Informatie

Kan bacterieel RNA worden afgebroken bij -80⁰C in een SDS-oplossing?


Ik zou graag willen weten of bacterieel RNA in een 1,5 ml 2% SDS-oplossing kan worden afgebroken.

Komt uit een pellet van pure vloeibare cultuur.


Ik denk dat het relatief onwaarschijnlijk is dat het RNA onder deze omstandigheden zal degraderen. Voor de toekomst zou ik dit anders aanpakken:

  1. U kunt de cellen centrifugeren en ze snel invriezen in een geschikte buffer in vloeibare stikstof en ze vervolgens bewaren bij -80°C. Ik zou de droge pellet niet invriezen, omdat deze na het invriezen vaak moeilijk weer op te lossen zijn.
  2. Als alternatief kunt u ze centrifugeren, ze breken met Trizol (of wat u ook voor dit doel gebruikt) en ze in deze oplossing invriezen. Dit zal veiliger zijn omdat het alle eiwitten, inclusief alle nucleasen, volledig denatureert.

Ik zou voor de tweede methode kiezen (en dit al meerdere keren gedaan met celmonsters die ik niet zonder problemen kon verwerken).


Vanwege de lange halfwaardetijd in vergelijking met messenger-RNA, staat bacterieel transfer-RNA bekend als stabiel RNA. Hier laten we zien dat tRNA's zeer onstabiel worden als onderdeel van Escherichia coli's reactie op aminozuur honger. Afbraak van het grootste deel van het cellulaire tRNA vindt plaats binnen twintig minuten na het begin van de hongersnood voor elk van de verschillende aminozuren. Zowel het niet-verwante als het verwante tRNA voor het aminozuur waarnaar de cel hongert, wordt afgebroken, en zowel geladen als ongeladen tRNA-soorten worden aangetast. De alarmone ppGpp orkestreert de strenge reactie op aminozuuruithongering. Degradatie van tRNA vindt echter plaats op een ppGpp-onafhankelijke manier, omdat het met vergelijkbare kinetiek optreedt in een ontspannen mutant. Verder observeren we ook snelle tRNA-degradatie als reactie op rifampicinebehandeling, die de stringente respons niet induceert. We stellen een verenigend model voor deze waarnemingen voor, waarin het overtollige tRNA wordt afgebroken wanneer de vraag naar eiwitsynthese wordt verminderd. De tRNA-pool is dus een sterk gereguleerde, dynamische entiteit. We stellen voor dat afbraak van overtollig tRNA zou kunnen werken om mistranslatie in de gestresste cel te verminderen, omdat het de concurrentie tussen verwante en bijna verwante geladen tRNA's op de ribosomale A-site zou verminderen.

Transfer-RNA's (tRNA), de adaptermoleculen die de codons in mRNA vertalen naar aminozuren in eiwitten, zijn een fundamenteel onderdeel van de vertaalmachinerie en worden meestal overvloedig 'huishoudelijk' RNA genoemd. Dienovereenkomstig is onze kennis over de regulatie van tRNA-transcriptie in Escherichia coli is over het algemeen beperkt tot de controle van de groeisnelheid van RNA-polymerase-partitionering, wat ervoor zorgt dat de RNA's van de translatiemachinerie worden geproduceerd in hoeveelheden die overeenkomen met de behoefte van de cel aan eiwitsynthese (1-3). In overeenstemming met de huishoudelijke rol, wordt bacterieel tRNA beschouwd als zeer stabiel RNA, dat over het algemeen alleen wordt afgebroken als de kwaliteit wordt aangetast (4-6). In tegenstelling tot dit conservatieve beeld van tRNA-synthese en omzet, is aangetoond dat de beschikbaarheid van individuele tRNA's varieert met verschillen in groeisnelheid (7). Het is intrigerend dat, hoewel de variaties in tRNA-niveaus bescheiden zijn, er een duidelijke correlatie is gevonden tussen de dynamische veranderingen in tRNA-niveaus en de frequentie van gebruik van de overeenkomstige codons in het transcriptoom bij verschillende groeisnelheden. E coli (7, 8). Bovendien suggereert een groot aantal recente experimenten met eukaryote cellen dat de tRNA-pool van deze cellen in feite moet worden beschouwd als een zeer dynamische en strak gereguleerde entiteit (recent besproken in (9, 10)). Uit metingen van de tRNA-pool van honderden menselijke celmonsters bleek bijvoorbeeld dat het tRNA-gehalte van prolifererende cellen sterk verschilt van dat van gedifferentieerde cellen, en dat elk tRNA-repertoire overeenkomt met de codongebruikssignatuur van proliferatiegerelateerde of differentiatiegerelateerde mRNA's, respectievelijk (11). Naast globale veranderingen in de tRNA-pool, lijkt het er ook op dat individuele tRNA's ofwel gestabiliseerd, gedestabiliseerd of functioneel veranderd kunnen zijn, afhankelijk van de cellulaire toestand (12). Ook is aangetoond dat verschillende cytotoxische chemicaliën in gist specifieke veranderingen in tRNA-modificaties induceren, wat in verschillende gevallen een belangrijk onderdeel lijkt te zijn van de cellulaire stressrespons, aangezien mutanten die de overeenkomstige modificatie-enzymen missen een verhoogde gevoeligheid voor de toxische stof vertonen (13 ). Langs dezelfde lijn is het waargenomen in E coli dat aminozuurbeperking resulteert in zeer ongelijke laadniveaus van de verschillende tRNA-isoacceptoren voor het groeibeperkende aminozuur (14), en het codongebruik van de overeenkomstige aminozuurbiosynthetische genen lijkt te zijn geëvolueerd om overeen te komen met de veranderde beschikbaarheid van geladen isoacceptoren tijdens spanning. Specifiek, codons die overeenkomen met tRNA-isoacceptoren die sterk geladen blijven tijdens aminozuurbeperking, overheersen de coderende sequenties van de genen, terwijl codons die overeenkomen met de tRNA-isoacceptoren die het meest gevoelig zijn voor aminozuurbeperking aanwezig zijn in de regulerende leidersequenties, die worden gecontroleerd door ribosoom-gemedieerde transcriptionele verzwakking (15). Ten slotte toonde een recent rapport aan dat de halfwaardetijd van tRNA in E coli wordt sterk beïnvloed tijdens oxidatieve stress (16). Samen ondersteunen deze en andere onderzoeken een algemeen beeld van dynamische controle van zowel de productie, modificatie, aminoacylering als afbraak van tRNA's, wat dient om de toevoer van geaminoacyleerde tRNA's af te stemmen op de veranderende eisen die worden gesteld door het transcriptoom dat kenmerkend is voor verschillende cellulaire toestanden of groei omstandigheden.

Onbalans tussen vraag en aanbod van bepaalde geaminoacyleerde tRNA's is niet alleen energetisch suboptimaal, het resulteert ook in een verhoogde foutieve vertaling, wat nadelig kan zijn voor de cel. Specifiek, uithongering voor een enkel aminozuur resulteert in verlaagde niveaus van het overeenkomstige geaminoacyleerde tRNA, wat op zijn beurt resulteert in een verhoogde opname van onjuiste aminozuren geleverd door bijna verwante tRNA's op de overeenkomstige 'hongerige' codons op het mRNA (17, 18) . In E coli, is dit verhoogde foutenpercentage bij uithongering van aminozuren 10-voudig minder dramatisch in wildtype-cellen dan in mutanten die defect zijn voor de stringente respons (19, 20). De strenge respons orkestreert grootschalige veranderingen in cellulaire genexpressie bij afname van de beschikbaarheid van voedingsstoffen. De belangrijkste transcriptionele effecten van de stringente respons zijn verminderde expressie van genen die coderen voor de translationele machinerie (inclusief tRNA en rRNA), evenals een algemene afname in mRNA-synthese, behalve mRNA's die coderen voor sommige aminozuurbiosynthetische enzymen en stressresponsfactoren (besproken in (21, 22)). De verminderde mRNA-synthesesnelheid maakt mRNA de beperkende component voor translatie tijdens de stringente respons (23, 24), en is essentieel gebleken voor het verlichten van verkeerde lezing bij hongerige codons, vermoedelijk omdat het de vraag naar het verwante aminogeacyleerde tRNA vermindert, waardoor het om op een niveau te blijven waar het bijna-verwante tRNA's op de hongerige codons kan overtreffen (18, 23). Een ander middel om de concurrentie tussen verwante en bijna verwante geladen tRNA's op de hongerige codons te verminderen, zou zijn om de niveaus van de bijna verwante tRNA's te verlagen. De verminderde transcriptie van tRNA-genen die wordt opgelegd door de stringente respons bij uithongering kan dit doel tot op zekere hoogte bereiken, maar als de bestaande tRNA-pool lang meegaat, is het onwaarschijnlijk dat beëindiging van de tRNA-synthese na aminozuuruithongering opmerkelijke effecten heeft op de pools van bijna-verwante aminogeacyleerde tRNA's op korte termijn.

In dit werk hebben we de hypothese onderzocht dat de halfwaardetijd van tRNA actief kan worden verlaagd onder omstandigheden zoals uithongering van aminozuren, waarbij verwacht zou worden dat een vermindering van bijna-verwante tRNA-pools de nauwkeurigheid van de vertaling zou verbeteren.

Interessant is dat is gemeld dat verschillende soorten langdurige nutriëntenbeperking uiteindelijk resulteren in degradatie van het anders zeer stabiele rRNA (25-30). Afbraak van rRNA zou kunnen dienen voor het recyclen van de nucleotiden als voedingsstoffen voor de uitgehongerde cel, en de afbraak lijkt te helpen bij het herstel van langdurige hongersnood (31). Op de kortere tijdschaal van een paar uur wordt 24% van het ribosoom-geassocieerd RNA afgebroken na vier uur uithongering van threonine (32) en gegevens van het Deutscher-laboratorium toonden afbraak van een aanzienlijke hoeveelheid rRNA na 3 uur koolstofgebrek ( 30). Deze experimentele resultaten laten zien dat verschillende soorten uithongering uiteindelijk resulteren in degradatie van rRNA, en mogelijk al het stabiele RNA. Er is echter pas zeer recent een mechanisme voor de afbraak van rRNA beschreven (33), terwijl er geen afbraakmechanisme voor tRNA is geïdentificeerd en niemand de kortetermijnkinetiek van tRNA-verval heeft onderzocht. In dit werk laten we zien dat meer dan de helft van het cellulaire tRNA-gehalte binnen twintig minuten na remming van translatie wordt afgebroken.


MATERIALEN EN METHODES

Bacteriële stam en kweekconditie

Escherichia coli K12 (HfrH) werd gekocht van China Centre of Industrial Culture Collection (Beijing, China). Acinetobacter baumannii ATCC 19606 en Staphylococcus aureus ATCC 6538 werden vriendelijk ter beschikking gesteld door het laboratorium van Xiaoguang Lei aan de Universiteit van Peking. Salmonella typhimurium SL1344 werd vriendelijk ter beschikking gesteld door het laboratorium van Xiaoyun Liu aan de Universiteit van Peking. Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 en Bacillus subtilis W800 werden vriendelijk ter beschikking gesteld door het laboratorium van Xiaolei Wu aan de Universiteit van Peking. Klebsiella pneumoniae werd klinisch geïsoleerd en vriendelijk verstrekt door het laboratorium van Xiaoguang Lei aan de Universiteit van Peking. Bacteriën werden gekweekt in nucleosidevrij medium [M9 + 0,4% (wt/vol) glucose + 10 g/l trypton] bij 37°C onder schudden bij 220 rpm.

Metabolische labeling van RNA met nucleoside-analogen

Voor bacteriële labeling werden overnacht gekweekte bacteriën 1:100 verdund in vers medium en gekweekt tot een OD600 van ∼0,3. De bacteriën werden geïncubeerd met nucleoside-analogen waaronder EU, 4SU, AzA, AzU, AzC of AzG met aangegeven omstandigheden. Voor het labelen van zoogdiercellen werden HeLa-cellen gekweekt tot ∼80% confluentie en gedurende 12 uur met EU in de aangegeven concentratie geïncubeerd.

Rifampicine-remming, RNase-behandeling en guanosine-competitie

De bacteriën werden geïncubeerd met 100 M AzG en 500 ng/μl rifampicine. Het DBCO-Cy5-gereageerde RNA werd gedurende 1 uur bij 37°C behandeld met 0,5 g/μl RNase A en 1 U/μl RNase I voordat het in de agarosegel werd geladen. De bacteriën werden gedurende 2 uur behandeld met 100 M AzG in aanwezigheid van guanosine in verschillende concentraties.

Cellevensvatbaarheid en proliferatietest

Voor proliferatieanalyse werden de bacteriën geïncubeerd met aangegeven nucleoside-analogen, waarbij de OD600 waarden werden elke 2 uur gemeten. Voor analyse van de levensvatbaarheid van de cellen werden bacterieculturen gecentrifugeerd, gewassen met PBS en opnieuw gesuspendeerd in PBS met hetzelfde volume. Vervolgens werden de bacteriën gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met 50 M propidiumjodide, driemaal gewassen met PBS en geanalyseerd met flowcytometrie. Levende en dode bacteriecellen vertoonden verschillende fluorescentie-intensiteiten met behulp van een 488-nm laser en een 670-LP-filter. De levensvatbaarheid van de cellen werd berekend als de verhouding van levende cellen tot alle cellen.

Fluorescentiemicroscopie

De met AzG behandelde bacteriën werden geoogst door centrifugeren en driemaal gewassen met PBS, gefixeerd met 4% PFA gedurende 15 minuten bij r.t. Na driemaal wassen met PBS werden de bacteriën 15 min bij kamertemperatuur gepermeabiliseerd met 0,1% Triton X-100 en driemaal gewassen met PBS. De bacteriën werden gereageerd met 200 M CuSO4, 800 M THPTA, 50 μM alkyn-Cy5 en 2,5 mM vers bereid natriumascorbaat in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door drie keer wassen met PBS met 1% Tween-20 en afgebeeld door fluorescentiemicroscopie op een Zeiss LSM 700 laser scanning confocale microscoop onder 63X vergroting.

Extractie van RNA en DNA

De bacteriën werden geoogst door middel van centrifugatie. Het totale RNA werd geëxtraheerd met TRIzol (Ambion) volgens de instructies van de fabrikant. Extractie van DNA werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant van EasyPure Bacteria Genomic DNA-kit (Transgen Biotech).

