Informatie

Hoeveel zout [NaCl] zit te veel in DNA-precipitatie?


Hoeveel is te veel zout in een CTAB-extractiebuffer bij DNA-extracties? Protocollen zweven rond de 2,5 molair; als je hier overheen gaat (bijvoorbeeld 25 molair), ga je dan je oplossing verzadigen en het DNA te vroeg neerslaan?

Achtergrond: De meeste DNA-extractieprotocollen benaderen het volgende:

  1. ~Fysieke lysis
  2. ~Chemische (wasmiddel) lysis
  3. Fasescheiding (gevreesde fenol-chloroform-isoamylstap)
  4. Neerslag, droog

Varianten zijn er in overvloed, maar een gemeenschappelijk kenmerk van stap 12 is opname van CTAB en NaCl in de extractiebuffer - detergentia en zouten helpen het celmembraan te scheuren, maar (misschien belangrijker) CTAB 'selectief' complexen en precipiteert organische onzuiverheden (sachariden, eiwitten…) terwijl DNA/RNA in oplossing blijft.

Om dit te laten werken, moet de netto-negatieve lading van de DNA-fosfaat (PO4-) ruggengraat worden geneutraliseerd, zodat het DNA in oplossing kan blijven: natrium (Na+) ionen worden aangetrokken door de reguliere (PO4-) groepen, terwijl meer onregelmatig gespreide ladingen* in eiwitten enz. gaan nauw samen met CTAB en 'vallen' uit de oplossing: je houdt je DNA in de vloeibare fase en zuivert, waarbij overtollig zout aan het eind wordt weggespoeld met herhaalde 70% EtOH-wassingen.

Zou een teveel aan Na+/Cl- de 'selectieve' eigenschappen van CTAB effectief nivelleren? Het 'uitzouten' van het DNA uit de oplossing (het verstoren van de solvatatieschil) wordt gebruikt in stap 4, meestal met natriumacetaat en 2-propanol: hoeveel zout kan worden gebruikt in stap 12 voordat het DNA wordt neergeslagen met andere Organische materialen? Zijn er andere overwegingen (bijv. zouten en organische oplosmiddelen in stap 3)?

De eerste beschrijving die ik hiervoor heb gevonden is Zhou (1996), maar een echt goed protocol hiervoor is Wilson (2001).

*: vermoedelijk?


Te veel zout kan de bloedvaten beschadigen en leiden tot hoge bloeddruk

Het eten van een zoutrijk dieet gedurende meerdere jaren kan de bloedvaten beschadigen - waardoor het risico op het ontwikkelen van hoge bloeddruk toeneemt, volgens onderzoek dat is gerapporteerd in het American Heart Association-tijdschrift Circulatie.

Mensen met dit type bloedvatbeschadiging die een zoutrijk dieet volgen, hebben meer kans op het ontwikkelen van hypertensie of hoge bloeddruk. Dit onderzoek wijst op de aanwezigheid van een "natriumversterkingslus" waarbij langdurig te veel zout eten de bloedvaten beschadigt, wat leidt tot een grotere kans op het ontwikkelen van hoge bloeddruk als het zoutrijke dieet wordt voortgezet.

Onderzoekers hebben de oorzaak-en-gevolgrelatie tussen zoutinname en hoge bloeddruk niet beoordeeld. Maar de resultaten van de studie "voegen toe aan het aanzienlijke bewijs dat een dieet met veel zout nauw verband houdt met hoge bloeddruk", zegt John Forman, MD, hoofdauteur van de studie en een nefroloog aan het Brigham and Women's Hospital en de Harvard Medical School in Boston. , Massa.

"Bovendien versterkt deze studie de richtlijnen die worden ondersteund door de American Heart Association en andere professionele organisaties die aanbevelen om de zoutconsumptie te verminderen om het risico op het ontwikkelen van hoge bloeddruk te minimaliseren," zei Forman.

Eén gram natrium is gelijk aan 2,5 gram keukenzout (natriumchloride).

Onderzoekers voerden een observationele studie (PREVEND) uit waarin ze de natriuminname van 5.556 mannen en vrouwen uit de algemene bevolking van Groningen, Nederland volgden. De natriuminname werd beoordeeld door meerdere 24-uurs urinemonsters te verzamelen, wat wordt beschouwd als de optimale methode om de natriuminname te meten.

Onderzoekers analyseerden de associatie tussen natriumconsumptie en bloedspiegels van urinezuur en albumine in de urine - beide markers van schade aan bloedvaten - bij deelnemers die geen medicijnen tegen hoge bloeddruk gebruikten.

Tijdens een mediane follow-up van 6,4 jaar werden 878 nieuwe hypertensiediagnoses gesteld.

Een hogere natriuminname werd in de loop van de tijd in verband gebracht met toenemende niveaus van urinezuur en albumine. Hoe hoger de niveaus van deze markers, hoe groter het risico op het ontwikkelen van hypertensie als de zoutinname via de voeding hoog was, vonden onderzoekers. Vergeleken met deelnemers die de minste hoeveelheid natrium aten (ongeveer 2.200 milligram per dag), hadden degenen die het meest aten (ongeveer 6.200 mg/d) 21 procent meer kans op het ontwikkelen van hoge bloeddruk. Degenen die hoge urinezuurspiegels hadden en het meeste zout aten, hadden echter 32 procent meer kans om hoge bloeddruk te ontwikkelen, terwijl degenen met hoge urine-albuminespiegels en de hoogste zoutinname 86 procent meer kans hadden om hoge bloeddruk te ontwikkelen.

Aangenomen wordt dat een zoutrijk dieet verantwoordelijk is voor 20 tot 40 procent van alle gevallen van hoge bloeddruk in de Verenigde Staten.

