Informatie

Groeien bacteriën op pure droge glucose?


Ik heb per ongeluk pure glucose aangeraakt met mijn blote handen (vingers om precies te zijn), die bedoeld was voor celcultuur.

Ik ben bang dat bacteriën van mijn huid op de glucose gaan groeien en mijn dierlijke celculturen besmetten.

Moet ik me hier echt zorgen over maken en er nog een glucosepakket voor halen of gewoon cellen ermee gaan voeden?


Bacteriën of andere micro-organismen kunnen niet echt groeien op watervrije (totaal droge) glucose omdat ze water nodig hebben.

Ze kunnen daar echter blijven en besmetting veroorzaken. Zelfs als u het glucosemonster niet echt hebt aangeraakt, hangen er veel bacteriën in de lucht en kunnen ze zich in uw glucosepakket nestelen. Haal je de glucose eruit om te wegen, dan kunnen ook bacteriën die in de lucht zitten, op je handschoenen, op het papier waarmee je weegt, zich op het glucosemonster nestelen. Eigenlijk elke stof (zouten in PBS, water enz.).

Daarom moet u, voordat u oplossingen in celkweek gebruikt, ze steriliseren door ze te autoclaveren of te filteren. Glucoseoplossingen mogen niet worden geautoclaveerd omdat de hitte glucose verkoolt. Je moet ze filteren met een 0,2 micron filter. Alle materialen die voor celcultuurdoeleinden worden gebruikt, mogen alleen in de laminaire kap worden geopend.


Antwoorden en antwoorden

Ok, hier is een korte vraag (of misschien niet zo snel). Ik was vanmorgen koffie aan het zetten en bracht spullen naar mijn werk, waaronder suiker. De laatste zak suiker is bijna op en staat hier al een flink aantal maanden, maar hij is nog net zo schoon en puur als de dag dat ik hem binnenbracht.

Waarom groeit er op geen enkele manier schimmel op of bederft suiker? Ik moet geloven dat er microben in de suiker zitten, dezelfde als die op een oppervlak liggen of door de lucht drijven en op voedsel landen. Waarom bederft suiker niet?

Interessante vraag. Geraffineerde suiker is bijna pure (99%) sucrose, die kan worden afgebroken door schimmels en gist. Er zijn onderzoeken gedaan naar bacteriële besmetting:

En blijkbaar is geraffineerde suiker erg gevoelig voor schimmel:

Mijn gok is dat je suiker droog genoeg bleef zodat er geen uitgebreide besmetting kon optreden.


Honing: zijn antibacteriële werking bij de behandeling van gastro-enteritis

PIP: De resultaten van verschillende recente "in vitro"-onderzoeken met honing in orale rehydratatieoplossingen (ORS) die aan zuigelingen en kinderen met gastro-enteritis werden gegeven, toonden aan dat het gebruik van honing de duur van bacteriële diarree had verminderd en dat het goed had gewerkt als een substituut voor glucose in een orale rehydratatie-oplossing die elektrolyten bevat. Studies hebben bevestigd dat honing de duur van diarree bij patiënten met bacteriële gastro-enteritis verkort door zijn antibacteriële eigenschappen. Bij niet-bacteriële gastro-enteritis had honing hetzelfde effect als glucose op de duur van de diarree. In een recent onderzoek werd het antibacteriële effect van pure honing geëvalueerd door de groei van een reeks gram-positieve en gram-negatieve bacteriën te testen in media die verschillende concentraties honing bevatten. Het bleek dat de meeste pathogene bacteriën niet konden groeien in honing bij een concentratie van 40% en hoger. Vergelijkbare onderzoeken hebben aangetoond dat organismen zoals Staphylococcus aureua, Proteus mirabilis en Candida albicans niet konden groeien in aanwezigheid van onverdunde honing in in vitro experimenten. In experimenten om de effectiviteit van honing bij het remmen van de groei van verschillende bacteriën te evalueren, bleek dat alle bacteriën goed groeiden op hun respectieve controleplaten met verschillende groeimedia, terwijl in honing-agar alle bacteriële darmpathogenen niet groeiden bij een concentratie van 40% en meer van pure honing. Omdat honing een hoog suikergehalte heeft, kan het worden gebruikt om de opname van natrium en water uit de darm te bevorderen op een manier die vergelijkbaar is met het gebruik van oraal rijstwater en sucrose. Bevindingen uit onderzoeken naar honing hebben dus aangetoond dat wanneer het wordt gegeven met een ORS, het de duur van bacteriële diarree verkort en veilig kan worden gebruikt als vervanging voor glucose, op voorwaarde dat de oplossing elektrolyten bevat.


Melk als groeimedium

Het maken van kaas is afhankelijk van de groei van bacteriën om zuurgraad, smaakstoffen en rijpingsenzymen te produceren. Het is daarom belangrijk om de eigenschappen van melk als groeimedium te begrijpen.

Algemene voedingsstoffen

Melk is een goede bron van alle belangrijke voedingsstoffen, waaronder koolstof, stikstof en macromineralen. Veel micronutriënten zoals vitamines en micromineralen zijn ook beschikbaar. Melk is echter uniek met betrekking tot zijn suiker.

Melksuiker

Koolhydraten, vooral eenvoudige suikers zoals sucrose (tafelsuiker), kunnen sneller als energiebronnen worden gebruikt dan vetten en eiwitten. De energievaluta van de cel is echter glucose (ook wel dextrose genoemd), dus om beschikbare koolhydraten te gebruiken, moeten micro-organismen ze in glucose kunnen omzetten.

De enige suiker die van nature aanwezig is, is melk, is lactose. De meeste micro-organismen missen het enzym lactase dat nodig is om lactose te breken in de twee componenten suikers, namelijk glucose en galactose. Melkzuurbacteriën die wel lactase hebben, breken lactose gemakkelijk af en gebruiken glucose als energiebron. Melkzuurbacteriën hebben daarom een ​​concurrentievoordeel in melk, dat wil zeggen dat ze andere bacteriën kunnen ontgroeien die geen glucose uit lactose kunnen halen. Verder zijn sommige melkzuurbacteriën in staat galactose om te zetten in glucose.

Zuurgraad (pH)

Zuurgraad zoals gemeten door pH is een van de meest kritische parameters met betrekking tot zowel voedselveiligheid als zowel proces- als kwaliteitscontrole van gefermenteerde voedingsmiddelen zoals kaas. De begrippen zuurgraad en pH worden uitgelegd in paragraaf 3.5. De titreerbare zuurgraad van melk varieert typisch van 0,12 tot 0,19% melkzuur, afhankelijk van de samenstelling, met name het eiwitgehalte. De pH van melk ligt in de buurt van de fysiologische pH van 6,8, wat, gezien de volgende punten, betekent dat melk een goed groeimedium is met betrekking tot zuurgraad (pH).