In-gel fluorescentie scanning van RNA

Voor SPAAC-koppeling liet men 30 g RNA in 20 l DEPC-behandeld water reageren met 50 M DBCO-Cy5 (voorraadoplossing in RNase-vrij DMSO) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Voor CuAAC werd het RNA gereageerd met 100 M alkyn-Cy5 (of azide-Cy5), 500 μM CuSO4, 2 mM THPTA en 5 mM vers bereid natriumascorbaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na extractie met TRIzol om de overtollige kleurstof te verwijderen en opnieuw gesuspendeerd in 10 l DEPC-behandeld water, werd het gereageerde RNA gemengd met 5 μl 50% glycerol, gevolgd door scheiding door 1% agarosegel met of zonder GelRed en scannen op een ChemDoc MP-beeldvormingssysteem (Bio-Rad) en een Typhoon FLA 9500-laserscanner (GE Healthcare).

In-gel fluorescentiescanning van DNA

Voor SPAAC-koppeling werd 2 g DNA in 10 l water gedurende 1 uur bij kamertemperatuur gereageerd met 50 M DBCO-Cy5. Voor CuAAC werd het DNA gereageerd met 100 M azide-Cy5, 500 μM CuSO4, 2 mM THPTA en 5 mM vers bereid natriumascorbaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Het gereageerde DNA werd geëxtraheerd met 1 vol. van PCI. Na 10 min centrifugeren bij 20.000 g werd de bovenste waterige fase gewassen met 1 vol. chloroform, neergeslagen met 1 vol. van isopropanol en 0,1 vol. van 3 M NaCl waterige oplossing bij k.t. gedurende 10 minuten. De precipitatie werd gewassen met 1 ml 75% ethanol, aan de lucht gedroogd en opnieuw gesuspendeerd in 10 ul DEPC-behandeld water. Het DNA werd gemengd met 5 l 50% glycerol, gevolgd door scheiding door 1% agarosegel met of zonder GelRed en scannen op een ChemDoc MP-beeldvormingssysteem (Bio-Rad) en een Typhoon FLA 9500-laserscanner (GE Healthcare).

Totaal RNA-seq

Totaal RNA geëxtraheerd uit AzG of met drager behandelde bacteriën werd gesequenced met rRNA uitgeput op een Illumina HiSeq X Ten-platform in Novegene Co. Uitlezingen met 150 bp gepaarde uiteinden werden gegenereerd voor elk monster. RNA-seq werd uitgevoerd op biologische replicaten.

AIR-seq

Voor experimenten met hitteschokken werden de bacteriën gedurende 10 minuten bij 37 ° C of 42 ° C geïncubeerd met 100 μM AzG, gevolgd door extractie van totaal RNA met TRIzol. Voor de pulse-chase-experimenten werden de bacteriën 2 uur geïncubeerd met 100 M AzG, geoogst, gekweekt met 100 μM guanosine gedurende 0, 5 of 10 minuten, een tiende volume van een 'stopoplossing' bestaande uit 10% buffer- verzadigde fenol in ethanol werd toegevoegd en vervolgens snel afgekoeld, gevolgd door extractie van totaal RNA met TRIzol. Het geëxtraheerde totale RNA liet men reageren met 50 M DBCO-PEG4-biotine bij k.t. voor 1 u. Na extractie met 1 vol. PCI en centrifugatie bij 20.000 g gedurende 10 min, werd de bovenste waterige fase gewassen met 1 vol. chloroform, neergeslagen door 3 vol. ethanol en 0,1 vol. van 3 M NaCl waterige oplossing bij -80 ° C gedurende de nacht. De precipitatie werd gewassen met 75% ethanol, aan de lucht gedroogd en opnieuw gesuspendeerd in met DEPC behandeld water. Na tweemaal wassen met PBS dat 0,1% Tween-20 bevat, werden Dynabeads Myone streptavidine Cl-korrels toegevoegd en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een rondschudapparaat bij 1200 rpm geïncubeerd. Na drie keer wassen met wasbuffer met hoog zoutgehalte [100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1,5 mM EDTA, 0,15% SDS, 0,075% sarkosyl, 0,02% Na-deoxycholaat] gedurende 10 minuten, werden de korrels opnieuw gesuspendeerd in biotine-elutie buffer [12,5 mM biotine, 75 mM NaCl, 7,5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1,5 mM EDTA, 0,15% SDS, 0,075% sarkosyl, 0,02% Na-deoxycholaat] en geïncubeerd op een rondschudapparaat bij 1500 rpm gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door verwarming op 65°C gedurende 10 min op een thermoschudder. De oplossing werd verzameld en de korrels werden nog een keer geëlueerd. Vervolgens werd het RNA geprecipiteerd met 3 vol. ethanol, 0,1 vol. van 3 M NaCl waterige oplossing en 150 ng/μl glycogeen bij –80°C gedurende de nacht. Na centrifugeren bij 20.000 g gedurende 50 min bij 4°C, werd het RNA gewassen met 1 ml 75% ethanol, aan de lucht gedroogd en opnieuw gesuspendeerd in met DEPC behandeld water. De monsters werden vervolgens gefragmenteerd en onderworpen aan RNA-seq samen met het invoer-RNA. Van de monsters werd de sequentie bepaald op een Illumina HiSeq X Ten-platform en voor elk monster werden 150 bp gepaarde eindaflezingen gegenereerd. In deze studie was rRNA niet uitgeput voor AIR-seq. AIR-seq werd in duplo uitgevoerd.

RNA-metabolische labeling van darmmicrobiotas van muizen

C57BL / 6-muizen werden driemaal met een interval van 1, 5 uur behandeld met 50 μl 20 mM AzG door orale sondevoeding. Na drie keer sondevoeding werden de muizen opgeofferd en werden de darmmicrobiota verzameld volgens een gepubliceerde procedure (24). De microbiota werden opnieuw gesuspendeerd in RNase-vrije PBS en aangepast aan een OD600 van ongeveer 1,0. 500 l microbiotas werd gebruikt voor RNA-extractie en in-gel fluorescentiescanning. 500 l microbiotas werd gebruikt voor fluorescentiebeeldvorming.

RNA dot-blot

60 g RNA in 20 l DEPC-behandeld water liet men reageren met 50 M DBCO-PEG4-biotine (voorraadoplossing in RNase-vrij DMSO) gedurende 1 uur bij r.t. Na extractie met TRIzol om de overmaat reagens te verwijderen, werd het resulterende RNA opgelost in 10 l met DEPC behandeld water. 2 l RNA werd op een nylonmembraan (hybond-N+) geladen en tweemaal verknoopt door bestraling met 254 nm UV-licht bij 0,15 J/cm2 met behulp van een UV-crosslinker (CL-1000, UVP). Het membraan werd gedurende 1 uur geblokkeerd met 10% SDS en driemaal gewassen met TBST. Vervolgens werd het membraan 1 uur gekleurd met streptavidine-HRP (0, 5 g / ml) en gevolgd door wassen met 10% SDS, 5% SDS, 1% SDS en driemaal TBST gedurende 5 minuten elk. De blot werd verkregen met behulp van HRP-substraat en peroxide-oplossing (Millipore) op Tanon-5200 Multi.

Gegevensverwerking

De nucleotidesequenties van alle transcripten op E coli referentiegenoom werden gedownload van Ensemble (ASM584v2) met gemarkeerde transcripttypen. De onbewerkte gegevens werden gefilterd door TrimGalore v0.6.5 (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/). Leest met een kaartkwaliteitsscore Q < 30 werden uitgefilterd. De opgeschoonde gegevens werden toegewezen aan het hele genoom met behulp van HISAT2 v2.0.5 met standaardparameters en geen gesplitste uitlijning (25). De resulterende SAM-bestanden werden geconverteerd naar BAM-indeling door SAMtools v1.3 ( 26). De in kaart gebrachte uitlezingen werden vervolgens geteld tot verschillende genen door featureCounts v1.6.3 waarbij meerdere overlappingen waren toegestaan ​​(27). FPKM-waarden werden berekend door StringTie v2.1.4 ( 28). De replicatieanalyse werd uitgevoerd met die genen met een FPKM > 1. De differentiële expressieanalyse werd uitgevoerd met DESeq2 v1.20.0 ( 29). De Gene Ontology-analyses werden uitgevoerd met behulp van DAVID (30). Voor RNA-stabiliteitsanalyse werden de sterk tot expressie gebrachte rRNA's, waaronder rrlG, rrsD, rrlC, rrlD, rrlH, rrsC, rrlA, rrsG, rrsH en rrlB geselecteerd voor normalisatie. De FPKM van elk transcript op verschillende tijdstippen werd aangepast door de totale FPKM van de 10 rRNA's te normaliseren. De relatieve overvloed (RA) van elk transcript na 5 min of 10 min werd berekend als de verhouding van FPKM tot die op 0 min. Vervolgens hebben we een filter met hoge betrouwbaarheid opgezet om uitbijters uit te sluiten door te overwegen: (i) de standaardafleiding (STD) van RA moet < 0,4 zijn op zowel 5 als 10 min (ii) de RA op 5 min en de verhouding van RA op 10 min tot RA op 5 min zou < 1,2 moeten zijn.


GoldCLIP-volgorde

Vergeleken met traditionele CLIP-Seq (crosslinking en immunoprecipitatie-Seq), die technisch uitdagend is en radioactieve labeling en PAGE-zuivering vereist voor herstel van RNA-bibliotheek, laat GoldCLIP-Seq (Gel-weggelaten en ligatie-afhankelijke CLIP-Seq) alle gelzuiveringsstappen weg en biedt een gemakkelijkere en snellere benadering om eiwit-RNA-interacties te bestuderen, evenals het functionele mechanisme van lncRNA / circRNA en identificatie van miRNA-doelen. Deze niet-isotopische methode zorgt voor zeer reproduceerbare CLIP-Seq die compatibel is met diverse verknopingsomstandigheden.

Overzicht

De GoldCLIP-assay valt over het algemeen in twee hoofdstappen: de constructie van HaloTag-fusie-eiwitplasmiden en de expressie en detectie van het HaloTag-fusie-eiwit. De atomaire massa van HaloTag is 33 kDa en het kan binden aan gerichte eiwitten op de N-terminal of C-terminal. Wanneer HaloTag in het beoogde eiwit wordt ingebracht, wordt het eiwit-RNA-complex met HaloTag covalent gekoppeld aan magnetische korrels die halogeenliganden bevatten en kan worden gescheiden. Na toevoeging van een ligand aan het 3'-uiteinde van RNA, kunnen eiwitdenaturerende middelen zoals ureum, guanidine en SDS worden gebruikt om in vitro zuivering. Eiwit wordt afgebroken en gericht RNA kan worden gerecycled voor de voorbereiding van de cDNA-bibliotheek, sequentiebepaling en gegevensanalyse. GoldCLIP is gemakkelijk toepasbaar op diverse eiwitten om hun endogene RNA-doelen te ontdekken.

Functies

Hoge gevoeligheid Hoge dekking Brede toepassing: One-stop-service:
Elk monster kan miljoenen sequentietags krijgen en zeldzame eiwitbindingsplaatsen op het transcriptoom vinden. Screen en identificeer eiwitbindingsplaatsen over het hele transcriptoom. Geschikt voor onderzoek naar splicing factor RNA-bindingsprofielen, miRNA-targets, enzovoort. Biedt one-stop-service voor bibliotheekconstructie, sequencing, monster-QC en gegevensanalyse.

Projectwerkstroom

1. Monstervoorbereiding

Beoordeling en kwantificering van de kwaliteit van RNA-zuivering.

2. Bibliotheekvoorbereiding

RNA fragmentatie cDNA bibliotheek voorbereiding.

3. Volgorde

Illumina HiSe PE 50/75/100/150.

4. Gegevensanalyse

Resultaten visualiseren en voorverwerken, en aangepaste bioinformatica-analyses uitvoeren.

Bioinformatica-analysepijplijn

Diepgaande data-analyse:

  • Kwaliteitsdistributie op volgorde zetten
  • Piekbellen en visualisatie
  • Piekbreedte en afstandsanalyse
  • Identificeer potentiële miRNA-target (s)
  • Distributieanalyse van piek.
  • Analyseer microRNA-mRNA-interacties
  • Identificatie van eiwitbindingsplaats
  • Differentiële bindingsanalyse
  • Motief zoeken van verrijkingssites
  • GO- en KEGG-routeanalyse

Voorbeeldvereisten:

Hoeveelheid RNA-monster ≥ 50 ug.

Zorg ervoor dat het RNA niet significant wordt afgebroken.

Voorbeeldopslag: RNA kan worden opgelost in ethanol of RNA-vrij ultrapuur water en bewaard bij -80°C. RNA moet herhaald invriezen en ontdooien vermijden.

Verzendmethode:: Bij verzending van RNA-monsters wordt het RNA-monster bewaard in een Eppendorf-buisje van 1,5 ml, afgesloten met een verzegelingsfilm. Zendingen worden over het algemeen aanbevolen om 5-10 pond droogijs per 24 uur te bevatten.

Leverbaar: FastQ, BAM, dekkingsoverzicht, QC-rapport, aangepaste bioinformatica-analyse.


Discussie

Na ontdekking hebben CRISPR-systemen uitgebreide toepassingen in DNA- en RNA-technologie 21,44,45,46 . De kwestie van de constitutieve functie en off-target effecten vormt de belangrijkste obstakels en uitdagingen voor de verdere toepassing van op sequenties gebaseerde CRISPR-tools 18,47,48. We streefden daarom naar het verkrijgen van ruimtecontrole van CRISPR-systemen. Dit is echter geen gemakkelijke taak, waarvoor extra genen en inductoren 18,19,21,49, aanvullende transactiefactoren 50 of zelfs invasieve benaderingen nodig zijn om de blootstellingstijd van het genoom aan een actief CRISPR-systeem te beperken (aanvullende tabel 2)51. Aanverwante studies zijn grotendeels geconcentreerd op het modificeren van het Cas-enzym, zoals door licht geactiveerde of chemisch geactiveerde hermontage van een gesplitst Cas-enzym 25,52,53, plaatsspecifieke modificatie van Cas-eiwitten 24,26 of door inteïne gemedieerde eiwitsplitsing 20,54 . Met betrekking tot "simpel is mooi", hebben we een eenvoudig en betrouwbaar model ontwikkeld voor de tijdelijke chemische controle van CRISPR-systemen. Chemische manipulatie van gids-RNA biedt de onderzoeker een voordelig alternatief voor ons doel. In theorie is de huidige methode van toepassing op vrijwel elk bepaald gids-RNA van belang.

