Informatie

Komen gistinvoegconstructies terug?


Als ik een nieuw gen inbreng met een gistintegrerend plasmide en een keer selecteer met een drop-outcultuur, kan ik dan aannemen dat het nieuw geïntegreerde gen in de stam zal blijven zonder er selectieve druk op uit te oefenen? (d.w.z. kan ik normale vloeibare cultuur en platen gebruiken nadat ik de gist met de nieuw geïntegreerde stam heb gekregen?


Het hangt af van wat je precies hebt gedaan.

De standaardmanier om een ​​gistintergratingplasmide (YIp) te gebruiken, is om het in het genoom te integreren door recombinatie tussen een stuk gist-DNA dat de YIp draagt ​​en hetzelfde DNA in het genoom. Dit is vaak, maar niet noodzakelijk, de selecteerbare marker. Dus bijvoorbeeld een YIP met de URA3 gen aangezien het enige gist-DNA zal integreren aan de URA3 locus (waarschijnlijk mutant om selectie voor Ura . mogelijk te maken+, dus meer correct ura3).

Als de YIp wordt gelineariseerd door te snijden op een plaats binnen de URA3 marker zal dit de invoeging sturen en de transformatie-efficiëntie verhogen.

Nadat de invoeging heeft plaatsgevonden, is de configuratie op de integratiesite:

chromosoom... URA3... andere YIp-sequenties... ura3... chromosoom

Dit is inherent onstabiel omdat er een looping-out-gebeurtenis kan plaatsvinden via recombinatie tussen de URA3/ura3 Regio's. Selectie verwijderen betekent dus dat u het risico loopt de insert te verliezen. Verder is het mogelijk dat uitloop optreedt waarbij de URA3 allel achter in plaats van de ura3 allel. U kunt de vector dus verliezen, zelfs als de selectie wordt gehandhaafd (maar dit hangt af van de exacte aard van de mutatie).

Complexere configuraties zijn mogelijk waarbij de richtende sequentie gescheiden is van de selecteerbare marker, en waar digestie een heel deel van de richtende sequentie verwijdert vóór transformatie. Dus bijvoorbeeld als de TRP1 gen werd gebruikt voor het targeten van een plasmide met de URA3 marker in a TRP1 ura3 spanning zou je krijgen:

chromosoom… TRP1-fragment A… URA3+andere YIp-sequenties… TRP1-fragment B… chromosoom

de resulterende transformant is nu Ura+ vanwege de geïntegreerde URA3 plasmide, maar sommige TRP1 DNA ontbreekt nu (het DNA dat werd weggesneden toen het plasmide werd verteerd), dus de stam is trp1. Het uiterlijk van deze Trp- fenotype geeft aan dat de transformatie waarschijnlijk heeft plaatsgevonden via de beschreven route.

In dit geval is het ingevoegde plasmide veel stabieler omdat die twee resterende fragmenten van TRP1 DNA is niet identiek, dus er is geen mogelijkheid om uit te lussen.

Samengevat, als uw transformant het insert heeft dat het "nieuwe gen" draagt, geflankeerd door een herhalende sequentie, dan is het onstabiel, anders is het oké om selectie te verwijderen. In het eerste geval, als het nieuwe gen überhaupt schadelijk is, zal er een sterke selectiedruk zijn ten gunste van cellen die de insert hebben verloren.

Aanvulling

U kunt het gebruik van YIp-plasmiden helemaal vermijden door uw nieuwe gen op elke locus te integreren met behulp van lange targeting-primers, zoals weergegeven in de onderstaande afbeelding.

Ontwerp primers om uw gen zoals gewoonlijk te amplificeren, maar synthetiseer ze met 40 bp 5'-extensies die overeenkomen met twee sequenties aan de uiterste uiteinden van de integratieplaats (URA3 hier ter illustratie gebruikt). Het resulterende fragment kan vervolgens worden gebruikt in een transformatie en zal worden geïntegreerd op de URA3 plaats door homologe recombinatie, waarbij het aanwezige DNA wordt vervangen. Het voordeel van het gebruik URA3 hiervoor is dat je voor integranten kunt selecteren als Ura- cellen door resistentie tegen fluorotinezuur (FOA). Hoewel je hier waarschijnlijk direct op kunt selecteren, heb ik het fragment altijd samen met een ander selecteerbaar plasmide (LEU2, TRP1 enz., maar geen CEN-plasmide) Dan is uw b.v. Leu+ transformanten kunnen worden gescreend op diegene die ook FOA . zijn gewordenR. Deze co-transformatie gebeurt met een vrij hoge frequentie omdat de cellen die DNA opnemen, er veel van opnemen. Zodra u de selectie voor het co-transformerende plasmide verwijdert, gaat het snel verloren, waardoor u een schone niet-terugkerende integrant overhoudt.

Het is een tijdje geleden dat ik dit soort dingen heb gedaan - waarschijnlijk zijn er nu nog slimmere methoden.


Van gistintegrerende plasmiden is bekend dat ze stabiel zijn, zelfs in afwezigheid van een selectief medium, maar kunnen terugkeren zoals de meeste homologe recombinatieplasmiden.

Citaat uit het boek Gistgenanalyse (pg476):

YIps zijn over het algemeen stabieler dan YRp- of YEp-plasmiden. Als gevolg hiervan is het veilig om de meeste YIp-dragende soorten in rijke media te kweken, hoewel het een goede gewoonte is om ze onder selectieve omstandigheden op te slaan. De stabiliteit van YIp-dragende stammen hangt af van de aard van de integratiegebeurtenis. Als de YIp bijvoorbeeld een tandemherhaling genereert bij integratie in het genoom, kan dit terugkeren naar wildtype door een intramoleculaire homologe recombinatiegebeurtenis.

-> gebruik daarom markeringen regelmatig en vaak.

bronnen:

Mick F. Tuite, Yeast Gene Analysis Vol 26 (Academic Press, 1998) p.476


Een gist ABC interactome primer

Analyse van de gist ATP-bindende cassettetransporter interactome geeft inzicht dat relevant is voor de menselijke gezondheid over de regulatie en functie van een eiwitfamilie die de tolerantie voor fysiologische omstandigheden en extern opgelegde stress bepaalt.

De meeste studies van het gistproteïne-interactoom hebben ofwel het twee-hybride systeem (YTH) van gist gebruikt om oplosbare intranucleaire lokaas-prooi-koppelingen te identificeren, of MS om componenten van oplosbare affiniteit-gelabelde co-complexen (AP-MS) te identificeren 3 . Voor membraaneiwitten is MS van stabiele, affiniteitsgezuiverde, in detergent oplosbare co-complexen gebruikt 8 . Alle drie de benaderingen detecteren functionele en regulerende interacties die kunnen worden geannoteerd door middel van 'guilt by association'. Er zijn echter belangrijke beperkingen bij het verkrijgen van kwaliteitsresultaten op systeemniveau en de identificatie van netwerken met verschillende topologische en biologische eigenschappen is methodeafhankelijk 9 . Het twee-hybride membraangist (MYTH)-systeem maakt gebruik van reconstitutie van een gesplitste ubiquitine om te rapporteren over interacties tussen membraaneiwitten die als lokaas worden gepresenteerd en hun prooien ter plaatse 10 . Reconstitutie van een quasi-native ubiquitine activeert genen die groei op selectief medium mogelijk maken, wordt geverifieerd met behulp van een lacZ-reporter, terwijl de verwachte lokaaslokalisatie wordt bevestigd met behulp van een YFP die aan het aas is bevestigd (iMYTH) 3,10. Snider et al. 7 gebruiken fenotypische analyse om de impact te beoordelen van geselecteerde ABC-transporter-aasconstructies van gist op de celfunctie en een gemuteerd ubiquitine C-terminaal domein dat een aas-prooi-complex vereist voor ubiquitine-reconstructie. Bimoleculaire fluorescerende complementatie met behulp van een gesplitste YFP bevestigt aas-prooi-interacties en identificeert de subcellulaire lokalisatie van het aas-prooi co-complex.


