Informatie

Optimalisatie van gloeitemperatuur


Ik probeer de gloeitemperatuur voor sommige primerparen te optimaliseren. Ik heb optimalisatie geprobeerd met behulp van cDNA, genomisch DNA, Taq-polymerase, phusion-polymerase enz., maar elke keer krijg ik ofwel niet-specifieke amplificatie, een band die groter is dan verwacht of geen amplificatie. Elke keer krijg ik een primer-dimeer. Kan iemand mij helpen de gloeitemperatuur te optimaliseren?


Ik ga deze vraag een blinde poging geven, ervan uitgaande dat je het hebt over PCR (omdat je het hebt over genomisch DNA en cDNA) en niet over RT-PCR of qPCR, aangezien ik er heel weinig over weet. Dit antwoord is niet noodzakelijkerwijs optimalisatie voor gloeien, maar het controleren van enkele basisprincipes en mogelijke oplossingen. In mijn werk moest ik veel plaatsgerichte mutagenese en genotypering uitvoeren en er zijn enkele belangrijke regels die u moet volgen in uw primerontwerp. Probeer eerst uw primerlengte tussen 25-30 te houden voor sequencing (tenminste dat is wat ik doe) en voor plaatsgerichte mutagenese tussen 25-45, aangezien alles boven de 45 basen de kans op secundaire structuurvorming vergroot. De smelttemperatuur van de primer (Tm) moet >=78 oC zijn (Tm= 81,5 + 0,41(%GC)-675/N [waarbij N de lengte van de primer in basen is]). Ook moeten primers een minimaal CG-gehalte van 40% hebben en idealiter beginnen en eindigen met een C of G. Controleer dus uw primer-CG%, want als deze te hoog is, zal dit enkele problemen veroorzaken, waaronder een verhoogde Tm en de mogelijkheid van primer-dimeer vorming door CG drievoudige waterstofbinding. Dit document bevat wat leuke informatie (http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/210518.pdf)

Naar mijn mening, als al het andere faalt en je nog steeds worstelt met je primers, ontwerp dan indien mogelijk een nieuwe primerset. Om nu terug te komen op het probleem met de gloeitemperatuur, in mijn ervaring voor cDNA, werkt een gloeitemperatuur van 50 oC het beste en voor genomisch DNA werkt een gloeitemperatuur van 55 oC het beste, wat ongeveer het bereik is waar de meeste mensen mee werken en die ik tot nu toe heb gehad geen problemen. Ik ben meer dan blij om mijn genomische DNA PCR-cyclusinformatie met u te delen als u dat wenst via een bewerking.

Ik hoop dat dit helpt!


QPCR-assay ontwerp en optimalisatie

Een succesvolle qPCR-assay vereist een efficiënte en specifieke amplificatie van het product. Zowel de primers als de doelsequentie kunnen de efficiëntie en specificiteit van de amplificatie beïnvloeden en daarmee de nauwkeurigheid van qPCR-assays. Daarom moet voorzichtigheid worden betracht bij het kiezen van een doelsequentie en het ontwerpen van primers. Het gebruik van PCR-primers die speciaal zijn ontworpen en gevalideerd voor qPCR-assays met uw doel van interesse, wordt ten zeerste aanbevolen. Dit gedeelte bevat informatie en tips over het ontwerpen van primers en probes voor qPCR-assays, het kiezen van een doelsequentie, multiplexen, het selecteren van reporters en quenchers en het valideren en optimaliseren van qPCR-assays.

Pagina-inhoud

PCR-optimalisatie 2.0

Decennia lang heeft het optimaliseren van de uitgloeitemperaturen in PCR de grenzen van PCR verlegd naar moeilijkere taken. Tegelijkertijd werden mastermixen en kits krachtiger en minder vatbaar voor fouten. Een gemakkelijke PCR aan het werk krijgen is tegenwoordig een kwestie van minuten of uren, niet van dagen of weken. Toch werken moeilijkere PCR's niet meteen. En zelfs na het proberen van verschillende gloeitemperaturen, produceren sommige testen gewoon geen DNA op een logaritmische schaal.

Een bekende reden hiervoor is PCR-remming. Veel stoffen kunnen PCR remmen, hetzij door binding aan het polymerase, hetzij door binding aan het DNA. Vooral de laatste categorie zorgt voor problemen omdat deze stoffen vaak “copurified” zijn (d.w.z. ze komen uit het zuiveringsproces dat nog aan het DNA vastzit).

Een niet zo bekende factor die leidt tot onvoldoende PCR-product is onvoldoende denaturatie van het DNA. De meeste testen worden opgesteld bij 95°C voor denaturatie, ongeacht de kenmerken van het matrijs-DNA. De duur van de denaturatiestap van 95 °C kan variëren, maar verder gaan dan 95 °C voor efficiëntere denaturatie lijkt terra incognita voor de wetenschapper.

Als men weet hoe het denaturatieproces werkt, is het heel gemakkelijk te begrijpen dat de matrijslengte, het GC-gehalte of de tertiaire structuur van het DNA een significant effect kan hebben op de benodigde denaturatietemperatuur. Een hogere denaturatietemperatuur kan gunstig zijn om de denaturatie te verbeteren, maar gaat ten koste van een hogere thermische stress voor alle biomoleculen in het monster.

