Informatie

Moet de lengte van de elektroden in de elektroforesekamer evenredig zijn met de grootte van de kamer?


Ik probeer een kleine horizontale elektroforesekamer helemaal opnieuw te bouwen. Ik wil het gebruiken voor kometentesten en ik zal slechts 1 objectglaasje gebruiken, dus het wordt ongeveer 3 cm breed, 10 cm lang en 4 cm hoog, net genoeg om op het objectglaasje te passen en een kleine hoeveelheid buffer. Voor zover ik weet is zoiets niet in de handel verkrijgbaar, dus voordat ik het maak, wil ik zeker weten dat het gaat werken. Het belangrijkste probleem zijn de kosten van de elektrode (moet platinadraad zijn). Ik wil niet zoveel geld uitgeven om te beseffen dat het niet werkt. Mijn vraag is: is een elektrode van 3 cm in een 60-70 cm3 genoeg? Zijn er in principe fysieke beperkingen aan de grootte en de positie van de elektroden en de vorm van de kamer? Aangezien ik een bioloog ben en mijn kennis in de natuurkunde vrij beperkt is, zou ik alle informatie hierover zeer op prijs stellen.


Deze instructies voor het bouwen van een elektroforesekamer geven geen commentaar op de minimale lengte van de draad, maar aan de andere kant stellen ze voor om iets genaamd Monel Seizing Wire (Ni/Cu-legering - £ 8,95 voor 10 m in het VK) of 20-gauge te gebruiken koperdraad, dus als u hun advies opvolgt, hoeft u zich waarschijnlijk geen zorgen te maken over de kosten.

Ik kan me voorstellen dat legeringselektroden niet zo lang meegaan, maar ze zouden goedkoop te vervangen zijn - in feite zou je op zoek zijn naar mogelijkheden om al je overtollige draad op te gebruiken!


Spurthi's AP Biologie Notebook


Abstract
Gelelektroforese is een methode die moleculen scheidt op basis van de bewegingssnelheid door de gel tijdens het aanleggen van een elektriciteitsveld. De richting waarin de moleculen bewegen (vooruit of achteruit) is gebaseerd op de lading van de moleculen omdat ze naar hun tegenpool zullen bewegen. Hoe snel deze moleculen bewegen, wordt ook beïnvloed door de fysieke aspecten van het molecuul, zoals grootte en vorm, de dichtheid van de gel en de sterkte van het elektriciteitsveld. Omdat de dichtheid van de gel en de sterkte van het elektriciteitsveld hetzelfde zijn voor alle moleculen in een bepaalde elektroforesekamer, zullen de kleinste deeltjes de hoogste bewegingssnelheid hebben.

Omdat we geen DNA voor dit lab konden gebruiken, moesten we ze vervangen door laadkleurstoffen. Deze laadkleurstoffen bevatten sucrose, broomfenolblauw en TE-buffer. We hebben de gelatine zo gemaakt dat er aan het uiteinde kleine sleuven zijn ingesprongen. In die deuken zouden we ze opvullen met kleurstof voor het laden van verschillende kleuren. De laadkleurstof zonk naar de bodem omdat het de sucrose bevatte. Het broomfenolblauw was de manier waarop ze konden verven, zowel positief als negatief. Op basis van waar de kleurstof naartoe is verplaatst, kunnen we zien hoe groot de moleculen erin waren en of het positief of negatief was.

Deel 1
Eerst hebben we een gel gegoten met behulp van een waterbad, magnetron, gelkam met 6 putjes, maskeerkraan, bakje en agarosegel. Met behulp van de maskeertape hebben we de twee uiteinden van de gelgietbak bedekt om te voorkomen dat de agarosegel eruit valt. Vervolgens lieten we de gel smelten in het waterbad dat hem niet lang genoeg opwarmde. Daarom hebben we de gelfles met de dop eraf in intervallen van 1 minuut in de magnetron verwarmd totdat deze volledig was gesmolten. Met beschermende handschoenen haalden we de fles eruit, maten 15 ml van de vloeistof af in een reageerbuis en gebruikten de 15 ml in de gietschaal. Maar vlak voordat we de gel op het bakje hebben gegoten, plaatsen we de 6-wells gelkam aan het einde van het bakje. Nadat u de gel op de bak heeft laten uitharden, verwijdert u de afplakkraan aan één kant. Voordat u de gel voorzichtig schuift zonder in de kamer te breken, giet u buffer uit een bekerglas in één kant van de kamer. Nadat de gel op de kamer is geplaatst, voegt u buffer toe tot het niveau ongeveer 2-3 mm boven de bovenkant van de gel is. Sluit de kamer en laat deze 24-48 uur in die positie blijven.
Deel 2
Breng 2 dagen later de gel uit de kamer terug op de plaat zodat deze perfect past. Plaats vervolgens de plaat met de gel terug in de kamer en giet de buffer in de kamer zodat deze zich ongeveer 2-3 millimeter boven de gel bevindt. Gebruik een micropipet, neem een ​​kleurstof en krijg er 10 ul van. Herhaal deze stap nog 4 keer met verschillende kleuren kleurstoffen en met verschillende micropipetten voor elke kleur. Verbind vervolgens 5 alkalinebatterijen in een stapel en verbind het rode snoer en het zwarte snoer van de batterijen met hun respectieve delen van de kamer. Zodra het batterijpakket op de kamer is aangesloten, observeert u het verschijnen van luchtbellen en of de verschillende gekleurde kleurstoffen bewegen en zo ja, in welke richting van de kamer. Koppel na observatie de batterij los wanneer het snelst bewegende kleurstofmonster zich aan het einde van de gel bevindt.