Omdat bij de studie alleen Europese blanken betrokken waren, zouden de resultaten moeten worden gerepliceerd bij Hispanics, Afro-Amerikanen en anderen in de Verenigde Staten, maar andere onderzoekers hebben een verband gevonden tussen een zoutrijk dieet en hoge bloeddruk bij deze andere populaties, zei Forman .

Co-auteurs zijn Lieneke Scheven, M.D. Paul de Jong, M.D. Stephan Bakker, Ph.D. Gary Curhan, M.D. en Ron Gansevoort, M.D.

De American Heart Association, het National Institute of Diabetes, Digestive and Kidney Disease en de Nierstichting financierden het onderzoek.


Zout zuigt, cellen zwellen op

Water in cellen beweegt naar de hoogste zoutconcentratie. Als er meer zout in een cel is dan erbuiten, zal het water door het membraan de cel in bewegen, waardoor het groter wordt en opzwelt als het water de cel vult in de noodzaak om te combineren met het zout. Als een hogere concentratie zout buiten het celmembraan wordt geplaatst, zal het water de cel verlaten om zich ermee te binden. Het verlies van water door deze beweging zorgt ervoor dat plantencellen krimpen en verwelken. Dit is de reden waarom zout planten kan doden, het lekt het water uit de cellen. De beweging van water om een ​​dierlijke cel te verlaten, zal er ook voor zorgen dat die cellen krimpen en uitdroging veroorzaken. Dit is de reden waarom een ​​persoon kan overlijden aan uitdroging als hij genoeg zeewater drinkt.

Bonnie Crowe is moeder van twee tieners, lerares en auteur van kinderboeken, leerplannen en artikelen over Engelse grammatica, literatuur, technologie, kunst, opvoeding en loopbaangidsen voor middelbare scholieren. Ze is voormalig directeur van AOL Parenting, lid van SCBWI en afgestudeerd aan de University of California, Berkeley.


DNA-precipitatie van CTAB-extractie: kreeg een troebele laag na toevoeging van ethanol, maar geen pellet?

Ik haal meestal DNA uit dierlijke cellen, maar nu moet ik DNA uit planten halen. Ik heb een CTAB-extractie uitgevoerd, zoals voorgesteld door Google. Ik kwam bij het DNA-precipitatiegedeelte. Ik voegde natriumacetaat en koude ethanol toe en er verscheen een troebele laag zoals ik eerder ervaar in DNA-extracten van dieren. Er vormde zich echter geen DNA-pellet na centrifugatie. Er zat echter nog een troebele laag in de buis. Ik denk dat het DNA nog steeds in die troebele laag zit. Hebben jullie enig idee waarom het DNA niet neerslaat?

Heb je een chlorofrom:IAA-extractie gedaan voor de precipitatie? Telkens wanneer ik een van de interfaces in het supernatant krijg, wordt er geen pellet gevormd.

Ik zal het CTAB-protocol opnemen dat ik gebruik voor Ficus bladeren hieronder. Een student met wie ik werkte, gebruikte dit protocol om 10x meer volume per keer te extraheren dan ik, en hij kreeg een vergelijkbaar resultaat als de jouwe (een troebele laag in plaats van een pellet, ongeacht hoe lang hij het centrifugeerde). We vertelden hem net zoveel mogelijk isopropanol eruit te halen en dan gewoon door te gaan met wassen met ethanol.

☐ Broedstoof instellen op 65 °C. Plaats 100% isopropanol in de vriezer.

☐ Stukje blad in koker plaatsen samen met 2x metalen kralen. Breek het blad met een pincet of een schaar.

☐ Maal 1 min op 30 RPM.

☐ Voeg 600 µL CTAB-buffer toe bij kamertemperatuur. draaikolk.

☐ Herhaal het malen nog twee keer, tussendoor kloppen en vortexen op de buis om al het bladmateriaal los te maken.

☐ Incubeer bij 65 ° C gedurende 45 min. Vortex elke 15 min.

☐ Centrifugeer gedurende 2 minuten op maximale snelheid.

☐ Breng supernatant over in nieuwe buis (ongeveer 450 L).

☐ Voeg 100 µl 24:1 chloroform:isoamylalcohol toe.

☐ Vortex grondig. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.

☐ Vortex opnieuw en centrifugeer vervolgens 2 minuten op maximale snelheid.

☐ Breng supernatant (alleen bovenste fase) over naar nieuwe buis (ca. 400 µL).

☐ Herhaal de extractie met chloroform:isoamyl (de vier bovenstaande stappen — volume van het supernatant ca. 300 uL).

☐ Voeg 1,5 volumen -20 °C isopropanol (ca. 450 µL) toe.

☐ Incubeer monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

☐ Centrifugeer gedurende 5 minuten op maximale snelheid. Er zal zich een korrel vormen. Als zich een zware vloeistoflaag vormt, is er wat C:IAA overgedragen.

☐ Supernatant verwijderen, de onderste fase behouden.

☐ Voeg 600 µL 70% ethanol toe bij kamertemperatuur.

☐ Keer om om de pellet van de onderkant van de buis te verwijderen. Incubeer bij 4 ° C 's nachts (of gedurende ten minste 2 uur).