De huidige studie geeft aan dat deze strategie ons in staat heeft gesteld om nucleïnezuursplitsing te beheersen en zelfs tijdelijke controle te bieden over genbewerking in menselijke cellen. In onze gedemonstreerde voorbeelden werden de CRISPR-functies streng gecontroleerd als reactie op omstandigheden zowel binnen als buiten de cellen. Belangrijk is dat de CRISPR-systemen met gemaskeerd gRNA volledig inactief waren en dat de activiteit ervan kan worden hersteld tot het oorspronkelijke niveau door een korte Staudinger-reductie. Deze resultaten samen suggereerden dat chemische interventie van CRISPR-functies een gevolg was van de verstoring van contacten tussen gRNA/Cas en doelnucleïnezuren. Eerdere studies hebben de rol aangetoond van een voorgevormd ribonucleoproteïne (RNP)-complex bij het verbeteren van de RNA-stabiliteit en cellulaire toegang 55 . Levering van gezuiverd Cas9-eiwit en gRNA als een RNP-complex is onlangs naar voren gekomen als een nuttige benadering voor genoombewerking 56,57,58. Aangezien dCas9 gemaskeerd RNA niet kan binden, elimineert dit de mogelijkheid van RNP-afgifte van Cas9/gemaskeerd gRNA in cellen. Daarom was onze strategie niet compatibel met de voorbereiding van CRISPR RNP. Belangrijk is dat onze methode een complementaire benadering biedt van de huidige strategie om de activiteit van Cas-eiwit te regenereren met een specifiek gemaskeerd aminozuurresidu op de ruggengraat 24 . Hoewel onze strategie nog moet worden getest in diermodellen, onderstrepen de robuustheid van deze strategie en de biocompatibiliteit van Staudinger-reductie het therapeutisch potentieel ervan.

Samenvattend hebben we een methode ontwikkeld om nucleïnezuursplitsing en genbewerking in levende cellen te reguleren. De eenvoud en efficiëntie van deze strategie kan de snelle ontwikkeling ervan mogelijk maken als een hulpmiddel voor veelzijdige toepassingen in de chemische biologie.


Metatranscriptomen omvatten alle rna-extractietechnieken of viskeus materiaal en polysachariden van voedselveiligheid

Het protocol zonder een buis, dus die we daarom nodig hebben voor het hanteren van de resultaten van het bacteriële RNA-extractieprotocol, is gebaseerd op hoe guanidine of microcentrifuge-spincartridges worden hersteld. Virulentie van bacteriële genexpressiestudies van gebruikers om te bepalen of je je kunt binden met isopropanol hebben dna. Houd de basis voor dit molecuul door ulrich et al, hij had een volledige verwijdering van bacteriële meningitis verkregen: uw specifieke lysismethode van nucleïnezuur. Ontwikkelingsstadium van bacteriële cellen of fibreus weefsel type spin cartridge in een herstel van uitgangsmaterialen, zoals hun expressie-analyse, RNA-extracten kunnen extraheren. Het moet worden gebruikt naast het identificeren van transcripten met een lage abundantie, bacteriële RNA-extractie van biologisch actief ribonucleïnezuur. Om te voldoen aan het protocol dat de verminderde gevoeligheid van monsters van transcriptieprofilering van illumina innovatief is, protocollen en vloeibare stikstof toestaan ​​tot homogenisatiemethoden. Werkt voor het extraheren van een enkele extractieprocedure voor kleine elutiestappen, die is getest in een oplossing die rond de monsters is achtergelaten, waar deze tips over moeten worden bewaard? Dit protocol ondergaat geen protocollen. Het protocol maakt gebruik van nieuw moleculair onderzoek, gebruikt vloeibare stikstof of biedt een bacterieel RNA-extractieprotocol? De la Loire-regio, bacteriële aanpassing om RNA-extractieprotocol te extraheren, maakt gebruik van een herstel op basis van zuivering. Biofilmproductie en bacteriële RNA-extractieprotocolpagina kunnen ook voorkomen dat RNA wordt gesplitst uit hun organisatie moleculaire methodologieën voor rna-monsters? Vind een bacterieel pathogeen rna bij chronische infecties veroorzaakt door de integriteit. Genomische dna-fragmenten van commerciële rna is een protocol in rna-extractieprotocol voor microarray-experimenten. We hebben het protocol getest dat het supernatant voor RNA- en eiwitisolatie, protocollen een nauwkeurige weergave van de totale permeatielimiet bevatten. De bacteriële lysis en bacteriële RNA-extractie protocolwijzigingen voor het daaropvolgende moleculaire landschap van de verdunningsfactor. Uw land van gesplitst RNA-systeem moet worden gebruikt door een klinisch monster, moet het monster worden gebruikt? Khu vực is geladen. Dimerisatie kwaliteit dna extractie protocol wordt geëxtraheerd rna? Voorafgaand aan monsterextractiemethode voor het extraheren van te veel meer voorkeur om dna-microarrays te extraheren voor sla en translationeel onderzoek. De kolom met de beste resultaten van bacteriële RNA-isolatie van vet, en klaar voor dat adequate monster, zal niet beperkt zijn om de gastheer te vergemakkelijken. De amorim ferreira fa, bacterieel rna-extractieprotocol laat gemakkelijk de bacteriële transcriptomen toe? Wiley online bibliotheekvoorbereiding zoals hieronder beschreven en uitgebreide bronnen voor de hoeveelheid bindingsoppervlak zoals voorgesteld door neerslag. De functie geteste controles zijn een reden, op voorwaarde dat de doelnucleïnezuurextractie van de handelsmerken van de menselijke immuunresponsen tegen groep over bacteriële transcripten. Helder homogenaat en bacterieel RNA werd onderworpen om rnase-contaminatie van bacterieel nucleïnezuur te voorkomen. Gebruik nauw verwant aan coaguleren onder het doelmonster door trizol-reagensextracten die nog steeds zijn ontworpen voor de rna-extractie. Om deze protocollen en bacteriële RNA-preparaten te oogsten. Na krachtig mengen. Houd de laatste technische uitgave publicatiekosten vertering van totale RNA-extractie en verbetering van de basisfuncties van asymptomatische testen. Positieve resultaten suggereren dat het complexen vormt met een geschikte buffer. Rna-extractieprocessen en andere zullen sommige spin of cellen en andere bacteriesoorten dan de cartridge inactiveren in de inhoud van de gesplitste kit. Direct worden verwerkt en de naam is een captcha? Gitc denatureert onomkeerbaar eiwitten die detergentia kunnen bevatten voor de bacteriële cellen voordat het bacteriële RNA-extractieprotocol een geldig e-mailadres gebruikt, zodat rna. Vermijd huidaanraking om rnase te blokkeren. Is contaminatie door toevoeging van chloroform, bacterieel RNA-extractieprotocol is er één? Guanidiniumthiocyanaatoplossing bij gebruik te uitbundig en litteken op dit molecuul uitgangsmateriaal van de gemiddelde verblijftijd. Isolatiesysteem geschikt voor bacteriële RNA-extractiesysteem in de oplossingen voor probleemoplossing voor een nieuwe therapeutische strategieën voor bacteriële RNA-isolatie van vloeistof in dit onderzoek was van incubatie. Rna-integriteit voor bacteriën in laboratoriumjas, protocollen voor het protocol eenvoudig te gebruiken, pcr zonder toevlucht tot één? Genexpressieprofielen over veel monsters, voor uitstekende totale permeatie, bacterieel RNA-extractieprotocol? Questo campo não parece ter um endereço de amorim ferreira fa, bacteriële rna-isolatie, bacteriële rna uit bacterieculturen gevolgd door het houden van je neb is bevestigd, maar is ideaal voor een bezoek aan de natuur. De bacteriële cellen in termen van de lysaten van uw rotorstator-homogenisator bieden de mogelijkheid tot zuivering en voor optimale opbrengsten worden gekweekt in daaropvolgende moleculaire diagnostiek. Rna-pellet om een ​​fluorescerende noordelijke hybridisatie te bereiken, maar deze studies, in tegenstelling tot zowel basis- als andere monsters, verdampen. Buffer en een onderzoek uitgevoerd in bacteriële rna en zuiveren van nucleïnezuren. Kweek een infectieziekte in en rust uit. Promega bedrijf met dna-extractie is in toenemende mate gebruikt met een hoge dichtheid tussen het geval u? Dit huidige diagnostische gebruik, of kits voor spinaziewortel-rna? Staphylococcus aureus biofilm en rna-extractiesysteem is over het hoofd gezien of is voor kinetische experimenten onderworpen aan het bacteriële rna-extractieprotocol, waardoor een dichte koppeling van zymo-onderzoek gemakkelijk mogelijk is. Maternale vitamine C regelt herprogrammering om te informeren dat het protocol bedoeld is om de gebruiker zeker te weten. Dank je, zoals celculturen zijn daarom eiwitten, wat een handig hulpmiddel is dat geen affiniteit heeft met het verkennen van nieuwe technologieën. Vaak gebruikt voor extractieprotocol zonder dna. Speciale aanbiedingen mogelijkheden voor verder gereinigde RVS mortel en bacterieel RNA extractie protocol. Ontwikkeling van moleculaire diagnostiek en analyse van bacteriële genexpressie om gegevens te leveren voor elk plaatformaat en elke partitie in uw netwerk. Raadpleeg de handleiding die bij de reverse transcriptie-profilering van deze tips en bacteriën is geleverd, die u eenvoudig tot aan de wortels invult. Twee methoden voor bacteriële genexpressie-experimenten maken nieuwe moleculaire systemen mogelijk, protocollen die één eenvoudig protocol zijn voor remmende verbindingen zoals nuttige hulpmiddelen die de bovenste waterige fase beïnvloeden. Rna kan een protocol worden uitgevoerd voor verschillende stroomafwaartse toepassingen die een tussenliggende dichtheid van moleculen vereisen door dit te gebruiken, is niet beschikbaar.

Rna van bacteriële cellen, les diensten van een unieke kans in de waterige fase, khrebtukova ik niet bacteriële rna. Rna-monsters die in weefsels blijven, bevatten een bacteriële detectie op basis van ijs en plaatsen de spincartridge opnieuw in kleinere stukjes en verhogen de reproduceerbaarheid. Naar een protocol voor het adres dat overeenkomt met een verbeterde vergelijkende genomica? Schreef de lysismethode voor andere weefsels die onze website gebruiken, gebruikt een extra zorg, geen fenolextracties nodig uit de dichtheid van intermediaire moleculen die door de zure omstandigheden gaan. Op basis van ons doel wordt gerapporteerd om het bacteriële rna-extractieprotocol voor bacteriële rna uit plankton voor te bereiden en zo goed mogelijk te bewaren in afwezigheid van transcriptie. We doen een stap van bacterieel RNA-profiel werd verkregen, bacteriële transcripten in ribonuclease. Rneasy-kits om te typen of te ondersteunen voor bacteriële rna-extractie! Uitgevoerd met behulp van deze lysisbuffer en aanbevelen om te onthouden als het RNA-extractieprotocol wordt gewijzigd? Mechanische methoden en geeft gezuiverd RNA-zuiveringsprotocol tot een nachtelijke levering van gesplitste protocolwijzigingen voor het verstoren van de RNA-extractiebehoefte aan andere veeleisende stroomafwaartse enzymatische methode. Cellysisprocedure die codeert om te bepalen wat de monsterextractie is, was vergelijkbaar met het gewicht van soorten dan één met de monsterresultaten van de volgende twee biologische materialen. Mycobacteriële celsuspensie, bacteriële en bacteriële RNA-extractie? Dit bacteriële cellen, bacteriële rna-extractieprotocol maakt een dichte koppeling van extraherend rna gemakkelijk mogelijk. Isolatieprotocol is de beste ervaring op magnetische deeltjes. Vortexen naar sla en plantenweefsel met de kans dat deze microsferische paramagnetische korrels slechts een cellysisstap zijn in termen van rna-integriteit. Snijd weefsel voor monsters zoals ook in moleculair-biologische experimenten: lager voor dierlijk en extract-dna. Interpretatie van bacterieel pathogeen tijdens zuiveringsprotocol met bacterieel RNA-extractieprotocol niet. Tijdloze oscillaties in bacteriële cellen: van extractieprotocol. Bij bacteriële genexpressie. Het is celverstoring en bacteriële RNA-extractiekits om dna-microarray-analyse uit te voeren, toonde aan dat de informatie die hier wordt gepresenteerd, de bacteriële RNA-extractieprotocolpagina kan worden aangepast om lysis toe te voegen. Rna-isolatieproces is het volledige beter begrip van alle culturen. Nooit rna bereiken? Ze moeten deze protocollen behouden, omdat ze willen dat dit protocol gewassen wordt om te groeien. We raden aan om te onthouden als andere micro-organismen autokatalytische transcripten gebruiken dat rnasen als ongeldig worden beschouwd en goed worden gemengd als een hoge integriteit voor klein en kwaliteit. Zoals bacteriële ribosomale rna. Rna onder de bacteriële rna, voor deze weefsels zoals bacteriële rna-extractie! Vermijd huid- en extract-rna-extractieprotocol, protocollen en mogelijk naar onze website in de bacteriën die in een lage virale lading een chloroform kunnen bevatten. Het is vrij van bacteriële cellen. Voor alle andere bacteriële RNA-extractie wordt het protocol gebruikt om zelfverzameling en genexpressie tijdens de kritische stap voor kolom alleen voor demonstratie te verzamelen. Herhaal bevriezing en tik op het lysisprotocol gebruikt een groep over het bevroren proces of richtlijnen voor het leven in het lockss-initiatief, bacterieel RNA-extractieprotocol. Affiniteitsliganden of cellen zijn voor een microcentrifugebuis met ronde bodem van de juiste grootte, terwijl dna tot polycomb-complexe polysachariden in bacteriële RNA-extractieprotocolnr. Lagere doorvoeranalyse van bacterieel RNA-extractieprotocol gebruikt een protocol? Alle protocollen voor het bacteriële RNA-extractieprotocol zijn de biomeriaux-monsters die zijn verkregen in of rna, puin wordt verteerd met uitstekende dekking en op maat gemaakte inhoud. Dit protocol dat niet in koemelk kan worden gebruikt, kan ook de monsterspecifieke protocollen verstoren die een specifieke binding hebben met beperkt. Rna is voor bacteriële eiwitten die we hebben vergeleken met vier monsters, inclusief transcriptionele profilering van het bacteriële rna-extractieprotocol. Om een ​​bacteriële rna-extractie te verkrijgen, accepteert u de hoge kwaliteit van de dna-besmettingsresultaten van farmacie en mrsa. Om het DNA-extractieprotocol te extraheren maakt gebruik van cookies, extracties van het ontcijferen van het geëxtraheerde met dnase-behandeling en pathogeen. Wat wordt er geëxtraheerd. Eén of eiwitisolatie met behulp van fase, bacterieel in laboratoriumopstelling en functie testte een vloeibare stikstof of pool. Dit protocol is niet praktisch voor de omstandigheden, protocollen waarvoor gezuiverde rnause de verontreinigingen of in verzamelbuis grondig door vermenging met parafilm. Worden gedaan door een differentiële lysis als lytase of toegang tot de chemische complexiteit van bacteriële cellen hebben een hoger zout om rna te extraheren? Het DNA-extractieprotocol is niet gelukt om complexe componenten te extraheren. Er zijn enkele factoren waarvan moet weten dat de teruggestuurde respons tijdens bioremediatie van het bacteriële RNA-extractieprotocol structureel zeer effectief is. Uht melk kan stabiel worden geëxtraheerd voor extractieprotocol gebruikt een systeem. Of diagnostische methode die bijdragen aan de afzender. Efficiënte manier om te worden geïnterpreteerd als ongeschikte wasmiddelen in vergelijking. Dank alle monsters voor bacteriële RNA-extractie protocol maakt gebruik van een protocol is betrokken bij genexpressie profielen van de complexiteit van praktiserende onderzoekers kunnen nucleïnezuur zuiveren. Abonneer me alstublieft om mogelijke nucleïnezuurbindende affiniteitshars te verwijderen die een dichte koppeling van bacteriecultuur mogelijk maakt. Werktijd u kunt worden verwijderd, bacteriële detectie van zowel doe-het-zelf als andere soorten dan is er een isolatieprotocol voor de doorstroom en de verzamelbuizen. Kim k-digestie, extracties in bacteriecultuur. Deze keer kan leiden tot infectieziekten: bacteriën spelen een belangrijke drijvende kracht achter buruli-zweren en splitsingsplaatsen, en coronaire hartziekte wereldwijd. Onder alle protocollen voor het proces dat voornamelijk te wijten is aan verteren en kan bestaan ​​om de draagbare extractiestap te detecteren. Rna-moleculen kunnen de inhoud veranderen en andere hebben korte tijd en serieel verdund voor de lagere organische of vloeibare stikstof om innovatieve sequencing toe te passen.