INVOERING

Translocatie van eiwitten over en integratie in het membraan van het endoplasmatisch reticulum (ER) worden beide gemedieerd door het Sec61 translocon-complex (Johnson en van Waes, 1999). Eiwitten worden op dit complex gericht door hydrofobe signaalsequenties (von Heijne, 1990). Niet-gesplitste signalen en daaropvolgende hydrofobe segmenten van het polypeptide worden als transmembraanhelices in de dubbellaag geïntegreerd. Noch de determinanten van eiwittopologie in het membraan, noch het mechanisme van integratie zijn volledig begrepen. Het eenvoudigste geval van eiwittopogenese in het membraan is de oriëntatie van de signaalsequentie bij het binnenkomen van de translocon. Signaalsequenties kunnen ofwel het C-terminale uiteinde (splitsbare signalen en signaalankers) of het N-terminale uiteinde (omgekeerde signaalankers) verplaatsen. De best vastgestelde determinant van signaaloriëntatie is de verdeling van geladen residuen aan weerszijden van de hydrofobe kern van het signaal. Volgens de “positive-inside rule” (von Heijne, 1986 Hartmann et al., 1989), is het positievere einde in het algemeen cytosolisch. Bijkomende determinanten zijn het vouwen van sequenties N-terminaal tot een intern signaal dat N-translocatie sterisch kan belemmeren (Denzer et al., 1995), en de hydrofobiciteit van de apolaire signaalkern (Sakaguchi et al., 1992 Wahlberg en Spiess, 1997 Eusebio et al., 1998 Harley et al., 1998 Rösch et al., 2000 Goder en Spiess, 2003).

De Sec61 translocon bestaat uit Sec61α (Sec61p in gist) met 10 transmembraandomeinen, en de enkelvoudige overspannende eiwitten Sec61β (Sbh1p) en Sec61γ (Sss1p), die in bacteriën overeenkomen met het SecY-complex (SecY/SecG/SecE). De recente kristalstructuur van het archaebacteriële SecY-complex van Methanococcus jannaschii (van den Berg) et al., 2004) onthulde een verrassend compacte helixbundel met een potentiële hydrofiele kanaalporie en een laterale uitgangsplaats gemaakt van transmembraansegmenten TM2 en TM7, consistent met eerdere verknopingsgegevens (Plath et al., 1998). Het suggereert dat het translocatiekanaal wordt gevormd door een enkele heterotrimeer. De structuur vertegenwoordigt duidelijk de gesloten toestand, omdat de centrale doorgang wordt geblokkeerd door een lumenaal plugdomein en een centrale vernauwingsring. Om te openen, moet de plug naar buiten bewegen en de ring moet uitzetten om de centrale doorgang te verbreden. Door cysteïnemutagenese en disulfideverknoping werd aangetoond dat translocatie-polypeptiden inderdaad naar het centrum van SecY in Escherichia coli (Kanon et al., 2005). Het plugdomein is waarschijnlijk betrokken bij het poorten van de translocon die door de signaalsequentie wordt getriggerd om toegang en overdracht van het te transloceren polypeptide mogelijk te maken en om het kanaal af te sluiten wanneer het inactief is (Tam et al., 2005).

In een systematische analyse van geconserveerde geladen residuen in Sec61p die kandidaten waren om verantwoordelijk te zijn voor de positive-inside-regel, werden drie residuen, R67, R74 en E382, geïdentificeerd die voldoen aan de criteria van toenemende N-translocatie van een modelsignaalanker eiwit met meer positieve N-terminale flankerende ladingen bij mutatie en om N-translocatie van een modeleiwit met een tegengesteld ladingsverschil te verminderen (Goder et al., 2004). Gebaseerd op de structuur van het archaebacteriële SecY-complex, bevindt E382 zich aan het cytoplasmatische uiteinde van transmembraansegment TM8, en zowel R67 als R74 bevinden zich in het plugdomein, posities die schijnbaar geschikt lijken om de oriëntatie van een signaal dat het gesloten kanaal binnenkomt te beïnvloeden. Om de rol van het plugdomein in signaaloriëntatie en het belang ervan voor translocon-functionaliteit en cellevensvatbaarheid te testen, werden specifieke mutaties geïntroduceerd om de structuur ervan te verstoren, inclusief een volledige deletie. Verrassend genoeg had mutatie of deletie van het plugdomein geen invloed op de levensvatbaarheid of groei, ondanks verminderde translocatie-efficiëntie en translocon-vorming.


MATERIALEN EN METHODES

Plasmide constructie

Plasmide pUC21ΔBB werd geconstrueerd door pUC21 (11) te splitsen met Bamhoi en BglII gevolgd door ligatie om het fragment tussen de twee plaatsen te verwijderen, het resulterende plasmide heeft geen a BamHI noch a BglII restrictieplaats. Plasmide pUC21-NotI werd geconstrueerd door het invoegen van de 123 bp NietI polylinkerfragment van plasmide pFA6b (12) in pUC21ΔBB dat was gesplitst met NietI. Een vergelijkbare strategie werd gebruikt om equivalente vectoren te construeren met een Kanamycine-resistentiemarker, pUK21ΔBB en pUK21-NotI, te beginnen met plasmide pUK21 (11).

Plasmide HO-poly-HO werd in verschillende stappen gebouwd. Een fragment van 912 bp (HO-L) met reeksen uit de HO promotor (–2720 tot –1814 stroomopwaarts van de ATG) werd gemaakt door PCR met primers die waren ontworpen om een ​​fragment te genereren met hihiDIII en BsiWI overhangsequenties (zie hieronder). Dit fragment is ingevoegd in hihiDIII–BsiWI verteerd pUC21-NotI. Een fragment van 507 bp (HO-R) met reeksen vanaf het 3'-uiteinde van de HO gen (+1199 tot +1699 stroomafwaarts van de ATG) werd gemaakt door PCR met primers die zijn ontworpen om een ​​fragment te genereren met EcoRI en sfiIk overhang sequenties (zie hieronder). Dit fragment is ingevoegd in EcoRI–sfiIk heb pUC21-NotI verteerd. Plasmide HO-poly-KanMX4-HO werd geconstrueerd door het invoegen van de 1494 bp BsiWI–EcoRI-fragment met KanMX4 van plasmide pFA6-KanMX4 (12) in BsiWI–EcoRI verteerd HO-poly-HO. Plasmide HO-zijnG-URA3-hisG-poly-HO werd geconstrueerd door het invoegen van de 3853 bp BamHOI-BglII fragment met de zijnG-URA3-hisG cassette ( 8) in BamHI verteerd HO-poly-HO.

De PCR-amplificatie van de HO-L werd uitgevoerd met behulp van de 'sticky end PCR-klonering'-methode (13) met behulp van vier primers, F852-F855 (tabel 1). In het kort omvat deze methode het uitvoeren van twee PCR-reacties gevolgd door DNA-smelten en annealing. PCR met primers F852 en F854 resulteert in een fragment met een stomp uiteinde waarbij elk uiteinde 5 bp van ofwel de hihiDIII of BsiWI-erkenningssites. In een afzonderlijke reactie resulteert PCR met primers F853 en F855 in een fragment met een stomp uiteinde waarbij elk uiteinde 1 bp bevat dat nodig is voor de hihiDIII of BsiWI-erkenningssites. De twee PCR-reacties worden gemengd, bij 100°C gesmolten en vervolgens langzaam afgekoeld om DNA-hybride mogelijk te maken. Deze DNA-annealing resulteert in vier soorten DNA-producten, met verschillende uiteinden. Een kwart van de DNA-producten heeft uitsteeksels voor klonering in de vector verteerd met hihiDIII en BsiWI. Deze methode elimineert de soms problematische stap van restrictiedigestie van DNA-producten na PCR-amplificatie. Dezelfde methode werd gebruikt om de HO-R-fragment met behulp van primers F856-F859.