PEG-precipitatie van DNA-bibliotheken - Hoe Ampure of SPRIselect werkt

Een vraag die ons is gesteld, en een die onze NGS-providers vaak krijgen, is hoe PEG in principe DNA neerslaat bij het opruimen van de volgende generatie sequencing-bibliotheekvoorbereiding? Meestal horen we de vraag gepresenteerd als: hoe laten de Ampure XP- of SPRIselect-korrels van Agencourt DNA neerslaan? Het antwoord heeft te maken met de chemische eigenschappen van DNA, polyethyleenglycol (PEG), de gebruikte kralen en water. Polystyreen – magnetietkralen (Ampure) zijn bedekt met een laag negatief geladen carboxylgroepen. De sterk geladen fosfaatruggengraat van DNA maakt het polair, waardoor het gemakkelijk oplost in water (ook polair). Wanneer PEG [ H-(O-CH2-CH2)N-OH] wordt in verzadigende toestand aan een DNA-oplossing toegevoegd, DNA vormt grote willekeurige spoelen. Het toevoegen van dit hydrofiele molecuul met de juiste zoutconcentratie (Na+) zorgt ervoor dat DNA aggregeert en neerslaat uit de oplossing door gebrek aan solvatatie (1, 2). Te veel zout en je hebt veel zout DNA, te weinig zorgt voor een slecht herstel. De Na+-ionen beschermen de negatieve fosfaatruggengraat waardoor DNA aan elkaar blijft plakken en op al het andere dat zich in de buurt bevindt (inclusief gecarboxyleerde kralen). Zodra je klaar bent om je DNA te elueren en het weer in oplossing te brengen (nadat je je maat hebt geselecteerd of enzymen, nucleotiden, enz. het verplaatsen van een geaggregeerde toestand terug naar oplossing. De negatieve lading van de carboxylkorrels stoot nu DNA af, waardoor de gebruiker het in het supernatant kan extraheren. Het veranderen van de hoeveelheid PEG en zoutconcentratie kan helpen bij het selecteren van de grootte van DNA (2). Dit is een veelgebruikte methode bij de voorbereiding van NGS-bibliotheken waarbij de gebruiker geïnteresseerd is in het selecteren van een fragment van een bepaalde grootte. Het wordt vaak gebruikt om gelstappen te vervangen in NGS-bibliotheekvoorbereiding. Er is al een schat aan literatuur over voorwaarden om DNA op maat te selecteren, doe gewoon een simpele google-zoekopdracht. Het eerste artikel dat we hebben gevonden dat deze selectie beschrijft, wordt hieronder vermeld (3).

Sinds deze publicatie op 7 mei 2014 zijn er meerdere commerciële, Ampure-achtige maatselectiekralen op de markt:


Gids voor probleemoplossing voor genomische DNA-extractie en zuivering (NEB #T3010)

Hulp nodig bij het zuiveren van genomisch DNA met de Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010)? We zijn hier om te helpen. Onze gids voor probleemoplossing hieronder schetst enkele van de meest voorkomende pijnpunten die wetenschappers tegenkomen tijdens gDNA-zuivering. U kunt ook richtlijnen vinden voor het kiezen van de juiste inputbedragen in onze online bron, Inputbedragen kiezen voor de Monarch Genomic DNA Purification Kit. Nog steeds problemen? Neem op elk moment contact op met onze technische ondersteuning.