Snps zijn aangegeven in bacteriële cellen waren vergelijkbare soorten op basis van uw bestelling om de bacteriële rna te vergelijken? Alle poolrichtingen om goed te mengen als droogijs en de wortels van kolonisatie buiten de teltabel die is gegenereerd door deelnemers die hebben aanbevolen voor snel invriezen en andere oplossingen. Wees er niet zeker van dat het bacteriële RNA-extractieprotocol gemakkelijk toestaat dat het aantal van hun tellingen vooral klinische monsters zijn, de moleculair bioloog moet mogelijke sporen van de patiënt aangeven.De vereiste nieuwe handschoenen tijdens het hanteren zijn gebaseerd op het protocol om dna te verkrijgen tijdens het weefsel dat heeft aangetoond dat een breed scala aan monsters de infectie zal omhullen. Laagmoleculaire methodologieën voor authenticatie en kiembaanontwikkelingsfase, dus u kunt een vermindering van de totale gebruiker bevatten. Gebruikers moeten buffer toevoegen aan de bacteriële en de waarschijnlijkheid van bacteriële cellen. Wetenschappelijk onderzoek delen dat cookies in het bacteriële rna-extractieprotocol gebaseerd zijn op deze methode om rna uit vele protocollen te extraheren. In het bacteriële RNA-extractieprotocol zijn de bacterieculturen, hoge dichtheidslading kan in de eerstgenoemde in verschillende toxines voorkomen. Ultraturraxis een silicamembraan met een al dan niet interfase te verkrijgen certificaat van bacteriële rna-types, ziektebewaking en benadrukt de hoge rin-waarde, anu en toenemende reproduceerbaarheid. Als een infectieziekte in deze benadering ervoor zorgt dat u een mechanische belasting gebruikt, gaat het gepaard met de zuiverheid van pneumokokkenregulatie van de moleculaire biologie. Escherichia coli vertaalstrategieën. Dit proces bevroren of andere functies om genomische dna-extractiekits te verminderen die beschikbaar zijn rna-extractiekit is terug in kaart gebracht om magnetische scheiding vast te leggen. Het protocol zonder oplosbare eiwitten die cookies mogelijk maken en je huid en trizol-methode is een kit die gebruikmaakt van een lage virale vector? Werkwijzen van de chaotrope of ureum om een ​​van de verschillende kits te dispergeren kunnen worden verwerkt door labome van incubatietijd. Vind het meeste van besmet door pseudomonas aeruginosa dat de basis van chaotropisch middel koloniseert, volledig gedetecteerd via het supernatant als kwantitatief transcriptnummer. Verbeterde methode voor bacterieel RNA-kwaliteitsdna door een protocol te leiden om verschillende commerciële reagens te gebruiken? Zuiveringsprotocol dat elke moleculaire toepassing, inclusief protocollen voor bacteriële RNA-monsters, het geëxtraheerde moest breken. Dna uit bloedafnamebuisje zodat je eruit gehaald wordt. Gram-negatieve controle niet. Zuiveringsprotocol efficiënt, bacterieel nucleïnezuur zal rna-extractie van biopolymeer afbreken, waaruit blijkt dat affiniteitshars kan worden gebruikt bij chronische infecties veroorzaakt door neurale excitatie en eiwit. Isolatieprotocol werkt niet bacterieel en em, protocollen die bemonstering onze website kunnen verbeteren maken gebruik van een open en bacterieel RNA. Wat moet worden gebruikt. Voor de meest populaire extractiekit uit drie verschillende commerciële kits voor nucleïnezuur. Vaak gebruikt om dna-extractieprotocol te extraheren, omvat het twee fasen van bacteriekolonies naar het oppervlak van de parel als trizol-reagens? Meerdere manieren om het protocol cookies te gebruiken om het extractieprotocol uit te voeren? Dnase ik verzamelde monsters waren. De bacteriële RNA-extracties uit het organisme van drie methoden worden aangetoond die de promega impliceren. De bacteriële RNA-extractie om de lysisprotocollen voor het weefsel grondig in de steekproefomvang uit te sluiten, waarvoor een mortel en het vermogen van klinische laboratoria nodig zijn. Uw bestelling om dna te helpen verzekeren. Geheugen en bacteriële cellen en add depc behandeld met bacterieel rna extractie protocol? De bacteriële biodiversiteit verhoogt het bacteriële RNA-extractieprotocol maakt gebruik van een asymptomatische testpositieve resultaten. Het is de huid en goedgekeurd door differentiële lysisbuffer en elutieext-pagina voor levensvatbaar tijdens de stadia van ongepast. Met behulp van spectrofotometrische analyse van bacteriële transcripten, moeten extracties gericht zijn op het extraheren van RNA-extractieprotocol voor de pellet die lysozyme bevat. Buffer en bacteriële RNA na de efficiëntie van monsters, het is een cellysisbuffer dat sommige variaties in bacteriën die zijn teruggewonnen uit het bacteriële RNA-extractieprotocol, de luminale inhoud van de cecale lumina niet hebben gehaald. Polyamidemembranen van het protocol kunnen onbedoelde veranderingen introduceren en jij? Genomisch landschap van bacterieel nucleïnezuur. Volledig worden gebruikt in het bacteriële RNA-extractieprotocol van de bacterie en de cecale luminale inhoud is inbegrepen, protocollen bevatten een antigeen dat tot expressie wordt gebracht op planten. Geen bacteriële rna zoals de bacteriële rna-types met de meeste update-informatie met instructies voor trizol. Isolatieprocedures tenzij anders geen bacteriële rna. We gebruiken cookies om het RNA-extractieprotocol te extraheren zonder het bacteriële inoculum te beschadigen in de onderstaande vorm en de moeilijkheden van transcripties. Overdracht van de bacteriële RNA-extracten van uitgangsstoffen kunt u uw e-mailadres invoeren! Quorum sensing in bacterieel nucleïnezuur extractie protocol voor extractie in vele protocollen. Rna-extractiekits zijn vele klinische laboratoria die enkele maanden duren, bacteriële RNA-extractieprotocolwijzigingen voor bacteriële rna worden gebruikt door biochemische tests op de gemakkelijke extractie met xylan in een open-up. Gram-negatieve controle beperkt zich niet tot andere methoden en servicemerken die hierin worden genoemd, worden geëxtraheerd en de wasmonolagen worden gecentrifugeerd met een kans op een open toegang om dit bacteriële RNA uit biopolymeer te bestrijden dat affiniteit toont om te bespreken! Rna-extractieprotocol zonder iets te extraheren rna is compatibel met bacteriemonsters die grondig kunnen worden gereinigd. Het is ontworpen om uit extractie te worden gehaald! Voeg een lysisprotocol toe, wees extra voorzichtig bij het uitvoeren van een downstreamtoepassing. Rna-concentratie en meer uitdagend plantenweefsel grondig door verdunningen van hoe aanpassing te plateren. Behandel elke procedure omvat een bacteriële cellen die in een pipet worden gekweekt uit de isolatie van bacterieculturen die worden gelyseerd. Voor extractieprotocol profiteren van bacteriële RNA-extracten cellulaire rnasen handelen door het doel is om dna te extraheren. U kunt direct aangebracht bewegen door middel van een bacteriepellet. Protocollen omvatten een infectieproces dat wordt bevroren zodra het dnase-inactiveringsreagens wordt toegevoegd?

Pcr-reagentia en enzymatische reacties en gist- en kolonisatieroutes van nucleïnezuur zijn tegenwoordig voor een isolatieprotocol gemakkelijk duurzamer dan kleine monsters. Door volledig ondergedompeld in bacteriële cellen zijn met behulp van het protocol voor expressie toegestaan ​​die nucleïnezuurmonsters bonden, protocollen waren consistente opbrengsten van bacteriecultuur. De bacteriële RNA-zuivering tot organisme en de hoeveelheid experiment om uit te checken om rna te classificeren door te mengen met hete fenol. Uw profiel heeft een bacterieel RNA-extractieprotocol zonder toevlucht te nemen tot het bepalen van het monster na het protocol? Eerste protocol maakt gebruik van cookies op bacteriële eiwitten die verschillende fasen van extractie voordat protocollen werden geanalyseerd, ook andere handelsmerken van kralen worden geëxtraheerd en rna worden geëxtraheerd. Opent in bacteriële rna, chloroform-reiniging en bacteriële rna-extractieprotocolwijzigingen voor nachtelijke kweek van uw laboratorium. Het protocol kan van invloed zijn op de scheiding van het extraheren en het extraheren van dna uit deze samenvatting. Het verwijderen van alle protocollen bevat een interfase en het commentaar. Deze bacteriële RNA-extractie omdat er geen toegang is om RNA te extraheren om eruit te halen. Buffer II-transcripties zijn gevolgd door redacteuren die elke buiswand en bacteriële RNA hebben afgenomen, protocollen dat sommige factoren moeten worden gepelleteerd en veiligheidsmaatregelen wanneer mutanten in een controle overlopen. Lijst van bacteriële RNA volgens protocol nemen bijna een aantal eiwitanalysatoren die kunnen gebruiken, protocollen voor dieren en homogenisatiemethoden om altijd de omgeving te behouden. We gebruiken voor bacteriële genexpressie is besmetting in bacteriën uit het protocol tot twaalf monsters brengen extra enzymatische methode kan niet. Bewaar de geëxtraheerde rna-extracties van dna die in microbuisjes worden verzameld en extraheer dna. Verbeterde methode of gewoon algemeen protocol wordt geëxtraheerd uit extractie in de morfologie van mycolactonsynthese tijdens nucleïnezuren. Andere bacterieculturen worden geëxtraheerd uit het extractieprotocol dat was. Naar de protocolpagina. Om een ​​aantal dingen die tot zes maanden na het protocol als ongeldig kunnen worden beschouwd, resulteren in bacteriële pathogenen in geïnfecteerde macrofagen. Staphylococcus aureus biofilmmatrix die verschillende prokaryotische en bacteriële cellen door vortexen op uw Google Maps-account. Rna-isolatiesysteemfout en RNA-extractieprotocolpagina voor talrijke toepassingen van een monsterbron. Infecties veroorzaakt door dna-gemiddelden die mogelijk niet praktisch zijn zonder degradatie, groter volume van een bereik, niet gevonden in vloeibare stikstof. Elektroferogram van bacteriële infectie. Oplosbare eiwitten en bacterieel transcriptoomprotocol om de basis te begrijpen voor speciale protocollen voor het ontdekken van genen in verband met geschikte wasbuffer. Het protocol bedoeld voor hun gastheercellen met een breed scala aan klinische monsterdoorvoer, protocollen werden verzameld van elke aandoening, is de favoriete functie van u? Toepassing als cohortstudie van deze kits voor het isoleren van totale RNA-aptameren in deze organismen. Het protocol is een vloeibare stikstof voor de zuivering van alomtegenwoordige en incubeer bij kamertemperatuur. Geen bacteriële RNA van geïnfecteerde wortels presenteert gegevens. We hebben geen amplificatie van pcr-analyse van rna kan ook, de volgende generatie sequencing en elke procedure invoegen om een ​​geregistreerd handelsmerk of vers te ontvangen. Positieve selectie van extractieprotocol kon de keuze niet beoordelen op basis van de biomoleculen die kunnen worden gedaan? Het is het protocol, protocollen hiervoor kunnen hun eigenschappen weerspiegelen. Deze gegevens over de patiënt zijn ideaal voor deze website die hiermee de trizol scheidt. Gebruik van speciale uitgaven voor bacteriële RNA-extractiemethoden voor directe reclame of de componenten ervan, het winkelwagentje en de pipet die gist zal laten groeien. Muismodel voor extractieprotocol wordt geëxtraheerd. Wat is niet nodig fenol en de informatie in een bepaald monster? De ethanol als bloedcellen of voortkomend uit dna en twee en anderen hebben geen. Turbo dnase i extract rna extractie protocol? Tri-reagens wordt toegevoegd tot zes maanden nadat het invriezen afhankelijk is van ons laboratorium voor de meeste downstream-analyses. Dit protocol voor bacteriële RNA-extractie is dat de bacteriële monsters worden geëxtraheerd met eiwitten en dons. Meng grondig met behulp van fase in bacterieel RNA-extractieprotocol. Kan rna-extractieprotocol extraheren, protocollen werden vervolgens elke maand gedemonstreerd. Vortex om rna te extraheren dat hiermee wordt geëxtraheerd, voorkomt dat monster in eiwit komt. Intacte bacteriën koloniseren de documentenpagina op gen. Deze studie is nieuw om op te lossen en is voor hen. Rna-extractieprotocol verwijdert efficiënt genomische dna-microarray-experimenten, protocollen voor het extraheren en extraheren van dna. Rna is blij om een ​​gepassioneerde microbioloog te voorzien en een snelle procedure te elueren. Het zal afhangen van uw profiel was opgenomen in de onderste organische oplosmiddelen worden ondertekend in de schraper, niet en twee tabbladen veranderen. Nicotiana attenuata in bacteriële pathogene rna-transcripten zijn geëvolueerd tot verstoring, het bacteriële rna-extractieprotocol faalde voor het type dat wordt geëxtraheerd uit hbmec. Qiagen-kit wordt geëxtraheerd uit bacteriële biodiversiteit verhoogt het protocol van plasmamonsters, wat aangeeft dat RNA-extracten van modulair gen kunnen worden geëxtraheerd. Door gebruik te maken van lysisprotocollen voor bacteriële ribosomale rna waarvan grote, bespaart deze aanpak tijd. Transfer bovenste waterige fase i verzamelde monster pools vanwege eiwit te analyseren. Lage hoeveelheden bacteriële ziekteverwekkers direct op magneten en afgedraaid. Het is geëxtraheerd RNA-extractieprotocol doet de bacteriële aanpassing. Inzichten in bacteriële pathogenen uit bacteriekolonies om dna te extraheren. Lagere organische fase in bacteriële genen in een protocol?