We moeten echter in gedachten houden dat PCR een biologisch systeem is. Bij een normale denaturatiestap zullen sommige matrijsmoleculen van dubbelstrengs DNA scheiden en andere niet. Dit kan de efficiëntie van uw PCR aanzienlijk beïnvloeden, vooral in de eerste cycli. Gezien de heterogeniteit van DNA-templates die bij PCR worden gebruikt, is het enigszins verrassend dat de meerderheid van de wetenschappers slechts 95 °C gebruikt en alleen de duur van die temperatuurstap varieert, maar niet de temperatuur zelf.

Nu de moleculaire biologie steeds geavanceerder wordt op het gebied van vragen en experimenten, wordt het een cruciale succesfactor om de moeilijke PCR's te laten werken. Het kan dus belangrijk zijn om dat beetje extra rendement uit de eerste paar cycli te halen om de reactie logaritmisch te laten verlopen. De juiste denaturatietemperatuur lijkt een variabele te zijn die niet zoveel is benut als andere variabelen in een PCR-assayopstelling om dit doel te bereiken.

Een te hoge denaturatietemperatuur veroorzaakt stress voor alle biomoleculen. De halfwaardetijd van polymerasen kan tussen 95 °C en 100 °C met een factor 3–9 afnemen, afhankelijk van het type enzym. Daarom moeten onnodig hoge temperaturen worden vermeden om de enzymen procesmatig te houden.

Zoals getoond in Figuur 1, lijkt het bij bepaalde testen het geval te zijn dat de opbrengst beter wordt bij hogere denaturatietemperaturen, terwijl de specificiteit toeneemt bij iets lagere denaturatietemperaturen. In een dergelijke opstelling kan optimalisatie van de denaturatietemperatuur worden gebruikt om uw PCR te optimaliseren voor opbrengst of specificiteit, afhankelijk van uw behoeften. Met dat soort optimalisatiekracht en flexibiliteit kunnen testen eenvoudig worden ontwikkeld voor betere en meer reproduceerbare resultaten. Een temperatuurgradiëntfunctie van uw PCR-cycler waarmee deze tijdens de denaturatiestap kan worden gebruikt, kan zorgen voor de optimalisatie van de denaturatietemperatuur. De nieuwste technologie biedt zelfs 2D-gradiënten die optimalisatie van twee temperaturen (bijv. annealing en denaturatie) in een enkele PCR-run mogelijk maken.

Het optimaliseren van de denaturatietemperatuur kan een extra techniek in uw repertoire zijn om zeer moeilijke PCR-assays te laten draaien. Als jij de persoon bent die eindelijk een sjabloon krijgt versterkt dat geen ander lab heeft kunnen produceren, is de roem helemaal van jou.


Figuur 1: PCR-optimalisatie van het ß-actine-gen, waarbij zowel de denaturatietemperatuur (van beneden naar boven) als de gloeitemperatuur (van links naar rechts) worden geoptimaliseerd. Hogere denaturatietemperaturen kunnen het voordeel hebben van een verhoogde specificiteit, terwijl lagere denaturatietemperaturen de thermische stress op biomoleculen verminderen en tot een hogere opbrengst kunnen leiden. Assays die moeite hebben om betrouwbaar te werken bij een denaturatietemperatuur van 95 °C, zouden aanzienlijk kunnen profiteren van de optimalisatie van de denaturatietemperatuur.


PCR-optimalisatie - (Aug/10/2005 )

Hallo,
ben hier weer en nieuw bij mol bio en ik dank iedereen die mij begeleidt en hun expertise en ervaringen deelt. Ik wil het deze keer gewoon opnieuw vragen met optimalisatie.

ik begon pcr-run met behulp van het protocol in het tijdschrift en tot nu toe werd het geamplificeerd oke (tot nu toe controlegen) werd geamplificeerd. Moet ik beginnen met het variëren van de magnesiumconcentratie? als dat het geval is, hoe ga ik het dan benaderen of toevoegen aan mijn monsters? moet ik het volume rechtstreeks aan de reageerbuis toevoegen of aan de mastermix toevoegen?
Moet ik na magnesiumchloride nog steeds met de gloeitemperatuur spelen? of vasthouden aan de gloeitemperatuur die ik heb geprogrammeerd? aantal cycli is al 45. Moet ik het ook behouden?