  • De meeste organismen groeien het best bij een pH in de buurt van een fysiologische pH van 6,8. Zoals uitgelegd in paragraaf 3.5, is titreerbare zuurgraad (TA) geen goede voorspeller van zuureffecten op microbiële groei en chemische eigenschappen zoals eiwitfunctionaliteit.
  • De belangrijkste groepen micro-organismen die belangrijk zijn voor het bewaren van voedsel, zijn in volgorde van toenemende zuurtolerantie: bacteriën, gisten en schimmels.
  • Natuurlijke fermentatie van warme rauwe melk door melkzuurbacteriën verlaagt de pH van de melk tot minder dan 4,0, wat de groei van pathogene bacteriën en de meeste bederfbacteriën voorkomt

Vochtigheid

Melk heeft een hoog vochtgehalte (typisch 87% voor koemelk) en is, gezien het beschikbare vocht, een uitstekend groeimedium. Maar het moet duidelijk zijn dat met betrekking tot microbiële groei de kritische parameter de wateractiviteit is en niet het vochtgehalte. Wateractiviteit (aw) is een index van de beschikbaarheid van water voor microbiële groei. Het is de beschikbaarheid van water in het voedsel gerapporteerd als een fractie van de beschikbaarheid van water uit zuiver water. Met andere woorden, de aw van water is 1 en de aw van andere stoffen wordt gerapporteerd als decimale fracties van 1. Wateractiviteit wordt verminderd door opgeloste stoffen, die direct variëren met het aantal opgeloste moleculen in plaats van het gewicht. Om deze reden hebben kleine moleculen zoals suiker en zout, in vergelijking met grote moleculen zoals eiwitten, een groot effect op de wateractiviteit. Jam wordt bijvoorbeeld geconserveerd door het hoge suikergehalte.

Micro-organismen variëren sterk in hun vermogen om te overleven en/of te groeien bij verminderde wateractiviteit. Hoewel er echter uitzonderingen zijn, is de minimale wateractiviteit voor de belangrijkste groepen micro-organismen als volgt:

Vergelijk deze waarden met typische aw-waarden voor melk, kaas en enkele andere voedingsmiddelen.

  • Melk, verse groenten en fruit, vers vlees 60 - 98% vocht, aw 0,97 - 1,00
  • De meeste gebakken producten, wat kaas, wat vleeswaren, 20-60% vocht, aw 0,88 - 0,96.
  • Gedehydrateerde voedingsmiddelen zoals ontbijtgranen. Minder dan 5% vocht, aw 0.20 - 0.30

Typische aw-waarden voor sommige kaas in de marketingfase worden hieronder gegeven (Eck en Gillis, 2000). Zie ook typische aw-waarden voor kaasfamilies in tabel 1.1.

  • Huisje 0,988
  • Brie 0.980
  • Munster 0,977
  • Saint-Paulin 0.968
  • Edam 0.960
  • Cheddar 0,950
  • Parmezaanse kaas 0,917

Beschikbaarheid van zuurstof

Met betrekking tot de zuurstofbehoefte kunnen micro-organismen zijn:

  • Aeroob: moet zuurstof hebben om te groeien
  • Anaëroob: kan alleen groeien in afwezigheid van zuurstof
  • Microaërofiel: kleine hoeveelheden zuurstof nodig
  • Kan met of zonder zuurstof groeien.

Schimmels hebben zuurstof nodig, dus ze kunnen worden verwijderd door vacuüm- of begassingsverpakkingen. De meeste gisten zijn aëroob (zuurstof nodig), maar sommige kunnen anaëroob groeien (bij afwezigheid van zuurstof). Bacteriën kunnen in een van deze categorieën vallen, maar melkzuurbacteriën zijn mico-aërofiel of anaëroob.

Melk zal tijdens het melken, bewaren en hanteren wat opgeloste zuurstof opnemen, maar het wordt snel opgebruikt tijdens bacteriegroei.


Beginsel

De oxidatief-fermentatieve test bepaalt of bepaalde gramnegatieve staafjes glucose metaboliseren door fermentatie of aerobe ademhaling (oxidatief). Tijdens het anaërobe fermentatieproces wordt pyruvaat omgezet in een verscheidenheid aan gemengde zuren, afhankelijk van het type fermentatie. De hoge zuurconcentratie die tijdens de fermentatie wordt geproduceerd, zal zet de bromthymolblauw-indicator in OF-media van groen naar geel in aanwezigheid of afwezigheid van zuurstof.

Bepaalde niet-fermenterende gramnegatieve bacteriën metaboliseren glucose met behulp van aerobe ademhaling en produceren daarom slechts een kleine hoeveelheid zwakke zuren tijdens de glycolyse en de Krebs-cyclus. De afname van de hoeveelheid pepton en de toename van de hoeveelheid glucose vergemakkelijkt de detectie van de aldus geproduceerde zwakke zuren. Dikaliumfosfaatbuffer wordt toegevoegd om zuurdetectie verder te bevorderen.


Groeien bacteriën op pure droge glucose? - Biologie

Steriele techniek is altijd een relatieve kwestie. De vereiste voorzorgsmaatregelen zijn afhankelijk van de experimentele situatie, inclusief de gebruikte groeimedia, het competitieve vermogen van het experimentele organisme, de duur van het experiment en het beoogde gebruik van de cultuur. Bij deze experimenten is schimmel het ernstigste besmettingsprobleem. Veel gewone schimmels groeien goed op gistmedia en concurreren effectief, waardoor de platen te groot worden en de gist die erin slaagt te groeien, wordt verduisterd. Bacteriën zijn minder een probleem, omdat de meeste van hen niet goed groeien op deze media en met een beetje ervaring kunnen ze gemakkelijk van gist worden onderscheiden. Andere giststammen kunnen rampzalige verontreinigingen zijn als ze onopgemerkt blijven. Vooral een rode gist die soms opduikt, kan erg verwarrend zijn, maar onderscheidt zich van onze rode gist omdat hij geen adenine nodig heeft.

In tegenstelling tot experimenten op korte termijn, moeten sterilisatiemedia echter behoorlijk rigoureus zijn, omdat opslag voldoende tijd biedt voor zelfs langzaam groeiende verontreinigingen om zich te ontwikkelen. Uit ervaring hebben we geconcludeerd dat het bewaren van media in de kou juist contraproductief is. Het voorkomt geen besmetting, maar vertraagt ​​​​de groei. Bijgevolg kan besmetting onopgemerkt blijven totdat de culturen zijn geïncubeerd. Het is veel beter om media op kamertemperatuur te bewaren en contaminatie te detecteren voordat het medium wordt gebruikt.

(1) Steriliseren met vochtige warmte

Vochtige warmte van een autoclaaf of snelkookpan is een efficiënte manier om de meeste materialen te steriliseren. Bij een druk van 15 psi boven atmosferische druk, bereikt water een temperatuur van ongeveer 121 ° C voordat het kookt. De meeste materialen worden effectief gesteriliseerd door 15 minuten blootstelling aan deze temperatuur. Als er geen autoclaaf beschikbaar is, zal een gewone huishoudelijke snelkookpan de mediavoorraden effectief in kleine batches steriliseren.

(2) Steriliseren met droge hitte

Droge materialen zoals glas en metaal kunnen in een oven worden gesteriliseerd, maar dit vereist een hogere temperatuur (160°C) en een langere tijd (minimaal 2 uur) dan een autoclaaf. Dit is het meest praktisch voor glaswerk wanneer er een oven beschikbaar is die wordt bestuurd door een automatische timer, zodat sterilisatie en koeling 's nachts kan plaatsvinden. Het gebruik van wegwerpbare, voorgesteriliseerde plastic artikelen maakt de oven minder belangrijk.