  • Ontdooi celpellets langzaam op ijs en veeg de buis meerdere keren om de pellet van de bodem van de buis los te laten. Zorg ervoor dat u koude PBS gebruikt voor resuspensie en resuspendeer voorzichtig door 5&ndash10 keer op en neer te pipetteren totdat een uniform troebele celsuspensie is verkregen en de pellet volledig is opgelost.
  • Voeg Proteinase K en RNase A toe aan het monster en meng goed voordat u de Cell Lysis Buffer toevoegt, anders zal de hoge viscositeit van het lysaat een goede menging van de enzymen belemmeren.
  • Houd ingevroren bloedmonsters bevroren en voeg proteïnase K, RNase A en bloedlysebuffer rechtstreeks toe aan de bevroren monsters. Start lysis meteen en laat de monsters ontdooien bij lysis incubatie.
  • Vers (niet-bevroren) volbloed mag niet ouder zijn dan een week. Oudere monsters zullen een progressieve hoeveelheid DNA-afbraak en opbrengstverlies vertonen.
  • Vertering van volbloedmonsters van sommige diersoorten met een hoog hemoglobinegehalte (bijv. cavia) kan leiden tot de ophoping van onoplosbare hemoglobinecomplexen die het membraan bevlekken en verstoppen, wat leidt tot verminderde opbrengst en zuiverheid. Verminder de proteïnase K-lysistijd van 5 tot 3 minuten om de vorming van deze precipitaten te voorkomen.
  • Snij het uitgangsmateriaal in zo klein mogelijke stukjes of vermaal met vloeibare stikstof. In grote stukken weefsel zullen nucleasen het DNA vernietigen voordat de Proteinase K het weefsel kan lyseren en het DNA kan vrijgeven.
  • Proteïnase K-vertering van fibreuze weefsels (bijv. spieren, hart, huid, oorclips), hersenweefsel en alle RNA-later gestabiliseerde weefsels leidt tot het vrijkomen van kleine onverteerbare eiwitvezels die het lysaat vaak een troebel uiterlijk geven. Deze vezels zullen de bindingsplaatsen van het silicamembraan blokkeren, waardoor de opbrengst wordt verminderd en eiwitverontreiniging wordt veroorzaakt. Om vezels te verwijderen, centrifugeert u het lysaat gedurende 3 minuten op maximale snelheid, zoals aangegeven in het protocol. Gebruik voor oorclips en hersenweefsel niet meer dan 12&ndash15 mg invoermateriaal, anders is de vezelverwijdering niet volledig.
  • Monsters die gedurende lange tijd bij kamertemperatuur, 4°C of -20°C worden bewaard, zullen na verloop van tijd degradatie en verlies van het gDNA-gehalte vertonen. Flits bevriezen weefselmonsters met vloeibare stikstof of droogijs en bewaar ze bij -80°C. U kunt ook stabiliserende reagentia gebruiken om het gDNA te beschermen en opslag voor langere tijd bij 4°C of -20°C mogelijk te maken.
  • Orgaanweefsels zoals pancreas, darmen, nieren en lever bevatten aanzienlijke hoeveelheden nucleasen. Ze moeten met uiterste zorg worden behandeld en op de juiste manier worden bewaard om DNA-afbraak te voorkomen. Bewaar bevroren en op ijs tijdens de monstervoorbereiding. Raadpleeg het protocol voor de aanbevolen hoeveelheid uitgangsmateriaal en Proteinase K te gebruiken.
  • Sommige orgaanweefsels (bijv. milt, nier, lever) zijn extreem rijk aan genomisch DNA. Pogingen om grotere hoeveelheden te verwerken dan de aanbevolen invoerhoeveelheden zullen resulteren in de vorming van wolken van verward gDNA met lange fragmenten die niet van het silicamembraan kunnen worden geëlueerd. Verminder de hoeveelheid inputmateriaal om een ​​hogere opbrengst te krijgen.
  • De meeste monsters worden verteerd met 10 & microl Proteinase K, maar voor hersen-, nier- en oorclips zal het gebruik van 3 µl betere opbrengsten opleveren.
  • Monsters die gedurende lange tijd bij kamertemperatuur, 4°C of -20°C worden bewaard, zullen na verloop van tijd degradatie en verlies van het gDNA-gehalte vertonen. Vries weefselmonsters in met vloeibare stikstof of droogijs en bewaar ze bij -80°C. U kunt ook stabiliserende reagentia zoals RNAlater gebruiken om het gDNA te beschermen en opslag voor langere tijd bij 4°C of -20°C mogelijk te maken.
  • Snij het uitgangsmateriaal in zo klein mogelijke stukjes of vermaal met vloeibare stikstof. In grote stukken weefsel zullen nucleasen het DNA afbreken voordat de Proteinase K het weefsel kan lyseren en het DNA kan vrijgeven.
  • Orgaanweefsels zoals pancreas, darmen, nieren en lever hebben een zeer hoog nucleasegehalte. Ze moeten met uiterste zorg worden behandeld (zie het gedeelte "Voorbeeld niet goed bewaard" hierboven) om DNA-afbraak te voorkomen. Bewaar bevroren en op ijs tijdens de monstervoorbereiding.
  • Vers (niet-bevroren) volbloed mag niet ouder zijn dan een week. Oudere monsters zullen een progressieve hoeveelheid DNA-afbraak en opbrengstverlies vertonen.
  • Bij het ontdooien van ingevroren bloedmonsters komt DNase vrij, wat afbraak veroorzaakt. Houd bevroren bloedmonsters bevroren en voeg enzymen en lysisbuffer rechtstreeks toe aan de bevroren monsters. Start lysis meteen en laat de monsters ontdooien bij lysis incubatie.

Guanidinezout werd in het eluaat overgedragen:

De bindingsbuffer bevat guanidinethiocyanaat (GTC), dat een zeer sterke absorptie vertoont bij 220 & 230 nm.

De meest gebruikelijke manier waarop zout in het eluaat wordt gebracht, is door het buffer/lysaatmengsel in contact te laten komen met het bovenste kolomgebied.

    Bij het overbrengen van het lysaat/bindingsbuffermengsel moet u het bovenste kolomgebied niet aanraken met de pipetpunt en altijd voorzichtig op het silicamembraan pipetteren.


Aanpassing van Escherichia coli ATCC 8739 tot 11% NaCl

Escherichia coli (E coli) is een niet-halofiele microbe en wordt gebruikt om fecale besmetting aan te geven. Zout (natriumchloride, NaCl) is een veelgebruikt voedingsadditief en wordt gebruikt in conserveermiddelen om microbiële groei tegen te gaan. Het effect van hoe E coli interageert met het zout dat aanwezig is in de menselijke voeding is onduidelijk. Het is dus belangrijk om deze relatie te onderzoeken. Om de veranderingen in de omgeving aan te passen en te overleven, E coli kan halofilisatie ondergaan. In deze studie hebben we de genetische veranderingen en groeikinetiek van E coli ATCC 8739 onder 3% -11% NaCl over 80 passages. Onze resultaten suggereren dat E coli aangepast aan 1% toename van NaCl elke maand met een succesvolle aanpassing aan 11% NaCl. Gramkleuring en PCR/RFLP toonden aan dat de kweken Gram-negatief zijn en dat de DNA-profielen van alle 4 replica's vergelijkbaar waren, wat suggereert dat de kweken niet besmet waren.

1. Inleiding

Escherichia coli is een schoolvoorbeeld van niet-halofiele bacteriën en is een indicatororganisme voor fecale verontreiniging van water als E. coli is een meer consistente voorspeller van gastro-intestinale aandoeningen dan andere bacteriële indicatoren in water [1]. Dit bevestigt Burton et al. [2] wie suggereerde dat? E. coli was een geschikte voorspeller van Salmonella enterica serovar Nieuwpoort in verschillende zoetwatersedimenten en is waargenomen om zo lang of langer te overleven dan Salmonella spp. voldoet dus aan zijn eis als indicator voor pathogene bacteriën. Bovendien is het voortbestaan ​​van E. coli is onafhankelijk van de hoeveelheid organische stof [2]. Dit suggereerde dat E. coli is een geschikte indicator omdat het kan overleven in media met verschillende voedingsrijkdom.