RESULTATEN

Sla1p lokaliseert naar de corticale actine-patches

het verwijderen van SLA1 zorgt ervoor dat cellen temperatuurgevoelig zijn voor groei en geassocieerde actinedefecten hebben die worden gekenmerkt door minder en grotere corticale patches (Holtzman et al., 1993). Om na te gaan of de effecten van mutaties in SLA1op actine-organisatie direct zou kunnen zijn, werd de subcellulaire lokalisatie van Sla1p bepaald. Andere genen, zoals ANC1, dat codeert voor een nucleair eiwit, actinedefecten veroorzaken wanneer ze worden verwijderd, hoewel hun genproducten niet zijn gelokaliseerd in het actine-cytoskelet (Welch en Drubin, 1994). Een antiserum werd verhoogd tot aminozuren 854-920 van Sla1p. Na affiniteitszuivering herkende dit antiserum een ​​enkel eiwit van 148 kDa (versus een voorspeld molecuulgewicht van 136 kDa) op Western-blots (Figuur 1A). Figuur 1, B en C, toont de colokalisatie van Sla1p met een subset van de corticale actine-patches. Colocalisatie van Sla1 naar de actinekabels werd niet waargenomen. Bovendien was er geen aantoonbare kleuring insla1 null-cellen (onze niet-gepubliceerde resultaten). We hebben ook een myc-gelabelde versie van Sla1p gegenereerd, die een kleurpatroon onthulde zoals dat werd verkregen met de anti-Sla1p-antilichamen (onze niet-gepubliceerde resultaten). De fluorescentiegegevens tonen aan dat Sla1p goed gepositioneerd is om een ​​directe rol te spelen in de organisatie van actine-assemblage in de gistcelcortex.

Fig. 1. Lokalisatie van Sla1p en actine met behulp van indirecte dubbellabel immunofluorescentiemicroscopie. (A) Antilichamen opgewekt tegen Sla1p werden gebruikt om Sla1p op Western-blots van wildtype cellen te detecteren en om een ​​gebrek aan reactieve eiwitten aan te tonen in sla1 nul cellen. (B en C) Immunofluorescentiemicroscopie werd vervolgens uitgevoerd om Sla1p (C) en actine (B) in wildtype diploïde cellen te lokaliseren. Bar, 5 m.

Lokalisatie van actine-geassocieerde eiwitten in afwezigheid van Sla1p

Veel eiwitten vertonen volledige of gedeeltelijke colokalisatie met corticale actinepleisters. Andere eiwitten zoals de Rab-GTPase Sec4p colocaliseren niet met actine, maar zijn niettemin afhankelijk van een intact actine-cytoskelet om een ​​gepolariseerde lokalisatie op de vermoedelijke knopplaats en in de knop van groeiende cellen te bereiken. Om de mogelijke rol van Sla1p bij de lokalisatie van dergelijke eiwitten te onderzoeken, werden 11 cortex-geassocieerde eiwitten samen met actine gelokaliseerd in wildtype ensla1 nul cellen. Van de geteste eiwitten waarvan bekend is dat ze binden aan actine of die significante colokalisatie met actine vertonen, bleven de meeste dit doen, zelfs toen het actine zijn wildtype "patch"-structuur verloor in sla1 nul cellen. Deze categorie omvatte Abp1p, Sac6p, cofilin, Srv2p, Arp2p en Las17p/Bee1p (Drubin et al., 1988 Maan et al., 1993 Freeman et al., 1996 Moreau et al., 1996 Li, 1997), zoals geïllustreerd in Figuur 2, A en B, voor Abplp. Bovendien zijn er drie eiwitten (Cdc42p, calmodulin en Spa2p) die sterk gepolariseerd zijn in cellen maar niet colocaliseren met actine (Snyder, 1989 Brockerhoff en Davis, 1992 Ziman et al., 1993) normaal gelokaliseerd in afwezigheid van Sla1p (onze niet-gepubliceerde resultaten). Daarentegen vertoonden twee andere eiwitten significante veranderingen in hun lokalisatie in sla1 nul cellen. Sla2p, dat een C-terminaal gebied heeft met homologie met talin (Holtzman et al., 1993 Raths et al., 1993) en actine in vitro bindt (McCann en Craig, 1997), en die substantiële co-lokalisatie vertoont met corticale actine-patches in vivo (Yang, Cope en Drubin, niet-gepubliceerde observaties), colokaliseert niet met actine in afwezigheid van Sla1p. In plaats van te associëren met de actine-brokken in sla1 nulcellen, wordt Sla2p gevonden in kleine stukjes aan de celperiferie (Figuur 2, C en D). Bovendien is Sla2p niet zo goed gepolariseerd in afwezigheid van Sla1p als in wildtype cellen. De penetrantie van het Sla2p/corticale actine patch noncolocalization fenotype werd beoordeeld door 100 cellen te tellen in elk van de drie costtaining-experimenten. In wildtype cellen vertoonden de Sla2p-pleisters colokalisatie met een subset van actine-pleisters in 88% van de getelde cellen. In cellen waarin Sla1p niet tot expressie werd gebracht, vertoonde echter slechts 24% van de cellen colokalisatie van Sla2p-pleisters met corticale actinestructuren. Er moet echter worden opgemerkt dat endocytose, waarvoor Sla2p (Raths et al., 1993) is niet ernstig getroffen insla1 cellen (Ayscough, ongepubliceerde observatie).

Fig. 2. Lokalisatie van eiwitten in afwezigheid van Sla1p.sla1 nulcellen werden gekweekt tot de log-fase en onderzocht door middel van dubbel-label immunofluorescentiemicroscopie. (A en B) Cellen gelabeld voor Abp1p (A) en actine (B). (C en D) Cellen gekleurd voor Sla2p (C) en actine (D). Bar, 5 m.

Het tweede eiwit waarvan wordt vastgesteld dat het afwijkend lokaliseert in afwezigheid van Sla1p, is Rho1p. Antilichamen opgewekt en met affiniteit gezuiverd tegen een Rho1p-peptide (zie MATERIALEN EN METHODEN) herkenden een eiwit van de juiste grootte door Western-blotting, en pre-incubatie van de antilichamen met het peptide blokkeerde deze herkenning (Figuur3A). Bovendien nam deze band in intensiteit toe wanneer: RHO1 werd tot overexpressie gebracht (Figuur 3B). Toen de antilichamen werden gebruikt voor immunolokalisatie in wildtype cellen, werd Rho1p gevonden in een patch op de plaats waar de knop zal verschijnen, aan het uiteinde van de nieuwe knop en vervolgens rond de cortex van de knop terwijl deze groeit (Figuur 3C ), zoals eerder beschreven (Yamochi et al., 1994). In de afwezigheid van Sla1p, hoewel Rho1p-lokalisatie relatief normaal was tijdens knopvorming, vertoonden veel cellen zonder knop kleuring over de hele celcortex (Figuur 3D). Daarentegen was in wildtype cellen weinig of geen algemene corticale kleuring zichtbaar in unbudded cellen (Figuur 3C). Tellingen toonden aan dat bijna 50% van de unbudded sla1nulcellen vertoonden ongepaste corticale kleuring (Figuur 3E).

Afb. 3. Verwijderen van SLA1 beïnvloedt de Rho1p-lokalisatie. (A en B) Immunoblots van lysaten van hele cellen (10 g/laan) onderzocht met affiniteitsgezuiverde anti-Rho1p-antilichamen. (A) Lysaat van wildtype cellen (DDY664) gesondeerd met onbehandelde antilichamen (linkerbaan) of met dezelfde antilichamen na pre-incubatie met het Rho1p-peptide-antigeen (rechterbaan). (B) Lysaten van DDY1097 (met aGALRHO1 plasmide rechterbaan) en DDY1098 (met een controleplasmide) werden bereid na 8 uur groei op galactose en onderzocht met de anti-Rho1p-antilichamen (onder) of (als een laadcontrole) met anti-β-tubuline-antilichamen (boven). (C en D) Immunolokalisatie van Rho1p in log-fase cellen van wildtype (C) en sla1 nulcellen (D) Bar, 5 m. (E) De kleurpatronen van unbudded cellen werden geteld. De getoonde gegevens zijn de gemiddelden van drie experimenten waarin ten minste 200 ontkiemde cellen werden gescoord. De enkele vlek van kleuring in wildtype cellen zonder knopen is vermoedelijk de plaats van waaruit de nieuwe knop tevoorschijn zal komen.