Dit werd genomen binnen enkele minuten na het activeren van het elektrische veld. Zoals u kunt zien, hebben de meeste kleurstoffen een langzame bewegingssnelheid.

Deze foto is genomen voordat de draden werden losgekoppeld en de stroom van elektriciteit werd gestopt. De resultaten, geverifieerd door deze foto, zijn hieronder opgenomen.

De lengte en richting van de run worden bepaald door de lading van het molecuul. Op basis van de resultaten kunnen we dan concluderen dat de kristalviolette kleurstof het meest negatief is. Het is ook het enige molecuul met een negatieve lading in ons lab. Methylgroen was het meest positief, gevolgd door het kleurstofmengsel, xyleencyanol en tenslotte het broomfenolblauw.

De kristalviolette kleurstof zat niet in het kleurstofmengsel omdat er geen kleurstofband werd gevonden in baan 6.

Bepaalde kleurstoffen migreren naar de positieve elektrode en andere naar de negatieve elektrode, omdat moleculen in een elektrisch veld neigen naar een lading die het tegenovergestelde is van de lading die ze dragen. Daarom zullen positieve moleculen neigen naar negatief, vice versa.

Het verhogen van de agaroseconcentratie in een gel zal de poriegrootte van de gel verkleinen zodra de gel gestold is. De kleinere poriegrootte kan worden gebruikt om een ​​mengsel van kleinere moleculen te scheiden.

Toen de scheiding van de kleurstoffen gebeurde in een hoger percentage agarosegel dan degene die werden gebruikt om veel DNA-mengsels te scheiden. We kunnen aannemen dat de kleurstofmoleculen over het algemeen kleiner zijn dan de DNA-fragmenten.

Als we uit ons elektroforeselab zouden worden weggeroepen en niet in staat zouden zijn om ons lab te controleren, zouden de kleurstofmonsters na verloop van tijd naar de negatieve of positieve kant van de polen blijven bewegen. Als we het lang genoeg weglieten, zou de gel van de gel af gaan.

De agarose-elektroforeseprocedure voor DNA is anders dan onze procedure omdat DNA niet zichtbaar is voor het oog, dus het vereist een kleurstof op de DNA-monsters om te bepalen wanneer het elektroforeselab moet worden beëindigd. Een ander verschil is dat DNA een negatieve lading draagt, dus de monsters worden aan het ene uiteinde van de gel geplaatst in plaats van aan het andere.

Elektroforese versus chromatografie

Elektroforese instellen


Een ander gebruik voor elektroforese kan genetische manipulatie, eiwitidentificatie, vaderschapstesten en screening op genetische aandoeningen zijn. Alles wat met DNA te maken heeft, kan bij elektroforese worden gebruikt.

Moeten er databanken komen voor DNA-informatie? Er moeten databanken worden opgericht voor DNA-informatie, zolang het maar is om anderen te helpen en er geen misbruik van wordt gemaakt. Een voordeel hiervan zou zijn dat het wordt gebruikt om genetische aandoeningen of identificatie in rechtszaken te bestuderen, maar een nadeel zou zijn dat onderzoek wordt gedaan om te proberen DNA voor uiterlijk te veranderen. Mensen die controle over de informatie zouden moeten hebben, moeten die van de persoon zijn wiens DNA wordt opgeslagen en informatie moet worden gecontroleerd door mensen die betrouwbaar zijn. Een goed persoon voor de baan is bijvoorbeeld iemand die de DNA-bank niet voor zijn/haar voordelen zal gebruiken. Het moet ook zwaar worden bewaakt omdat het persoonlijke informatie is. DNA dat voor identificatie van een verdachte is afgenomen, moet strikt worden gebruikt voor identificatie en alleen voor identificatie. Alleen baby's met een familiegeschiedenis van een genetische aandoening mogen bij de geboorte hun DNA-vingerafdrukken laten nemen voor veiligheidsdoeleinden en vroegtijdige preventie.

Conclusie
Na het uitvoeren van dit experiment met behulp van laadkleurstoffen, concludeerden we dat de kristalviolette kleurstof het meest negatief was. We concludeerden ook dat methylgroen het meest positief was. Dit experiment heeft ons geholpen een beter begrip te krijgen van gelelektroforese.


Stap 1: Onderdelen en gereedschappen

Acrylmaterialen en ontwerpbestanden

Van elke leverancier van acrylmaterialen (McMaster-Carr, US Plastics enz.):

12 "x 12" x 1/4" helder acryl
12 "x 12" x 1/4" blauw acryl (of voorkeurskleur)
5 "x 5" x 1/8 "helder acryl

6" x 6" x 1/16" teflon plaat, Cat # 8545K13

1/8" solacryl (UV-doorlatend) - Optioneel : Als u geen UV-doorlatende geltray nodig heeft, maakt u deze onderdelen gewoon van gewoon helder acryl.

Gebruik de onderstaande ontwerpbestanden om de delen uit uw materiaal te knippen - het type materiaal dat u moet gebruiken, staat in de titel van het bestand. Als u geen toegang heeft tot een lasersnijder, kunt u de bestanden naar een lasersnijservice sturen (wij gebruiken Pololu). Deze services bevatten ook het meeste materiaal dat u nodig hebt, met uitzondering van solacryl. U kunt ook een kit kopen in onze online winkel (IO Rodeo, Cat #IMG-01) voor $ 93. De kit bevat alle lasergesneden onderdelen en hardware, platinadraad (in plaats van roestvrij staaldraad) en voorgemonteerde kammen. U moet nog wel de Weld-On kopen.