U kunt de uiteindelijke MgCl2-concentratie variëren van 1,0-3 mM in stappen van 0,5 mM. Dit voeg je toe aan de mastermix (in met je buffer). Als je een 10X-buffer hebt die al MgCl2 bevat, zal deze meestal een werkconcentratie van 1,5 mM hebben (en in dat geval sla ik de 1 mM over). Onthoud dat dit is laatste werkconcentratie van MgCl2 in uw reactie

De eenvoudigste manier om de gloeitemperatuur te variëren, is door een gradiënt-PCR-blok te gebruiken (vraag rond - misschien heeft iemand er een die u kunt lenen). Zo kun je in één PCR het MgCl2 en de gloeitemperatuur wijzigen. (u kunt bijvoorbeeld 4 MgCl2-concentraties en 12 uitgloeitemperaturen controleren voor twee monsters in een PCR-gradiëntblok met 96 putjes).
Zo niet, dan kun je beginnen met een gloeitemperatuur van

5 C onder de laagste Tm van het primerpaar, of (aangezien het een gepubliceerd resultaat is) verhoog de temperatuur gewoon met een paar graden (1-2C) totdat u het beste resultaat krijgt. Zorg ervoor dat u voor elke temperatuur die u test, ook een verscheidenheid aan MgCl2-concentraties heeft - op deze manier optimaliseert u voor beide.

45 cycli lijkt me veel. Als je mooie sterke banden krijgt met je MgCl2 en gloeitemperatuur geoptimaliseerde PCR, dan kun je proberen deze te verlagen tot (zeg) 40 of 35. Ik zou dat echter tot het laatst laten.

Ik heb geen gradiënt-PCR, dus ik heb nog steeds moeite om mijn PCR-profiel te optimaliseren haha

Mijn laatste lab had een spiksplinternieuwe waarmee ik bovenstaande optimalisatie kon doen. Mijn nieuwe lab heeft maar een capaciteit van 24 buisjes. Het duurt te verdomd lang!

U kunt het variëren van de gloeitemperatuur simuleren door verschillende PCR-volumes en relatief korte gloeitijden te gebruiken (zeg 10sec). Hoe groter het volume, hoe lager de gloeitemperatuur. Dit komt door de thermische massa van de reactie.

bedankt nicole. dat zal ik proberen. ik denk dat we een gradiënt pcr hebben. ik zal het nakijken. meestal in optimalisatie, hoeveel monsters zijn er idealiter nodig om te worden uitgevoerd? 2 buizen in elke staat? bedankt.

Het hangt af van wat je wilt versterken. Is het een gen op een geconserveerd gebied van menselijk/dierlijk/plantaardig genomisch DNA? Dan zou ik zeggen dat 1 of 2 buizen onder elke conditie prima zou zijn. Als je echter een gen van een zeer gevarieerd genoom (virussen of zo) wilt versterken, dan zou ik voor elke aandoening verschillende (en diverse) monsters proberen. Ik heb ooit een PCR op een plasmide geoptimaliseerd en heb zojuist een gradiënt-PCR uitgevoerd met slechts één monster voor elke aandoening en was succesvol (slechts 10 temperaturen en 3 verschillende Mg-concentraties uitgevoerd).

Wat doet MgCl2 bij de PCR-reactie?

Er zijn waarschijnlijk nog tal van andere berichten in deze, maar ik zal u slechts een korte beschrijving geven. Mg2+-ionen hebben drie belangrijke functies in een PCR-reactie.

1) Vorm een ​​oplosbaar complex met dNTP's dat essentieel is voor de opname van dNTP
2) Noodzakelijke co-factor voor taq-polymerase-activiteit
3) Verhoogt de Tm (smelttemperatuur) van primer/sjabloon-interactie (d.w.z. het dient om de duplex-interactie te stabiliseren)

Opmerking: #1 & #2 is een beetje een evenwichtsoefening. Als de dNTP-concentratie te hoog is, raakt Mg2+ snel uitgeput en wordt PCR geremd.

Als het Mg2+-gehalte te laag is, is het resultaat weinig of geen PCR-product. Als deze te hoog is, kan dit leiden tot mispriming. De ideale concentratie voor je reactie is iets waar je mee moet spelen. Typische probleemoplossing, zoals vermeld door Nicole, houdt meestal in dat er een Mg2+-gradiënt wordt uitgevoerd tussen 0,5 en 3 mM voor normale PCR-reacties en soms zo hoog als 4-5 mM voor meer gespecialiseerde PCR.

Voor meer informatie kun je deze link bekijken Yale

Hoewel de antwoorden informatief waren, ben ik benieuwd naar je oorspronkelijke vraag. Als uw PCR werkt, waarom probeert u deze dan te optimaliseren? Wat verwacht u van een "geoptimaliseerde" reactie die u niet krijgt van een reactie die werkt? Knoei niet met succes, zou ik zeggen.


Email waarschuwingen

Gerelateerde artikelen in

Artikelen citeren via

Laatste

Meest gelezen

Meest geciteerd

  • Online ISSN 1362-4962
  • ISSN 0305-1048 afdrukken
  • Copyright © 2021 Oxford University Press

Aansluiten

Bronnen

Ontdekken

Oxford University Press is een afdeling van de Universiteit van Oxford. Het bevordert de doelstelling van excellentie van de universiteit in onderzoek, wetenschap en onderwijs door wereldwijd te publiceren

Deze functie is alleen beschikbaar voor abonnees

Deze pdf is alleen beschikbaar voor abonnees

Voor volledige toegang tot deze pdf logt u in op een bestaand account of koopt u een jaarabonnement.