Eerder toonden we aan dat Sla1p in de aanwezigheid van het actineverstorende medicijn latrunculine-A wel in staat was zich te lokaliseren naar de celcortex, maar niet in staat was te polariseren naar de beginnende knopplaats (Ayscough et al., 1997). Het hier gepresenteerde resultaat dat een afhankelijkheid van Rho1p van Sla1p voor zijn lokalisatie laat zien, zou suggereren dat Rho1p ook niet zou kunnen polariseren in afwezigheid van een intact actine-cytoskelet. We hebben de afhankelijkheid van Rho1p-lokalisatie op F-actine getest zoals beschreven in Ayscough et al. (1997) en observeerde dat Rho1p in staat was om naar de celcortex te lokaliseren in aanwezigheid van latrunculine-A, maar niet gepolariseerd was naar de uiteinden van de cel (onze niet-gepubliceerde resultaten). Een telling van de cellen onthulde dat >70% van de cellen corticale maar niet-gepolariseerde kleuring van Rho1p vertoonde en 13% kleuring vertoonde zowel over de gehele cortex als op een patch aan één uiteinde van een cel. De overige cellen vertoonden geen detecteerbare kleuring voor Rho1p.

Rho1p reguleert het celwand-synthetiserende enzym 1,3-β-glucan synthase (Drgonová et al., 1996 Qadota et al., 1996). Om te onderzoeken of de abnormale lokalisatie van Rho1p in sla1 nulcellen beïnvloedden de celwandafzetting, we gebruikten elektronenmicroscopie. Zoals weergegeven in figuur 4, is de sla1 nul-mutante cellen vertoonden een afwijkende verdikking van de wanden van ontkiemde en moedercellen. Deze verdikking leek uniform te zijn over het gehele oppervlak van de ontkiemde en moedercellen, maar strekte zich niet uit tot in de knoppen (Figuur 4B), consistent met de relatief normale lokalisatie van Rho1p in ontluikende cellen (zie hierboven).

Fig. 4. sla1 nulcellen hebben dikke celwanden. (A) Wild-type en (B) Δsla1 cellen werden gekweekt tot logfase en vervolgens gefixeerd en verwerkt voor elektronenmicroscopie met behulp van kaliumpermanganaatfixatie om de visualisatie van de celwand en membranen te verbeteren.

Expressie van mutante vormen van Sla1p definieert functionele domeinen binnen het eiwit

De primaire sequentie van Sla1p suggereert dat er structurele elementen in het eiwit zijn die verantwoordelijk kunnen zijn voor specifieke functies en interacties. Een serie van sla1 deletiemutanten (Figuur 5) werden uitgedrukt insla1 null-cellen om deze mogelijkheid te onderzoeken. Western-blots bevestigden dat vergelijkbare niveaus van Sla1p tot expressie werden gebracht in cellen die de verschillende constructen droegen (onze niet-gepubliceerde resultaten), wat aangeeft dat de stabiliteit van de mutante Sla1-eiwitten niet significant was verminderd.

Afb. 5. Mutant sla1 constructies. Details van de constructie van plasmiden worden gegeven in Tabel 2.

Vervolgens hebben we bepaald of de mutante Sla1-eiwitten in staat waren om twee fenotypen te redden die geassocieerd zijn met de deletie van SLA1, temperatuurgevoelige groei en Abp1p-afhankelijkheid. Transformanten werden uitgeplaat op geschikte selectieve media bij 25° of 37°C (Figuur 6A). Op één na waren alle constructen, Sla1-ΔG1+SH3#3, in staat om de temperatuurgevoeligheid van de sla1 nul-mutant. Dit construct miste het gebied tussen het tweede en derde SH3-domein (Gap1) en ook het derde SH3-domein (Figuur 5). Interessant is dat mutanten die alleen Gap1 of alleen het derde SH3-domein missen, de groei bij de niet-permissieve temperatuur konden ondersteunen. Bovendien ondersteunde een ander construct, Sla1-ΔG2, slechts een slechte groei bij 37°C.

Fig. 6. Groei van cellen die mutante Sla1-eiwitten bevatten. (A) Cellen waarin de genomische kopie van SLA1 werd verwijderd (KAY14) werden getransformeerd met de sla1 mutantconstructen en uitgeplaat op selectief medium bij 25° en 37°C. (B) Cellen die dragen ABP1 op een URA3-gemarkeerde plasmide (KAY78) werden getransformeerd met de sla1 mutantconstructen en getest op groei op selectief medium in aanwezigheid of afwezigheid van 5-FOA. (C) Cellen (KAY14) werden gecotransformeerd met sla1mutant constructen Sla1-ΔC-term.rpts en Sla1ΔGap1+SH3#3 en getest op groei bij 37°C. Expressie van beide vormen van Sla1p werd geverifieerd door Western-blotting.

Redding van het Abp1p-afhankelijkheidsfenotype werd getest door platingsla1 abp1 dubbel-mutante cellen die a . droegenURA3-gemarkeerd ABP1 plasmide en brachten de verschillende sla1 mutant construeert op 5-FOA-bevattend medium, dat selecteert tegen de ABP1-dragend plasmide (Figuur 6B). In deze cellen is ABP1 was alleen aanwezig op aURA3-gemarkeerd plasmide. Bij afwezigheid van Sla1p kunnen deze cellen niet groeien zonder de ABP1 plasmide en kan daardoor niet groeien op 5-FOA-platen. Van de mutante vormen van Sla1p konden alleen cellen die Sla1-ΔC-terminale herhalingen tot expressie brachten de Abp1p-afhankelijkheid niet redden. Dit resultaat suggereert dat dit herhalingsgebied betrokken is bij een functie die redundant is met die van Abp1p.

In deze eerste analyse hadden we één mutant eiwit geïdentificeerd dat de Abp1p-afhankelijkheid van de sla1 nul-mutant maar niet de temperatuurgevoeligheid en een tweede die de temperatuurgevoeligheid redde, maar niet de Abp1p-afhankelijkheid. Om te testen of de twee Sla1p-functies in transformanten konden worden uitgevoerd, werden de twee mutante constructen gecotransformeerd in sla1 nul cellen. De transformanten groeiden erg slecht bij 37°C (Figuur 6C), wat suggereert dat Sla1-ΔG1+SH3#3 competitief de Sla1-ΔC-terminale herhalingen remt (Sla1-ΔC-term.rpts).

Actine-organisatie in cellen die de mutante vormen van Sla1p uitdrukken

Zoals hierboven vermeld, sla1 nul-mutanten hebben minder corticale actine-patches en deze patches lijken groter en minder gepolariseerd dan normaal (Figuur 7, B en C). Om te beoordelen of dit afwijkende actine-fenotype kan worden toegeschreven aan een bepaald domein van Sla1p, kleurden we cellen die de verschillende Sla1p-mutanten tot expressie brengen met Rd-phalloidin. Cellen met wildtype of afwijkende corticale actinepleisters werden geteld, en dit is samengevat in figuur 7A. Representatieve cellen voor drie van de mutanten zijn afgebeeld in Figuur 7, D-F. Cellen die Sla1-ΔG1+SH3#3 tot expressie brengen (Figuur 7D) hadden het meest ernstige actine-fenotype, vergelijkbaar met dat in sla1nulcellen, wat aangeeft dat dit domein een cruciale rol speelt bij de regulatie van de corticale actine-organisatie. Daarentegen hadden cellen die de meeste andere mutante vormen van Sla1p tot expressie brachten een kleurpatroon dat bijna niet te onderscheiden was van dat van wildtype cellen. Figuur 7E toont bijvoorbeeld het kleurpatroon voor Sla1-ΔC-terminale herhalingen. Deze eiwitten bevatten dus de informatie die nodig is voor het handhaven van een normale corticale actine-cytoskeletorganisatie. Sommige mutanten, waaronder Sla1-ΔSH3#1&2 en Sla1-ΔGap1, hebben een gedeeltelijk penetrant actine-fenotype waarbij ∼15-20% van de cellen in de populatie actinebrokjes hebben, hoewel de overige cellen een wildtype actine-uiterlijk hebben (Figuur 7F, Sla1-ΔSH3#1&2).