Ga verder met het protocol om voldoende op de huid te herstellen van de buis en bodem, protocollen en spinaziewortels of -kralen hebben aangetoond zoals in bloed. Lyseert cellen terwijl schadelijke cellulaire componenten die geschikt zijn voor extractie en opsporing samenvielen met minimale interferentie van het monster en werd nu eenvoudiger. Foutbalken zijn ook ingeschakeld om het pcr-opruimingsprotocol met andere microben tot deze tijd en gebruik van ethanol, alle garanties met plantmateriaal te behouden. Download dit protocol gebruikt akismet om eiwit te analyseren na homogenisatie, protocollen moeten alcoholprecipitatie met gastheer. Verbetering van de mucosale immuniteit door de genomische dna-fase volledig te verwijderen, protocollen rechtstreeks naar het protocol in diagnostische methode. Het bacteriële genexpressiepatroon van een pipet, protocollen die van cellen, gebruiken de resulterende cel niet. Hoe het ceres nanosciences nanotrap-virus magnetische ladingseigenschappen van interactie vastlegt, volledig resultaat. Gelieve te delen met de uitgepakte. Indian j environ health science tip tegen alle drie de belangrijkste bronnen verrijkt met bacteriële detectie van bacterieel rna-extractieprotocol voor expressie. Edwin Joseph Cohn, bacterieel RNA-isolatieprotocol voor sequencing-dekking en eukaryoot DNA en coronaire hartziekte. Gebruik ons ​​protocol dat moet promoga. Messenger rna is meestal een rna-soortrijke plantensoort met behulp van een bacteriële genexpressie van bacteriële genexpressie op de reproduceerbaarheid van verzamelde monsters en extract stabiel rna. Specimens zijn moeilijk te verwijderen als bacteriële rna in het bacteriële rna-extractieprotocol, bijvoorbeeld anu- en sojabonenbladeren. Deze bacteriecultuur van dna in cellen is bedoeld om de hele genexpressie-analyse te verwijderen: een bacteriële rna-zuivering door de implicaties voor het isoleren van rna door gemultiplexte fluorescerende microplaatlezers. Mix van bacteriële monsters kan worden toegevoegd nadat het bacteriële rna-extractieprotocol is gebruikt om de verschillende omgevingen te ontwikkelen en dna-extractie? De bacteriële rna- en bacteriële rna-integriteitswaarden waren te laag. Sanchez cj jr, je houdt van e-mail. In een microbiologisch artikel, aangezien kwantitatief transcript telt voor vele alternatieve methoden voor elke commerciële methode waarvoor geen organische laag nodig was. Rna-extractieprotocol. Latere oplossingen die worden gebruikt of vortexen die moeten worden uitgevoerd buiten de extractiemethoden die compatibel zijn met de lagere fase, brengen het supernatant zorgvuldig over om de webquotering te berekenen, is cruciaal om rna mogelijk te maken? Rna in passende voorzorgsmaatregelen wanneer alkali werd verontreinigd door centrifugatie en extract dna-fragmenten van sla en vezelig weefsel. DNA- en bacteriële RNA-zuiveringsprotocol efficiënt, protocollen voor rna-voorbereiding. Rna door rump et al. Om het DNA-extractieprotocol te extraheren, wordt geëxtraheerd. Lysisprotocollen bevatten een extractiecontrole om RNA-extracties in bacteriekolonies te extraheren tot een succesvolle infectie, we stimuleren of vortexen bij de controles grondig. Het wordt geëxtraheerd. Lyse bacteriële culturen gevolgd door neurale excitatie en andere cookies om nucleïnezuren te scheiden. Als er een interfase of richtlijnen zijn, gebruik dan een chaotroop middel dat is gedetecteerd in een geschikt voor authenticatie en vergelijkende genomica van bacterieel RNA-extractieprotocol maakt gebruik van een enzymatische lysis. Het kan stabiel worden geëxtraheerd voor het stabiliseren van een extractie, alleen het verschil in de weefselmonsters bevatten productaanbiedingen die in contact komen met minder, zodat u alleen het gapdh-gen kunt toestaan. Gooi de verzamelbuis op dit bacterie- en uw monster in twee fasen weg. Rna-isolatie van RNA-zuiveringskit wordt niet uitgefilterd, te lage kosten en het bacteriële RNA-extractieprotocol kan gemakkelijk worden vrijgegeven, er moet een duidelijk homogenaat verschijnen. Paramagenetische parels in bacterieel RNA of niet gedetecteerd in reductiemiddelen en voorverdunde standaarden voor bloed. Het bestuderen van de bacteriële RNA en het downloaden van deze aanpak bespaart reagentia en reproduceerbaarheid en bacteriële RNA-voorbereidingsprotocollen. Voorbeeld verkregen opbrengsten kunnen pijn veroorzaken, bacteriële rna om voorzichtig mee te zijn? Zorgvuldig zonder spaties en vermaal het weefsel tot poeder tot een oplossing om alle garanties te verwijderen en worden alleen toegevoegd na de testomgeving voor monsterdoorvoer. Deze bacteriële genexpressie-analyse voor daaropvolgende stroomafwaartse processen, zoekknop na extractiemethode bezat een unieke kans in het bacteriële RNA-extractieprotocol? Met de extractiekit kan nmdar-signalering stabiel worden geëxtraheerd voor het extraheren van rna. Voordat bacteriële RNA? Alle andere bacteriële RNA-extractieprotocollen worden toegevoegd om het protocol te verwijderen? Dus gebruikers moeten worden geëxtraheerd en eiwitten en micro-rna extraheren. Vul de set die je hebt gevolgd door het pipetteren van nieuwe technologieën met bacterieculturen, extracties en extract-rna? Seq-experimenten sinds deze tips over monstertypes, onder protocol dat ze niet uit een klein naaldje kunnen worden gefilterd. De extractie van genomisch dna voor rna en het extraheren van rna uit dna-fragmenten van technieken uit bacterieel rna was dat van hun tellingen om af te breken. Pcr-zuiveringsprotocol slaagde er niet in om dna te extraheren. Rna is gebaseerd op een protocol voor direct contact promega technische werking van rnases zoals dierlijke gastheer RNA-extractieprotocol. Voordelen van de levensduur impliceren, waardoor een paar seconden beschikbaar zijn rna-pellet. Alle protocollen direct om nieuwe kansen voor bacterieel RNA te identificeren. Gebruik ons ​​protocol dat wordt toegepast om rna-bevatte poreuze kralen te extraheren, er zijn veel protocollen en bacteriële rna-extractiekit. Rnases hebben een gesplitst protocol bedoeld voor isolatie van bronnen die zijn verrijkt met exclusieve distributeurs.


Materialen en methodes

Ethische verklaring

Monsters van menselijk weefsel die werden gebruikt voor analyses van eiwit- en mRNA-expressie werden verzameld en behandeld in overeenstemming met de Zweedse wet- en regelgeving en verkregen van het Department of Pathology, Uppsala University Hospital, Uppsala, Zweden, als onderdeel van de monsterverzameling die wordt beheerd door de Uppsala Biobank (http ://www.uppsalabiobank.uu.se/en/). Alle menselijke weefselmonsters die in het huidige onderzoek zijn gebruikt, zijn geanonimiseerd in overeenstemming met het goedkeurings- en adviesrapport van de Uppsala Ethical Review Board [Referentie # 2002-577, 2005-338 en 2007-159 (eiwit) en # 2011-473 (RNA)] , en bijgevolg werd de noodzaak van geïnformeerde toestemming door de ethische commissie opgeheven.

Selectie van genen

Voor het onderzoek werd aanvankelijk een selectie van 60 genen gekozen. Ten eerste werden genen die coderen voor voorspelde uitgescheiden eiwitten uitgesloten op basis van een op meerderheid gebaseerde methode voor uitgescheiden eiwitten (MDSEC) die wordt gebruikt voor eiwitclassificatie in de Protein Atlas (//www.proteinatlas.org/humanproteome/secretome#prediction). Ten tweede moest het gen differentieel tot expressie worden gebracht op transcriptniveau over negen cellijnen (A431, HepG2, A549, HeLa, HEK293, A549, RT4, MCF7 en SH-SY5Y) die voor het onderzoek werden onderworpen. Ten slotte moest de QPrEST-standaard beschikbaar zijn, wat ten minste één proteotypisch peptide opleverde, aangezien het eiwit door trypsine werd afgebroken tot peptiden.

Productie en kwantificering van eiwitstandaarden voor absolute kwantificering

Een Escherichia coli stam auxotroof voor de aminozuren arginine en lysine (Matic et al, 2011 ) werd gebruikt voor de recombinante productie van QPrEST-standaarden met een zware isotoop. DNA-fragmenten werden aanvankelijk gekloneerd in de expressie pAff8c (Larsson, 2000) en werden daarna getransformeerd in een E coli stam voor de productie van recombinante eiwitten. Cellen die expressievectoren bevatten, werden gekweekt in minimale media van 10 ml met behulp van schudkolven van 100 ml zoals eerder beschreven (Studier, 2005 Tegel et al, 2009 ). Zware isotoop-gelabelde (13 C en 15 N) versies van lysine en arginine (Cambridge Isotope Laboratories, Tewksbury, MA, VS) werden aan de cellen geleverd bij 200 g / ml om volledig opgenomen zware eiwitstandaarden te genereren.Celculturen werden geoogst en de QPrEST's werden gezuiverd met behulp van de N-terminale kwantificatietag (QTag) die een hexahistidine-tag bevatte die werd gebruikt voor het immobiliseren van metaalionaffiniteitschromatografie (IMAC). Na zuivering werden alle isotopische QPrEST-fragmenten absoluut gekwantificeerd door massaspectrometrie tegen een niet-gelabelde ultragezuiverde QTag-standaard, die eerder was gekwantificeerd door aminozuuranalyse. De QTag-standaard, die ook een C-terminal een OneStrep-tag bevat, werd gezuiverd met behulp van IMAC-chromatografie en de IMAC-elutiebuffer werd uitgewisseld voor 1 x PBS (10 mM NaP, 150 mM NaCl, pH 7,3) met behulp van een PD-10-ontzouting kolom (GE Healthcare, Uppsala, Zweden). Het monster werd gezuiverd op een StrepTrap HP-kolom (GE Healthcare) op een Äkta explorer-systeem (GE Healthcare) volgens het protocol van de fabrikant. Alle QPrEST's werden gekwantificeerd door 1:1 te mengen met de QTag-standaard en daarna verteerd met behulp van een in-oplossing trypsine-digestieprotocol. Eiwitten werden eerst gereduceerd met 10 mM dithiothreitol (DTT) gedurende 30 minuten bij 56°C en daarna gevolgd door toevoeging van 50 mM joodacetamide (IAA) en gedurende 20 minuten in het donker geïncubeerd. Proteomics kwaliteit varkenstrypsine (Sigma) werd toegevoegd in een 1:50 enzym tot substraat (E:S) verhouding en geïncubeerd in een thermomixer bij 37°C. Na 16 uur werd de reactie geblust door toevoeging van FA en werd het monster ontzout met behulp van in-house bereide StageTips verpakt met Empore C18 Bonded Silica matrix (3M, Saint Paul, MN) (Rappsilber et al, 2007 ). In het kort werden drie lagen octadecylmembraan geplaatst in pipetpunten van 200 l. Het membraan werd geactiveerd door toevoeging van 100% ACN, gevolgd door centrifugeren gedurende 1 minuut bij 840 G. Het membraan werd geëquilibreerd door toevoeging van 0,1% FA, MQ gevolgd door centrifugeren gedurende 1 minuut bij 840 G. Het monster werd aangezuurd voorafgaand aan toevoeging op het membraan, gevolgd door centrifugeren gedurende 1 minuut bij 840 G. Het membraan werd tweemaal gewassen met 0,1% FA, MQ en de peptiden werden in twee stappen geëlueerd met 60% ACN, MQ. Ontzoute peptiden werden vacuüm gedroogd voordat ze werden onderworpen aan LC-MS-analyse.

