Informatie

Oorsprong van de term 'confluentie' in celcultuur


Sinds ik aan celkweek doe, wordt het woord confluentie gebruikt om de procentuele groei van cellen of het gebied dat ze bestrijken te beschrijven. Geen enkel woordenboek dat ik heb gevonden gebruikt dit woord echter. Ik vroeg me af of iemand betrouwbaar kan aangeven waar de betekenis vandaan komt of hoe de associatie begon, en echt wat het betekent. Ik geloof niet dat ik dit op een andere Deze Site kan plaatsen, omdat het woord in het woordenboek niet eens een vergelijkbare betekenis heeft. Celcultuur is zo'n integraal onderdeel van celbiologie, medisch onderzoek en biologische productie. En deze term is een integraal onderdeel van celcultuur. Ik was verrast dat ik de betekenis ervan niet betrouwbaar kon verifiëren.


Naast de etymologische verklaring die @aandreev gaf, wordt deze term in celcultuur vaak gebruikt om de dichtheid van hechtende cellen te beschrijven en wordt het gebruikt als een maat voor hun proliferatie. Het wordt meestal gecombineerd met een geschat (of geteld) percentage, dus 10% confluentie betekent dat 10% van het oppervlak van de schaal of kolf bedekt is met cellen, 100% betekent dat het volledig bedekt is. De cellen groeien in dit geval tweedimensionaal op het oppervlak van de kolf. De onderstaande afbeelding (vanaf hier) illustreert verschillende niveaus van confluentie:

Het niveau van samenvloeiing is belangrijk omdat de cellen hun groei veranderen met veranderende dichtheden. Cellen met een lage dichtheid (10-20%) groeien gewoonlijk langzamer dan 50% confluente cellen. Als de plaat volledig door cellen is gegroeid, hebben ze de neiging om weer veel langzamer te groeien. Dit beïnvloedt hun genetisch programma, gedrag in experimenten en transfecties.

Zoals @Roland opmerkte, is het belangrijk om te zeggen dat confluentie geen harde maatstaf is, maar eerder een schatting van de celdichtheid. Verschillende mensen krijgen verschillende schattingen, maar de trend zou hetzelfde moeten zijn.


con- (com-) is een voorvoegsel dat gewoonlijk "saamhorigheid" betekent, samenvoegen. Wortelvloeiendheid/vloeiend komt uit het Latijn fluere, vloeien.

Bron: Google's definities voor tegen- en vloeiendheid (informatie geschraapt van OUP).


Het woord samenvloeiing is een variant van het woord samenvloeiing, hoewel deze variant alleen met enige frequentie voorkomt in de context van celcultuur [1]. Het woord samenvloeiing zelf verscheen in de vijftiende eeuw en is afgeleid van het laat-Latijn confluentie wat betekent "een samenvloeien" [2]. In het Engels werd het aanvankelijk gebruikt voor het samenvloeien van twee of meer stromen, maar het kreeg een grote verscheidenheid aan meer figuratieve betekenissen [3].

Het woord samenvloeiing (maar zelden samenvloeiing) komt voor in verschillende biologische contexten in de eerste helft van de twintigste eeuw [4], maar het eerste voorbeeld dat ik kan vinden met betrekking tot monolaag celcultuur is in 1961 [5], hoewel de term samenvloeiend verschijnt in de jaren vijftig [6]. Het formulier samenvloeiing lijkt rond dezelfde tijd te zijn verschenen als: samenvloeiing [7]. Sinds de jaren zestig worden beide vormen door verschillende auteurs gebruikt, momenteel met een vergelijkbare frequentie [8]. Sommige auteurs gebruiken de een of de ander exclusief, anderen gebruiken samenvloeiing bij het aangeven van een procentuele aanduiding en samenvloeiing om het absolute concept aan te geven - of vice versa [9].

De reden dat samenvloeiing wordt niet gedefinieerd in algemene woordenboeken (of zelfs in de Oxford Dictionary of Biology [10]) kan alleen worden vermoed. Geen van de online woordenboeken die ik heb geraadpleegd [11] geeft het gebruik van celculturen als voorbeeld van: samenvloeiing, wat suggereert dat het gebruik ervan minder frequent is dan in andere technische contexten, waar de betekenis vergelijkbaar is. Met dit gebruik van samenvloeiing aangezien niet geacht wordt een afzonderlijke vermelding te verdienen (ongeacht het belang of anderszins van celkweek), dan zou de noodzaak om een ​​alternatieve vorm te definiëren niet zijn ontstaan.