Eerdere studies [3-6] over de aanpassing en evolutie van E coli werden uitgevoerd met antibiotica en medicijnen. Veelvoorkomende levensmiddelenadditieven zoals zout, dat wordt gebruikt om voedsel te bewaren en micro-organismen te remmen, wordt echter minder begrepen in termen van: E coli’s adaptieve mechanisme, hoewel recente studies [7, 8] hadden gesuggereerd dat E coli is in staat om zich aan te passen aan levensmiddelenadditieven over uitgebreide cultuur. Dit suggereert dat E coli kan zich mogelijk aanpassen aan hogere concentraties van levensmiddelenadditieven, maar dit moet nog worden onderzocht. Doudoroff [9] toonde aan dat de levensvatbare telling van E. coli eerder gekweekt in gewone zoetwatermedia en vervolgens overgebracht naar zoute voedingsoplossingen bleven op een constante tot 7% ​​NaCl-concentratie. De levensvatbare telling daalde geleidelijk met een verdere toename van de concentratie, wat suggereert dat: E coli is niet-halofiel en 7% NaCl is bacteriostatisch. Hrenovic en Ivankovic [10] rapporteerden dat de groei van E. coli optimaal is onder 5% NaCl. de aanpassing van E coli tegen zout kan wijzen op een vergelijkbare resistentie tegen andere conserveermiddelen en het vermogen om te groeien in een zoute omgeving kan worden onderschat.

Deze studie heeft tot doel de geleidelijke aanpassing van E coli ATCC 8739, een volledig gesequenced stam, gekweekt in NaCl-aangevuld medium tot 8% NaCl over 80 passages. Onze resultaten suggereren dat E coli aangepast aan 1% toename van NaCl elke maand met een succesvolle aanpassing aan 11% NaCl. Gramkleuring en DNA-fingerprinting door middel van PCR/restrictiefragmentlengtepolymorfisme bij passage 72 toonden aan dat de kweken Gram-negatief zijn en dat de PCR-RFLP-profielen van alle 4 replica's vergelijkbaar waren. Dit suggereerde dat de culturen niet besmet waren met Staphylococcus aureus, wat Gram-positief is en de meest waarschijnlijke contaminant als S. aureus is een zouttolerante commensaal die op de menselijke huid wordt aangetroffen.

2. Methodologie

Hoofdcultuurexperiment werd uitgevoerd met een eerste inoculum van

E coli ATCC 8739-cellen uit Passage 70 van Lee et al. [8] als de eerste passage in elk van de 4 replica's van 10 ml 1X voedingsbouillon met een vaste concentratie NaCl (we noemen dit adaptatiemedia) en gekweekt in goed afgesloten conische buizen van 15 ml. Subcultuur werd uitgevoerd met 1% van de vorige cultuur op elke oneven dag behalve zondag (3 subkweek per week). De NaCl-concentratie voor de passages was als volgt: passages 1 tot 15 bij 3% NaCl, passages 16 tot 31 bij 4% NaCl, passages 32 tot 39 bij 4,5% NaCl, passages 40 tot 50 bij 5% NaCl, passages 51 tot 62 bij 6% NaCl, passages 63 tot 74 bij 7% NaCl en passages 75 tot 80 bij 8% NaCl.

Contaminatiebewaking was als volgt. De kweken werden routinematig gecontroleerd op contaminatie met behulp van Gram-kleuring en DNA-fingerprinting. De DNA-fingerprinting door PCR/restrictiefragmentlengtepolymorfisme werd uitgevoerd met behulp van de procedure in een eerder vergelijkbaar aanpassingsonderzoek [8] waarbij elk van de 3 primers (Primer 5, CgCgCTggC Primer 6, gCTggCggC en Primer 7, CAggCggCg) werd gebruikt als beide voorwaartse en omgekeerde primers. De PCR-reactie werd uitgevoerd (Hybaid Limited, PCR-express) onder de cyclische conditie van initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 10 minuten 35 amplificatiecycli bij 95 °C gedurende 1 minuut, 27 °C gedurende 1 minuut en 72 °C gedurende 3 minuten gevolgd door een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten vóór digestie met 1 eenheid TaqI-restrictie-endonuclease gedurende 16 uur bij 65 °C vóór analyse op 2% (w/v) agarosegel met 1X GelRed.

Doorgangsbewaking was als volgt. De groeiomstandigheden van elke passage werden gevolgd door optische dichtheid bij een golflengte van 600 nm (OD600-aflezingen) met behulp van Shimadzu UV-1601 UV/licht-spectrofotometer. OD600-aflezing van elk replicaat werd voorafgaand aan elke subcultuur genomen voor het schatten van de inoculumdichtheid. OD600-aflezingen werden gedaan op de vijfde en zevende dag na inoculatie voor het schatten van de celdichtheid in de stationaire fase. Bij elke derde passage, 10

L van E coli kweek van elk replicaat (A, B, C en D) werd geïnoculeerd in 1 ml 1X voedingsbouillon en OD600-metingen werden met tussenpozen van maximaal 360 minuten genomen en kunnen worden gebruikt om de generatietijd te schatten.

Voor kweek MIC, 1% van E coli cultuur van elke replicaat (A, B, C en D) werd geënt in 1 ml 1X voedingsbouillon aangevuld met 0% (w/v) NaCl, 1% (w/v) NaCl, 3% (w/v) NaCl, 5% (w/v) NaCl, 7% (w/v) NaCl, 9% (w/v) NaCl en 11% (w/v) NaCl van verschillende zoutconcentraties. Voor kolonie MIC, elk monster van E coli werd uitgestreken op voedingsagar en overnacht bij 37°C geïncubeerd. Tien kolonies werden willekeurig uit elke plaat genomen en in 1 ml 1X voedingsbodem geënt en overnacht bij 37°C geïncubeerd vóór inoculatie in 1 ml 1X voedingsbodem aangevuld met verschillende zoutconcentraties. Het geïnoculeerde medium werd 21-23 uur bij 37°C geïncubeerd voordat de OD600-metingen werden gedaan.