Fig. 7. Actine-organisatie in cellen die mutante vormen van Sla1p tot expressie brengen. Log-fase-cellen werden verwerkt voor Rd-phalloidin-kleuring. (A) Voor elke mutant werden ten minste 300 cellen gescoord op wildtype of afwijkende actine-patchmorfologie. Representatieve afbeeldingen van actinekleuring worden getoond voor cellen die (B) wildtype Sla1p, (C) geen Sla1p, (D) Sla1-ΔG1+SH3#3, (E) Sla1-ΔC-terminale herhalingen, (F) Sla1- ΔSH3#1&2. Bar, 5 m.

We hebben ook immunofluorescentiemicroscopie met dubbele labeling uitgevoerd voor actine en Sla2p in cellen die mutante vormen van Sla1p tot expressie brengen (onze niet-gepubliceerde resultaten). Onze resultaten gaven aan dat de ontkoppeling van Sla2p en corticale actine-patchlokalisatie correleert met de ernst van het actinedefect in plaats van een specifiek Sla2p-bindend domein in Sla1p.

Analyse van de rol van Sla1p met behulp van een gepermeabiliseerde celassay

Een in vitro gepermeabiliseerde celassay werd gebruikt om de rol van Sla1p bij de regulatie van actinepatchassemblage verder te testen. De test meet de genucleëerde assemblage van exogeen toegevoegd rhodamine-actine in gepolariseerde plekken in de cortex van permeabel gemaakte cellen (Li et al., 1995). Deze patches lijken op die waargenomen in vivo in termen van hun grootte en distributie (Figuur 8A). Zoals eerder gemeld (Liet al., 1995), gepermeabiliseerd sla1 nulcellen zijn niet in staat om genucleëerde actine-assemblage te ondersteunen en vertonen slechts een laag achtergrondniveau van rhodamine-actine-fluorescentie die nooit in corticale patches wordt geassembleerd (Figuur 8B). sla1 nulcellen die drie van de mutanten tot expressie brengen sla1 constructen werden onderzocht en de gegevens werden gekwantificeerd en uitgedrukt als het bereik van fluorescentie-intensiteiten gemeten in de knoppen van cellen met kleine knoppen. Cellen die Sla1-ΔSH3#1&2 of Sla1-ΔC-terminale herhalingen tot expressie brachten, verzamelden verschillende gepolariseerde patches van rhodamine-actine die lijken op die in wildtype cellen, en de fluorescentieniveaus waren vergelijkbaar met, of (voor Sla1-ΔSH3#1&2) enigszins groter dan die waargenomen in wildtype cellen (Figuur 8, C en E).

Fig. 8. Rhodamine-actine-opname in gepermeabiliseerde cellen die mutante vormen van Sla1p tot expressie brengen. Cellen die (A) wildtype Sla1p, (B) geen Sla1p, (C) Sla1-ΔSH3#1&2, (D) Sla1-ΔG1+SH3#3, (E) Sla1-ΔC-term uitdrukken. herhalingen werden gekweekt, permeabel gemaakt en getest op actine-assemblage zoals beschreven door Liet al., (1995) (zie MATERIALEN EN METHODEN). Plaatsen van incorporatie werden vervolgens bekeken met fluorescentiemicroscopie en de intensiteit van fluorescentie in de knoppen werd gemeten. De eenheden van fluorescentie-intensiteit zijn willekeurig. Bar, 5 m.

Daarentegen zorgde deletie van het Gap1-gebied en het derde SH3-domein samen, maar van geen van beide alleen, ervoor dat cellen volledig defectief waren in de opname van rhodamine-actine in corticale actinestructuren (Figuur 8D).

Om het belang van Sla1p bij de assemblage van actinepleisters verder te onderzoeken, werden celextracten terug toegevoegd aan permeabel sla1nulcellen in een poging om de actine-assemblage-activiteit te reconstrueren. De activiteit zou inderdaad hersteld kunnen worden door toevoeging van wildtype celextracten, maar extracten van sla1 nulcellen of van cellen die alleen Sla1-ΔG1 + SH3 # 3 tot expressie brengen, waren niet in staat om de actine-assemblage-activiteit te herstellen (Eby en Ayscough, niet-gepubliceerde gegevens, zie MATERIALEN EN METHODEN). Deze gegevens ondersteunen de conclusie dat Sla1p een directe rol speelt bij de regulatie van het corticale actine-cytoskelet.

Een splijtingsgisthomoloog van SLA1 kan de temperatuurgevoeligheid van S. cerevisiae sla1 nulcellen redden

Een volledige homoloog van SLA1 werd geïdentificeerd in deS. pombé genoom database. Hoewel de algemene sequentieovereenkomst niet hoog is (27%), is de voorspelde S. pombéeiwit bevat dezelfde herkenbare domeinen van Sla1p, waaronder drie SH3-domeinen, een proline-helixmotief en een C-terminaal herhalingsgebied (Figuur 9A). Bovendien waren in het centrale derde deel van de eiwitten twee niet-verwante regio's, elk van ∼60 aminozuren, die meer op elkaar leken (respectievelijk 58 en 60% identiteit) dan enig ander deel van het eiwit (Figuur 9A). Deze domeinen delen geen significante homologie met andere sequenties in de openbaar toegankelijke databases. De antisera verhoogd tot S. cerevisiae Sla1p herkende geen eiwit van de juiste grootte op een Western-blot van S. pombé eiwitten, noch gaven ze een duidelijk kleurpatroon door immunofluorescentie. De S. pombe sla1 gen werd gekloneerd van cosmide-DNA in een overexpressievector en getransformeerd in S. cerevisiae cellen waarinSLA1 was verwijderd. De S. pombé gen was in staat om de temperatuurgevoeligheid geassocieerd met de deletie gedeeltelijk te redden (Figuur 9, B en C), maar kleuring van deze cellen voor actine gaf aan dat hun afwijkende actine-organisatie niet werd gered door het splijtingsgistgen.

Afb. 9. De S. pombé homoloog vanSLA1 redt de temperatuurgevoeligheid van S. cerevisiae sla1Δ cellen. (EEN) S. pombé Sla1p heeft een domeinstructuur die lijkt op die van S. cerevisiaeSla1p. Twee regio's met hoge homologie worden aangeduid als SHD (Sla1p homologiedomein) 1 en 2. De percentages van identiteit van de SH3-domeinen en de SHD-regio's worden vermeld onder de respectieve motieven. Groei vanS. cerevisiae sla1 nulcellen (KAY14) metS. cerevisiae SLA1, S. pombe sla1of vector alleen werd getest bij (B) 29°C en (C) 37°C.