Algoritme

Stap 1: We beginnen eerst met een eerste oplossing s = S₀. Dit kan elke oplossing zijn die voldoet aan de criteria voor een acceptabele oplossing. We beginnen ook met een begintemperatuur t = t₀.

Stap 2: Stel een temperatuurverlagingsfunctie in alfa. Er zijn meestal 3 hoofdtypen regels voor temperatuurverlaging:

Elke reductieregel verlaagt de temperatuur met een ander tempo en elke methode is beter in het optimaliseren van een ander type model. Voor de 3e regel geldt bèta een willekeurige constante is.

Stap 3: Beginnen bij de begintemperatuur, doorlopen N iteraties van stap 4 en verlaag vervolgens de temperatuur volgens alfa. Stop deze lus totdat de beëindiging voorwaarden zijn bereikt. De beëindigingsvoorwaarden kunnen het bereiken van een bepaalde eindtemperatuur zijn, het bereiken van een acceptabele prestatiedrempel voor een bepaalde set parameters, enz. Het in kaart brengen van tijd tot temperatuur en hoe snel de temperatuur daalt, wordt de Gloeischema.

Stap 4: Gezien de buurt van oplossingen NS), kies een van de oplossingen en bereken het verschil in kosten tussen de oude oplossing en de nieuwe buuroplossing. De buurt van een oplossing zijn alle oplossingen die dicht bij de oplossing liggen. De buurt van een set van 5 parameters zou bijvoorbeeld kunnen zijn als we een van de vijf parameters zouden veranderen, maar de overige vier hetzelfde zouden houden.

Stap 5: Als het verschil in kosten tussen de oude en nieuwe oplossing groter is dan 0 (de nieuwe oplossing is beter), accepteer dan de nieuwe oplossing. Als het verschil in kosten minder dan 0 is (de oude oplossing is beter), genereer dan een willekeurig getal tussen 0 en 1 en accepteer het als het lager is dan de waarde die is berekend met de vergelijking van de energiemagnitude van tevoren.

In het geval van gesimuleerd gloeien is de vergelijking als volgt gewijzigd:

Waar de delta c is de verandering in kosten en de t is de huidige temperatuur.

De P berekend in dit geval is de kans dat we de nieuwe oplossing moeten accepteren.


Optimalisatie van de gloeitemperatuur - Biologie

Meerdere toepassingen voor gradiënt-PCR:
In de aanwezigheid van een totale dNTP-concentratie van 0,8 mM zal een magnesiumchloride-titratiereeks in stappen van 0,5 mM over het bereik van 1 mM tot 4,5 mM bijvoorbeeld de magnesiumionconcentratie bepalen, die de hoogste opbrengst van een specifiek PCR-product oplevert. In combinatie met een temperatuurgradiënt van 20C over het blok voor de gloeistap, kunnen belangrijke parameters van een specifieke PCR in slechts één run worden gecontroleerd.

De gradiëntfunctie van de Mastercycler is niet beperkt tot de gloeitemperatuur. De gradiëntfunctie kan ook worden gebruikt voor optimalisatie van de denaturatiestap of de rektemperatuur. DNA-denaturatie is een cruciale stap in het PCR-proces en is vaak de stap waar PCR-experimenten mislukken. Het temperatuurbereik voor denaturatie van de meeste DNA-monsters is 94C tot 96C. Speciale doel-DNA's vereisen echter een andere denaturatietemperatuur om een ​​optimaal resultaat te bereiken. De gradiënt zou de laagst mogelijke denaturatietemperatuur bepalen die een hoge opbrengst aan geamplificeerd DNA oplevert.

De blootstelling van de Taq-polymerase aan onnodig hoge temperaturen zou de enzymactiviteit tijdens de PCR-run verminderen, wat zou moeten worden gecompenseerd door meer enzym te gebruiken.

Voor het bepalen van de optimale denaturatietemperatuur van deze templates kan de gradiëntfunctie van de Mastercycler worden ingesteld vanaf 9099C. Een initiële denaturatiestap van 1 tot 5 minuten (310) zou de reactie verder kunnen optimaliseren. Schadelijke nucleasen in het monster worden geïnactiveerd, waardoor de volledige denaturatie van complexe sjablonen zoals genomisch DNA wordt gegarandeerd.

In speciale gevallen kan het nodig zijn de uitgloeiingstemperatuur van de primer zo hoog te verhogen als de verlengingstemperatuur. In feite zou annealing bij hoge temperatuur moeten resulteren in verhoogde specificiteit, omdat de hybridisatie van de primer met het matrijs-DNA onder strengere omstandigheden plaatsvindt. Het combineren van primer-annealing- en primerverlengingsstappen resulteert in een tweestaps PCR-protocol. Primerverlenging vindt in de meeste toepassingen effectief plaats bij een temperatuur van 72C en behoeft zelden optimalisatie. Daarentegen kan bij PCR-experimenten met twee temperaturen de annealing-extensietemperatuur in het bereik van 60 tot 70°C liggen. Nogmaals, de optimale temperatuur kan eenvoudig worden bepaald met de gradiëntfunctie van de Mastercycler.