Hardware en gereedschappen

2-56 Taps taps toelopende hand, kat # 2522A663
Tapsleutel Verschuifbare T-handgreep, 0-1/4" (1,6-6,3 mm) Tapmaat, Cat # 2546A22
2x 2-56 nylon machineschroef met platte kop, 3/16" lengte, cat. # 93135A076
4x 2-56 nylon machineschroef met platte kop, 1/8" lengte, cat. # 93135A074
Roestvrij staaldraad, 0,01" diam. Cat # 9882K31
2x 6/32 Hex machinemoeren Cat # 91841A007
2x platte sluitring, nr. 6 schroefmaat, 5/16" Cat # 92141A008

IPS-lascement #3 of 4, Cat. # 10792
Hypo-type oplosmiddelcement applicator, Cat # 25658

2x Banaanstekker, Cat #655K-ND
Zwarte banaanstekkerkabel, 36", Cat # 4771-36-0-ND
Rode banaanstekkerkabel, 36", Cat # 4771-36-2-ND
4x Rubberen voetjes, Cat # SJ5012-0-ND

Bijlagen


RESULTATEN

Aanbevolen procedure:

De gelbox is gemaakt van een plastic opslagcontainer (14 × 20 × 5 cm, 1,6 L) en voorzien van aluminiumfolie-elektroden (1 × 25 cm vierlaagse gevouwen strips) op 14 cm afstand van elkaar, bevestigd met plakband of lijm. De elektroden zijn in serie verbonden met vijf 9V-batterijen met behulp van draden die zijn uitgerust met krokodillenklemmen. Gels werden gegoten in een schone glazen ovenschaal (9 x 13 inch), waar een rechthoek (8,5 x 5,5 cm) werd getekend met een waskrijt. Agar van het telefoonmerk (1 g) werd gesmolten met behulp van een magnetron in 50 ml loopbuffer (3 g L -1 Seachem Neutral pH Regulator). Na het zorgvuldig gieten van de gesmolten agar in de krijtrechthoek totdat deze vol was, werd een kam gemaakt van een plastic winkelcadeaubon en bindclips gebruikt om putjes te vormen ongeveer 1 cm vanaf het einde van de gel. Toen de gel was afgekoeld (10-20 min), werd de kam verwijderd, de gel uit de gietschaal gehaald, in de gelbox geplaatst met de putjes dicht bij de kathode en ondergedompeld (tot 1 cm boven de gel) in loopbuffer. DNA-monsters (∼ 10 L) zoals een standaard lambda HindIII-ladder (Fisher Scientific ∼ $ 1 per baan) of genomisch extract werden 1: 1 toegevoegd in laadkleurstof (één druppel glucosestroop met drie druppels groene voedselkleuring) met behulp van een pipet. Elektroforese verliep gedurende 1 tot 1,5 uur, terwijl de migratie van de volgkleurstoffen werd waargenomen. Gels werden gekleurd ondergedompeld in een gentiaanviolet (10.000 x verdunning) bad gedurende 12 tot 72 uur zonder schudden bij kamertemperatuur. DNA-banden werden gevisualiseerd met achtergrondverlichting en gefotografeerd voor verdere analyse.

Typische resultaten

Het resultaat van een typische gel die een lambda HindIII-ladder scheidt, wordt getoond in Fig. 2. Merk op dat na kleuring afzonderlijke banden zichtbaar zijn, die elk een DNA-fragment van verschillende grootte van de ladder vertegenwoordigen. Studenten in onze klassikale test waren succesvol in het visualiseren van DNA-banden in hun gels. Genomisch DNA heeft de neiging om diffuse banden met een hoog molecuulgewicht te vormen, maar kan ook meer dan één band produceren. Deze kunnen van verschillende grootte zijn of het kunnen verschillende conformaties zijn (bijvoorbeeld supercoiled) van het genomische DNA die leiden tot veranderingen in elektroforetische mobiliteit. Elektroforese gedurende langere perioden zal de DNA-banden verder in de gel verplaatsen en zorgen voor een betere scheiding. Een breder scala aan bandafmetingen kan worden verkregen door eerst genomisch DNA af te scheren door herhaalde snelle passage door een injectienaald of door in de handel verkrijgbare restrictie-enzymen te gebruiken.

Planning en beoordeling

Afhankelijk van de belschema's is het misschien het beste om stappen in het protocol in verschillende blokken te verdelen. In onze onderzoeken werd het eerste blok gebruikt voor een activiteit om pipetteren te oefenen en voor discussies over de procedure en de reden ervan. De gelboxen werden geconstrueerd, gels gegoten, geladen en in het tweede blok gelopen (met gebruikmaking van een lambda HindIII-ladder). De leraar verwijderde de gels later van de vlek en bewaarde deze voor een derde blok, waar de bandpatronen werden gedocumenteerd en geanalyseerd. Studenten kregen een werkblad om in te vullen terwijl ze wachtten op procedures om te voltooien, waaronder vragen over de basis voor elektroforese, het negatief geladen ruggengraat-DNA dat elektroforetische scheiding mogelijk maakt en de bepaling van moleculaire lengtes door analyse van de bandpatronen. Open vragen, leerlinggerichte antwoorden, gepaste wachttijden en non-verbaal gedrag werden gebruikt om de dialoog aan te gaan en ideeën op te doen [15-18]. Studenten genereerden een standaard laboratoriumrapport en werden beoordeeld op basis van hun voortdurende interacties tijdens de lessen. Docenten kunnen ook het begrip van leerlingen beoordelen door middel van voorlichtingsprojecten (zie hieronder).