De vlam van een gasbrander steriliseert effectief kleine glazen of metalen voorwerpen, zoals entlussen, maar men moet voorkomen dat de gist "frituurt" door contact met voorwerpen die in een vlam worden verwarmd. Dip glazen strooiers in alcohol en gebruik vervolgens de vlam om de alcohol te ontsteken. Plaats metalen gereedschappen zoals lussen in de vlam totdat ze roodgloeiend zijn. Koel hete gereedschappen door ze aan te raken op de agar of de binnenkant van een steriele glazen buis. Omdat vlammen echter gevaarlijk zijn, kan en moet deze methode waar mogelijk worden vermeden. We hebben ontdekt dat vlammen eigenlijk alleen nodig is om entlussen en kleine instrumenten te steriliseren. We hebben bij deze experimenten geen enkele waarde kunnen aantonen bij het in brand steken van de openingen van buizen, flessen of kolven.

(4) Steriliseren met alcohol

In veel experimentele procedures is de meest effectieve manier om objecten te steriliseren met ethanol. Ofwel 95% of 70% zal werken. Dat laatste is eigenlijk effectiever, maar het eerste is vaak handiger. Uiteraard moet de alcohol eerst verdampen of verbrand worden voordat het object in contact komt met de gist. Gebruik een vlam om de alcohol te verbranden, een kaars is over het algemeen goedkoper en veiliger dan een gasbrander. De alcohol, meer dan de hitte, doet de sterilisatie, dus "steek" de alcohol gewoon aan om verhitting tot een minimum te beperken en het proces te versnellen. Veeg de bank ook af met alcohol voordat u een experiment start om met schimmel beladen stof, de meest voorkomende bron van besmetting, te verwijderen. Als uw huid niet bijzonder gevoelig is, veegt u uw handen ook af met een kleine hoeveelheid alcohol.

(5) Steriele dingen steriel houden

De meest voorkomende bronnen van besmetting tijdens een experiment zijn stof, van het werkblad, uit de lucht en van mensen. Dit dicteert een aantal voor de hand liggende principes:
1) Houd dingen zoveel mogelijk afgedekt.
2) Raak niets aan dat in contact komt met de cultuur en als u het toch aanraakt, steriliseert u het opnieuw voordat u het gebruikt.
3) Veeg het oppervlak rond het experiment af met alcohol en minimaliseer luchtturbulentie.
4) Vermijd praten, zingen, fluiten, hoesten of niezen in de richting van dingen die steriel zouden moeten zijn. Lang haar, als het niet wordt vastgebonden, kan een bron van besmetting zijn.
5) Zorg voor een geschikte ruimte voor het voorbereiden, bewaren en gebruiken van steriele media. Helaas zijn kamerplanten, dieren en andere materialen zoals Drosophila-media, die vaak worden aangetroffen in biologieklaslokalen, overvloedige bronnen van schimmels en moeten ze ver weg worden gehouden van het gebied dat wordt gebruikt voor steriele procedures.

(6) Bestudeer uw besmetting om het de volgende keer te vermijden

Als sommige van uw agarplaten besmet raken, kunt u vaak door de plaat te onderzoeken zien hoe de besmetting plaatsvond. Als de verontreinigingen in de agar zijn ingebed, is de verontreiniging waarschijnlijk met het medium gegoten. Als de verontreiniging zich onder de agar bevindt, kan deze in de schaal zijn geweest voordat deze werd gegoten of binnengekomen toen het deksel werd geopend om te schenken. Als de vervuiling er bovenop zit, kan deze zijn binnengekomen voordat het deksel na het uitschenken werd gesloten, tijdens het openen van het deksel om condens weg te vegen of tijdens het enten van de plaat.

(7) Stem uw technieken af ​​op uw behoeften

Passende steriele techniek is essentieel voor succesvolle microbiologische experimenten, maar overmatige voorzorgsmaatregelen kunnen ernstige afleiding zijn. Gist en bacteriën vragen om andere methoden dan weefselkweek. Gist groeit robuust en overtreft de meeste dingen, behalve een paar draadvormige (donzige) schimmels en sommige bacteriën. Experimenten kunnen besmet raken en toch niet verloren gaan wanneer studenten gist gebruiken, omdat de gist ondanks besmetting goed genoeg zal groeien om de resultaten van een experiment door de gewraakte groei heen te kunnen lezen. Wees daarom uiterst voorzichtig bij het maken en gieten van media.

De meeste experimenten in dit handboek gebruiken een of twee van de volgende soorten media:
1) een qua voedingswaarde compleet medium met een suboptimale hoeveelheid adenine (YED),
2) een qua voedingswaarde compleet medium met een overmaat aan adenine (YEAD),
3) een chemisch gedefinieerd medium zonder adenine (MV),
4) een chemisch gedefinieerd medium met adenine (MV + Ade),
5) een sporulatiemedium (YEKAC),
6) een medium dat wordt gebruikt om petite mutanten (PETITE) te identificeren en
7) een rijk medium dat wordt gebruikt om giststammen op te slaan (YEPAD).

We gebruiken media die zijn bereid met in de handel verkrijgbare ingrediënten. De kleine extra kosten van deze ingrediënten worden ruimschoots gecompenseerd door hun uniformiteit en betrouwbaarheid. De besparingen die gerealiseerd kunnen worden door het gebruik van "zelfgemaakte" ingrediënten zijn kleiner dan verwacht mag worden omdat we nog geen vervanger hebben gevonden voor het duurste ingrediënt, agar. Hoewel gemeenschappelijke bronnen, zoals verschillende soorten groentesappen, de meeste andere ingrediënten kunnen leveren, hebben we ontdekt dat het opofferen van reproduceerbaarheid ongerechtvaardigd is.

YED medium (gistextract + dextrose) wordt ons standaard groeimedium. Het wordt een "complex" medium genoemd omdat het is gemaakt van natuurlijke ingrediënten (gist) en de exacte chemische samenstelling niet bekend is. Het bevat alles wat in gist zit - inclusief adenine natuurlijk - dus het is ook een "compleet" medium. Rode adenine-benodigde mutanten groeien goed op dit medium en ontwikkelen het karakteristieke rode pigment.

YEAD medium (gistextract + adenine + dextrose) bevat dezelfde ingrediënten als YED maar heeft een overmaat aan adenine. Rode adenine-eisende mutanten groeien goed op dit medium en zal niet het karakteristieke rode pigment ontwikkelen.

YEPAD medium (Gistextract + Pepton + Adenine + Dextrose) bevat dezelfde ingrediënten als YEAD maar heeft pepton toegevoegd. Dit is een zeer rijk medium dat wordt gebruikt voor het bewaren van giststammen.

MV-medium (Minimal plus Vitamins) is een chemisch gedefinieerd medium, wat betekent dat het is samengesteld uit het minimum aan pure chemische ingrediënten die nodig zijn om de groei van wildtype gist te ondersteunen. We zullen MV gebruiken als we een medium nodig hebben dat geen adenine bevat.

MV + Ade medium (Minimaal plus Vitaminen + adenine) bevat dezelfde ingrediënten als MV maar heeft een overmaat aan adenine toegevoegd.

