged sodium ions. The analytes of interest must then be detected by some means, typically by conductivity or UV/visible light absorbance.

Control an IC system usually requires a chromatography data system (CDS). In addition to IC systems, some of these CDSs can also control gas chromatography (GC) and HPLC.

A type of ion exchange chromatography, membrane exchange [34] [35] is a relatively new method of purification designed to overcome limitations of using columns packed with beads. Membrane Chromatographic [36] [37] devices are cheap to mass-produce and disposable unlike other chromatography devices that require maintenance and time to revalidate. There are three types of membrane absorbers that are typically used when separating substances. The three types are flat sheet, hollow fibre, and radial flow. The most common absorber and best suited for membrane chromatography is multiple flat sheets because it has more absorbent volume. It can be used to overcome mass transfer limitations [38] and pressure drop, [39] making it especially advantageous for isolating and purifying viruses, plasmid DNA, and other large macromolecules. The column is packed with microporous membranes with internal pores which contain adsorptive moieties that can bind the target protein. Adsorptive membranes are available in a variety of geometries and chemistry which allows them to be used for purification and also fractionation, concentration, and clarification in an efficiency that is 10 fold that of using beads. [40] Membranes can be prepared through isolation of the membrane itself, where membranes are cut into squares and immobilized. A more recent method involved the use of live cells that are attached to a support membrane and are used for identification and clarification of signaling molecules. [41]

Ion exchange chromatography can be used to separate proteins because they contain charged functional groups. The ions of interest (in this case charged proteins) are exchanged for another ions (usually H + ) on a charged solid support. The solutes are most commonly in a liquid phase, which tends to be water. Take for example proteins in water, which would be a liquid phase that is passed through a column. The column is commonly known as the solid phase since it is filled with porous synthetic particles that are of a particular charge. These porous particles are also referred to as beads, may be aminated (containing amino groups) or have metal ions in order to have a charge. The column can be prepared using porous polymers, for macromolecules over 100,000 the optimum size of the porous particle is about 1 μm 2 . This is because slow diffusion of the solutes within the pores does not restrict the separation quality. [42] The beads containing positively charged groups, which attract the negatively charged proteins, are commonly referred to as anion exchange resins. The amino acids that have negatively charged side chains at pH 7 (pH of water) are glutamate and aspartate. The beads that are negatively charged are called cation exchange resins, as positively charged proteins will be attracted. The amino acids that have positively charged side chains at pH 7 are lysine, histidine and arginine. [43]

The isoelectric point is the pH at which a compound - in this case a protein - has no net charge. A protein’s isoelectric point or PI can be determined using the pKa of the side chains, if the amino (positive chain) is able to cancel out the carboxyl (negative) chain, the protein would be at its PI. Using buffers instead of water for proteins that do not have a charge at pH 7, is a good idea as it enables the manipulation of pH to alter ionic interactions between the proteins and the beads. [44] Weakly acidic or basic side chains are able to have a charge if the pH is high or low enough respectively. Separation can be achieved based on the natural isoelectric point of the protein. Alternatively a peptide tag can be genetically added to the protein to give the protein an isoelectric point away from most natural proteins (e.g., 6 arginines for binding to a cation-exchange resin or 6 glutamates for binding to an anion-exchange resin such as DEAE-Sepharose).

Elution by increasing ionic strength of the mobile phase is more subtle. It works because ions from the mobile phase interact with the immobilized ions on the stationary phase, thus "shielding" the stationary phase from the protein, and letting the protein elute.

Elution from ion-exchange columns can be sensitive to changes of a single charge- chromatofocusing. Ion-exchange chromatography is also useful in the isolation of specific multimeric protein assemblies, allowing purification of specific complexes according to both the number and the position of charged peptide tags. [45] [46]

Gibbs–Donnan effect Edit

In ion exchange chromatography, the Gibbs–Donnan effect is observed when the pH of the applied buffer and the ion exchanger differ, even up to one pH unit. For example, in anion-exchange columns, the ion exchangers repeal protons so the pH of the buffer near the column differs is higher than the rest of the solvent. [47] As a result, an experimenter has to be careful that the protein(s) of interest is stable and properly charged in the "actual" pH.

This effect comes as a result of two similarly charged particles, one from the resin and one from the solution, failing to distribute properly between the two sides there is a selective uptake of one ion over another. [48] [49] For example, in a sulphonated polystyrene resin, a cation exchange resin, the chlorine ion of a hydrochloric acid buffer should equilibrate into the resin. However, since the concentration of the sulphonic acid in the resin is high, the hydrogen of HCl has no tendency to enter the column. This, combined with the need of electroneutrality, leads to a minimum amount of hydrogen and chlorine entering the resin. [49]

Clinical utility Edit

A use of ion chromatography can be seen in the argentation ion chromatography. [ citaat nodig ] Usually, silver and compounds containing acetylenic and ethylenic bonds have very weak interactions. This phenomenon has been widely tested on olefin compounds. The ion complexes the olefins make with silver ions are weak and made based on the overlapping of pi, sigma, and d orbitals and available electrons therefore cause no real changes in the double bond. This behavior was manipulated to separate lipids, mainly fatty acids from mixtures in to fractions with differing number of double bonds using silver ions. The ion resins were impregnated with silver ions, which were then exposed to various acids (silicic acid) to elute fatty acids of different characteristics.