3. Gegevenssetbeschrijving

De dataset behorende bij deze Dataset Paper bestaat uit 5 items die als volgt worden beschreven.

Gegevenssetitem 1 (tabel). OD600-metingen voor elk replicaat genomen op de dag van de volgende subcultuur die kan worden gebruikt om de inoculumdichtheid van elke passage en het aantal generaties tussen elke cultuur te schatten. De tabel heeft een lang formaat waarbij elke rij slechts één gemeten data-attribuut heeft. In dit geval zijn de gemeten gegevens de OD600-metingen. De andere attributen zijn descriptoren van het gemeten data-attribuut. Dit in tegenstelling tot het brede formaat waarbij de descriptoren voor een bepaalde OD600-waarde worden gegeven als rij- en kolomlabels. De tabel bevat slechts 3 attributen: Passage, Replicate en OD600 Reading die respectievelijk het passagenummer aangeven, de replica's gelabeld van "A" tot "D" en de OD600-meting.

  • Kolom 1: Passage
  • Kolom 2: repliceren
  • Kolom 3: OD600-lezing

Gegevenssetitem 2 (tabel). OD600-metingen voor elke replicaat genomen op de vijfde en zevende dag na inoculatie voor schatting van de celdichtheid in de stationaire fase. De tabel heeft een lang formaat waarbij elke rij slechts één gemeten data-attribuut heeft. In dit geval zijn de gemeten gegevens de OD600-metingen. De andere attributen zijn descriptoren van het gemeten data-attribuut. Dit in tegenstelling tot het brede formaat waarbij de descriptoren voor een bepaalde OD600-waarde worden gegeven als rij- en kolomlabels. De tabel bevat 4 attributen: Passage, Replicate, Day en OD600-meting die het passagenummer aangeeft, de replica's gelabeld van "A" tot "D", of de OD600-meting werd uitgevoerd op de vijfde of zevende dag na inoculatie, en de OD600 respectievelijk meten.

  • Kolom 1: Passage
  • Kolom 2: repliceren
  • Kolom 3: Dag
  • Kolom 4: OD600-lezing

Gegevenssetitem 3 (tabel). OD600-metingen genomen bij inoculatie (tijdstip nul of nul minuten), 2 uur na inoculatie en met regelmatige tussenpozen na het tweede uur. Deze gegevens kunnen worden gebruikt voor het schatten van de generatietijd. De tabel heeft een lang formaat waarbij elke rij slechts één gemeten data-attribuut heeft. In dit geval zijn de gemeten gegevens de OD600-metingen. De andere attributen zijn descriptoren van het gemeten data-attribuut. Dit in tegenstelling tot het brede formaat waarbij de descriptoren voor een bepaalde OD600-waarde worden gegeven als rij- en kolomlabels. De tabel bevat 4 attributen: Passage, Replicate, Minutes en OD600 Uitlezing die het passagenummer aangeeft, de replica's gelabeld van "A" tot "D", de hoeveelheid tijd in minuten na inoculatie wanneer de OD600-metingen werden gedaan, en de OD600 respectievelijk meten.

  • Kolom 1: Passage
  • Kolom 2: repliceren
  • Kolom 3: Minuten
  • Kolom 4: OD600-lezing

Gegevenssetitem 4 (tabel). OD600-metingen van het MIC-experiment van elk replicaat. De tabel heeft een lang formaat waarbij elke rij slechts één gemeten data-attribuut heeft. In dit geval zijn de gemeten gegevens de OD600-metingen. De andere attributen zijn descriptoren van het gemeten data-attribuut. Dit in tegenstelling tot het brede formaat waarbij de descriptoren voor een bepaalde OD600-waarde worden gegeven als rij- en kolomlabels. De tabel bevat 4 attributen: Passage, Replicate, [NaCl] en OD600 Uitlezing die het passagenummer aangeeft, de replica's gelabeld van "A" tot "D", respectievelijk de concentratie van NaCl voor MIC-schatting en de OD600-meting (zie Tabel 1 met replicagegevens in breed formaat voor gemakkelijke referentie).

  • Kolom 1: Passage
  • Kolom 2: repliceren
  • Kolom 3: [NaCl]
  • Kolom 4: OD600-lezing

Gegevenssetitem 5 (tabel). OD600-aflezingen van het MIC-experiment van elke kolonie waarbij 10 willekeurige kolonies werden geselecteerd voor elke replica (in totaal werden 40 kolonies gekozen) na isolatie van een enkele kolonie van elk van de 4 replica's. In dit geval zijn de gemeten gegevens de OD600-metingen. De andere attributen zijn descriptoren van het gemeten data-attribuut. Dit in tegenstelling tot het brede formaat waarbij de descriptoren voor een bepaalde OD600-waarde worden gegeven als rij- en kolomlabels. De tabel bevat 5 attributen: Passage, Replicate, Colony, [NaCl] en OD600 Uitlezing die het passagenummer aangeeft, de replica's gelabeld van "A" tot "D", de kolonie in 2 alfabetten waarbij het eerste alfabet de replica aanduidt en de het tweede alfabet geeft respectievelijk de kolonie, de concentratie van NaCl voor MIC-schatting en de OD600-meting aan. De kolonie met het label "DA" vertegenwoordigt bijvoorbeeld kolonie "A" van replicaat "D" (zie tabellen 2, 3 en 4 met kolonie-MIC-gegevens in breed formaat voor gemakkelijke referentie).