YEKAC (gistextract plus kaliumacetaat) induceert diploïde gist om te sporen en te ondergaan meiosis. Het is qua voedingswaarde onevenwichtig, dus er zal weinig groei plaatsvinden.

PETITE-medium bevat glycerol als koolstofbron en wordt gebruikt om kleine koloniemutanten te identificeren. Kleine cellen zullen niet groeien op dit medium.

Recepten voor agargroeimedia

Als u een voorverpakte mix gebruikt, volg dan de instructies op de verpakking. Als je droge ingrediënten afweegt, gebruik dan de volgende recepten. De recepten zijn gegeven voor de bereiding van 100 milliliter. Als u meer wilt maken, vermenigvuldigt u gewoon de hoeveelheden om het gewenste volume te krijgen. Voorbeeld: om 500 milliliter te maken vermenigvuldig je elk ingrediënt met 5. Doe niet meer dan 600 milliliter in een kolf van 1000 milliliter. Als u containers te vol vult, kunnen ze tijdens het sterilisatieproces overkoken. Er is ongeveer 25 milliliter medium nodig om een ​​standaard plaat van 100 x 15 mm te gieten. (Vloeibare media kunnen van deze recepten worden gemaakt door de agar weg te laten.)

Gist-Extract Dextrose Medium (YED):

1 gram gistextract
2 gram watervrije dextrose (glucose)
2 gram agar (agar-agar gom agar)
100 ml water

Gistextract Adenine Dextrose Medium (YEAD):

1 gram gistextract
2 gram watervrije dextrose (glucose)
2 gram agar (agar-agar gom agar)
8 ml adenine stockoplossing
92 ml water

Gistextract Pepton Adenine Dextrose Medium (YEPAD):

1 gram gistextract
2 gram Pepton
2 gram watervrije dextrose (glucose)
2 gram agar (agar-agar gom agar)
8 ml adenine stockoplossing
92 ml water

1 gram gistextract
0,025 gram watervrije dextrose (glucose)
2,4 ml glycerol
2 gram agar (agar-agar gom agar)
98 ml water

0,15 gram Gist Stikstof Base zonder aminozuren en ammoniumsulfaat
0,52 gram ammoniumsulfaat
2 gram watervrije dextrose (glucose)
2 gram agar (agar-agar gom agar)
100 ml water

Minimale media plus adenine (MV + ade):

0,15 gram Gist Stikstof Base zonder aminozuren en ammoniumsulfaat
0,52 gram ammoniumsulfaat
2,0 gram watervrije dextrose (glucose)
2.0 gram Agar (agar-agar gom agar)
8,0 ml adenine stockoplossing
92 ml water

1 gram kaliumacetaat
0,25 gram gistextract
2 gram agar (agar-agar gom agar)
100 ml water

400 mg adenine in 400 ml water (1 mg/ml)
Bewaar op kamertemperatuur.
Gebruik 2 ml stockoplossing voor 100 ml medium. Verminder het water toegevoegd aan het medium met 2 ml.

Adenine vloeipapier schijven

1,25 gram adenine
150 ml gedestilleerd water
kunstvloeipapier schijven
Voeg adenine toe aan het gedestilleerde water in een beker die groot genoeg is, zodat de oplossing niet overkookt. Kook vijf minuten. Voeg vloeipapierschijven toe en kook nog vijf minuten. Verwijder de schijven met steriele pincet naar een steriele overdekte container zoals een petrischaal. Leg ze in een enkele laag en laat ze enkele dagen drogen.

Voor veel van de kortetermijnexperimenten is het mogelijk om water te "steriliseren" door te koken.
1) plaats het water in een losjes afgedekte bak,
2) plaats de container gedurende 15 minuten in een pan met kokend water,
3) draai het deksel op het waterreservoir vast nadat het is afgekoeld.

Een betere manier om steriel water te bereiden, is waarschijnlijk om de losjes afgedekte watercontainers in een autoclaaf of snelkookpan te plaatsen en het water vervolgens te steriliseren onder dezelfde omstandigheden die worden gebruikt voor groeimedia.

F. Incubatietemperatuur en groeisnelheden

De optimale groeitemperatuur voor deze soorten is ongeveer 30 ° C, maar ze zullen behoorlijk bevredigend groeien over een veel groter bereik. Al deze experimenten kunnen worden gedaan bij een comfortabele kamertemperatuur, maar de gist tolereert bijna elke temperatuur die mensen kunnen. De temperatuur zal echter de groeisnelheid beïnvloeden. Bij lagere temperaturen zullen de cellen langzamer groeien en de snelheid moet proefondervindelijk worden bepaald. De geschatte incubatietijden in deze experimenten zijn gebaseerd op incubatie bij temperaturen binnen een graad of twee van 30 ° C.

Je kunt gist in feite vertragen door ze te koelen om experimenten in het lesrooster te laten passen. Zet borden eenvoudig in verschillende stadia in de koelkast of koel ze gewoon om de groei te vertragen. Houd er echter rekening mee dat nadat een kweek is gekoeld, er een vertragingsperiode van enkele uren kan zijn voordat deze weer begint te groeien. Als het de stationaire fase heeft bereikt, zal het natuurlijk bij geen enkele temperatuur verder groeien.

Gistsoorten kunnen zelfs voor langere tijd in de koelkast worden bewaard bij temperaturen net boven het vriespunt. Sommige soorten zullen bij deze temperaturen blijven groeien, hoewel zeer langzaam, maar de meeste blijven weken of maanden levensvatbaar en sommige jaren.

Temperaturen boven 30O C moeten worden vermeden. Hoewel cellen bij hogere temperaturen zullen groeien, accumuleren ze ongewenste kleine mutaties en wordt sporulatie sterk geremd. Het rode pigment in adeninemutanten wordt ook geremd bij hogere temperaturen. Het is het veiligst om culturen die worden gesporuleerd te incuberen bij een comfortabele kamertemperatuur.

Incubeer culturen in het donker of verminderd licht zoveel als handig is. Hoewel niet kritisch, zal langdurige blootstelling aan normaal kamerlicht of helderder licht de levensvatbaarheid van de cellen die het rode pigment bevatten verminderen. De UV-gevoelige stam G948-1C/U mag niet langdurig aan lichtbronnen worden blootgesteld.

Voor optimale groei en om het rode pigment te laten ontwikkelen, moeten de platen aëroob zijn. We bebroeden borden in open plastic voedselbewaarzakjes. Met de zakken open is er voldoende zuurstof beschikbaar om de aerobe ademhaling te ondersteunen. Plastic zakken zorgen ervoor dat de borden niet te snel uitdrogen, beschermen ze tegen vervuiling en maken ze gemakkelijker te dragen zonder te morsen.