Alternatieve oligomere toestanden van het gist Rvb1/Rvb2-complex geïnduceerd door histidine-tags

Rvb1 en Rvb2 zijn essentieel AAA + (EENTPasen eengeassocieerd met diverse cellulaire eenactiviteiten) helicasen, die belangrijke componenten zijn van kritische complexen zoals chromatine-remodellering en telomerasecomplexen. De oligomere toestand van de Rvb-eiwitten is controversieel. Independent studies from several groups have described the yeast and human Rvb1/Rvb2 complex both as a single and as a double hexameric ring complex. We found that histidine-tagged constructs of yeast Rvb proteins employed in some of these studies induced the assembly of double hexameric ring Rvb1/Rvb2 complexes. Instead, untagged versions of these proteins assemble into single hexameric rings. Furthermore, purified endogenous untagged Rvb1/Rvb2 complexes from Saccharomyces cerevisiae were also found as single hexameric rings, similar to the complexes assembled in vitro from the purified untagged components. These results demonstrate that some of the differences between the reported structures are caused by histidine tags and imply that further studies on the purified proteins should be carried out using untagged constructs.


Yeast are first cells known to cure themselves of prions

When colonies of baker's yeast cells that contain clumped prion proteins (colonies of white cells on left) are stressed by high temperatures, some can convert the aggregated prion proteins to the non-clumping form of the protein (red cells in the colonies the right). Credit: Serio laboratory/ UA molecular and cellular biology

Yeast cells can sometimes reverse the protein misfolding and clumping associated with diseases such as Alzheimer's, according to new research from the University of Arizona.

The new finding contradicts the idea that once prion proteins have changed into the shape that aggregates, the change is irreversible.

"It's believed that when these aggregates arise that cells cannot get rid of them," said Tricia Serio, UA professor and head of the department of molecular and cellular biology. "We've shown that's not the case. Cells can clear themselves of these aggregates."

Prions are proteins that change into a shape that triggers their neighbors to change, also. In that new form, the proteins cluster. The aggregates, called amyloids, are associated with diseases including Alzheimer's, Huntington's and Parkinson's.

"The prion protein is kind of like Dr. Jekyll and Mr. Hyde," said Serio, senior author of the paper published today in the open-access journal eLife. "When you get Hyde, all the prion protein that gets made after that is folded in that bad way."

For yeast, having clumps of amyloid is not fatal. Serio and her students exposed amyloid-containing cells of baker's yeast to 104 F (40 C), a temperature that would be a high fever in a human. When exposed to that environment, the cells activated a stress response that changed the clumping proteins back to the no-clumping shape.

The finding suggests artificially inducing stress responses may one day help develop treatments for diseases associated with misfolded prion proteins, Serio said.

"People are trying to develop therapeutics that will artificially induce stress responses," she said. "Our work serves as a proof of principal that it's a fruitful path to follow."

First author on the paper "Spatial quality control bypasses cell-based limitations on proteostasis to promote prion curing" is Serio's former graduate student Courtney Klaips, now at the Max Planck Institute for Biochemistry in Munich. The other authors are Serio's students Megan Hochstrasser, now at the University of California, Berkeley, and Christine Langlois of Brown University.

National Institute of Health grants R01 GM069802001, F31 AG034754 and F31 GM099383 funded the research.

These yeast cells contain a prion protein that can change shape from a non-clumping form to one that aggregates into clumps called amyloids. Proteins in these cells have the non-clumping shape and are tagged with a marker that fluoresces green under UV light. Credit: Serio laboratory/ UA molecular and cellular biology

To accomplish their jobs inside cells, proteins must fold into specific shapes. Cells have quality-control mechanisms that usually keep proteins from misfolding. However, under some environmental stresses, those mechanisms break down and proteins do misfold, sometimes forming amyloids.

Cells respond to environmental stress by making specific proteins, known as heat-shock proteins, which are known to help prevent protein misfolding.

Serio and her students wanted to know whether particular heat-shock proteins could make amyloids revert to the normal shape. To that end, the team studied yeast cells that seemed unable to clear themselves of the amyloid form of the prion protein Sup35.

The researchers were testing one heat-shock protein at a time in an attempt to figure out which particular proteins were needed to clear the amyloids. However, the results weren't making sense, she said.

So she and Klaips decided to stress yeast cells by exposing them to a range of elevated temperatures - as much as 104 F (40 C) - and let the cells do what comes naturally.

As a result, the cells made a battery of heat-shock proteins. The researchers found at one specific stage of the cell's reproductive cycle, the yeast could turn aggregates of Sup35 back into the non-clumping form of the protein.

Yeast cells reproduce by budding. The mother cell partitions off a bit of itself into a much smaller daughter cell, which separates and then grows up.

The researchers found in the heat-stressed yeast, just when the daughter was being formed, the mother cell retained most of the heat-shock proteins called chaperones, especially Hsp-104. As a result, the mother had a particularly high concentration of Hsp-104 because little of the protein was shared with the daughter.

The fluorescent green chunks in these yeast cells are prion proteins that have assumed the shape that aggregates into clumps called amyloids. The prion proteins in these cells are tagged with a marker that fluoresces green under UV light. Credit: Serio laboratory/ UA molecular and cellular biology

The mother cells ended up "curing" themselves of the Sup35 amyloid, although the daughters did not. The degree of curing was correlated with the concentration of Hsp-104 in the cell, and the higher the temperature the more Hsp-104 the cells had.

The Hsp-104 takes the protein in the amyloid and refolds it, Serio said. But she and her colleagues found that just inducing high levels of Hsp-104 in cells by itself does not change the amyloid protein back to the non-clumping form.

"Clearly the heat-shock proteins are collaborating in some way that we don't understand," she said.

Having the amyloid-forming version of the protein is not automatically bad, she said. It may be that shape is good under some environmental conditions, whereas the non-aggregating form is good under others.

Even in humans, amyloid forms of a protein can be helpful, she said. Amyloid proteins are associated with skin pigmentation and with hormone storage.

To clear the amyloid from yeast cells, these experiments triggered cells to make many different heat-shock proteins.

Serio now wants to figure out the minimal system necessary to clear amyloids from a cell. Knowing that may help the development of drug therapies for amyloid-related human diseases, she said.


Dankbetuigingen

This work was supported by the European Commission (Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network “HONOURS” grant agreement no. 721367), the Swiss National Science Foundation (SNF grants CRSII3_160780 and 310030_173085), the German Research Council (DFG grants SFB-TR84 (TRR 84/3, A07) and DR 772/7-2), the Federal Ministry of Education and Research (BMBF grant RAPID, 01KI1723A) and by core funds of the University of Bern. We thank S. Vashee for the provision of the TAR vectors and for discussions related to his herpesvirus work J. Peters Zocher for her advice in generating the figures F. Suter-Riniker and P. Bittel for providing clinical samples staff from the Next Generation Sequencing platform (University of Bern) and M. Schweizer, P. Plattet, M. Gerber, M. Friesland, M. Alves, N. Vielle, B. Zumkehr, M. Brügger and D. Brechbühl for reagents, technical advice and helpful discussions. This study is dedicated to S. Kunz.


Resultaten en discussie

Efficient Construction of Yeast Homozygous Diploid Strains

Our strategy for construction of homozygous diploid cells is shown in Figure 1B . As a host strain, we used either a MAT een of MAT α haploid strain carrying i) PSTE18-URA3, which expresses the URA3 gene under the control of haploid specific STE18 (G-protein γ subunit) promoter [11] and ii) PGAL1-HO, which expresses the HO endonuclease under the control of GAL1 promoter (repressed by glucose and induced by galactose [12]). Once the host strain is transiently incubated on galactose plates (HO induction) , the mating-type switch (MAT eenMAT α of MAT αMAT een) occurs and consequently diploid cells are formed by mating of MAT een en MAT α cells within colonies. Following short induction times of HO (㰒 hours), the colonies contain three cell types, MAT een, MAT α, en MAT een / α. Our strategy can select diploids by counter selection using 5-FOA, where haploids cannot grow because Ura3 (orotidine-5′-phosphate decarboxylase) converts 5-FOA into a toxic compound [13], while diploids are resistant to 5-FOA because URA3 is not expressed. Leaky expression of HO does not matter as long as the host strain is maintained on plates lacking uracil.