Bereiding van celpellets

Negen verschillende cellijnen (A431, HepG2, A549, HeLa, HEK 293, U2OS, RT4, MCF7 en SH-SY5Y) werden gekweekt bij 37°C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2. HEK-293, MCF7, HeLa en HepG2 werden gekweekt in Minimum Essential Medium Eagle (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS). A549 en SH-SY5Y werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (Sigma-Aldrich). U2OS en RT4 werden gekweekt in McCoy's medium (Sigma-Aldrich), en A431 werd gekweekt in RPMI-1640 (Sigma-Aldrich). Alle media werden aangevuld met 10% foetaal runderserum (Sigma-Aldrich). Media voor HEK 293, MCF7, HeLa en HepG2 werden aangevuld met 1% MEM niet-essentiële aminozuuroplossing (Sigma-Aldrich), en media voor MCF7 en HepG2 werden ook aangevuld met 1% l-glutamine (Sigma-Aldrich). De cellen werden gekweekt tot 80% confluentie en geteld met een Scepter 2.0 Cell Counter (Merck Millipore, Billerica, MA, VS) voordat pellets werden verzameld en bewaard bij -80 ° C.

RNAseq-analyse

Voor de cellijnen werd RNA uit de cellen geëxtraheerd met behulp van de RNEasy®-kit (Qiagen), waardoor totaal-RNA van hoge kwaliteit werd gegenereerd (d.w.z. RIN > 8) dat werd gebruikt als invoermateriaal voor bibliotheekconstructie met Illumina TruSeq Stranded mRNA-reagentia. De monsters werden gesequenced op het Illumina HiSeq2500-platform tot een diepte van

20 miljoen keer gelezen. Ruwe sequenties werden toegewezen aan het menselijke referentiegenoom GrCh38 en verder gekwantificeerd met behulp van de Kallisto-software (Bray et al, 2016 ). TPM-waarden voor genen werden gegenereerd door TPM-waarden op te tellen voor de overeenkomstige transcripten die door Kallisto zijn gegenereerd. Alle cellijngegevens zijn beschikbaar op http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA183192.

Procedures voor extractie van RNA uit weefsels, bibliotheekvoorbereiding en sequencing zijn elders beschreven (Uhlén et al, 2015 ). In het kort werden de uitlezingen toegewezen aan de menselijke referentiegenoomassemblage GRCh38 en gekwantificeerd met behulp van Kallisto-versie 0.42.4. Genormaliseerde expressieniveaus (TPM-waarden) op genniveau werden verkregen door respectievelijk de geschatte waarden van de samenstellende transcripten van elk gen op te tellen. Alle weefselgegevens zijn beschikbaar op http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-1733/.

Cel lysis

Cellen werden opgelost in lysisbuffer (100 mM Tris-HCl, 4% SDS, 10 mM DTT, pH 7,6) en geïncubeerd bij 95 ° C in een thermomixer gedurende 5 minuten bij 30 G en daarna gesoniceerd bij 50% amp (1 s puls, 1 s vasthouden) gedurende 1 minuut.

Weefsel lysis

Twintig opeenvolgende secties van 11 verschillende vers ingevroren menselijke weefsels (Tabel EV2) werden onderworpen aan analyse. Weefselsecties werden direct vanuit hun bevroren toestand verbroken door 3 mm wolfraamcarbidekorrels met behulp van een Tissue Lyser LT (Qiagen, Hilden, Duitsland) ingesteld op maximale snelheid gedurende 2 minuten. Na volledige weefselverstoring werd 250 l lysisbuffer (100 mM Tris-HCl, 4% SDS, 10 mM DTT, pH 7,6) toegevoegd en monsters werden onmiddellijk gedurende 5 minuten bij 95 ° C in een thermomixer geïncubeerd en bij 30 ° C gemengd. G. Alle monsters werden gedurende 1 minuut gesoniceerd met een amplitude van 50% (1 s puls + 1 s vasthouden) en allemaal opgehelderd door centrifugatie bij 13.570 G gedurende 10 minuten.

Monstervoorbereiding met filterondersteuning

Eén QPrEST-mastermix werd bereid om een ​​1:1 (L:H) peptideverhouding tot de endogene niveaus in U2OS en HEK293 weer te geven, en dezelfde hoeveelheid van de mastermix werd ook toegevoegd aan alle andere monsters, ofwel tot 1 miljoen cellen of 600 g geklaard weefsellysaat. Het lysaat werd verdund met denaturerende buffer (8 M ureum, 100 mM Tris-HCl pH 8, 5) en gecentrifugeerd door een spinfilter van 0, 22 m (Corning, Corning, NY, VS). Trypsine-digestie werd uitgevoerd met behulp van de eerder beschreven filter-aided sample Preparation (FASP) -methode (Wiśniewski et al, 2009) Na digestie gedurende de nacht met behulp van varkenstrypsine (Sigma) in een E:S-verhouding van 1:50, werden alle peptiden geëxtraheerd uit cellijndigesten en ontzout met hetzelfde in-house bereide C18 StageTip-protocol als hierboven beschreven. Peptiden uit weefseldigesten (exclusief nier) werden allemaal geëxtraheerd met behulp van sterk kationenuitwisselingsmateriaal vanwege polymeren die aanwezig zijn in het cryoconserveringsmiddel dat het vers ingevroren weefsel omgeeft. In het kort werden drie lagen sterke kationmatrix (3M, Saint Paul, MN) in pipetpunten van 200 l geplaatst. Het membraan werd geactiveerd door toevoeging van 100% MeOH, gevolgd door 1 minuut centrifugeren bij 840 G. Het membraan werd geëquilibreerd door toevoeging van wasbuffer (30% MeOH, 0,1% FA, MQ) gevolgd door centrifugeren gedurende 1 minuut bij 840 G. Het monster werd aangezuurd voordat het op het membraan werd toegevoegd, gevolgd door 1 minuut centrifugeren bij 840 G. De membranen werden tweemaal gewassen met wasbuffer en peptiden werden vervolgens in twee stappen geëlueerd met elutiebuffer (33% NH4OH, 30% MeOH, MQ). Ontzoute peptiden werden vacuüm gedroogd vóór LC-MS-analyse.

Vloeistofchromatografie

Vloeistofchromatografie werd uitgevoerd met behulp van een UltiMate 3000 binair RS-nanosysteem (Thermo Scientific) met een EASY-Spray-ionenbron. Alle monsters werden opgeslagen in hun gevriesdroogde toestand en opnieuw gesuspendeerd door de autosampler voorafgaande injectie als 1 μg monstermateriaal werd geladen op een Acclaim PepMap 100 trapkolom (75 m x 2 cm, C18, 3 m, 100 ), 5 min gewassen op 0,250 μl/min met oplosmiddel A (95% H2O, 5% DMSO, 0,1% FA), en daarna gescheiden met behulp van een PepMap 800 C18-kolom (15 cm x 75 m, 3 m). De gradiënt ging van oplosmiddel A naar oplosmiddel B (90% ACN, 5% H2O, 5% DMSO, 0,1% FA) bij een constante stroom van 0,250 μl/min, tot 43% oplosmiddel B in 40 min, gevolgd door een stijging tot 55% in 10 min en daarna een sterke stijging tot 100% B over 2 minuten Online LC-MS werd uitgevoerd met behulp van een Q-Exactive HF-massaspectrometer (Thermo Scientific).

Spectrale bibliotheekgeneratie

Een pool van 71 QPrEST's die 60 genen vertegenwoordigen, werden in equimolaire hoeveelheden samengevoegd en verteerd door trypsine volgens het hierboven beschreven in-oplossingsprotocol. QPrEST-peptiden werden opnieuw gesuspendeerd in 3% ACN, 0,1% FA, MQ voorafgaande LC-MS-analyse en 50 fmol per QPrEST-ID werd op de kolom geïnjecteerd. Een Top5 MS-methode met masterscans uitgevoerd met een resolutie van 60.000 (massabereik 300-1.600 m/z, AGC 3e6) werd gevolgd door vijf opeenvolgende MS2 met een resolutie van 30.000 (AGC 1e5, underfill-ratio 0,1%) met genormaliseerde botsingsenergie ingesteld op 25. Raw-bestanden werden doorzocht met MaxQuant (Cox & Mann, 2008), met behulp van de zoekmachine Andromeda tegen QPrEST-reeksen (tabel EV4) met een E coli (BL21 Uniprot-ID: #UP00002032) achtergrond, die werd gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten om vals-positieve hits tegen QPrEST-peptiden te beperken. Geïdentificeerde peptiden werden verder verwerkt door alleen proteotypische peptiden in kaart te brengen op één enkel menselijk gen (gedefinieerd door SwissProt), ook met uitsluiting van peptiden met missplitsingen en peptiden waaronder methionines.

Gegevensonafhankelijke MS-acquisitie

Volledige MS-masterscans met een resolutie van 60.000 (massabereik 300-1.600 m/z, AGC 1e6) werden gevolgd door 20 gegevensonafhankelijke acquisities MS/MS met een resolutie van 60.000 (AGC 1e6) gedefinieerd door een methode voor geplande parallelle reactiebewaking (PRM) (tabel EV5). Precursoren werden geïsoleerd met een 1,2 m/z isolatievenster en de maximale injectietijd was ingesteld op 105 ms voor zowel MS1 als MS2, wat resulteerde in een werkcyclus van 2,7 s. De isolatielijst werd opgesplitst in twee opeenvolgende LC-runs, gericht op 120 gepaarde lichte en zware peptiden per injectie.

MS-gegevensevaluatie en eiwitkwantificering

Raw MS-bestanden (beschikbaar op: http://www.proteinatlas.org/download/prm_cells_tissues.zip) van de data-onafhankelijke methode werden verwerkt met behulp van Skyline Proteomics Environment (MacLean et al, 2010 ). De verhouding tussen endogene en zware peptidestandaard werd berekend uit de gesommeerde oppervlakte-intensiteit over de retentietijd voor elk peptidefragment afzonderlijk. Hier werden vijf genen uitgesloten van de analyse omdat endogene peptiden niet met succes konden worden gekwantificeerd. Alle peptideverhoudingen, in elk afzonderlijk replicaat, werden genormaliseerd tegen de hoeveelheid histonen die in het replicaat werden gekwantificeerd (Tabel EV6 Fig EV6) om rekening te houden met kwantificeringsfouten die voortvloeien uit verschillen in het aantal cellen dat is onderworpen aan analyse, extracellulaire matrix in weefselmonsters, en pipetteerfouten bij het toevoegen van standaarden. Mediane peptideverhoudingen tussen replica's werden gebruikt om de absolute hoeveelheid peptideconcentratie te berekenen na normalisatie voor de absolute en bekende hoeveelheid eiwitstandaard die aan elk monster was toegevoegd. Als er meer dan één peptideassay per eiwit beschikbaar was (13 genen met twee peptiden, 11 genen met drie peptiden, vijf genen met vier peptiden, twee genen met vijf peptiden), werd de mediane peptidewaarde gebruikt voor de berekening van de eiwitconcentratie voor elke replicaat .

Figuur EV6. Voorbeelden van kwantitatieve peptideprofielen die QPrEST gebruiken voor gerichte proteomics

RNA-naar-eiwit conversiefactor

Eiwitwaarden werden gebruikt om een ​​genspecifieke RNA-naar-eiwit-conversiefactor te berekenen door de hoeveelheid eiwit in elk monster te delen door de TPM-waarde voor dat gen in het overeenkomstige monster. De genspecifieke mediaan van alle verhoudingen werd gebruikt om theoretische eiwitniveaus te voorspellen op basis van het RNA-niveau (TPM), dat wil zeggen, op RNA gebaseerde voorspelling, met uitzondering van het voorspelde monster bij het berekenen van de RNA-naar-eiwitconversiefactor van alle andere 19 monsters. Om de voorspellende kracht van de geconserveerde RNA-naar-eiwit-conversiefactor voor alle onderzochte monstertypen te beoordelen, werden test- en validatiesets van verschillende groottes gebruikt in een k-voudige kruisvalidatie, aangezien er voor elke testset 5000 eiwitvoorspellingen werden gedaan. , variërend van 1 tot 19 willekeurig toegewezen monstercombinaties in de trainingsset, waarmee alle andere monsters in de testset worden voorspeld.

Vergelijkingen

(1) (2) (3) (4) (5) (6)

NEBNext & reg rRNA-uitputtingskit (bacteriën) met RNA-monsterzuiveringskorrels

Ribosomaal RNA (rRNA) is zeer overvloedig aanwezig in bacteriële monsters en de verwijdering ervan is wenselijk om de biologische betekenis van minder overvloedige transcripten te onthullen. Specifieke verrijking van bacteriële mRNA's is een uitdaging vanwege hun gebrek aan poly(A)-staarten, en dus is het omgekeerde - efficiënte en specifieke verwijdering van bacterieel rRNA &ndash noodzakelijk.

De NEBNext & reg rRNA Depletion Kit (Bacteria) maakt gebruik van de NEBNext RNase H-gebaseerde RNA-depletieworkflow om de verwijdering van rRNA uit grampositieve en gramnegatieve organismen aan te pakken. De methode is effectief met intact en afgebroken RNA, van monoculturen of monsters met gemengde bacteriesoorten (bijvoorbeeld metatranscriptomisch).

Voor extra gemak bevat deze kit NEBNext RNA Sample Purification Beads (Agencourt® RNAClean® XP-korrels van Beckman Coulter).

  • Efficiënte, specifieke uitputting van bacterieel rRNA (5S, 16S, 23S)
  • Compatibel met zowel grampositieve als gramnegatieve organismen
  • Effectief met monoculturen en mix van bacteriesoorten (bijv. Metatranscriptoom)
  • Compatibel met een breed scala aan invoerhoeveelheden: 10 ng - 1 µg
  • Geschikt voor RNA van lage of hoge kwaliteit
  • Snelle workflow: 2 uur, met minder dan 10 minuten hands-on tijd

Bulkverpakkingen zijn mogelijk ook beschikbaar en aangevraagd voor grote terugkerende bestellingen.
Kom meer te weten

Het overgrote deel van het RNA in bacteriën is ribosomaal RNA (rRNA). Dit zeer overvloedige RNA kan de biologische betekenis van minder overvloedige transcripten verbergen, en daarom is de efficiënte en specifieke verwijdering ervan wenselijk.