Een maximale helling van 20C kan over het blok worden geprogrammeerd, zodat elke langsrij van het blok een individuele temperatuur zou uitvoeren, hetzij voor uitgloeien, rek of denaturatie.

Deze afbeelding toont een thermograaf van de Mastercycle r die in de gradiëntmodus werkt.

Bron:


Pagina: Alle 1 2 3
Gerelateerde biologie technologie:


Uw PCR optimaliseren

PCR kan soms een optimalisatie van de reactieomstandigheden vereisen om een ​​succesvol resultaat te verkrijgen. Leer hoe u PCR-omstandigheden voor uw experimenten kunt optimaliseren met behulp van de onderstaande veelgestelde vragen.

Welke voorwaarden zijn bijzonder belangrijk bij het optimaliseren van PCR-condities?

Initiële denaturatiestap

Voorverwarmen is soms nodig om complexe sjablonen (bijv. genomisch DNA) te denatureren. 94 & degC gedurende 1 minuut is voldoende voor denaturatie. Overmatige hittebehandeling kan leiden tot inactivatie van het enzym.

  • Voor Terra PCR Direct Polymerase Mix, dat wordt gebruikt voor directe PCR-amplificatie van weefsel zonder DNA-extractie en -zuivering, is voorverwarmen bij 98°C gedurende 2 minuten vereist.
  • voor Takara LA Taq DNA-polymerasen en Advantage GC2-DNA-polymerasen, is een eerste denaturatiestap vereist.
  • PrimeSTAR-enzymen hoeven niet voorverwarmd te worden voor enzymactivering.

Denaturerende omstandigheden

Denaturerende omstandigheden moeten worden geselecteerd door rekening te houden met het thermische cycler-model dat zal worden gebruikt. Een algemene richtlijn is 94&ndash95°C gedurende 30 sec of 98°C gedurende 10 sec.

Als een hittebestendig enzym wordt gebruikt, zoals een van de PrimeSTAR-polymerasen, raden we een denaturatiestap van korte duur en hoge temperatuur aan (d.w.z. 5 & ndash10 sec bij 98 & degC).

Denaturatie bij een te hoge temperatuur of te lang kan leiden tot verlies van enzymactiviteit en/of beschadiging van lange templates.

Gloeiomstandigheden

De gloeistap moet worden aangepast voor elke primerset, de gloeitemperatuur is direct afhankelijk van de Tm van primers. Het gebruik van te lage annealingtemperaturen kan leiden tot mispriming en niet-specifieke amplificatie, wat leidt tot lage opbrengsten van het gewenste product.

De efficiëntie en specificiteit van de amplificatie kunnen worden verbeterd door de gloeitemperatuur aan te passen aan de T . van de primerm of door tweestaps-PCR uit te voeren.

  • Voor Taq enzymen, is de aanbevolen gloeitijd 30 sec.
  • Enzymen in de PrimeSTAR-serie hebben een uitstekende priming-efficiëntie. Daarom is het belangrijk om een ​​korte gloeitijd van 5 & ndash15 sec te hanteren. Extreem lange annealing tijden kunnen leiden tot mispriming-geïnduceerde niet-specifieke amplificatie.
  • Bij het amplificeren van korte sequenties kleiner dan 1 kb, wordt een driestaps PCR-protocol aanbevolen. Voor GC-rijke doelen of amplificaties van lange sequenties (>10 kb) wordt een tweestaps PCR-protocol aanbevolen.

Uitbreidingsstap

Over het algemeen wordt een verlengingstijd van 1 min/kb aanbevolen. Gebruik bij gebruik van de snelle enzymen SpeedSTAR HS DNA Polymerase of SapphireAmp Fast PCR Master Mix een reactiesnelheid van 10 sec/kb geamplificeerd product (dwz 10 sec voor een product van 1 kb, 20 sec voor een product van 2 kb , enzovoort.).

PrimeSTAR Max DNA Polymerase en PrimeSTAR GXL DNA Polymerase bevatten een gepatenteerde verlengingsfactor en zorgen voor snelle reacties van 5&ndash20 sec/kb. Als deze enzymen worden gebruikt met monsters die een overmaat aan template bevatten, moet een rektijd van 1 min/kb worden aangehouden.

Moet ik een driestaps- of een tweestaps-PCR-protocol gebruiken?

Driestaps-PCR omvat denaturatie-, annealing- en verlengingsstappen. Dit type protocol moet worden gebruikt wanneer de Tm van de primers lager is dan de verlengingstemperatuur of lager is dan 68°C.

Als de smelttemperatuur van de primer (Tm) dicht bij de extensietemperatuur (72°C) of een paar graden lager ligt, overweeg dan om een ​​tweestaps PCR-protocol te gebruiken dat een denaturatiestap en een gecombineerde annealing/extensiestap omvat. Met dit protocol mag de gloeitemperatuur de verlengingstemperatuur niet overschrijden.

Welke verlengingstemperatuur moet ik gebruiken, 68°C of 72°C?