Studentenenquêtes

De testklas bij NEM bestond voornamelijk uit tweedejaarsstudenten in vijf groepen van elk 4-5 studenten. Enquêtes met behulp van een Likert-type schaal werden ingevuld door alle 21 studenten, met de juiste toestemming van ouders en school (tabel I). Over het algemeen waren de scores 4,0 of hoger, wat aangeeft dat studenten de activiteit waardeerden en waardevol vonden. De scores waren significant (P < 0,05) hoger dan verwacht voor elke vraag (behalve Q13) met behulp van chikwadraatanalyse en de verwachting van een gelijkmatige verdeling over de antwoorden. Studenten zagen de activiteit als verbonden met hun cursussen en up-to-date. De studenten hadden het gevoel dat ze actief deelnamen, iets waardevols leerden en meer wetenschappelijk onderzoek wilden doen. De hoogste scores waren het erover eens dat de activiteit leuk en goed georganiseerd was. De studenten waren niet teleurgesteld dat de activiteit goedkope materialen gebruikte in plaats van laboratoriumapparatuur. Hoewel de gemiddelde reacties positief waren, scoorden twee studenten over het algemeen lager, net onder neutraal (3,0). Alles bij elkaar genomen waren deze onderzoeksresultaten significant hoger (P < 0,01) dan verwacht en suggereren dat studenten de elektroforese-activiteit als succesvol en een waardevolle aanvulling op een inleidende biologiecursus op de middelbare school beschouwden. Inhoudsonderzoeken die eerder werden uitgevoerd na vergelijkbare elektroforetische activiteiten met behulp van laboratoriumapparatuur op NEM en andere WPS middelbare scholen, toonden een significante toename van de inhoudelijke kennis die specifiek is voor de activiteit [11]. Opgemerkt moet worden dat niet wordt verwacht dat een enkele activiteit in de klas op zichzelf de prestaties op brede wetenschappelijke beoordelingen of algemene cursuscijfers aanzienlijk zal verbeteren.

Vraag Score ± SDa een Likert-schaal: 1 = helemaal mee oneens 2 = niet mee eens 3 = niet mee eens, niet mee oneens 4 = mee eens 5 = helemaal mee eens.
1. De gellaboratoriumsessies waren goed georganiseerd 4.3 ± 0.8
2. De experimentele stappen werden goed uitgelegd 4.2 ± 0.8
3. Het gellaboratorium stimuleerde actieve deelname 4.1 ± 0.9
4. Ik was gemotiveerd om de resultaten te zien 4.1 ± 0.9
5. Het experiment werkte goed voor mijn groep 4.1 ± 0.9
6. Ik was niet blij dat we goedkope materialen gebruikten 2.1 ± 1.0
7. Het gellaboratorium zette me creatief aan het denken 3.7 ± 0.8
8. Ik had het gevoel dat ik echt onderzoek deed 3.5 ± 1.0
9. Het gebruik van nieuwe laboratoriumapparatuur wekt mijn interesse in wetenschap 4.0 ± 0.9
10. Het gellaboratorium bevatte actuele informatie 4.0 ± 0.9
11. Mijn leraar kan mijn vragen beantwoorden 4.1 ± 1.1
12. Het gellaboratorium heeft me geholpen belangrijke concepten te begrijpen 3.9 ± 0.9
13. Mijn begrip van DNA is beter na het gellaboratorium 3.7 ± 1.1
14. Ik heb geleerd hoe ik micropipetten moet gebruiken 4.0 ± 1.2
15. Ik heb het gevoel dat ik iets heb geleerd van deze activiteit 4.1 ± 0.8
16. Het gellaboratorium was relevant voor mijn klas 4.2 ± 0.8
17. Het gellaboratorium was een waardevol leermiddel 3.9 ± 1.0
18. De activiteit zorgde ervoor dat ik meer experimenten wilde doen 3.9 ± 1.0
19. Het gellaboratorium was van hoge kwaliteit 4.0 ± 0.8
20. Het was leuk om het gellaboratorium te doen 4.3 ± 0.8
  • een Likert-schaal: 1 = helemaal mee oneens 2 = mee oneens 3 = niet mee eens, niet mee oneens 4 = mee eens 5 = helemaal mee eens.

Agarose- en acrylamidegels

De polymerisatie van acrylamide wordt geremd door zuurstof. Deze gels moeten daarom verticaal worden gegoten tussen twee glasplaten die uit elkaar worden gehouden door twee plastic afstandhouders. Dit proces is tijdrovend en technisch veeleisender dan horizontale agarosegelelektroforese. Acrylamidegels hebben echter een uitstekend oplossend vermogen. Ze worden gebruikt wanneer een hoge mate van scheiding (d.w.z. een verschil in grootte van een enkel basenpaar) vereist is, zoals bij het sequencen van DNA.

Elektroforesebuffers

DNA-monsters

Detectie

Gels kunnen voor of na een elektroforese-run worden gekleurd. Om een ​​gel te kleuren vóór een elektroforese-run, wordt ethidiumbromide toegevoegd aan de gesmolten agarose voordat deze op de geltray wordt gegoten. Deze kleurmethode is de snelste en biedt het voordeel dat de positie van het DNA tijdens de scheiding kan worden gevolgd. Als alternatief kan de gel na de elektroforese-run gedurende 10-30 minuten in een verdunde oplossing van ethidiumbromide worden geplaatst.

Factoren die van invloed zijn op mobiliteit


Wat is gepulseerde veldgelelektroforese?

Pulsed Field Gel Electrophoresis, of PFGE, is een techniek die wordt gebruikt voor de scheiding van zeer grote DNA-moleculen.

Onder standaard elektroforese-omstandigheden wordt een elektrisch veld in één richting op de agarosegel aangebracht, en DNA-moleculen groter dan 40 kilobasen bewegen in wezen samen door de gel, onafhankelijk van hun grootte.