Er moet worden toegevoegd dat er is is een Wikipedia inzending voor samenvloeiing [12] maar ondanks de titel gebruikt dit de term samenvloeiing in zijn definitie:

“In de celcultuurbiologie, samenvloeiing verwijst naar het percentage van het oppervlak van een kweekschaal dat is bedekt met hechtende cellen. Bijvoorbeeld 50 procent samenvloeiing betekent dat ongeveer de helft van het oppervlak bedekt is, terwijl 100 procent samenvloeiing betekent dat het oppervlak volledig wordt bedekt door de cellen en dat er geen ruimte meer is voor de cellen om als monolaag te groeien.”

Opmerkingen:

[1] De hits gerapporteerd door een Google Book-ngram voor het woord samenvloeiing tussen 1800 en 1954 werden afzonderlijk geanalyseerd, omdat tijdschriftresultaten van ngrams vaak foutieve data hebben. Er was één voorbeeld (1829) van vóór 1900 en 13 vóór 1950, ongeveer de helft in verband met vaccins of biologische verschijnselen.

[2] De etymologie van samenvloeiing gegeven in het online etymologische woordenboek is: begin 15c., "een samenvloeiing, vooral van twee of meer stromen", uit het late Latijn confluentie, uit het Latijn samenvloeiend (nominatief confluens), onvoltooid deelwoord van samenvloeiing "samenvloeien", van geassimileerde vorm van com “met, samen” (zie con-) + fluere "vloeien" (zie vloeiend). Ik zou willen benadrukken dat het woord samenvloeiing is niet een verbinding die in het Engels wordt gevormd door een voorvoegsel toe te voegen aan het woord vloeiend, maar is afgeleid van het samengestelde woord, confluentie, al geëvolueerd in het laat-Latijn (d.w.z. tegen de zesde eeuw).

[3] De Oxford English Dictionary citeert een vroeg voorbeeld van de uitbreiding van de betekenis van het woord samenvloeiing (1606) als "In deze samenvloeiing van zoveel voorspoedige successen”. Een verscheidenheid aan voorbeelden, die uit de politiek, filosofie en wiskunde lijken te komen, zijn te vinden in de Cambridge woordenboek online voor zijn tweede definitie van samenvloeiing, "een situatie waarin twee dingen samenkomen of samenkomen".

[4] Dit kun je zien door naar de websites van enkele van de oudere biologische tijdschriften te gaan (bijv. Journal of the National Cancer Institute of the Journal of Experimental Medicine) en te zoeken op het woord samenvloeiing.

[5] 1961 Jaarboek van het Carnegie Institute of Washington (p.66).

[6] W.R.Earle (van de zoutoplossing van Earle) gebruikt het bijvoorbeeld in een artikel over de groei van fibroblasten in 1951, en T.T.Puck (van de zoutoplossing van Puck) gebruikt het in een artikel uit 1958 in Ervaringen. Het eerdere gebruik van samenvloeiend (ook van oorsprong uit de 15e eeuw) in verband met de monolaagcultuur suggereert dat het woord samenvloeiing, in plaats van een verbastering te zijn van samenvloeiing, kan zijn gevormd uit het bijvoeglijk naamwoord - misschien in onwetendheid dat er al een zelfstandig naamwoord bestond.

[7] Koningsberg et al. (1960) J.Biochem. Biofysica. cytol. 8 333-343.

[8] Er lijkt in het begin verdeeldheid te zijn geweest. In de VS gebruikten Harry Eagle en Renato Dulbecco de term samenvloeiing, terwijl Howard Green en George Todaro gebruikten samenvloeiing. Wat men de Glasgow-school zou kunnen noemen, gebruikte altijd samenvloeiing: John Paul) aan het Beatson Institute en zijn student Ian Freshney, beide auteurs van invloedrijke boeken over celcultuur. De recentere gebruiksfrequentie kan worden beoordeeld aan de hand van een Google-ngram voor "celconfluentie versus celconfluentie".

[9] Zoeken naar samenvloeiing in de Journal of Cell Science en het onderzoeken van recente problemen levert resultaten op voor beide samenvloeiing en samenvloeiing. Deze recente paper gebruikt samenvloeiing uitsluitend zowel als absoluut begrip als als percentage, terwijl dit recente artikel bijvoorbeeld gebruik maakt van samenvloeiing uitsluitend in absolute en numerieke zin. Een ander document verwijst naar: samenvloeiing, maar tot 70% samenvloeiing, maar precies het tegenovergestelde wordt gevonden in dit artikel dat verwijst naar samenvloeiing, maar 70-80% samenvloeiing. Sommige papieren - b.v. deze wisselen willekeurig af. De redactie van het tijdschrift interesseert het natuurlijk niet.