Een verlengingstemperatuur van 68°C heeft de voorkeur voor PCR in twee stappen en bij het amplificeren van langere templates (>4 kb). Deze lagere verlengingstemperatuur verbetert de opbrengsten van langere amplificatieproducten aanzienlijk door de depurineringssnelheid die de amplificatie beïnvloedt, te verminderen.

72°C moet worden gebruikt als de verlengingstemperatuur bij het uitvoeren van driestaps standaard PCR en voor amplificatie van korte fragmenten (<4 kb).

Wat is de optimale hoeveelheid DNA-template die moet worden gebruikt voor PCR?

De optimale hoeveelheid matrijs die vereist is, hangt af van de complexiteit van de matrijs en het aantal kopieën van de doelsequentie. Er zijn ongeveer 104 kopieën van de doel-DNA-sequentie nodig om het amplificatieproduct te detecteren in 25 & ndash30 PCR-cycli.

  • Gewoonlijk bevat 1 & microg humaan genomisch DNA 3,04 x 105 DNA-moleculen. Voor de meeste PCR-toepassingen is 30&ndash 100 ng humaan genomisch DNA voldoende. High-copy doelen, zoals huishoudgenen, vereisen slechts 10 ng sjabloon. Sjabloonbedragen voor sjablonen met een hogere complexiteit variëren tussen 10 ng en 500 ng.
  • Typisch, 1 & microg van E coli genomisch DNA bevat 2 x 108 moleculen DNA, daarom ligt de aanbevolen hoeveelheid template tussen 100 pg en 1 ng.
  • Gewoonlijk bevat 1 & microg lambda-DNA 1,9 x 1010 DNA-moleculen, daarom kan de matrijsinvoer slechts 100 pg zijn.
  • De hoeveelheid cDNA-template hangt af van het aantal kopieën van het doelwit. cDNA-invoer wordt meestal beschreven in termen van equivalente RNA-invoer. De hoeveelheid cDNA in een PCR-reactie kan slechts 10 pg (RNA-equivalent) zijn.

Het is belangrijk op te merken dat niet alle polymerasen overmatige hoeveelheden matrijs kunnen verdragen. Voor monsters die een teveel aan template bevatten (tot 1 & microg), raden we PrimeSTAR GXL DNA Polymerase aan.

Wat zijn de kritische factoren voor amplificatie van lange genomische doelen?

Sjabloonkwaliteit

DNA-integriteit is van cruciaal belang voor de amplificatie van lange doelen. DNA-schade&mdash zoals DNA-breuk tijdens DNA-isolatie of DNA-depurinatie bij verhoogde temperaturen en lage pH&mdash resulteert in een grotere hoeveelheid deelproducten en een lagere totale opbrengst. DNA-schade kan ook optreden in zure omstandigheden, vermijd daarom het gebruik van water voor het resuspenderen van DNA-templates. DNA is het meest stabiel bij pH 7&ndash8 of in gebufferde oplossingen.

PCR-voorwaarden

  • De denaturatietijd moet tot een minimum worden beperkt om depurinatie-gebeurtenissen te verminderen.
  • Gebruik touchdown PCR start bij een hogere gloeitemperatuur en verminder met twee graden per cyclus gedurende meerdere cycli.
  • Ontwerpprimers met smelttemperaturen (Tm) boven 68°C.

PCR-polymerasen

We bieden verschillende PCR-polymerasen die zijn geoptimaliseerd voor langeafstands-PCR. Takara LA Taq DNA-polymerase, TaKaRa LA Taq Polymerase met GC-buffer en PrimeSTAR GXL DNA-polymerase worden aanbevolen, afhankelijk van het GC-gehalte en de grootte van het/de doelwit(ten).

Hoe bepaal ik of een sjabloon GC-rijk is?

De GC-ratio varieert over het genoom. Sjablonen met >65% GC-inhoud worden als GC-rijk beschouwd. GC-rijke regio's van het genoom zijn meestal geconcentreerd in regulerende regio's, waaronder promotors, versterkers en cis-regulerende elementen. GC-rijke traktaten hebben de neiging om omgekeerde herhalingen of haarspeldstructuren te vormen die mogelijk niet smelten tijdens de gloeistap van PCR. Daarom wordt amplificatie van GC-rijke sjablonen belemmerd door inefficiënte scheiding van de twee DNA-strengen. Dit resulteert in afgeknotte amplicons als gevolg van voortijdige beëindiging van polymerase-extensie.

Wat zijn de kritische factoren voor amplificatie van GC-rijke sjablonen?

PCR-voorwaarden

  • Gebruik hogere denaturatietemperaturen (bijv. 98°C in tegenstelling tot 94°C of 95°C) om volledige denaturatie van de template mogelijk te maken.
  • Houd de gloeitijden voor GC-rijke sjablonen zo kort mogelijk.
  • Gebruik primers met een hogere Tm (>68°C), omdat uitgloeien bij een hogere temperatuur kan plaatsvinden.

PCR-polymerasen

Gebruik een polymerase geoptimaliseerd voor amplificatie van GC-rijke sequenties. Bezoek onze selectiegids om een ​​enzym te vinden.