First, we investigated whether the PSTE18-URA3 gene allows selecting for diploid cells. We constructed wild-type PSTE18-URA3 en hog1Δ PSTE18-URA3 strains in the three cell types (MAT een, MAT α, en MAT een / α) and grew them on SC plates lacking uracil or containing 0.1% 5-FOA. As shown in Figure 2A , the haploid and diploid PSTE18-URA3 strains showed the expected phenotypes, i.e. the haploid strains were uracil prototrophic and 5-FOA sensitive, and the diploid strains were uracil auxotrophic and 5-FOA resistant. Moreover, the haploid cells that germinated from spore progeny of the diploid PSTE18-URA3 strains displayed uracil prototrophy and 5-FOA sensitivity ( Figure 2B ). Taken together, these results demonstrate that the PSTE18-URA3 gene can be used as a diploid selection marker.

(A) The haploid and diploid PSTE18-URA3 strains display opposite growth phenotypes on plates lacking uracil or containing 5-FOA. The strains were grown for 2𠄳 days at 30ଌ. (B) The growth phenotype of the diploid PSTE18-URA3 strain can revert to that of haploid after sporulation. The indicated diploid strains were sporulated, tetrads were dissected and spore progeny was grown on YPD plate for 3 days at 30ଌ. Then, the cells were replicated on the indicated plates and grown for 2𠄳 days at 30ଌ.

Next, we determined the efficiency of construction of diploids by our strategy. The wild-type PSTE18-URA3 en hog1Δ PSTE18-URA3 stammen (MAT een en MAT α) carrying pJH283 (PGAL1-HO) were grown overnight on galactose plate, and then cells were restreaked on SC plate containing 0.1% 5-FOA. The single colonies obtained on the 5-FOA plate were analyzed by two methods: i) observation of pseudohyphal growth on SLAD plate, and ii) determination of mating type by PCR. All of the single colonies analyzed (10 colonies for each strain) showed diploid specific patterns: i) strongly enhanced pseudohyphal growth (data not shown), and ii) two PCR bands corresponding to diploids (Figure S1). These results indicate that our method is highly efficient for construction of diploid strains.

Screening Suppressor Mutations of Enhanced Morphological Developments of hog1Δ/hog1Δ

To demonstrate that our strategy for construction of diploid strains is useful for genetic studies of diploid-specific developments, we applied it to yeast filamentous growth in the � background. Transposon insertion mediated-random mutagenesis and -systematic gene disruption have previously been employed to dissect the genetic bases of filamentous growth [14], [15]. However, these studies used haploid strain backgrounds in which filamentous growth was ectopically induced by an extra copy of the opposite mating-type locus and the PHD1 gene (transcriptional activator for filamentation) or by adding 1% butanol to the growth medium. In addition, however, homozygous diploid strains must be used to analyze the genetics of filamentous growth. We have recently reported that hyperosmotic stress inhibits all of the yeast morphological developments and that the Hog1 MAPK is a central negative regulator of these developments [10]. Moreover, the effect of HOG1 deletion is reflected in diploids more clearly than in haploids [16]. Therefore, suppressor mutations of the enhanced morphological developments of hog1Δ/hog1Δ are expected to lead to the identification of genes involved in controlling those phenotypes. In the present study, we screened suppressor mutations of complex colony morphology, strong invasive growth, and hyper-filamentous growth in the � hog1Δ/hog1Δ background by constructing homozygous double mutants (i.e. xxx::mTn/xxx::mTn hog1Δ/hog1Δ).

Following the strategy shown in Figure 3A , a transposon insertion mutagenesis was performed using the haploid hog1Δ PSTE18-URA3 strain carrying pJH283 (PGAL1-HO) as a host strain. Since the diploid hog1Δ/hog1Δ strain displays complex colony morphology even on YPD plates while the diploid wild-type strain does not [10], [16], mutant strains defective in formation of complex colony morphology were first screened by visual inspection ( Figure 3B ). From more than six thousand 5-FOA resistant strains (candidates for homozygous diploids) which were obtained at 93% success rate of randomly picked transformants, we isolated more than 100 mutant strains that showed smooth- or less complex-colony morphology. The diploid state in those was confirmed by PCR analysis of the mating-type locus. We amplified the transposon insertion regions of these strains by vectorette PCR and sequencing of the PCR products identified 49 unique genes ( Table 1 and Table S1). Morphological developments (complex colony morphology, invasive growth, and filamentous growth) of all 49 homozygous double mutant strains on YPD plates were characterized, and the results are discussed below.

(A) Strategy for screening the suppressor mutations. Using the haploid hog1Δ PSTE18-URA3 strain carrying pJH283 (PGAL1-HO::TRP1) as a host strain, transposon insertion mutagenesis was performed and mutant strains defective in complex colony morphology were screened by visual inspection. The details are described in Materials and Methods. (B) One example of the screening results is shown. The candidates, smooth colony or less complex colony, were further analyzed: identification of the transposon insertion position, mating-type PCR, and morphological assay for invasive growth and filamentous growth.

Tafel 1

GenCCMIGFGDescription of gene productVerwijzing
ADE6– –– –Formylglycinamidine-ribonucleotide (FGAM)-synthetaseDeze studie
AMN1– –Protein required for daughter cell separation, multiple mitotic checkpoints, and chromosome stability [15]
ATO2– –– –+Putative transmembrane protein involved in export of ammoniaDeze studie
CLN1– –– –G1 cyclin involved in regulation of the cell cycle [16], [23]
DHH1– –– –Cytoplasmic DExD/H-box helicase [24]
FLO8– –– –– –Transcription factor required for flocculation, diploid filamentous growth, and haploid invasive growth [15], [20]
GCN2– –+Protein kinase that phosphorylates the alpha-subunit of translation initiation factor eIF2 [19]
HIR2– –Subunit of the HIR complex [15]
HIR3– –Subunit of the HIR complexDeze studie
IES1+Subunit of the INO80 chromatin remodeling complexDeze studie
IMP2′Transcriptional activator involved in maintenance of ion homeostasis and protection against DNA damageDeze studie
KRE11+Subunit of the TRAPP II (transport protein particle) complexDeze studie
KSS1– –– –– –Mitogen-activated protein kinase involved in filamentous growth and pheromone response [21]
MSN1– –Transcriptional activator involved in invertase expression and invasive growth/pseudohyphal differentiation [15], [26]
MTC5– –– –– –Subunit of the SEA (Seh1-associated) complexDeze studie
RAD1– –– –Single-stranded DNA endonucleaseDeze studie
RAD24+Checkpoint protein involved in the activation of the DNA damage and meiotic pachytene checkpointsDeze studie
RAS2– –– –– –GTP-binding protein that regulates the nitrogen starvation response, sporulation, and filamentous growth [15], [16]
RDI1+Rho GDP dissociation inhibitor involved in the localization and regulation of Cdc42 [22]
RIM9– –– –– –Protein of unknown function involved in the proteolytic activation of Rim101p in response to alkaline pH [15], [27]
SHE10– –+Putative glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored protein of unknown functionDeze studie
SIR3– –– –Silencing protein that interacts with Sir2p and Sir4p, and histone H3 and H4 tailsDeze studie
SLP1Member of the SUN-like family of proteinsDeze studie
SPT2– –Protein involved in negative regulation of transcriptionDeze studie
STE7– –– –– –MAPK kinase involved in pheromone response and pseudohyphal/invasive growth [16], [21]
TCO89Subunit of TORC1, a complex that regulates growth in response to nutrient availabilityDeze studie
TEC1– –– –– –Transcription factor required for haploid invasive and diploid pseudohyphal growth (TEA/ATTS family) [14], [15], [16]
UBP6Ubiquitin-specific proteaseDeze studie
YDR306C– –– –+F-box protein of unknown functionDeze studie
YHR177W– –– –– –Putative protein of unknown functionDeze studie