[10] The Oxford Dictionary of Biology heeft niets tussen de ingangen voor ijshoorntje en confocaal.

[11] Collins, Kamers, Cambridge, Lexico of Merriam Webster.

[12] Wikipedia inzending voor samenvloeiing.


Weefselkweek: definitie, geschiedenis en belang

Weefselkweek is de methode voor het kweken van plantaardige of dierlijke cellen, weefsels of organen op voedingsbodem onder aseptische omstandigheden, meestal in een glazen container. Weefselkweek wordt soms ‘steriele cultuur'8217 of '8216in vitro'8217 cultuur genoemd. Door deze techniek kunnen levende cellen geruime tijd buiten het lichaam van het organisme worden gehouden.

Volgens Street ('821777) wordt weefselkweek elke meercellige cultuur genoemd met protoplasmatische continuïteit tussen cellen en groeiend op een vast medium of gehecht aan een substraat en gevoed door een vloeibaar medium.

Door weefselkweek van planten kunnen nieuwe planten worden gekweekt in een kunstmatig medium uit zeer kleine delen van planten, zoals scheutpunt, wortelpunt, callus, zaad, embryo, stuifmeelkorrel, zaadknop of zelfs een enkele cel, ongeacht of het gekweekte weefsel zich ontwikkelt in een plant of ongeorganiseerd groeit, hangt af van het genetische potentieel van het weefsel en de chemische en fysieke omgeving.

Volgens de delen die voor de kweek worden gebruikt, kan de aseptische plantencultuur van de volgende soorten zijn:

(a) Als een zaailing wordt gekweekt, wordt dit plantenkweek genoemd.

(b) Wanneer een embryo wordt gekweekt, staat het bekend als embryocultuur.

(c) Als plantenorganen, zoals scheuttoppen, worteltoppen, bladprimordia, bloemprimordia of onrijpe vruchten worden gekweekt, wordt dit orgaancultuur genoemd.

(d) De kweek van ongeorganiseerde weefsels uit celproliferaties van segmenten van plantenorganen wordt calluscultuur genoemd. Celproliferaties worden gevormd in het explantaat als gevolg van letsel veroorzaakt door excisie.

(e) Wanneer een enkele cel of kleincellig aggregaat in gedispergeerde toestand wordt gekweekt, wordt dit celsuspensiecultuur genoemd. Het wordt ook wel celcultuur genoemd.

Kweek van eencellige wordt soms eencellige klonen genoemd. Het deel van de plant om de kweek te starten, wordt een explantaat genoemd. Cultuur afgeleid van een enkel explantaat wordt een kloon genoemd. Om een ​​kweek voor een relatief langere periode in stand te houden wordt het kweekme­dium van tijd tot tijd gewisseld.

Dit proces verwijdert de schadelijke uitscheidingsstoffen die zich door het metabolisme hebben opgehoopt. Door een fragment van de oudercultuur over te brengen naar een nieuw medium wordt subcultuur gedaan. Zo'n fragment wordt een inoculum genoemd.

Geschiedenis van weefselkweek:

In 1832 zei Theodor Schwann dat cellen buiten het lichaam van het organisme kunnen worden gekweekt als ze worden voorzien van de juiste externe omstandigheden. In 1835 kweekte Wilhelm Roux embryonale cellen van kip in zoutoplossing. Reichinger (1839) zei dat fragmenten dikker dan 1,5 mm wel konden groeien, maar dat fragmenten onder deze limiet niet konden groeien. Hij gebruikte geen enkele voedingsstof in zijn experiment.

Arnold (1885) en Jolly (1903) observeerden groei en celdeling van leukocytcellen van salamander in kweek. In 1907 kweekte de Amerikaanse zoöloog Ross Granville Harrison met succes zenuwcellen van kikkers in gestolde lymfe. Harrison staat bekend als de vader van weefselkweek.

M.J. Burrows (1910) kweekte embryonaal weefsel van kippen in plasma. Zoogdiercellen werden voor het eerst gekweekt door Alexis Carrel. Door herhaald subkweken was hij in staat het weefsel 34 jaar lang te kweken. Orgelcultuur werd voor het eerst gedaan door D.H. Fell (1929) in Engeland. Hij gebruikte gestold plasma en embryonaal extract als voedingsbodem.

Geschiedenis van plantenweefselcultuur:

De Duitse botanicus Gottlieb Haberlandt probeerde voor het eerst plantenweefsels te kweken '8216in vitro'8217. Hij begon zijn werk in 1898. Hij gebruikte cellen van palissadeweefsels van bladeren, cellen van merg, epidermis en epidermale haren van verschillende planten voor kweek in media die Knop'8217s-oplossing, aspergine, pepton en sucrose bevatten.