G. Tandenstokers gebruiken en entlussen

Voor de meeste doeleinden is de gemakkelijkste manier om gist van de ene plaats naar de andere op agarmedium te verplaatsen met een steriele tandenstoker. De platte tandenstoker is gemakkelijker te gebruiken dan de ronde stijl. Het puntige uiteinde is handig voor het plukken van monsters van individuele kolonies of voor het maken van kleine vlekken of strepen. Het platte uiteinde is goed voor het verspreiden van de gist, voor het uitstrijken om afzonderlijke kolonies te isoleren en om te mengen. Tandenstokers zijn direct steriel uit de doos zolang de doos niet besmet is. Snijd gewoon een hoek over om een ​​klein gaatje te maken (ongeveer 1/4 tot 1/2 inch breed) en de doos zal als dispenser dienen. De tandenstokers in een doos wijzen in beide richtingen, maar je kunt gemakkelijk het uiteinde kiezen dat je verkiest voor elke taak. Natuurlijk moet je ervoor zorgen dat je elke tandenstoker alleen vastpakt aan het uiteinde dat de gist of het medium niet raakt.

De tandenstoker is een alternatief voor de traditionele entlus, die in de handel verkrijgbaar is, zelfs in platina. We maken onze eigen entlussen van een stuk koperen staaf van 6 tot 8 inch (zoals gebruikt voor solderen) en nichroomdraad. Boor een klein gaatje in de buurt van het uiteinde van de staaf om de draad te verankeren, steek het uiteinde van de draad in het gat, wikkel enkele slagen om de staaf en laat een paar centimeter draad recht. Vorm aan het uiteinde van het rechte gedeelte een lus met een punttang. Vlam de draad in een bunsenbrander tot hij rood gloeit om hem voor elk gebruik te steriliseren, en laat hem natuurlijk afkoelen voordat hij de gist aanraakt (of frituurt). Als je het aanraakt met de agar, koelt het onmiddellijk af.

Er zijn verschillende manieren om cellen te verspreiden. Ze gebruiken verschillende soorten pipetteerapparatuur en verschillende methoden om de cellen op het agar-oppervlak te verplaatsen.
Kwantitatieve gietplateringsmethode:
Deze methode vereist de voorbereiding van een afzonderlijke eindverdunningsbuis voor elke plaat en vervolgens wordt de volledige inhoud van de buis op het agar-oppervlak gegoten. Deze methode heeft het voordeel dat er geen vlam nodig is. Het heeft het nadeel dat het niet zo reproduceerbaar is.

1. Maak een 1 tot 10 verdunningsreeks van gistcelsuspensies.
2. Pipetteer 0,1 ml van de juiste suspensie in een steriele buis met 0,9 ml steriel water. Wervel de buis om de cellen op te hangen en giet vervolgens de volledige inhoud van de buis op het oppervlak van het agarmedium. Kantel en draai de plaat om de suspensie gelijkmatig over het oppervlak van de agar te verdelen.
3. Als er plekken zijn die niet bedekt worden, gebruik dan een steriele tandenstoker om de suspensie over de onbedekte delen te verspreiden.

De ophanging moet zijn toegestaan ​​om in de agar te weken voordat de platen worden blootgesteld aan de experimentele behandeling. Om het proces te versnellen, maakt u de agarplaten enkele dagen van tevoren en laat u ze een beetje uitdrogen voordat u de gistsuspensie erop giet.

Videosectie Serial Dilution & Viable Cell Counts illustreert de gietplateringsmethode.

Kwantitatieve strooimethode
Als u nauwkeurige gegevens wilt, kunt u beter een alternatieve plateringsmethode gebruiken. De celsuspensie wordt nauwkeurig op het oppervlak van de agar gepipetteerd en vervolgens uitgespreid met een steriele strooier. Er zijn twee soorten strooiers:

Paperclipverspreider zonder vlam
Je kunt eenvoudig een goedkope herbruikbare spreider maken door twee bochten in een grote paperclip recht te trekken, zodat er een haarspeldvormig uiteinde overblijft om te spreiden en een rechte handgreep haaks erop. U kunt meerdere strooiers samen steriliseren in afgedekte bekers of verpakt in folie of papier.
Gevlamd glasstrooier
Als je over de apparatuur en vaardigheden beschikt om met een glazen staaf te werken, kun je een eenvoudige glazen spreider maken door een stuk van een inch aan het uiteinde van een kort stuk glazen staaf te verwarmen en te buigen. Deze spreaders zijn ook te koop.

1. Maak een 1 tot 10 verdunningsreeks van gistcelsuspensies.
2. Gebruik een verse pipetpunt om 0,1 ml van de juiste suspensie op het agaroppervlak te pipetteren. Klop de buis voordat u het monster neemt. Als u meerdere platen maakt, kunt u cellen in elke plaat pipetteren met dezelfde pipetpunt en ze vervolgens verspreiden zonder de spreider tussen elke plaat te verbranden.
3. Steriliseer de spreader in 95% ethanol en steek de spreader vervolgens door een vlam om de alcohol te ontsteken. Houd de spreader voorzichtig vast totdat alle alcohol op de spreader volledig is opgebrand. Het gebruik van alcoholvlammen is een gevaarlijke stap en vereist zorgvuldigheid en nauw toezicht door de leraar.
4. Koel de spreader door deze tegen de agar aan te houden. Gebruik de platte kant om de ophanging over het oppervlak te verspreiden en gebruik vervolgens het gebogen deel van de spreider om overlappende slagen te maken. Draai de plaat 90 graden en herhaal het proces van het maken van overlappende slagen. Het deksel kan over de plaat worden gehouden om besmetting te minimaliseren. Vermijd het verspreiden van de suspensie naar de rand waar het tussen de agar en de zijkant van de petrischaal kan lopen.

Videosectie Het gebruik van gist om zonne-UV te meten, illustreert een methode voor het plateren van gevlamd glas.

Kwalitatieve gietmethode om cellengazons te produceren
Deze methode produceert een dikke gelijkmatige groei van cellen (gazon) over het oppervlak van de agarplaat. Dit is een snelle methode en is nuttig voor een verscheidenheid aan kwalitatieve experimenten.

1. Maak een troebele suspensie van gistcellen.
2. Pipetteer 1,0 ml van de suspensie op het oppervlak van het agarmedium. Kantel en draai de plaat om de suspensie gelijkmatig over het oppervlak van de agar te verdelen.
3. Als er plekken zijn die niet bedekt worden, gebruik dan een steriele tandenstoker om de suspensie over de onbedekte delen te verspreiden.

Net als bij de kwantitatieve gietplateringsmethode is de suspensie moet zijn toegestaan ​​om in de agar te weken voordat de platen worden blootgesteld aan de experimentele behandeling. Als je de agarplaten enkele dagen van tevoren maakt en ze een beetje laat uitdrogen voordat je de gistsuspensie erop giet, versnel je het proces.

Videosectie Effect van zonne-UV op cellen illustreert de gietmethode van plating voor een gazon.