Kan DMSO worden toegevoegd om de amplificatie van GC-rijke sjablonen te verbeteren?

We hebben van klanten gehoord dat verbeterde amplificatie van GC-rijke sjablonen werd verkregen door DMSO toe te voegen aan reacties met behulp van PrimeSTAR MAX DNA Polymerase of CloneAmp HiFi PCR Premix. De aanbevolen concentratie DMSO ligt tussen 2,5% en 5%.

Hoe kan ik PCR-voorwaarden optimaliseren voor AT-rijke sjablonen?

Sommige sjablonen kunnen lange AT-rijke stukken hebben die moeilijk te amplificeren zijn onder standaard reactieomstandigheden. De Plasmodium falciparum genoom is ongeveer 80% AT, en regio's die genen flankeren zijn vaak AT-rijk.

Polymerasen die worden aanbevolen voor GC-rijke sjablonen, zoals EmeraldAmp GT PCR Master Mix, EmeraldAmp Max PCR-mastermixen en PrimeSTAR GXL DNA-polymerase, zijn ook geschikt voor AT-rijke sjablonen.

Het voordeel van het hebben van AT-rijke sjablonen is dat een lagere extensietemperatuur kan worden gebruikt. Voor bepaalde sjablonen met AT-inhoud >80&ndash85% kan de verlengingstemperatuur worden verlaagd van 72°C tot 65&ndash60°C. DNA-replicatie bij deze verlaagde temperatuur blijkt betrouwbaar te zijn (Su et al. 1996).

Referenties

Zo, X.Z., et al. Verlaagde extensietemperaturen vereist voor PCR-amplificatie van extreem A+T-rijk DNA. Nuclzuren Res. 24, 1574 en 1575 (1996).

Wat is de rol van magnesium bij PCR en wat is de optimale concentratie?

Magnesium is een vereiste cofactor voor thermostabiele DNA-polymerasen en is belangrijk voor succesvolle amplificatie. Zonder voldoende vrij Mg2+ zijn PCR-polymerasen niet actief. Daarentegen vermindert overmaat vrij Mg2+ de enzymgetrouwheid en kan niet-specifieke amplificatie verhogen. Een aantal factoren kan de hoeveelheid vrij Mg2+ in een reactie beïnvloeden, waaronder DNA-templaatconcentratie, chelaatvormers in het monster (bijv. EDTA of citraat), dNTP-concentratie en de aanwezigheid van eiwitten.

  • Sommige polymerasen (bijv. Takara Ex Taq DNA-polymerasen en Takara LA Taq DNA-polymerasen) worden geleverd met een magnesiumvrije reactiebuffer en een apart buisje van 25 mM MgCl2. Voor deze enzymen kun je voor elke reactie de Mg2+-concentratie optimaliseren. en Advantage 2 DNA-polymerasen zijn magnesiumtolerante polymerasen die worden geleverd met buffers die 3,5 mM MgCl bevatten2.
  • De uiteindelijke concentratie van Mg 2+ voor PrimeSTAR GXL DNA-polymerase- en PrimeSTAR MAX DNA-polymerasereacties is 1 mM. Deze concentratie verhoogt de betrouwbaarheid van deze enzymen.

Wat is de rol van zout bij PCR-reacties?

Succesvolle PCR vereist dat de DNA-duplex zich scheidt tijdens de denaturatiestap en dat primers aan het gedenatureerde DNA hechten. Zout neutraliseert de negatieve ladingen op de fosfaatruggengraat van DNA en stabiliseert dubbelstrengs DNA door negatieve ladingen te neutraliseren die elkaar anders zouden afstoten. Kaliumchloride (KCl) wordt normaal gesproken gebruikt in PCR-amplificaties bij een eindconcentratie van 50 mM. Om de amplificatie van DNA-fragmenten te verbeteren, met name fragmenten tussen 100 en 1.000 bp, wordt een KCl-concentratie van 70 & ndash 100 mM aanbevolen. Voor amplificatie van langere producten blijkt een lagere zoutconcentratie effectiever te zijn, terwijl amplificatie van kortere producten optimaal plaatsvindt bij hogere zoutconcentraties. Dit effect is waarschijnlijk omdat een hoge zoutconcentratie bij voorkeur denaturatie van korte DNA-moleculen over lange DNA-moleculen mogelijk maakt.

Het is belangrijk op te merken dat een zoutconcentratie boven 50 mM kan remmen Taq polymerasen.

Takara Bio USA, Inc.
Verenigde Staten/Canada: +1.800.662.2566 &stier Azië-Pacific: +1.650.919.7300 &stier Europa: +33.(0)1.3904.6880 &stier Japan: +81.(0)77.565.6999
UITSLUITEND VOOR ONDERZOEK. NIET VOOR GEBRUIK IN DIAGNOSTISCHE PROCEDURES. &kopie 2021 Takara Bio Inc. Alle rechten voorbehouden. Alle handelsmerken zijn eigendom van Takara Bio Inc. of haar dochteronderneming(en) in de VS en/of andere landen of hun respectievelijke eigenaren. Bepaalde handelsmerken zijn mogelijk niet in alle rechtsgebieden geregistreerd. Aanvullende informatie over producten, intellectueel eigendom en beperkt gebruik is beschikbaar op Takarabio.com.