PFGE daarentegen past een elektrisch veld toe dat periodiek van richting verandert. Door een alternerende spanningsgradiënt op een PFGE-systeem te introduceren, kunnen zeer grote DNA-fragmenten worden gescheiden door hun heroriëntatie en beweging met verschillende snelheden door de gel. Grotere stukken DNA zijn langzamer om hun lading af te stemmen op de richtingsverandering, terwijl kleinere stukken sneller uitlijnen, wat resulteert in een grotere scheiding.

Succesvolle PFGE-apparatuur & amp-voorwaarden

Laten we eens nader kijken naar de apparatuur en omstandigheden die zullen leiden tot succesvolle PFGE.

Hier is de elektroforesekamer, die de lopende buffer bevat. De agarosegel moet goed verankerd zijn in het midden van deze kamer, zodat deze niet gaat drijven. Er zijn meerdere paren elektroden rond de gel, geplaatst in een zeshoekig raster. Deze zeshoekige vorm van elektroden zorgt voor de directionele omschakeling van de spanning. De spanning wordt periodiek geschakeld tussen drie richtingen: één die door de centrale as van de gel loopt, en twee die aan weerszijden onder een hoek van 60 graden lopen.

De PFGE-techniek duurt langer dan standaard gelelektroforese, vanwege de grootte van de DNA-fragmenten en omdat de fragmenten niet in een rechte lijn bewegen.

Om te voorkomen dat de agarosegel oververhit raakt door de langere periode onder het elektrische veld, wat kan leiden tot verlies van resolutie, past een koelmodule de temperatuur van de buffer aan. Een typisch PFGE-programma wordt uitgevoerd bij 14 of 15 graden Celsius. Het is belangrijk dat er geen lucht in de leidingen van en naar de koelmodule achterblijft.

Op de besturingsmodule kan het migratieprotocol worden ingevoerd en bewaakt. Dit omvat de initiële en uiteindelijke schakeltijden, de duur van de migratie, de hoek van elektroforese en de spanning.

Hoe groter de DNA-fragmenten, hoe langer de pulstijden zouden moeten zijn en hoe langer de totale migratietijd. De schakeltijd is de tijdsduur dat het elektrische veld in een enkele richting wordt gepulseerd. Een schakeltijd van 10 seconden betekent bijvoorbeeld dat het elektrische veld gedurende 10 seconden in de ene richting wordt gepulseerd en vervolgens gedurende 10 seconden in een andere richting wordt geschakeld.

Monsters met een breed scala aan DNA-fragmentgroottes, zoals NEB's PFG-markers, kunnen worden opgelost door in de loop van de run op te hogen van een korte schakeltijd naar een langere.

De meeste PFGE-protocollen zijn geoptimaliseerd voor gelruns van 6 volt per centimeter en geoptimaliseerd voor een hoek van 120 graden. Met elk PFGE-systeem kunt u, afhankelijk van het migratieprotocol, DNA-fragmenten of moleculen scheiden van 10 kilobasen tot 10 megabasen.

Hier zijn scheidingsvoorbeelden van de Lambda Mono Cut Mix, van 1,5 tot 48,5 kilobasen, en gistchromosomen, van 225 tot 1900 kilobasen.


Wat is gepulseerde veldgelelektroforese?

Pulsed Field Gel Electrophoresis, of PFGE, is een techniek die wordt gebruikt voor de scheiding van zeer grote DNA-moleculen.

Onder standaard elektroforese-omstandigheden wordt een elektrisch veld in één richting op de agarosegel aangebracht, en DNA-moleculen groter dan 40 kilobasen bewegen in wezen samen door de gel, onafhankelijk van hun grootte.

PFGE daarentegen past een elektrisch veld toe dat periodiek van richting verandert. Door een alternerende spanningsgradiënt op een PFGE-systeem te introduceren, kunnen zeer grote DNA-fragmenten worden gescheiden door hun heroriëntatie en beweging met verschillende snelheden door de gel. Grotere stukken DNA zijn langzamer om hun lading af te stemmen op de richtingsverandering, terwijl kleinere stukken sneller uitlijnen, wat resulteert in een grotere scheiding.

Succesvolle PFGE-apparatuur & amp-voorwaarden

Laten we eens nader kijken naar de apparatuur en omstandigheden die zullen leiden tot succesvolle PFGE.

Hier is de elektroforesekamer, die de lopende buffer bevat. De agarosegel moet goed verankerd zijn in het midden van deze kamer, zodat deze niet gaat drijven. Er zijn meerdere paren elektroden rond de gel, geplaatst in een zeshoekig raster. Deze zeshoekige vorm van elektroden zorgt voor de directionele omschakeling van de spanning. De spanning wordt periodiek geschakeld tussen drie richtingen: één die door de centrale as van de gel loopt, en twee die aan weerszijden onder een hoek van 60 graden lopen.

De PFGE-techniek duurt langer dan standaard gelelektroforese, vanwege de grootte van de DNA-fragmenten en omdat de fragmenten niet in een rechte lijn bewegen.

Om te voorkomen dat de agarosegel oververhit raakt door de langere periode onder het elektrische veld, wat kan leiden tot verlies van resolutie, past een koelmodule de temperatuur van de buffer aan. Een typisch PFGE-programma wordt uitgevoerd bij 14 of 15 graden Celsius. Het is belangrijk dat er geen lucht in de leidingen van en naar de koelmodule achterblijft.

Op de besturingsmodule kan het migratieprotocol worden ingevoerd en bewaakt. Dit omvat de initiële en uiteindelijke schakeltijden, de duur van de migratie, de hoek van elektroforese en de spanning.