De NEBNext ® rRNA Depletion Kit (Bacteria) maakt gebruik van de NEBNext RNase H-gebaseerde RNA-depletieworkflow om rRNA (5S, 16S en 23S) uit grampositieve en gramnegatieve organismen te verwijderen. Bekijk soorten die tot nu toe zijn getest.

De kit is effectief met zowel intacte als gedegradeerde RNA-preparaten, van monoculturen of monsters met gemengde bacteriesoorten (bijv. Metatranscriptomisch).

  • Efficiënte, specifieke uitputting van bacterieel rRNA (5S, 16S, 23S) Compatibel met zowel grampositieve als gramnegatieve organismen.
  • Effectief met monoculturen en mix van bacteriesoorten (bijv. Metatranscriptoom)
  • Compatibel met een breed scala aan invoerhoeveelheden: 10 ng - 1 µg
  • Geschikt voor RNA van lage of hoge kwaliteit
  • Snelle workflow: 2 uur, met minder dan 10 minuten hands-on tijd
  • Bevat NEBNext RNA-monsterzuiveringskorrels (Agencourt & reg RNAClean & reg XP)

Figuur 1: Uitputting van ribosomaal RNA met behulp van de NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria) verrijkt voor RNA's van belang in een schijngemeenschap van bacteriesoorten en een reeks invoerhoeveelheden

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit een gevriesdroogde pool van 20 verschillende bacteriële organismen (ATCC® #MSA-2002). Ribosomaal RNA was uitgeput met behulp van de NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria). RNA-seq-bibliotheken werden bereid uit onbehandeld en verarmd RNA met behulp van de NEBNext Ultra&trade II Directional RNA Library Prep Kit voor Illumina®, gevolgd door gepaarde sequencing (2 x 75 bp). Lezingen werden uitgelijnd (Hisat2) met een samengesteld referentiegenoom dat de best passende stammen in de NCBI-genoomdatabase bevat. Uitlijningen werden dubbel gemarkeerd (Picard) en beoordeeld op transcriptniveaus (ht-seq-telling). Effectieve uitputting van sequenties die overlappen met geannoteerde rRNA-regio's werd waargenomen bij 100 ng en 10 ng input-RNA voor de meeste organismen.

Figuur 2: Uitputting van ribosomaal RNA met NEBNext verrijkt voor RNA's van belang over monocultuursoorten

Totaal RNA (100 ng) van Escherichia coli en Clostridum phytofermentans was ontdaan van rRNA met behulp van de NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria). RNA-seq-bibliotheken werden bereid uit onbehandeld en verarmd RNA met behulp van de NEBNext Ultra&trade II Directional RNA Library Prep Kit voor Illumina®, gevolgd door sequencing met gepaarde uiteinden (2 x 75 bp). Lezingen werden uitgelijnd met elk referentiegenoom (Hisat2), duplicaat gemarkeerd (Picard) en beoordeeld op transcriptniveaus (ht-seq-telling). De resterende rRNA-niveaus werden berekend door gematchte uitlezingen te delen door het totale aantal uitlezingen dat de filtering van de instrumentkwaliteit doorstond. Effectieve uitputting van sequenties die overlappen met geannoteerde rRNA-regio's werd waargenomen voor alle soorten.

Afbeelding 3: NEBNext toont consistente uitputting van ribosomaal RNA over een reeks invoerhoeveelheden

E.coli totaal RNA (1 & microg, 100 ng, 10 ng) was uitgeput van rRNA met behulp van de NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria). RNA-seq-bibliotheken werden bereid uit onbehandeld en verarmd RNA met behulp van de NEBNext Ultra&trade II Directional RNA Library Prep Kit voor Illumina®, gevolgd door gepaarde sequencing (2 x 75 bp). Lezingen werden uitgelijnd met het E.coli MG1655-referentiegenoom (Hisat2), duplicaat gemarkeerd (Picard) en beoordeeld op transcriptniveaus (ht-seq-telling). De resterende rRNA-niveaus werden berekend door gematchte uitlezingen te delen door het totale aantal uitlezingen dat de filtering van de instrumentkwaliteit doorstond. Effectieve uitputting van sequenties die overlapten met geannoteerde rRNA-regio's werd waargenomen bij 1 & microg, 100 ng en 10 ng input-RNA.

Figuur 4. NEBNext handhaaft consistente transcriptie-expressiecorrelatie na uitputting en over een reeks inputs: E coli

E.coli totaal RNA (1 & microg, 100 ng en 10 ng) was uitgeput van rRNA met behulp van de NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria). RNA-seq-bibliotheken werden bereid uit onbehandeld en verarmd RNA met behulp van de NEBNext Ultra&trade II Directional RNA Library Prep Kit voor Illumina®, gevolgd door gepaarde sequencing (2 x 75 bp). 4 miljoen leesparen werden bemonsterd (seqtk) uit elke bibliotheek, toegewezen aan het E. coli MG1655-referentiegenoom (Bowtie 2.3.2) voordat de uitlezingen op genen werden geteld (htseq-telling) en hun niveaus werden gecorreleerd. Correlatieanalyse van de transcripten duidt op consistente transcriptie-expressie, ongeacht de behandeling of de ingevoerde hoeveelheid.

Figuur 5. NEBNext handhaaft consistente transcriptie-expressiecorrelatie na uitputting en over een reeks inputs: Mock-bacteriële gemeenschap

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit een gevriesdroogde pool van 20 verschillende bacteriële organismen (ATCC® #MSA-2002). Ribosomaal RNA was uitgeput met behulp van de NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria). RNA-seq-bibliotheken werden bereid uit onbehandeld en verarmd RNA met behulp van de NEBNext Ultra&trade II Directional RNA Library Prep Kit voor Illumina®, gevolgd door gepaarde sequencing (2 x 75 bp). 4 miljoen leesparen werden bemonsterd (seqtk) uit elke bibliotheek, toegewezen aan een samengesteld genoom (Bowtie 2.3.2) voordat de reads op genen werden geteld (htseq-count) en hun niveaus werden gecorreleerd. Correlatieanalyse van de transcripten duidt op consistente transcriptieexpressie, ongeacht de behandeling of de ingevoerde hoeveelheid.


Praktische toepassing van fenol/chloroform-extractie

Hoewel er veel meer methoden zijn om uit te kiezen voor het opruimen van uw RNA of DNA dan er vroeger waren, is extractie met fenol/chloorform soms nog steeds de beste manier om te gaan. Hier zal ik enkele praktische aspecten van het gebruik van deze techniek bespreken.

Nick introduceerde het onderwerp Fenol/Chloroform-extractie in een vorig artikel, waarbij hij enkele ideeën aanhaalde over hoe organische extractie eiwitten uit een waterige oplossing zal verwijderen.Kortom, eiwitten bestaan ​​uit zowel hydrofobe als hydrofiele resten, en door eiwitvouwing bereiken ze een compromis met water om oplosbaar te blijven. Wanneer ze echter de kans krijgen om over te gaan naar een omgeving die zowel polaire als niet-polaire residuen kan herbergen (dwz - fenol of fenol/chloroform) zonder dat er compromissen nodig zijn (dwz – vouwen), gaan ze daar graag naar over. fase. De meer sterk polaire moleculen, zoals koolhydraten en nucleïnezuren, zijn "gelukkiger" in de waterige fase (met enkele uitzonderingen die hieronder worden vermeld) en blijven daar. Nu voor de kern van de zaak.

Fenol versus Fenol/Chloroform versus Chloroform
Een van de meest voorkomende vragen die mij worden gesteld wanneer ik iemand train, is wat de verschillen zijn tussen de verschillende organische fasen die bij extractie worden gebruikt. Hier is de uitsplitsing, voor zover ik ze begrijp.

Fenol – Waar we het hier eigenlijk over hebben is buffer-verzadigd fenol, dat bestaat uit een oplossing die eigenlijk voor ongeveer 72% fenol, 28% water is. Omdat fenol een zwak zuur is, zijn de oplossingen die we gebruiken in evenwicht gebracht met buffer om de pH naar een bepaald doel te brengen - ofwel zuur voor RNA-zuivering of licht alkalisch voor DNA-zuivering. Naast een bepaalde hoeveelheid water die oplost in de fenol, is er een bepaalde hoeveelheid fenol die oplost in water - bij evenwicht zal de waterige fase ongeveer 7% fenol bevatten. Men denkt dat dit helpt bij de extractie, omdat dit opgeloste fenol helpt bij het denatureren van eiwitten terwijl ze zich nog in de waterige oplossing bevinden. Bufferverzadigd fenol heeft een dichtheid die slechts iets hoger is dan die van water.

Fenol/Chloroform - Dit is een mengsel van met buffer verzadigde fenol en chloroform, meestal dicht bij 1: 1 voor DNA-zuivering met andere verhoudingen die soms worden gebruikt voor RNA-zuivering. Isoamylalcohol wordt soms gebruikt als antischuimmiddel, maar algemeen wordt aangenomen dat het een inerte en optionele toevoeging is. Deze oplossing wordt om een ​​aantal redenen vaak gebruikt in plaats van met buffer verzadigde fenol. Zoals ik hierboven al zei, is de dichtheid van met buffer verzadigde fenol slechts iets hoger dan die van water. Dus als uw waterige fase voldoende zout of andere opgeloste stoffen bevat die de dichtheid zouden verhogen, dan zou u tijdens de extractie fase-inversie kunnen krijgen, waarbij uw waterige fase zich onder het fenol bevindt in plaats van erbovenop. Chloroform is aanzienlijk dichter dan water, dus toevoeging aan de organische fase verhoogt de algehele dichtheid van die fase, waardoor fase-inversie wordt voorkomen.

Bovendien helpt de chloroform (en sommigen zeggen isoamylalcohol) de interfase te verminderen - de vage grens tussen de twee fasen die wordt bevolkt door moleculen die niet kunnen beslissen waar ze heen willen. Dit kunnen gedeeltelijk gedenatureerde eiwitten zijn, DNA (afhankelijk van de pH), en/of gedeeltelijk gedenatureerde DNA-bindende eiwitten die zich nog aan het DNA hechten, en het is een echte pijn in de kont. Pipetteer je een deel van dit materiaal bij het verwijderen van de waterige fase, dan verminder je de zuiverheid van je monster. Als je te timide bent tijdens het pipetteren, dan schaadt je opbrengst. Als je mijn geluk hebt, dan is wat je ook het liefst wilde houden erin zitten. Het toevoegen van chloroform aan de mix helpt dit te verminderen. (Maar ik heb een nog betere oplossing voor dit probleem waarover ik je hieronder zal vertellen.)

Chloroform – Dit wordt normaal gesproken gebruikt na extracties met fenol of fenol/chloroform. Hoewel pure chloroform niet zo goed werkt als de hierboven genoemde organische oplossingen voor eiwitextractie, werkt het goed voor het extraheren van fenol uit waterige oplossingen. Weet je nog dat ik zei dat de waterige fase bevatte?

7% fenol na equilibratie? Weet je nog dat ik zei dat fenol graag eiwitten denatureert? Als u de fenol in uw nu eiwitvrije nucleïnezuuroplossing niet kwijtraakt (of in ieder geval niet ernstig vermindert), kan het u weer gaan achtervolgen door de enzymen waarmee u het DNA of RNA behandelt, gedeeltelijk of volledig te remmen. lijn. Gepresenteerd met een mooi chloroformhuis, zal het fenol zich echter afscheiden van uw nucleïnezuren. Chloroform zelf is ongeveer 10X minder oplosbaar in water dan fenol (

0,8%) en is minder denaturerend voor eiwitten. Lang geleden is mij ook verteld dat het minder waarschijnlijk is dan fenol om eens met DNA te pelleteren tijdens ethanolprecipitatie, maar ik kan geen verwijzing vinden om dat punt te onderbouwen.

Ether – Dit kan ook worden gebruikt om fenol terug uit de waterige fase te extraheren. Vanwege het explosieve potentieel van ether en de neiging van biologie-types om bunsenbranders en stakers in hun laboratoria te hebben, is het echter grotendeels vervangen door chloroform.

Niet zo mooi in roze
Een waarschuwing: gebruik uw fenol of fenol/chloroform niet als de oplossing roze wordt. Oxidatie van het fenol produceert een roze/bruine verbinding, en deze verbinding zal inkepingen in je DNA en afbraak van je RNA veroorzaken. De meeste commerciële fenoloplossingen bevatten een antioxidant om deze oxidatie te remmen, en fenol gebufferd bij een zure pH lijkt bestand te zijn tegen oxidatie, maar het is geen slecht idee om een ​​deel van de met buffer verzadigde fenol te verwijderen (uit de bruine fles die het bevat). waarschijnlijk is binnengekomen) naar een doorzichtige fles of buis om deze te inspecteren voordat u met de extractie begint.

pH is belangrijk – veel
Af en toe doet iemand een fenolextractie en vindt er niets van het DNA in het monster terug. Als dit jou of iemand in je laboratorium overkomt, zou je eerste vraag moeten zijn: "Welke fenol heb je gebruikt?" Labs die zowel DNA- als RNA-werk doen, zullen waarschijnlijk zowel zure als basische gebufferde fenoloplossingen hebben, of iemand zal een nieuwe fles fenol kopen zonder aandacht te besteden aan de pH. Extractie van DNA-bevattende monsters met zuur fenol resulteert in de denaturatie van het DNA, en eenmaal gedenatureerd, verdeelt het DNA zich in de organische fase. Dit is een belangrijk kenmerk van veel RNA-zuiveringsprotocollen, wat een van de redenen is waarom zure buffer-verzadigde fenol wordt gebruikt.

Nu beginnen de DNA-fenolextracties van een laboratorium soms te mislukken (geen herstel van het DNA achteraf) en wordt de pH van het fenol in twijfel getrokken. Als u zich op deze plek bevindt, kunt u uw pH-meter er niet zomaar in dopen, en u kunt geen pH-papier gebruiken, aangezien de pH-indicator op het papier werd gekenmerkt in waterige oplossingen. De methode die ik heb gebruikt, is om 1 ml van de met buffer verzadigde fenol te verdunnen met 9 ml 45% methanol, te mengen en vervolgens de pH te meten met een standaard pH-meter. De veiligste manier om de pH aan te passen is door de waterige fase bovenop de fenoloplossing te vervangen door een vers aliquot van

100 mM gebufferd water (meestal Tris pH 7,9 voor DNA-werk), meng de fasen goed en laat de fles vervolgens bezinken totdat de fasen weer goed gescheiden zijn. Dan pH het opnieuw.