  • Kolom 1: Passage
  • Kolom 2: repliceren
  • Kolom 3: Kolonie
  • Kolom 4: [NaCl]
  • Kolom 5: OD600-lezing

4. Slotopmerkingen

Onze MIC-resultaten toonden een toename in OD600-metingen van 11% (w/v) NaCl-aangevulde voedingsmedia na Passage 60 (Figuur 1), wat suggereert dat E. coli was aangepast aan 11% (w/v) NaCl. Dit wordt verder geverifieerd door MIC op willekeurig geselecteerde kolonies bij passage 72 (tabel 4). Dit onderzoek levert dus een reeks gegevens op die als benchmark kunnen worden gebruikt voor andere adaptatieonderzoeken. Gramkleuring en PCR-RFLP op basis van eerdere onderzoeken [7, 8] bij passage 72 (Figuur 2) toonden aan dat de kweken Gram-negatief zijn en dat de PCR-RFLP-profielen van alle 4 replica's vergelijkbaar waren. Dit suggereerde dat de culturen niet besmet waren.


Zoute-zode bodems

Zoute bodems zijn als zoute bodems, behalve dat ze significant hogere concentraties natriumzouten hebben dan calcium- en magnesiumzouten.

Zoute-zode bodems hebben typisch een EC van minder dan 4 mmho cm-1, en de pH is over het algemeen lager dan 8,5. Het uitwisselbare natriumpercentage is meer dan 15 procent van de kationenuitwisselingscapaciteit (CEC). CEC is een maat voor het vermogen van de bodem om kationen vast te houden, namelijk calcium, magnesium, kalium, natrium, waterstof en aluminium. Hoe hoger de CEC, hoe problematischer de verwijdering en sanering van het zoutprobleem.

Water beweegt door deze bodems net als in zoute bodems, hoewel de stappen voor het corrigeren van zoute bodems anders zijn. Door simpelweg de zouten uit deze grond te spoelen, wordt deze omgezet van zout-zoet naar zure grond.


Rat Kallikreïne 10, speekselklierproteïnase K

Activiteit en specificiteit

Proteïnase K vertoont een voorkeur voor het splitsen van Arg-X-bindingen in substraten van kleine moleculen en maakt T-kinine vrij van T-kininogeen. Het vormt ook SDS- en hittestabiele complexen met het gezuiverde recombinante kallikreïne-bindende eiwit van de rat in vitro [6] . Het enzym (als antigeen ) werkte op T-kininogeen met a Km van 29±4 M en a kkat/Km van 140 M –1 s –1 . Met H- en L-kininogenen werden respectievelijk 7,4 en 10 μg kinine h −1 mg −1 vrijgemaakt [4].

Proteïnase K (als T-kininogenase) bleek te verschillen van weefselkallikreïne in zijn interacties op subsites S2, S1′ en S2′. Door gebruik te maken van deze verschillen zijn selectief gedoofde fluorescentiesubstraten ontworpen, die de Abz (O-aminobenzoyl) groep als fluorofoor, en EDDnp (2,4-dinitrofenyl-ethyleenndiamine) als quencher. Abz-Phe-Arg↓Ser-Arg-EDDnp, met Arg op P2′, is een goed substraat voor weefselkallikreïnen van paard, varken en rat, maar niet voor proteïnase K. Abz-Phe-Arg↓Leu-Val daarentegen -EDDnp en Abz-Phe-Arg-Leu-Val-Arg-EDDnp (de T-kininogeensequentie) zijn goede substraten voor proteïnase K, maar niet voor weefselkallikreïne. Arg in P1′, P2′ of P3′ verlaagt de Km waarden van proteïnase K, terwijl Val op P2′ k . verhoogtkat [7] . Proteïnase K splitst specifiek na Arg-residuen, zoals echte weefselkallikreïne, maar verschilt van weefselkallikreïne doordat het polaire of niet-polaire residuen op P2 kan accommoderen.

Ongebruikelijk voor een serineproteïnase wordt de activiteit van proteïnase K 10-voudig verhoogd door de aanwezigheid van een thiolverbinding zoals DTT. Remmers omvatten leupeptine, aprotinine, Tos-Lys-CH2Cl en soja-trypsine-remmer. Pepstatine en PMSF remden het enzym niet [3,8].

Het pH-optimum is ongeveer 8,0 [3]. Assays worden het gemakkelijkst gemaakt met de intramoleculair gedoofde fluorogene peptidesubstraten Abz-Phe-Arg↓Leu-Val-EDDnp en Abz-Phe-Arg↓Leu-Val-Arg-EDDnp [7].


DISCUSSIE

NaCl remt de reparatie van PSII

Eerdere studies van de fotosynthetische machinerie in vivo hebben aangetoond dat zoutstress de door licht geïnduceerde inactivatie van PSII verbetert (Neale en Melis, 1989 Lu en Zhang, 1999). In de huidige studie bevestigden we de synergetische negatieve effecten van lichtstress en zoutstress op het PSII-complex in Synechocystis. De mate van de door licht geïnduceerde inactivatie van PSII weerspiegelt een evenwicht tussen de snelheid waarmee schade wordt veroorzaakt en de snelheid van herstel van PSII (Greer et al., 1986). In our experimental system, the light-induced damage to PSII and the repair of PSII were clearly separate phenomena. Damage was inflicted by strong light (500 μE m −2 s −1 ) in the presence of lincomycin (Fig. 1), whereas repair was achieved in weak light (70 μE m −2 s −1 ) after PSII had been damaged by exposure of cells to very strong light (2,000 μE m −2 s −1 Figs. 2 and 3). Salt stress (1.0 m NaCl) strongly inhibited repair, but had no effect on the light-induced damage to PSII.