Detection limits as low as 1 μM can be obtained for alkali metal ions. [50] It may be used for measurement of HbA1c, porphyrin and with water purification. Ion Exchange Resins(IER) have been widely used especially in medicines due to its high capacity and the uncomplicated system of the separation process. One of the synthetic uses is to use Ion Exchange Resins for kidney dialysis. This method is used to separate the blood elements by using the cellulose membraned artificial kidney. [51]

Another clinical application of ion chromatography is in the rapid anion exchange chromatography technique used to separate creatine kinase (CK) isoenzymes from human serum and tissue sourced in autopsy material (mostly CK rich tissues were used such as cardiac muscle and brain). [ citaat nodig ] These isoenzymes include MM, MB, and BB, which all carry out the same function given different amino acid sequences. The functions of these isoenzymes are to convert creatine, using ATP, into phosphocreatine expelling ADP. Mini columns were filled with DEAE-Sephadex A-50 and further eluted with tris- buffer sodium chloride at various concentrations (each concentration was chosen advantageously to manipulate elution). Human tissue extract was inserted in columns for separation. All fractions were analyzed to see total CK activity and it was found that each source of CK isoenzymes had characteristic isoenzymes found within. Firstly, CK- MM was eluted, then CK-MB, followed by CK-BB. Therefore, the isoenzymes found in each sample could be used to identify the source, as they were tissue specific.

Using the information from results, correlation could be made about the diagnosis of patients and the kind of CK isoenzymes found in most abundant activity. From the finding, about 35 out of 71 patients studied suffered from heart attack (myocardial infarction) also contained an abundant amount of the CK-MM and CK-MB isoenzymes. Findings further show that many other diagnosis including renal failure, cerebrovascular disease, and pulmonary disease were only found to have the CK-MM isoenzyme and no other isoenzyme. The results from this study indicate correlations between various diseases and the CK isoenzymes found which confirms previous test results using various techniques. Studies about CK-MB found in heart attack victims have expanded since this study and application of ion chromatography.

Industrial applications Edit

Since 1975 ion chromatography has been widely used in many branches of industry. The main beneficial advantages are reliability, very good accuracy and precision, high selectivity, high speed, high separation efficiency, and low cost of consumables. The most significant development related to ion chromatography are new sample preparation methods improving the speed and selectivity of analytes separation lowering of limits of detection and limits of quantification extending the scope of applications development of new standard methods miniaturization and extending the scope of the analysis of a new group of substances. Allows for quantitative testing of electrolyte and proprietary additives of electroplating baths. [52] It is an advancement of qualitative hull cell testing or less accurate UV testing. Ions, catalysts, brighteners and accelerators can be measured. [52] Ion exchange chromatography has gradually become a widely known, universal technique for the detection of both anionic and cationic species. Applications for such purposes have been developed, or are under development, for a variety of fields of interest, and in particular, the pharmaceutical industry. The usage of ion exchange chromatography in pharmaceuticals has increased in recent years, and in 2006, a chapter on ion exchange chromatography was officially added to the United States Pharmacopia-National Formulary (USP-NF). Furthermore, in 2009 release of the USP-NF, the United States Pharmacopia made several analyses of ion chromatography available using two techniques: conductivity detection, as well as pulse amperometric detection. Majority of these applications are primarily used for measuring and analyzing residual limits in pharmaceuticals, including detecting the limits of oxalate, iodide, sulfate, sulfamate, phosphate, as well as various electrolytes including potassium, and sodium. In total, the 2009 edition of the USP-NF officially released twenty eight methods of detection for the analysis of active compounds, or components of active compounds, using either conductivity detection or pulse amperometric detection. [53]

Drug development Edit

There has been a growing interest in the application of IC in the analysis of pharmaceutical drugs. IC is used in different aspects of product development and quality control testing. For example, IC is used to improve stabilities and solubility properties of pharmaceutical active drugs molecules as well as used to detect systems that have higher tolerance for organic solvents. IC has been used for the determination of analytes as a part of a dissolution test. For instance, calcium dissolution tests have shown that other ions present in the medium can be well resolved among themselves and also from the calcium ion. Therefore, IC has been employed in drugs in the form of tablets and capsules in order to determine the amount of drug dissolve with time. [54] IC is also widely used for detection and quantification of excipients or inactive ingredients used in pharmaceutical formulations. Detection of sugar and sugar alcohol in such formulations through IC has been done due to these polar groups getting resolved in ion column. IC methodology also established in analysis of impurities in drug substances and products. Impurities or any components that are not part of the drug chemical entity are evaluated and they give insights about the maximum and minimum amounts of drug that should be administered in a patient per day. [55]