I. Automatische micropipetten, serologische pipetten en wegwerppipetten met bolletjes

Automatische pipetten zijn de werkpaarden van de moderne moleculaire biologie en microbiologie. Ze zijn snel en nauwkeurig en besparen veel tijd en frustratie. De experimenten in deze handleiding vragen vaak om het gebruik van een pipet van 0,1 ml. Hoewel ze relatief duur zijn, maken ze het werk zo snel dat het gemakkelijk kan worden gedeeld door meerdere studenten of labgroepen. Je zult het gebruiken voor het maken van seriële verdunningen en voor het uitplaten van cellen op agar. De steriele tips zijn verpakt in herbruikbare plastic dispensers. Oefen het gebruik van de pipet met water totdat u zich er prettig bij voelt. (Als er geen automatische micropipetten beschikbaar zijn, is het mogelijk deze te vervangen door bolvormige wegwerppipetten, serologische pipetten of gegradueerde capillaire buisjes)

1. Druk het kleine uiteinde van de pipet stevig in het open uiteinde van een tip terwijl de tip nog in de dispenser zit.
2. Om het te vullen, drukt u de zuiger langzaam in totdat u weerstand voelt, maar niet zo ver mogelijk. Dompel de punt onder in de oplossing en laat de zuiger langzaam los. Als er druppels aan de punt blijven kleven, veeg ze dan af aan de rand van de container.
3. Plaats de punt in de vloeistof in de buis waarin u pipettert en druk de zuiger langzaam in. Druk deze keer zo ver mogelijk in om al het monster te verwijderen. Verwijder de punt van de pipet uit de oplossing, laat de zuiger los en gooi de punt weg.

In plaats van automatische pipetten kunnen serologische pipetten en pipetpompen worden gebruikt. Deze pipetten geven zeer nauwkeurige volumemetingen. Het is mogelijk om voorgesteriliseerde serologische pipetten in verschillende maten aan te schaffen. You must have a set of pipet pumps available for students to use with these pipets. Remember it's never good practice to use your mouth to draw liquid into a pipet. Not even sterile water!

Disposable bulbed pipets are also acceptable for most of the experiments in this handbook. Three drops from a one milliliter bulbed pipet is approximately equal to 0.1 ml. The volume measurements are not as accurate but these pipets are cheap and do not require the use of pipet pumps. These pipets may also be purchased presterilized and individually wrapped. The wrappers of presterilized pipets provide a convenient sterile holder for the pipet during the experimental procedure.

J. Making a Subculture of Yeast

Yeast nutrients can be supplied by a solid or a liquid medium. When the yeast strains come from a supplier they are usually growing on agar slants. If you keep these slants tightly closed and refrigerated you can store them for up to one year. The smaller slants allow you to use toothpicks to move the yeast. It's best to have fresh cultures for your experiments. So the day before you intend to use the yeast transfer a small number of cells from the stock culture to fresh medium (usually YED). You can use a flamed loop to transfer the cells but a sterile toothpick is usually easier. Touch the toothpick to the cells in the slant you don't need to transfer many cells. Make a streak of cells on the surface of the agar try not to gouge the surface of the agar. This procedure of growing fresh yeast is called subculturing. You should subculture at least 12 hours before you intend to use the yeast.

Sometimes cultures will be sent from yeast stock centers on milk papers. To make a fresh subculture: Open the foil sterilely and using sterile forceps place the small square of milk paper on a sterile agar YED plate. If you wipe the paper across the agar several times you should get single colonies to use and a large spot of cells will grow where the paper is placed. It will take from 3 to 5 days for many strains cultured in this way to grow to a suitable size. Cultures sent this way are less vulnerable to inclement weather conditions and long travel times.

K. Isolating Single Colonies

Many experiments require growing colonies from isolated single cells. This is easily accomplished by streaking cultures out on an agar plate with the flat end of a toothpick. The purpose of the technique is to dilute the cells on the surface of the agar in successive, overlapping streaks, until individual cells are separated or distributed to form isolated single colonies. Figure below illustrates the technique, which you should practice until you are proficient.

The first step is to make a single, short streak of cells (about 2 cm long) near the edge of the agar in a petri dish. With a fresh toothpick, make a second, overlapping streak, at an angle of about 15 degrees to the first one, dragging cells from the first streak onto fresh agar. Make several more parallel streaks with the same toothpick. Then take a new toothpick and repeat the process starting within the end of the last streak. Repeat this sequence until the whole plate has been covered. Since the population of cells that is produced from a single parent cell is a clone, this is a process for cloning yeast. If a culture is not pure, for whatever reason, this provides a method for isolating pure clones. The same result can be achieved using a flamed and cooled loop at each step where a fresh toothpick is used. This approach is slower, and risks frying the cells.

In some experiments we transfer many cultures from one kind of medium to one or several other kinds, to determine the cultures' growth requirements. This can be done using toothpicks or loops, but if there are very many strains to be transferred it becomes laborious. A simple, rapid method -- replica plating -- played a major role in the development of microbial genetics and is one of the great labor-savers of all time. The experiments described below can be done without this technique, but it is fascinating to do and worth the trouble to set it up. Even with modest experiments, the effort is a good investment in the long run.

The principle of replica plating is that of a rubber stamp .

A cotton velveteen stamp is used to stamp a replica of the pattern of cells growing on one plate to one or several other plates. The apparatus consists of a cylindrical holder for the velveteen that is just the right size to fit inside the bottom of a petri plate, and a ring of some sort to hold the velveteen in place. For standard 10 cm plastic plates the appropriate diameter is approximately 3.3 inches. The holder can be a cylinder of wood, metal, plastic, or any other material you can fabricate. It can even be a one pound food can or other heavy cylindrical container if the bottom is flat. (A circle cut from a foam meat tray makes a good flat surface to put on a food can) The ring to hold the velveteen can be a large hose clamp, some other found object, or even a large rubber band.

The velveteen, of course, must be sterilized, and newly cut cotton velveteen usually needs to be de-linted with a piece of masking tape before it is sterilized. Autoclave and dry it thoroughly. We use six-inch squares, which we stack and wrap in paper, autoclave, and then dry on the vacuum setting. If an autoclave is not available, dry them in a warm oven or just let them sit on the counter until they dry. To reuse the velveteen squares, rinse them out in plain water and resterilize. Other fabrics such as several layers of cotton gauze may be used instead of cotton velveteen.

To replica plate, invert the master plate, the one with the yeast on it, over the velveteen on the holder and press the plate firmly against the sterile fabric surface. Then slowly peel the plate off, leaving a replica or print of the cell pattern on the velveteen. Transfer the replica on the velveteen to one or a series of sterile plates by pressing each plate gently onto the velveteen and popping it off. It is possible to make as many as 20 replicas from a single master plate if necessary. The procedure is illustrated in Figure 13.

The manner in which you remove the plate from the velveteen controls the amount of yeast transferred from velveteen to plate or from plate to velveteen. If you peel the master plate off the velveteen with a slow, rolling motion, more yeast will remain on the velvet than if you pop it off with a quick vertical motion. It is desirable to transfer as few cells as possible and still be able to see the print of the cells on the replica plate.

M. Estimating the Number of Yeast Cells in a Culture

There are many ways of counting cells directly, the most common making use of counting chambers for the microscope or electronic particle counters. These have little instructive value in genetics, and are not suitable for general classroom use. Therefore, we have designed experiments that don't depend on accurate particle counts. When cell counts are needed, we determine them from the numbers of colonies on the plates (see Dilution and Plating Procedures).

Many experiments, however, do require making approximate estimates of the number of cells in a liquid suspension in order to get a reasonable number of colonies plated. For this you will use one of the most sophisticated and sensitive optical instruments in existence: the human eye. With surprisingly little practice, you can learn to estimate the number of cells in a suspension by just looking at it.