Hoe groter de DNA-fragmenten, hoe langer de pulstijden zouden moeten zijn en hoe langer de totale migratietijd. De schakeltijd is de tijdsduur dat het elektrische veld in een enkele richting wordt gepulseerd. Een schakeltijd van 10 seconden betekent bijvoorbeeld dat het elektrische veld gedurende 10 seconden in de ene richting wordt gepulseerd en vervolgens gedurende 10 seconden in een andere richting wordt geschakeld.

Monsters met een breed scala aan DNA-fragmentgroottes, zoals NEB's PFG-markers, kunnen worden opgelost door in de loop van de run op te hogen van een korte schakeltijd naar een langere.

De meeste PFGE-protocollen zijn geoptimaliseerd voor gelruns van 6 volt per centimeter en geoptimaliseerd voor een hoek van 120 graden. Met elk PFGE-systeem kunt u, afhankelijk van het migratieprotocol, DNA-fragmenten of moleculen scheiden van 10 kilobasen tot 10 megabasen.

Hier zijn scheidingsvoorbeelden van de Lambda Mono Cut Mix, van 1,5 tot 48,5 kilobasen, en gistchromosomen, van 225 tot 1900 kilobasen.


Referenties

[1] Jones, T. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine 2003, 22 (6), 33-42. http://dx.doi.org/10.1109/memb.2003.304999.

[2] Qian, C. Huang, H. Chen, L. Li, X. Ge, Z. Chen, T. Yang, Z. Sun, L. International Journal of Molecular Sciences 2014, 15 (12), 18281-18309. http://dx.doi.org/10.3390/ijms151018281

[3] Hughes, M.P. Biomicrofluïdica 2016, 10 (3), 032801. http://dx.doi.org/10.1063/1.4954841

[6] Voldman, J. Jaaroverzicht van biomedische technologie 2006, 8 (1), 425-454. Doi:http://dx.doi.org/10.1146/annurev.bioeng.8.061505.095739

[7] Pethig, R. Journal of The Electrochemical Society 2016, 164 (5). Doi: http://dx.doi.org/10.1149/2.0071705jes

[8] Hsu, T.-R. MEMS en microsystemen: ontwerp, fabricage en engineering op nanoschaal John Wiley: Hoboken, NJ, 2008.


Moet de lengte van de elektroden in de elektroforesekamer evenredig zijn met de grootte van de kamer? - Biologie

PROTOCOL VOOR SDS-PAGINA-ANALYSE

Arun Malik, Harnish, Priyanka Chopra, Stanzin Angmo en Hariom Yadav[*]

Nationaal Agri-Food Biotechnology Institute, Mohali, Punjab, India

SDS-PAGE-techniek die algemeen wordt gebruikt in de moleculaire biologie, gebruikt om eiwitten te scheiden op basis van hun lengte van een lineaire polypeptideketen. De algemene elektroforesetechniek kan niet worden gebruikt om het molecuulgewicht van biologische moleculen te meten, maar deze techniek wordt meestal gebruikt om de molecuulmassa te meten. De term elektroforese betekent beweging van geladen deeltjes naar een elektrisch veld. In een elektrisch veld beweging van eiwitten naar elektrode met tegengestelde lading. De scheiding van eiwitten volgens hun vorm, grootte vindt plaats.

SDS-PAGE uitgevoerd bij het gieten van de gels om problemen en risico's van het werken met acrylamide te voorkomen. In dit protocol aanwezigheid van SDS en beta-mercapto-ethanol die wordt gebruikt om de eiwitten in hun subeenheden te denatureren.

Figuur. SDS-PAGE-processtroom

Voorraadoplossingen: oplossende gel voor 12% oplossing

  1. 30% acrylamide/bis (37,5:1)
    Neem 29,2 g acrylamide + 0,8 g N,N-bis-methyleen-acrylamide. Voeg er 100 ml water aan toe.
  2. 1,5 M Tris-HCL, pH-6,8
    Neem 6 gram Trizma Base. Pas de pH 8,8 aan met 6 N HCL. Voeg er 60 ml water aan toe.
  3. 10% (w/v) VIB
    Om 100 ml SDS te maken, neem je 10 g SDS en voeg je er 90 ml water aan toe.
  4. Gedestilleerd water 3,35 ml.
  5. TEMED 5 microliter.
  6. 10% APS (Ammonium Persulfaat) 50 microliter.

  1. PAGINA Rigs bevat afstandhouders, kammen, glasplaten (10 X 20 cm).
  2. Eiwit monster.
  3. Monsterbuffer met SDS en sucrose of glycerol.
  4. 2-mercapto-ethanol.
  5. 1 X lopende buffer

25 mM Tris-HCL
200 mM glycine
0,1% (w/v) VIB
Ongeveer het watervolume dat onder de 1 liter blijft, afhankelijk van het elektroforesesysteem.

10% (w/v) VIB
10 mM dithiothreitol of betamercapto-ethanol
20% (v/v) Glycerol
0,2 M Tris-HCL, Ph-6,8
0,05% (g/v) Broomfenolblauw

Gel gieten in mini-eiwitcassette

  1. Bereid oplossende gel voor en voeg alle reagentia toe om gel te maken, behalve TEMED en ammoniumpersulfaat (APS). Nadat TEMED en APS zijn toegevoegd, wordt de oplossing binnen enkele minuten gepolymeriseerd.
  2. Zet de gietglasframes op de gietstreng. Giet de oplossende gel tussen glazen frames.
  3. Breng na het gieten van de gel de kam voorzichtig in en voordat de gel polymeriseert.
  4. Laat het polymeriseren tot de gel stevig wordt tot 25-30 minuten.