In natural habitats, photosynthetic organisms are often exposed to light stress and, in many instances, salt stress is combined with light stress. Thus, the combined effects of salt and light stress are of considerable importance in nature and agriculture.

NaCl Inhibits the Synthesis of Proteins de Novo

A schematic representation of the proposed steps required for expression of psbA genes and the synthesis of D1, with sites of apparent inhibition by high levels of NaCl (T bars weaker inhibition is indicated by broken T bars). A, 1.0 m NaCl. B, 0.5 m NaCl.

A schematic representation of the proposed steps required for expression of psbA genes and the synthesis of D1, with sites of apparent inhibition by high levels of NaCl (T bars weaker inhibition is indicated by broken T bars). A, 1.0 m NaCl. B, 0.5 m NaCl.

We observed two bands after western blotting with antibodies against the carboxy-terminal extension of pre-D1, namely, the amino acid sequence SGEGAPVALTAPAVNG. Shestakov et al. (1994) demonstrated that pre-D1 is converted to D1 by CtpA, a specific carboxy-terminal-processing protease. Inagaki et al. (2001)demonstrated that this processing involves two separate steps and, moreover, that the top and bottom bands observed after gel electrophoresis correspond to pre-D1 (pre-D1-1) and an intermediate in the processing of pre- D 1-1, namely, pre-D1-2.

Western-blotting analysis of pre-D1 (Fig. 6) indicated that levels of pre-D1-1 and pre- D 1-2 in cells that had been incubated in the presence of 0.5 m NaCl were about 50% of those in low-salt medium (20 m m NaCl), which might correspond to the 50% level of recovery of PSII activity shown in Figure 2. The level of pre-D1 is the result of a balance between the synthesis, processing, and degradation of the protein, and the results in Figure 7 indicate that NaCl had no effect on the processing and degradation of either form of pre- D 1. Northern-blotting analysis, for which results are shown in Figures 8 and 9, demonstrated that in the presence of 0.5 m NaCl, the accumulation of psbAtranscripts was delayed, but the maximum level of psbAtranscripts was unaffected. These observations suggest that translation of psbA transcripts to yield pre-D1 was partially inhibited by 0.5 m NaCl.

Taken together, our results indicate that NaCl inhibited the transcription and translation of psbA genes (Fig. 10). However, inhibition of transcription was the salient factor that was primarily responsible for inhibition of the repair of the PSII complex at 1.0 m NaCl, whereas inhibition of translation was most responsible for the partial inhibition of repair at 0.5 m NaCl.

The Overall Transcription and Translation of Genes Is Affected by NaCl

The results of DNA microarray analysis (Table I) demonstrated that 1.0 m NaCl completely inhibited the light-induced accumulation of the transcripts of all the light-inducible genes, confirming the results of labeling with [ 35 S]Met. These observations suggest that inhibition of transcription by 1.0 m NaCl was the primary cause of inhibition of the light-induced synthesis of light-inducible proteins (Fig. 10). At 0.5 m NaCl, transcription of most of the light-inducible genes ceased to be inducible by light. However, the light inducibility of some light-inducible genes was enhanced to some extent. These results might correspond to the synthesis of a protein of 25 kD (Fig. 5), whose light inducibility was enhanced in 0.5 m NaCl. However, it is unclear which gene encoded the 25-kD protein.

The results of labeling with [ 35 S]Met (Fig. 5) demonstrated that 1.0 m NaCl inhibited the light-induced synthesis de novo not only of D1, but also of all other proteins. At 0.5 m , NaCl also inhibited the light-induced synthesis of all the light-inducible proteins, with a few exceptions, for example, the 25-kD protein. At 0.5 m NaCl, the light inducibility of the synthesis of D1 de novo was reduced and synthesis of the 25-kD protein appeared to be enhanced. Thus, the salt stress due to NaCl significantly depressed the light inducibility of the synthesis de novo of almost all of the light-inducible genes.


Drop Dialysis

1. Pour 30&ndash100 ml of dialysis buffer, usually double-distilled water or 1X TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0), into a petri plate or beaker.

2. Float a 25 mm diameter, Type-VS Millipore membrane (MF type, VS filter, mean pore size = 0.025 &mum, Millipore, Inc. #VSWP 02500) shiny side up on the dialysis buffer. Allow the floating filter to wet completely (

5 minutes) before proceeding. Make sure there are no air bubbles trapped under the filter.

3. Pipette a few &mul of the DNA droplet carefully onto the center of the filter. If the sample has too much phenol or chloroform, the drop will not remain in the center of the membrane and the dialysis should be discontinued until the organics are further removed. In most cases, this is performed by alcohol precipitation of the sample. If the test sample remains in the center of the membrane, pipette the remainder on to the membrane.

4. Cover the petri plate or beaker and dialyze for 1 to 4 hours. Do not allow the sample to flip or become covered with dialysis buffer.

5. Carefully retrieve the DNA droplet with a micro-pipette and place in a microcentrifuge tube. Rinse the spot on the membrane with 50 &mul of 1X TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) and add to the microcentrifuge tube.

6. Estimate the concentration of the DNA product using agarose gel electrophoresis or a spectrophotometer.

Opmerkingen:
Step 4 may be tricky for those with shaky hands or poor handeye coordination. The filter has a tendency to move briskly around the surface as you touch it with the pipette tip. Practice with buffer droplets to master the technique before using a valuable sample.

Dialysis against double-distilled water is also recommended, especially if proceeding to another manipulation where EDTA might be a problem.

Steps 2 to 4 can be repeated with fresh buffer or for longer times if additional dialysis is required.


Bekijk de video: Tutorial Pengentalan Sabun Cair Menggunakan Garam NaCl dan Na2SO4, Lebih Lengkap dan Jelas (December 2021).