Visual estimation of cell density is based on the eye's fairly sharp threshold for observing turbidity. When viewed in a standard 13 x 100 mm tube, yeast suspensions of less than about 1 million cells per ml are not visibly turbid. Above this threshold density they are visibly cloudy. By adjusting the number of cells in a suspension until just barely visible, you can obtain a suspension of known density (approximately 1 x 106 cells/ml) and then use serial dilutions to obtain other concentrations. (Also see the experiment Serial dilutions and viable cell counts)

  • Sterile, capped 13 x 100 ml culture tubes
  • Sterile water
  • Sterile 1-ml pipets (disposable bulbed pipets or serological pipets and pipet pump)
  • Micropipettor and sterile tips (optional)

Procedure:
A. Place 1 to 2 ml of sterile water into a tube.
B. Use a cooled, flamed inoculating loop or sterile toothpick to suspend a small amount of yeast, about the size of the head of a pin, in the water.
C. Mix the suspension thoroughly by holding the tube loosely near its top between thumb and forefinger, and thumping it near the bottom with the palm side of one or more fingers of the other hand, imparting a swirling motion. (The thumping motion approximates the gesture one would make to beckon someone to come hither.)
This suspension should contain approximately 1 x 107 cells/ml, but this density is difficult to judge, so we will dilute it before judging its density.
NS. Pipet 0.9 ml of sterile water into a tube with a sterile 1.0 ml pipet.
e. Dilute 0.1 ml of your cell suspension into this tube and thump it. Compare it with a tube containing sterile water. If the tube with cells is barely turbid, then it contains very nearly 1 x 106 cells/ml.
F. If the tube is not visibly turbid, then add additional 0.1 ml volumes of the original suspension until it is. If you think it is more turbid than the limit of visibility, then add more sterile water. Adjust the volumes of water and cells until you are convinced. Keep track of the volumes you add so you will know the final dilution you have made.

N. Dilution and Plating Procedures

In many experiments one must spread an approximately known number of cells on a plate to grow into colonies. We use serial dilutions, making several small dilutions, one after another, instead of making one big dilution. The method saves material and avoids the use of large volumes that are difficult to measure and sterilize.

  • Sterile, capped 13 x 100 ml culture tubes
  • Sterile water
  • Sterile 1-ml pipets (disposable bulbed pipets or serological pipets and pipet pump)
  • Micropipettor and sterile tips (optional)
  • Paper clip or glass spreader: The cells are distributed over the surface of the agar with spreaders.

Making Serial Dilutions:
The following procedure yields a series of dilutions that vary by factors of ten. You will be able to use this procedure for most of the experiments that require serial dilutions (Figure 12).

A. Prepare a suspension containing approximately 1 x 106 cells/ml in sterile water using the procedure described in Estimating the Number of Yeast Cells in a Culture.
B. Pipet 0.9 ml of sterile water into each of three tubes and label them. We recommend making a diagram in your notebook showing the procedure and the meaning of your labels.
C. Resuspend the cells in the original suspension. Remove 0.1 ml with the micropipettor and a fresh tip and transfer it to one of the tubes of water. Then thump the tube to suspend the cells.
NS. Repeat the procedure serially, using a fresh pipet or pipet tip for each of the remaining tubes, so that each tube contains 1/10th the number of cells as the previous one. The third dilution should contain approximately 1 x 103 cells/ml.

Plating the Dilutions:
If you expect all the cells to grow, then you will only plate the final dilution, as the other tubes would be too concentrated and the plates made from them would contain too many colonies to count. However, in the radiation experiments you will use the dilutions containing more cells to compensate for the reduced number of cells that survive irradiation. This way you will obtain an optimal number of colonies to count on each plate, even when most of the cells are dead.

e. You will have better data if you do all platings in duplicate or triplicate. First label the plates using a marking pen (a Pilot SC-UF or a Sharpie). (You will also use this same kind of pen for marking the colonies when you count them.) We recommend that you identify each plate with the strain number, dose (for radiation experiments), dilution plated, and your initials, but you may prefer to code this information in your notes and put the code letters or numbers on the plate. Write only on the lid or in small letters on the edge of the bottom, leaving the bottom clear for marking the colonies when you count them.

F. Resuspend the cells in each tube by thumping it before taking a sample, then pipet 0.1 ml onto the center of each of the duplicate plates. If you are using paper clip spreaders take a sterile spreader from the envelope. If you are using a glass spreader take it from the alcohol, light it in a flame, and after the flame burns out, touch it to the agar of one of the plates away from the cells. Spread the cells over the surface with either spreader, taking care to keep the cells at least 0.5 cm from the edge of the agar. (If you are using the pour plating method pipet 0.1 ml of the suspension into 0.9 ml of sterile water. Mix the cells into the water. Pour all of the mixture onto the agar surface then tilt and rotate the plate until the mixture is evenly spread over the surface of the agar.)

O. Microscopic Examination of Yeast

The easiest way to examine yeast under the microscope is to look at them directly on the plate. This only works with low-powered objectives (10x) because higher power ones get too close to the agar and fog up. To see more detail, make a wet mount slide. Put a drop of water on a microscope slide. Transfer a small amount of yeast to the water with a sterile toothpick and stir a little. Then put a coverslip over the yeast suspension on the slide. If preparations are to be viewed by a number of students, seal the cover slip to the slide with finger nail polish and the slide will be viewable for several hours. Oil immersion should not be necessary and for merely observing the shapes of cells it is not necessary to stain them. With suitable staining methods the nucleus can be seen, but the yeast chromosomen are too small to see with most light microscopes.

For classroom demonstrations you may wish to use a video microscope. There are a number of very good video microscopes available on the market. If you don't have one it's possible to get many of the same results with a classroom microscope and a home video camera. When we look through a microscope our eyes are focused at infinity. If we place a video camera close to the ocular of the microscope and set the camera focus at infinity it will "see" the same thing as our eyes. It helps to cut out light entering from the side by wrapping the camera lens and the microscope ocular with a piece of dark cloth or aluminum foil.

The experiments make use of the following strains:

Q. Irradiating Yeast With Ultraviolet Radiation

Standard germicidal UV-C lamps, which are low-pressure mercury vapor discharge tubes, make an ideal UV source for irradiating wild type yeast with normal DNA repair enzymes. The sun or quartz halogen yardlights are good sources of UV for irradiating mutant strains of yeast that are deficient in normal DNA repair enzymes.

Standard germicidal UV-C lamps are common fluorescent tubes without a fluorescent coating and with an envelope that is transparent to ultraviolet. The low-pressure mercury spectrum is a line-spectrum with the most prominent line having a wavelength of 253.7 nanometers. This is fortuitously close to the 260 nanometers that is optimal for absorption by DNA.

The design of the U.V. Radiation Chamber is dictated by several considerations, the most important being safety. (See Instructions for Building a UV Radiation Chamber) The radiation emitted by germicidal lamps will cause painful and dangerous burns to eyes and skin so they must be effectively shielded. Exposure to the cells cannot be controlled by turning the lamp on and off because the output intensity of the lamp is strongly temperature-dependent. Therefore, it must be enclosed in a shielded box with a shutter mechanism so it can warm up to a constant temperature before being used. The door and the shutter must be interlocked so they cannot both be open at the same time.