Elektroforese

  1. Neem de glazen frames van de gietstreng en bewaar deze in de elektroforesekamer.
  2. Vul de kamer met buffer en laad de eiwitmonsters in putjes met gel en sluit vervolgens de elektroforesekamer.
  3. Sluit de rode en zwarte elektrische snoeren aan op de bijpassende gekleurde elektroden van de elektrode-eenheid.
  4. Zet de spanning rond de 120 volt en we kunnen 12% scheidingsgel gebruiken. Laat de gel normaal gesproken ongeveer 40-50 minuten lopen totdat de broomfenolkleurstof naar de bodem van de gel is gemigreerd.
  5. Na het migreren van de kleurstofbodem van de gel, verwijdert u de elektrodemontage.

Eiwitanalyse en detectie

Visualiseer het eiwit met Coomassie Brilliant Blue, zilverkleuring, of we kunnen een andere eiwitkleuring gebruiken.


Hoe werkt het?

Er zijn verschillende soorten PAGE-technieken die worden gebruikt, maar de meest voorkomende is SDS-PAGE. In SDS-PAGE wordt het detergens Natriumdodecylsulfaat gebruikt om de eiwitten te denatureren en hun massa-tot-ladingverhouding te normaliseren. Zonder SDS zouden zowel het molecuulgewicht als de lading van het eiwit de scheiding in de gel beïnvloeden. Met SDS heeft alleen het molecuulgewicht invloed op de migratiesnelheid en dus worden de monsters volgens deze gescheiden. PAGE zonder SDS wordt native PAGE genoemd, omdat de eiwitten in hun oorspronkelijke conformatie blijven.

De gelmatrix

Net als bij agarosegelelektroforese worden de monsters gescheiden met behulp van een elektrisch veld en gaan ze door een gelmatrix die de migratie van de eiwitten beïnvloedt. In PAGE gebruiken we in plaats van agarose een chemische stof genaamd polyacrylamide. Door het percentage polyacrylamide in de gel te variëren, kunnen we de grootte van de poriën in de gel veranderen, wat betekent dat we verschillende maten eiwit in gels met verschillende percentages kunnen scheiden. Typische gelpercentages worden weergegeven in de onderstaande tabel.

AcrylamidepercentageResolutie scheiden
5 %60 – 220 Kd
7.5 %30 – 120 Kd
10 %20 – 75 Kd
12%17 – 65 Kd
15 %15 -45 Kd
17.5%12 – 30 Kd

Acrylamide wordt normaal gesproken in vloeibare vorm verkocht, omdat de poedervorm neurotoxisch en gevaarlijk is om te hanteren. Polymerisatie wordt bereikt door acrylamide te mengen met bis-acrylamide, waardoor er verknopingen kunnen ontstaan ​​tussen de acrylamidemoleculen. Er worden extra chemicaliën toegevoegd om de polymerisatie op gang te brengen, meestal ammoniumpersulfaat als bron van vrije radicalen en TEMED als stabilisator. Zodra de polymerisatie begint, wordt de gel tussen 2 glasplaten gegoten en laat men deze volledig polymeriseren.

Het gelmengsel wordt niet in water gemaakt maar in elektroforesebuffer (Tris-HCl), die de ionen voor elektroforese levert. Vaak wordt de gel in 2 delen gegoten. Het eerste deel is een oplossende gel, met een pH rond 8,8 die de migratie van de eiwitten vertraagt. Boven de oplossende gel wordt een stapelgel gegoten met een pH van 6,8 en een grotere poriegrootte. Deze stapelgel werkt om de eiwitmonsters samen te persen tot een dun migratiefront, zodat alle eiwitten in het monster tegelijkertijd bij de oplossende gel aankomen, wat leidt tot een nauwkeurige relatieve migratie.

De gel uitvoeren

Anders dan bij agarosegelelektroforese, waarbij de gels in trays worden gegoten en horizontaal worden uitgevoerd, worden SDS-PAGE-gels verticaal gegoten met behulp van een gietapparaat. we gieten de gels op deze manier zodat de stapelende en oplossende gels een continue gel vormen, wat veel moeilijker zou zijn in een horizontale gel. Het maakt het ook mogelijk om een ​​veel grotere hoeveelheid eiwit op de gel te laden. De geltank is ook opgesplitst in 2 secties. Afhankelijk van de fabrikant heeft de tank een binnenste (of bovenste) bufferkamer en een buitenste (of onderste) bufferkamer. Deze twee kamers zijn verbonden door de gel om een ​​continu circuit te creëren. Elke kamer bevat en elektrode, negatief in de binnenste kamer en positief in de buitenste kamer. De binnenste kamer maakt contact met de bovenkant van de gel en wanneer een elektrisch veld wordt aangelegd, zullen de eiwitten zich naar de positieve elektrode in de buitenste bufferkamer bewegen vanwege de negatieve ladingen van de SDS-moleculen. Typische buffers voor SDS-PAGE zijn Tris-Glycine voor de bufferkamers en Tris-HCl voor de gel.

De bewegingssnelheid door de gel wordt dan bepaald door de spanningsgradiënt, d.w.z. de spanning tussen de elektroden. The required field strength is related to the size of the gel tank being used and the required voltage can be calculated using the simple equation E = V/d where E is the field strength, V the voltage and d the distance in cm between electrodes. Vertical gel tanks are generally run at 5 – 10 V / cm so if your tank has an electrode distance of 10 cm, you would run the gel at 50 – 100V. The exact value depends on your samples and should be determined empirically.

To apply this electrical field, we use a DC power supply. Most electrophoresis power supplies can be set to provide either a constant current or a constant voltage, with each having advantages and disadvantages. One potential issue is the production of heat due to the flow of current through the system which can be especially high with larger tanks that require higher voltage. For this reason, it is advisable to use some form of cooling, either passive in the form of a cooling block, or active such as a recirculating chiller, for larger electrophoresis systems.