Mitochondrial Function Is Essential for Complex Colony Morphology

Sixteen of the 49 strains displayed petite and smooth colony morphology (Figure S2) and were unable to grow on plates containing glycerol as a sole carbon source (data not shown). These phenotypes suggest impaired respiratory growth, and all of these mutations are indeed linked to mitochondrial functions (Table S1). We confirmed that a rho 0 mutant (lacking mitochondria DNA) in the hog1Δ/hog1Δ background also displays petite and smooth colony morphology (Figure S2). Moreover, we identified three additional genes encoding proteins related to mitochondrial functions, ILM1, SCO1, en SDH1 (Table S1). These results indicate that mitochondrial function is essential for complex colony morphology. Jin et al. have previously shown that mitochondrial dysfunction inhibits filamentous growth through the retrograde signaling pathway, which is a mitochondria-to-nucleus pathway transducing changes in mitochondrial function to specific adaptive changes in nuclear gene expression [15]. ILM1 is known to be required for both mitochondrial function and slowed DNA synthesis-induced filamentous growth [17]. However, all of the mitochondria-related mutants identified by our screen poorly suppressed hyper-filamentous growth and strong invasive growth of the hog1Δ/hog1Δ strain (data not shown), suggesting that the hyper-filamentous phenotype of HOG1 deletion involves multiple mechanisms that are not simply suppressed by mitochondrial dysfunction. Alonso-Monge et al. have recently reported that the Candida albicans hog1 mutant shows an enhanced basal respiratory rate compared to the wild-type strain and suggested a link between Hog1 and mitochondrial function [18]. Therefore, it would be interesting to investigate whether and how Hog1 activated by hyperosmotic stress inhibits mitochondrial function during filamentous growth.

Multiple Mechanisms Are Necessary for the Enhanced Morphological Developments of hog1Δ/hog1Δ

In addition to the mitochondria-related mutations, we identified 30 mutations that suppress at least two of the enhanced morphological developments of hog1Δ/hog1Δ (Table S1) and representative mutants are shown in Figure 4 . Thirteen of the 30 genes have previously been reported to be involved in at least one of the three morphological developments in the S. cerevisiae � background [14], [15], [16], [19], [20], [21], [22], [23], [24]. Those genes include the well-known STE7, KSS1, TEC1, RAS2, en FLO8 that regulate filamentous growth via the MAPK or cAMP-PKA signaling pathway. These two signaling pathways converge on the regulation of the MUC1 (ook gekend als FLO11) gene [25], which encodes a GPI-anchored cell surface mucin required for morphological developments. DHH1 is involved in translational regulation of the Ste12 transcription factor which is regulated under the Kss1 MAPK pathway and essential for MUC1 expression [24]. GCN2 (general amino acid control system) and MSN1 (transcriptional activator) are involved in the regulation of MUC1 under certain nutrient conditions [19], [26]. Presumably, RIM9 is also important for the regulation of MUC1 through the pH-responsive Dfg16-Rim101 pathway [27]. Thus, our screen implies that impaired MUC1 expression is sufficient to suppress enhanced morphological developments of hog1Δ/hog1Δ. Indeed, deletion of the MUC1 gene in the hog1Δ/hog1Δ background lost the enhanced morphological developments and resulted in morphology similar to a muc1Δ/muc1Δ strain ( Figure 4 ).

CCM: complex colony morphology, IG: invasive growth, FG: filamentous growth. All other suppressor mutants identified are shown in Table 1 .

Seventeen of the 30 mutations occurred in genes not previously implicated in filamentous growth in S. cerevisiae. These gene products are involved in various cellular mechanisms, especially DNA damage checkpoint control (IMP2′, RAD1, en RAD24), gene expression via chromatin remodeling or histone-nucleosome assembly (HIR2, HIR3, IES1, SIR3, en SPT2), control of cell cycle or cell division (AMN1 en YHR177W), and other functions. Although the present study did not reveal the morphological suppressing mechanism by deletion of these genes or physical interactions between Hog1 and the identified targets, our screen could highlight the genetic networks that are required for the enhanced morphological developments independent of the filamentous growth signaling pathways. Since the active Hog1 (Hog1-D170A/F318S) strain inhibits all of the morphological developments in a hyperosmotic stress-independent manner [10], the mechanisms identified in our screen might be negatively regulated by Hog1. While crosstalk between the HOG and filamentous growth MAPK pathways is well established [28], the present mutant collection will enable further analyses of connections between the HOG pathway and other mechanisms. Such efforts can contribute to understanding mechanisms of filamentous growth common between model yeasts and pathogenic yeasts as well as devising novel antifungal targets.

In conclusion, we demonstrate that combinatorial use of the PGAL1-HO en PSTE18-URA3 genes is effective for construction of homozygous diploid strains and a useful tool when combined with large-scale screening. Genetic information of S. cerevisiae homozygous diploids obtained by the method proposed in this study may be useful for the studies of other organisms such as diploid Candida albicans in which construction of homozygous mutant strains is a difficult task.


More Information

Applications

Get results fast!

With the Matchmaker Gold system, one-hybrid library screening is straightforward, quick, and easy:

Stap 1: Create a bait construct by cloning 1&ndash3 tandem repeats of the target DNA-binding sequence into pAbAi.

Stap 2: Create a bait-specific reporter strain by transforming and integrating the linearized pBait-AbAi construct into the Y1H Gold yeast strain and selecting on SD/&ndashUra agar medium.

Stap 3: Confirm the integration of the bait sequence using colony PCR and the Matchmaker Insert Check PCR Mix 1.

Stap 4: Use SMART technology to synthesize cDNA containing ends that are homologous to the ends of the linearized pGADT7-Rec vector.

Stap 5: Create and screen your library in a single step by cotransforming your bait-specific reporter strain with the SMART-generated cDNA and the linearized pGADT7-Rec vector, and plating on AbA-containing selective medium.

Stap 6: Harvest the resulting colonies, which contain putative DNA-binding prey proteins, and analyze your library inserts using the Matchmaker Insert Check PCR Mix 2.

Analysis by colony PCR

Screening positive colonies by PCR is a fast and convenient way to analyze the bait strain and sort through the positive clones identified in Y1H and Y2H screens. With the Matchmaker Insert Check PCR Mix 1, you can verify the integration of your Y1H pBait-AbAi construct, and with the companion Matchmaker Insert Check PCR Mix 2, you can quickly sort through and analyze the inserts in positive clones that have emerged from either one-hybrid or two-hybrid screens.

Yeast one-hybrid media

Our yeast one-hybrid media sets each contain a complete set of all the yeast media pouches you need for Matchmaker Gold One-Hybrid protocols.

Aanvullende productinformatie

Raadpleeg het analysecertificaat van het product voor informatie over opslagomstandigheden, productcomponenten en technische specificaties. Raadpleeg de lijst met kitcomponenten om de kitcomponenten te bepalen. Analysecertificaten en lijsten met kitcomponenten bevinden zich onder het tabblad Documenten.

Takara Bio USA, Inc.
Verenigde Staten/Canada: +1.800.662.2566 &stier Azië-Pacific: +1.650.919.7300 &stier Europa: +33.(0)1.3904.6880 &stier Japan: +81.(0)77.565.6999
UITSLUITEND VOOR ONDERZOEK. NIET VOOR GEBRUIK IN DIAGNOSTISCHE PROCEDURES. &kopie 2021 Takara Bio Inc. Alle rechten voorbehouden. Alle handelsmerken zijn eigendom van Takara Bio Inc. of haar dochteronderneming(en) in de VS en/of andere landen of hun respectievelijke eigenaren. Bepaalde handelsmerken zijn mogelijk niet in alle rechtsgebieden geregistreerd. Aanvullende informatie over producten, intellectueel eigendom en beperkt gebruik is beschikbaar op Takarabio.com.

Takara Bio Europe is lid van de Takara Bio Group, een toonaangevend life sciences bedrijf dat zich inzet voor het verbeteren van de menselijke conditie door middel van biotechnologie. Via onze merken Takara, Clontech en Cellartis is het onze missie om innovatieve tools en diensten van hoge kwaliteit te ontwikkelen om ontdekking te versnellen.