Operating procedure for UV radiation chamber:

1. Plug in the lamp and turn it on. You can safely tell when the lamp is on by seeing the indicator light.
2. Allow the lamp to warm up for 30 minutes, if possible.
3. Center the petri dish to be exposed on the mark in the bottom of the box, remove the plate lid, gently lower the door, and open the shutter. Measure the exposure time from when the shutter opened. When the time has elapsed, close the shutter, gently raise the door, put the lid on the petri dish and remove it. Moving the door too quickly causes air turbulence which is likely to cause contamination of the agar plates. If the box is fitted with a UV-B bulb the same procedure may be followed.

Exposure procedure using the sun or quartz halogen yardlights:

1. Cover the dish with dark paper and while it remains covered position the dish at a 90 degree angle to the light source. If you are using a quartz halogen light remove the glass cover from the light. While the sun and the yardlight produce less UV radiation than the germicidal tube one should still take reasonable precautions. Don't look directly at the source and avoid any long term direct exposure to skin.

CAUTION: A quartz halogen bulb gets very hot. The use of this lamp should be under the direct supervision of the teacher.

2. Remove the dark cover from the plate and start measuring the exposure time. When the time has elapsed cover the dish and move it to the incubator. It is usually not necessary to remove the lid from plastic Petri dishes when you use the sun or quartz halogen yardlights as the UV source. Most plastic Petri dishes are transparent to the wavelengths of UV produced by these sources. You may want to run a trial experiment on each new batch of Petri dishes. If you are getting survival rates higher than you expect you may wish to remove the lids during UV exposure. If contamination becomes a problem you may wish to cover the dishes with thin plastic wrap or a sandwich bag. These thin plastic films will not absorb significant amounts of UV.


Water or Moisture:

All bacteria need moisture, or water, in a "useable" or "available" form to grow and reproduce. Bacteria use the water to take in food and to remove unwanted waste products. Water activity (aw) is one measure of the available water in a food. The water activity scale runs from 0 to 1.0. The lower the water activity, the less water is available in a form that can be used by bacteria. The water activity of pure water is 1.0 - thus the water activity of all foods falls below this number. However, many food products, particularly meat, poultry, seafood and dairy products, have a water activity of 0.95-0.99. Unfortunately, this is the optimum range for many of the spoilage and disease-causing bacteria. Most fresh seafood products have a water activity above 0.98 - perfect for bacterial growth. Pathogenic bacteria do not grow well or produce toxin below 0.85 and most require 0.92 or above. Freezing, drying, or salting are ways to reduce available water to bacteria, and slow down their growth.


III. BACTERIN Kweken

A. Methoden om zuivere culturen te verkrijgen (een cultuur die slechts 1 soort organisme bevat)

1. De Streak Plate-methode Bacteriën worden opgepikt op een steriele draadlus en de draad wordt lichtjes over het agar-oppervlak bewogen, waardoor strepen bacteriën op het oppervlak worden afgezet. De lus wordt gevlamd en een paar bacteriën worden opgepikt uit het gebied dat al is afgezet en uitgestreken op een nieuw gebied. Er worden steeds minder bacteriën afgezet naarmate het strepen vordert, en de lus wordt na elke strepen gevlamd. Individuele organismen (individuele cellen) worden afgezet in het gebied met de laatste strepen. Nadat de plaat is geïncubeerd bij een geschikte groeitemperatuur voor het organisme, verschijnen kleine kolonies (elk afgeleid van een enkele bacteriële cel). De lus wordt gebruikt om een ​​deel van een geïsoleerde kolonie op te pikken en voor studie over te brengen naar een ander medium. Het gebruik van aseptische technieken zorgt ervoor dat het nieuwe medium organismen van een enkele soort zal bevatten. We doen dit in het lab.


Why Sugar Doesn’t Spoil

Two foods are left out on the counter – fresh tomatoes and a bowl of sugar. Within a week or so, one will develop black spots and the other remains pristine, albeit perhaps a little clumpy depending on the humidity of the air. Maar waarom?

Osmosis. While microorganisms love sugar, they also need a certain amount of water to thrive. This level of freely available water, called "water activity (amet wie)," for bacteria is about 0.91, for molds it is 0.8 and for fungi (yeasts), it must be at least 0.6. The amet wie of fresh foods is generally about 0.99, while crystalline sucrose (table sugar) is a paltry .06.

In its crystal form bone dry, sucrose (C12H22O11) loves to bind with water (H20). When present in sufficient concentrations, table sugar will suck all of the water around it. This is why sugar is an excellent food preservative. Via osmosis, the sugar pulls the available water from within the foodstuff, reducing the food's amet wie, thus making it unsuitable for microbes to grow, or even survive.

More specifically, at the outer edge of a cell is its membrane, a semi-permeable barrier that allows some substances, including nutrients and wastes, to move in and out. With a higher concentration of sugar outside the cell, the solution is hypertonic, meaning it will draw water from the cell, causing the bacteria (or whatever cell) to shrivel and die. (The reverse could potentially happen as well if the sugar concentration was higher inside the cell, hypotonic, with it drawing water in, perhaps to the point of bursting the cell.)

On a chemical level, it's pretty interesting as well. Notice all the hydrogen and oxygen involved between the two molecules, there are 24 hydrogen atoms and 12 oxygen. Each oxygen atom has a slight negative charge and each hydrogen atom has a slight positive charge, and in chemistry, opposites attract. Together, all of these hydrogen and oxygen atoms pull at each other – initially to form their respective molecules (table sugar or water), and then in the process that kills the microbe.

You can also observe this absorption effect simply by taking some cotton candy, which is made of pure spun sugar, and placing it in a humid environment . With just 33% relative humidity, cotton candy left out in the air will completely collapse and crystallize in just 3 days as it absorbs the moisture in the air. At 45% relative humidity, it will completely collapse in just one day. At 75% humidity, it takes just 1 hour. This is why it has only been since 1972 that non-"made on demand" cotton candy has been available. (1972 was when the first fully automated cotton candy machine was invented that could make the fluffy treat and quickly package it in water tight containers).


Why is bacteria used in genetic engineering?

Click to read more on it. Also know, why is bacteria often used in genetic engineering?

genetisch gewijzigd bacteriën. genetisch gewijzigd bacteriën were the first organisms to be modified in the laboratory, due to their simple genetica. These organisms are now gebruikt for several purposes, and are particularly important in producing large amounts of pure human proteins for use in medicine.

  • More nutritious food.
  • Tastier food.
  • Disease- and drought-resistant plants that require fewer environmental resources (such as water and fertilizer)
  • Less use of pesticides.
  • Increased supply of food with reduced cost and longer shelf life.
  • Faster growing plants and animals.

Similarly, how is bacteria used to make insulin?

Recombinant DNA is a technology scientists developed that made it possible to insert a human gene into the genetic material of a common bacterium. This &ldquorecombinant&rdquo micro-organism could now produceren the protein encoded by the human gene. There, the recombinant bacteria use the gene to begin producing human insulin.

What are some examples of genetic engineering?

Crop plants, farm animals, and soil bacteria are sommige of the more prominent voorbeelden of organisms that have been subject to genetische manipulatie.


Bekijk de video: Wat doen drugs met je lichaam? De overheid zocht het uit. (December 2021).