Visualising the Protein

After migration, proteins must be visualised to determine their length and abundance. There are several methods commonly used to visualise proteins that are either specific or non specific. Non specific protein visualisation targets all proteins, using dyes that bind to common regions of the proteins such as the amino groups. Examples of non-specific protein stains include Coomassie Brilliant Blue and Ruby Pro. These stains are often non-reversible and can (but don’t always) interfere with downstream applications. Non-specific staining can be useful for quickly quantifying samples in a gel, or for ensuring a sample of interest is present.

To specifically visualise certain proteins, we need to use antibodies. Antibodies recognise unique 3 dimensional structures in the protein to distinguish them from others. By conjugating the antibody with a dye or enzyme, we can visualise just the protein that it recognises. The process of moving proteins from a gel to a membrane that can be probed with antibodies is called western blotting. To Learn more about western blotting, you can read our dedicated article soon. Whether you are western blotting or just non-specific staining, you will need to visualise the proteins using the gel documentation system. The type of system you use will vary based on whether you are using a visible stain like coomassie, or fluorescent or chemiluminescent dye attached to an antibody. As with agarose gel documentation systems, gel documentation systems for proteins can come in a variety of specifications depending on the requirements. For more advice on gel docs you can read our dedicated article.


Electrophoresis Lab

In this lab we explored DNA replication and electrophoresis. Through use of various DNA samples running through an Agarose gel with a lab controlled electric current, we aimed to view the effects of electrophoresis. Although most of our results were inconclusive, we were able to identify one band representing electrophoresis.

Electrophoresis is a process in which DNA, which is negatively charged, is placed in a gel where an electric current is applied. The DNA particles move towards the positive charge at different rates based on the size of the DNA fragments. (Wootton). In this lab, strands of lambda of unknown lengths were run through the gel. DNA fragments of shorter lengths are able to travel a longer distance. The length of each DNA fragment was determined based off of the distance travelled from the origin.

The lab was conducted at New Tech High at Coppell on January 27 and 28, 2016 in the AP Biology classroom. It was conducted in 3 parts: Part A, Part B, and Part C.

Part A, Casting the Agarose Gel:

  1. Seal the ends of the gel-casting tray with tape, insert the comb, and set it aside.
  2. Pour the solution to cover 5-6 mm, and make sure that it does not cover the comb. Before the gel sets, move any bubbles or debris aside with a pipette. Allow the gel to solidify, and do NOT move the gel or tray for the 15-20 minutes it takes.
  3. Unseal the tray and place in the gel box so that the comb is at the negative end. This is the black/cathode end. Fill the box with TAE buffer to cover the entire surface.
  4. Gently remove the comb, and clear any dimples with buffer.

Part B, Loading the Gel:

  1. Load the contents of the first tube into the pipet, and steady it in your hand.
  2. Expel any air in the tip before loading the DNA sample, then expel it slowly into the buffer, underneath the surface.
  3. Complete the steps above for each sample

Part C, Electrophorese:

  1. Close the chamber and connect it to a power supply, ensuring that both electrodes are connected to the same supply.
  2. Turn on the power supply. You should see the loading dye moving toward the positive pole.
  3. The DNA should electrophorese until the blue band is about 1 cm from the end of the gel.
  4. Turn off power supply, remove the leads, and remove the lid of the chamber.
  5. Measure the distance the blue stain moved down the gel.

HindIII EcoRI
Distance Travelled (cm) Actual Bp Distance Travelled (cm) Actual Bp
*27,491
1.9 *23,130 1.9 10,400
2.1 9,416 2.3 7,240
2.4 6,557 2.5 6,190
2.9 4,361 2.8 4,900
3.6 2,322 3.2 3,350
3.8 2,027 3.6 2,375
**564 3,350
**125

  1. Discussion: Answers to questions 1 – 9 -Sameen
  1. The points were excluded because they are outliers based on the standard curve. This tells us that some of the gels are different sizes and have different sensitivities, making them imperfect, and therefore subject to inconsistencies.
  2. You would use the 0.3% gel.
  3. You would use the 2-2.5% gels.
  4. You would have to make sure the voltage would be less than 100 volts so it would take longer for the gel to run.
  5. Either the charges were switched or the gel was simply flipped.
  6. It would most likely be the 1080 and the 1000 bps that make up the doublet as they are the closest to each other.
  7. The restriction enzyme looks for the specific sequence to splice the DNA.
  8. .
  9. Because the restriction enzymes look for specific sequences and splice the DNA at particular places, we can use the enzymes to identify the DNA by the segments they were spliced at.
  1. Conclusion: Summarize what your group learned: what is electrophoresis, why does it work, what is an RFLP, restriction enzyme, ligase, etc. -Rahi

Throughout this lab, we learned what electrophoresis is, and the methods to prove that it works. Electrophoresis is used to separate macromolecules like DNA or RNA by size, or proteins by their charge. We use RFLP, restriction fragment length polymorphism, analysis which is a method in which a DNA sample is broken down into smaller pieces by restriction enzymes. These resulting fragments are separated by their lengths in a process called gel electrophoresis. This experiment also helped us understand that ligase, a glue-like protein, repairs the two smaller enzymes back into one larger structure. For our group, the end results were good for the Lambda DNA, but all of the other DNAs were non-visible. Even though this happened, we got to understand how gel electrophoresis works, and how restriction enzymes take part in DNA production.


Bekijk de video: 4 Typen des Schweißens: MAG vs WIG vs Elektrode vs Fülldraht. Für Anfänger erklärt (November 2021).