Takara Bio Europe is lid van de Takara Bio Group, een toonaangevend life sciences bedrijf dat zich inzet voor het verbeteren van de menselijke conditie door middel van biotechnologie. Via onze merken Takara, Clontech en Cellartis is het onze missie om innovatieve tools en diensten van hoge kwaliteit te ontwikkelen om ontdekking te versnellen.


Optimalisatie van de gloeitemperatuur - Biologie

U heeft een machinevertaling aangevraagd van geselecteerde inhoud uit onze databases. Deze functionaliteit is uitsluitend bedoeld voor uw gemak en is op geen enkele manier bedoeld om menselijke vertaling te vervangen. Noch BioOne, noch de eigenaren en uitgevers van de inhoud doen, en wijzen uitdrukkelijk af, enige uitdrukkelijke of impliciete verklaringen of garanties van welke aard dan ook, inclusief, maar niet beperkt tot, verklaringen en garanties met betrekking tot de functionaliteit van de vertaalfunctie of de nauwkeurigheid of volledigheid van de vertalingen.

Vertalingen worden niet bewaard in ons systeem. Uw gebruik van deze functie en de vertalingen is onderworpen aan alle gebruiksbeperkingen die zijn opgenomen in de gebruiksvoorwaarden van de BioOne-website.

Bepalen van gloeitemperaturen voor polymerasekettingreactie

Angela R. Porta, * Edward Enners *


* Angela R. Porta is een Distinguished Professor in de afdeling Biologische Wetenschappen en Edward Enners is een afgestudeerde student in het Biotechnology Masters Program aan het New Jersey Center for Science, Technology and Mathematics Education aan de Kean University, 1000 Morris Avenue, Union, New Jersey Jersey 07083. E-mail: [email protected] en [email protected]

Inclusief PDF & HTML, indien beschikbaar

Dit artikel is alleen beschikbaar voor: abonnees.
Het is niet beschikbaar voor individuele verkoop.

De polymerasekettingreactie (PCR) is een veelgebruikte techniek die wordt gebruikt in het wetenschapsonderwijs op de middelbare school en niet-gegradueerde. Studenten begrijpen vaak niet volledig de onderliggende principes van de techniek en hoe optimalisatie van het protocol de uitkomst en analyse beïnvloedt. In dit moleculair-biologisch laboratorium leren studenten de stappen van PCR met de nadruk op primersamenstelling en annealingtemperatuur, die ze manipuleren om het effect op succesvolle DNA-amplificatie te testen. Studenten ontwerpen experimenten om hun hypothesen te testen, het bevorderen van een op ontdekkingen gebaseerde benadering van laboratoriumonderwijs en de ontwikkeling van kritisch denken en redeneren.


Zoals Thomas Klimpel opmerkt in de opmerkingen, wordt vaak een bepaalde acceptatiekans gebruikt, die gelijk is aan bijvoorbeeld .8$. Het volgende is een eenvoudige iteratieve methode om een ​​geschikte begintemperatuur te vinden, voorgesteld door Ben-Ameur in 2004 [1]. In het volgende is $t$ een strikt positieve overgang, zijn $max_t$ en $min_t$ de toestanden na en voor de overgang, $delta_t$ het kostenverschil $E_ - E_ $ en $pi_ dfrac<1><|N(min_t)|>$ de kans om een ​​transitie $t$ te genereren wanneer de energietoestanden worden verdeeld in overeenstemming met de stationaire verdeling

Eindelijk, $ ext(-delta_t/T)$ is de kans op het accepteren van een positieve transitie $t$. Nu kunnen we een schatting maken $hat$ van de acceptatiekans $chi(T)$ op basis van een "willekeurige" set $S$ van positieve overgangen:

We willen een temperatuur $T_0$ vinden zodat $chi(T_0) = chi_0$, waarbij $chi_0 in ] 0,1 [$ de acceptatiekans is die we wensen.

$T_0$ wordt berekend door een iteratieve methode. Sommige staten en een buur voor elke staat worden gegenereerd. Dit geeft ons een reeks overgangen $S$. De energieën $E_$ en $E_$ die overeenkomen met de toestanden van de subset $S$ worden opgeslagen. Vervolgens wordt een waarde voor $T_1$ gekozen, die elke positieve waarde kan zijn. $T_0$ wordt dan gevonden met de recursieve formule

Als $hat(T_n)$ in de buurt van $chi_0$ komt, kunnen we stoppen. $T_n$ is nu een goede benadering van de gewenste begintemperatuur $T_0$. Voor meer uitleg, bewijzen en discussie, zie het eerste deel van het originele artikel [1].

[1] Ben Ameur, Walid. "Het berekenen van de begintemperatuur van gesimuleerd gloeien." Computationele optimalisatie en toepassingen 29, nee. 3 (2004): 369-385.


Bekijk de video: Geert Verhaeghe - De optimalisatie van een schadeproces als makelaarHello Insurance #8 (Januari- 2022).