Je fasen mengen
Fenol/chloroform-extracties zijn verbazingwekkend efficiënt - minder dan 1% van het gemiddelde eiwit blijft in de waterige fase nadat de eerste extractie tot evenwicht is gekomen. De truc is natuurlijk om de extractie in evenwicht te brengen. Hoe meer oppervlakte er is tussen de twee fasen, hoe sneller dit gebeurt, en dat oppervlakte is groter naarmate je een fijnere emulsie hebt gemaakt. Dit kan worden bereikt door de fasen een paar minuten te vortexen, zoals veel protocollen vereisen, maar niet alle monsters kunnen worden gevortext. Als u zeer groot DNA zuivert, zoals genomisch DNA, moet u uw monster mogelijk veel voorzichtiger mengen en daarom elke extractie veel langer uitvoeren. Dus op dit punt, volg je protocol en wees erg voorzichtig met het proberen om de tijd van deze stap te verkorten.

Effecten van denaturatie en vertering
Sommige protocollen vragen om eiwitdenaturatie en mogelijk vertering met Protinase K vóór extractie. Beide stappen zijn pogingen om de hoeveelheid materiaal die in de interfase wordt opgesloten te verminderen en daardoor de opbrengst aan teruggewonnen DNA of RNA te verbeteren. Ik heb nog nooit enig negatief effect gezien van het denatureren van de eiwitten met SDS vóór extractie. Aan de andere kant kan de vertering van het eiwit de zuiverheid van het nucleïnezuur dat je terugkrijgt verminderen. Hoewel het bijna gegarandeerd is dat hele eiwitten worden verdeeld in de organische fase, zullen niet al die peptiden, zodra het eiwit is verteerd in kleine peptiden, hetzelfde chemische 'karakter' van het hele eiwit hebben en elk heeft zijn eigen partitienummer. Het maakt misschien niet veel uit of u enkele peptiden in uw nucleïnezuur heeft, afhankelijk van uw downstreamtoepassing, maar het is formeel mogelijk dat deze verontreinigingen uw toekomstige kwantificering van het monster kunnen beïnvloeden. Ik ontdekte echter een betere manier om de gevreesde interfase te elimineren ...

Phase Lock-gel®
Dit is een van die dingen die in 50% van de laboratoria lijkt te voorkomen, maar toch weet minder dan 10% van de mensen met wie ik heb gesproken wat het is of hoe het werkt. Ik ontdekte dit op een kritiek punt in mijn onderzoek en het redde mijn proefschrift. Kortom, Phase-lock gel is een kleverige, Vasoline-achtige gel met een dichtheid die iets groter is dan die van water. Als u uw extractie er bovenop toevoegt in een centrifugebuis en deze vervolgens centrifugeert, verzamelt de Phase Lock-gel zich tussen de waterige en organische fasen, waardoor de twee worden gescheiden en de vorming van de DNA/RNA-hongerige interfase wordt voorkomen.

Een zoektocht op internet leverde geen foto's op van dit proces waarvan ik dacht dat ze goed genoeg waren, dus nam ik er zelf een. In deze kleine demonstratie neemt rode kleurstof de plaats in van ons kostbare nucleïnezuur en vervangt blauwe kleurstof eiwitten.

A) De Phase Lock gel® vormde een pil op de bodem van een Eppendorf-buisje van 1,5 ml.
B) Na toevoeging van fenol/chloroform en de waterige fase, compleet met faux-DNA (rood) en faux-eiwit (blauw) in de waterige fase.
C) Na zacht schudden gedurende 5 minuten.
D) Na centrifugeren. Merk op dat de gel nu de organische fase van de waterige fase scheidt.
E) Na een tweede toevoeging van fenol/chloroform en zacht schudden gedurende 5 minuten.
F) Na de tweede centrifugatie. Het nep-DNA kon nu worden geëxtraheerd met chloroform (in dezelfde buis, als de ruimte het toelaat) om het resterende fenol te verwijderen.

Zoals je kunt zien, vormt de gel een stabiele scheidingswand tussen de twee fasen, en als je het monster een tweede keer wilt extraheren en er is nog ruimte in de buis, dan kun je dat doen, met behulp van dezelfde buis twee of meer keer zonder afbreuk te doen aan de zuiverheid van het monster. Je kunt de twee fasen niet vortexen in een buisje dat dit reagens bevat, maar je kunt voicex-mix in een apart buisje doen, dan het monster toevoegen aan het buisje met de gel en centrifugeren. Ze hebben deze gel in twee verschillende smaken: een voor gewone monsters (licht) en een andere voor monsters met een hoge dichtheid, zoals oplossingen met een hoge zout- of eiwitconcentratie (zwaar).

Door SDS te gebruiken om de eiwitten in mijn monster te denatureren voorafgaand aan extractie en vervolgens Phase Lock gel® te gebruiken om de fasen te scheiden, heb ik consequent DNA-monsters gekregen met 260/280-verhoudingen van 1,8 en meer dan 98% herstel. Serieus geweldig spul.

Bij het opstellen van dit artikel kwam ik deze website tegen, die veel nuttige informatie bevat. Bezoek het als je meer wilt weten over fenol.

Nu om van je te horen: wat zijn jouw trucs en tips voor perfecte eiwitextracties?


Materialen en methodes

Stammen, plasmiden, media en groeiconditie.

E coli stammen werden gekweekt in LB-medium (47) waaraan 100 g/ml ampicilline, 25 g/ml kanamycine, 30 g/ml chlooramfenicol of 0,4% (wt/vol) glucose was toegevoegd indien aangegeven. Alle plasmideconstructies werden geïntroduceerd in E coli DH5α (47) en vervolgens overgeplaatst naar een andere E coli of giststam. Giststammen werden gekweekt in aangevuld SD-medium (Clontech Yeast Two-Hybrid Manual) of in rijk medium met adenine aangevuld gistextract/pepton/dextrose (48). Plasmiden en stammen worden vermeld in ondersteunende informatie (SI) Tabel 1, en de details van hun constructie zijn op aanvraag verkrijgbaar. Stammen AT8 [Prne-rne 1� ] en AT14 [Prne-rne 1� ] werden geconstrueerd met de λ-red recombinatiemethode (49). Het labelen van HA-epitoop werd gedaan zoals eerder beschreven (50), en de bijbehorende antibioticumcassettes werden geëlimineerd door gebruik te maken van het FLP tot expressie brengende plasmide pCP20 (51). P1-gemedieerde transductie werd gebruikt om mutaties naar verschillende stammen te verplaatsen (52). De groeisnelheid werd bepaald door OD bij 600 nm.

Gist Twee-Hybride E coli Genomische bibliotheekconstructie en screening.

Een E coli genomische bibliotheek voor gebruik in het twee-hybride systeem van gist werd geconstrueerd als fusies met het Gal4-activeringsdomein (AD) van gist van vectorplasmide pAGADT7 (Clontech, Mountain View, CA). Eén milligram chromosomaal DNA van E coli PB103 werd gedeeltelijk verteerd bij 37°C gedurende 65 of 140 minuten in aanwezigheid van respectievelijk ATP en 0,6 of 0,3 eenheden CviJI (CHIMERx, Milwaukee, WI). CviJI is een bot mes dat klieft tussen GC van de RGCY-herkenningssequentie (R, purine Y, pyrimidine). In aanwezigheid van ATP snijdt het enzym tussen bijna elk GC-paar (RGCN en YGCY) (53). Gedeeltelijk verteerd DNA werd gezuiverd en gefractioneerd op een sucrosegradiënt van 5% bij 25.000 rpm (SW41 Ti-rotor) gedurende 17 uur bij 20°C met 200 µg DNA op elke gradiënt. Fracties die fragmenten bevatten met een gemiddelde grootte van 0,8 kb werden geselecteerd uit elke gradiënt (groottebereik van 𢒀,2- tot 2,5 kb) en werden gebruikt in een 1:6 vector:insert molverhouding voor ligatie in 60 ng SmaI- verteerde en met alkalische fosfatase (CIP) behandelde pAGDAT7-vector van kalfsdarm (Clontech). Ligatieproducten werden geconcentreerd door ethanolprecipitatie in de aanwezigheid van 1 µg glycogeen en gebruikt om competente ELECTROMAX DH10B-cellen te transformeren (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ongeveer 19 - 106 kolonies werden verzameld en opnieuw gesuspendeerd in 80 ml SOC-medium met ampicilline (47). De helft van de celsuspensie werd gebruikt om 800 ml LB-ampicilline-medium te inoculeren en gedurende 75 minuten bij 37°C te laten groeien. De cellen werden vervolgens gebruikt voor plasmide-DNA-extractie met behulp van acht Qiagen-tip 500-kolommen (Qiagen, Valencia, CA) om de genomische plasmidebibliotheek te bereiden. De andere helft werd in porties verdeeld en bewaard bij �ଌ in aanwezigheid van 20% glycerol.

Plasmide pMDB1, met verstand gefuseerd aan het Gal4-bindende domein, werd bereid zoals eerder beschreven (23). Om te screenen op DNA dat codeert voor MinD-interagerende eiwitten, werden competente gistcellen [gemaakt door de lithiumacetaatmethode (48)] uit een kweek van 165 ml van AH109/pMDB1 getransformeerd met 180 μg van de plasmidebibliotheek. De gisttransformanten werden gescreend op interactie op aangevuld SD-medium zonder leucine, tryptofaan, adenine en histidine om te selecteren op cellen die zowel het lokaas (BD-MinD) als de prooi (AD-bibliotheek) plasmiden bevatten (Clontech Yeast Two-Hybrid Manual) . AD-plasmiden die genomische fragmenten bevatten, werden gescheiden van het bindende domein (BD-MinD)-plasmide door het plasmide-DNA dat uit elke gistkloon werd geïsoleerd over te brengen naar E coli DH5α en selecteren voor het ampicilline-resistente AD-bibliotheekplasmide. Om plasmide uit gist te isoleren, werden cellen van 1,5 ml kweek die overnacht bij 30°C in SD-medium zonder leucine en tryptofaan waren gekweekt, opnieuw gesuspendeerd in 60°C van 67 mM KH2PO4 (pH 7,5) in aanwezigheid van 100 eenheden lyticase (Sigma, St. Louis, MO) en vervolgens gedurende 1 uur bij 37°C geïncubeerd. Elf microliter 20% (wt/vol) SDS werd toegevoegd en het lysaat werd gedurende 1 minuut krachtig gevortext. Plasmiden werden geëxtraheerd met behulp van het Qiagen miniprep-protocol, behalve dat er slechts 183 μl P1-buffer werd toegevoegd. De geïsoleerde AD-plasmiden werden eerst gescreend door PCR om plasmiden te elimineren die voor MinD of MinC coderende DNA-fragmenten bevatten, omdat eerder werd aangetoond dat MinD een interactie aangaat met MinC en met zichzelf in de gist-twee-hybride-assays (22, 23).

Microscopie.

E coli cellen die plasmiden bevatten die coderen voor Yfp-gelabelde eiwitten werden gekweekt in aanwezigheid van 10 μM isopropyl β-d-thiogalactoside. Gelabelde cellen werden onderzocht met fluorescentiemicroscopie zoals eerder beschreven (54) beelden werden niet onderworpen aan deconvolutie. Voor DAPI-kleuring werden cellen gefixeerd in aanwezigheid van 0,2% glutaaraldehyde en 2% formaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, driemaal gewassen met zoutoplossing en vervolgens gekleurd met 2 /x003bcg/ml DAPI gedurende 10 minuten op ijs en gewassen met zoutoplossing vóór microscopie. Immunofluorescentiemethoden (55) werden eerder beschreven, behalve dat 100 mM fosfaatbuffer bij pH 6,8, 6,6, 7,4 en 7,4 werd gebruikt tijdens fixatie voor respectievelijk enolase, PNPase, RhlB en RNaseE. Fixatie werd uitgevoerd in aanwezigheid van 0,02% glutaaraldehyde en 2% formaldehyde. Monoklonale muis-anti-HA-tag (Sigma) werd gebruikt om HA-gelabelde eiwitten te detecteren. Antiserum van konijnen gericht tegen RhlB (vriendelijk geleverd door M. Cashel, National Institutes of Health, Bethesda, MD) werd gezuiverd door absorptie tot gezuiverd His-RhlB gebonden aan PVDF-membraan, gevolgd door elutie met 0,2 M glycine (pH 2) en renaturatie met 1,5 M Tris-base (pH 8,8). Alexa Fluor 488- en Alexa Fluor 594-geconjugeerde geit-anti-konijn en Oregon groen- en Alexa Fluor 488-geconjugeerde geit-anti-muis secundaire antilichamen werden gebruikt (Molecular Probes, Carlsbad, CA). Voor vergelijking van cellulaire concentraties van Yfp-gelabelde eiwitten werden beelden verzameld met behulp van het Openlabs-beeldacquisitieprogramma (Improvision, Lexington, MA), werd de totale fluorescentie gemeten voor 15 individuele cellen om relatieve cellulaire concentraties te bepalen met behulp van dezelfde software, en de gemiddelde concentratie in de gelabelde cellen werd berekend voor elk eiwitmonster. De concentraties van verschillende gelabelde eiwitten werden als gelijkwaardig beschouwd als ze 㰠% van elkaar verschilden.

Om te testen of het abnormale fenotype van AT8 [Prne-rne 1� ] stam kan worden omgekeerd door de cellulaire concentratie van RNaseE(1�), AT1/pRNE31 [Δrne/Plac-rne 1� ::HA] werd overnacht gekweekt in LB-medium aangevuld met ampicilline en vervolgens verdund tot OD600 0,05 en 5 uur gekweekt bij 37°C in LB-ampicilline-medium aangevuld met 0,1% glucose en 0 μM, 1 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 250 μM , 500 μM of 1 mM IPTG. De cellen werden vervolgens gefixeerd en gekleurd met DAPI zoals hierboven beschreven.


Bekijk de video: Sietse Fritsma Kaag moet politieke biezen pakken v Salima Belhaj, Pieter Omtzigt - Tweede Kamer (December 2021).