De gekweekte cellen overleefden enkele maanden, maar de cellen prolifereerden niet.

Dit kan komen door:

(a) Gebruik van zeer eenvoudige media,

(b) Cultuur van sterk gedifferentieerde cellen en

(c) Er werden geen aseptische technieken gebruikt.

In soortgelijke experimenten van enkele latere arbeiders bleven cellen gedurende een lange periode in leven, maar ze slaagden er niet in zich te delen.

Het kweken van meristeemweefsel begon in het begin van de 20e eeuw. Geïsoleerde wortelpunten werden voor het eerst gekweekt door Robbin in 1922. Zelfstandig werkend deed Kotte (󈧚) ook soortgelijke waarnemingen. Robbin en Maneval (󈧛) kweekten wortels en hielden de cultuur gedurende 20 weken in stand door subkweek.

In 1934 kweekte White voor het eerst met succes geïsoleerde tomatenwortels in een medium dat sucrose, anorganische ijzerzouten, thiamine, glycine, pyridoxine en nicotinezuur enz. bevat. Gautheret (󈧦) merkte op dat de cambiumcultuur van Salix capraea, Populus nigra enz. bleef groeien enkele maanden onder aseptische omstandigheden. Later (󈧩, 󈧪) gebruikte hij medium aangevuld met B-vitamines en IAA.

In 1937 erkende White het belang van B-vitamines voor de groei van wortelculturen. Went en Thimann (󈧩) ontdekten het belang van auxine (IAA). Nobecourt (󈧩, 󈧪) verkreeg enige groei in kweek van wortelwortelexplantaten. Hij merkte ook worteldifferentiatie op in weefselkweek. In 1938 werden tumorweefsels van tabakshybriden met succes en verlegen gekweekt.

In 1939 hebben drie wetenschappers, White in de VS en Nobecourt en Gautheret in Frankrijk, onafhankelijk van elkaar gewerkt en met succes continu callusweefsel op synthetisch medium gekweekt. Gautheret (󈧫) zei dat wortelcultuur Knop's8217s-oplossing nodig had, aangevuld met Bertholots'8217 zoutmengsel, glucose, gelatine, cysteïne HC1 en IAA.

White (󈧫a) in cultuur van proambiaal weefsel van jonge stengel van de hybride Nicotiana glauca × N. langsdorfii merkte onbeperkte en ongedifferentieerde groei op. Hij toonde aan dat dit weefsel herhaaldelijk in subculturen kon worden gekweekt. White (󈧫b) registreerde de ontwikkeling van bladknoppen in weefselkweek van de hybride N. glauca × N.langsdorfii in voedingsbodem.

Vervolgens werden weefsels van verschillende planten gekweekt. Er werd opgemerkt dat oudere culturen een toenemende mate van organisatie vertonen. De rol van vitamines in de plantengroei werd ook erkend. Wetmore en Wardlaw (󈧷) kweekten met succes scheuttoppen van pteridophyten (Selaginella, Equisetum en varens).

Weefsels van Sequoia semipervirens werden gekweekt door Ball (󈧻). Pollens van Taxus en Ginkgo biloba werden gekweekt door Tulecke (󈧿). Conifer weefsels werden met succes gekweekt door Harvey en Grasham (󈨉).

Uit weefselkweekstudies kan belangrijke informatie over de wortel-scheutrelatie worden verkregen. Verschillende wetenschappers rapporteerden over de factoren die de differentiatie van vaatweefsel controleren uit weefselkweekstudies.

Van Oberbeck (󈧭) kweekte embryo's van Datura op een medium aangevuld met kokosmelk. Het belang van kokosmelk en 2-4D als voedingsstof werd erkend. De stimulerende werking van kokosmelk is te danken aan de aanwezigheid van zeatine.

De krachtige celdelingsfactor bleek kinetine te zijn, wat een 6 furfurylaminopurine is. Cytokinine is een 6-gesubstitueerde aminopurineverbinding, die celdeling in kweek van plantenweefsels kan stimuleren. Eenzaadlobbige weefsels werden met succes gekweekt op een medium dat kokosmelk bevatte.

Calluskweek van Tagetus erecta en Nicotiana tabacum op vloeibaar kweekmedium, wanneer geroerd op een schudder, produceerde een suspensie van afzonderlijke cellen of celaggregaten (Muir '821753). Een dergelijke celsuspensie zou in subcultuur kunnen worden gebracht.

Studies over celsuspensiecultuur werden uitgevoerd door Muir, Hildebrandt en Riker (󈧺), Street, Shigomura (󈧽), Torrey en Reinert (󈨁), Reinert en Markel (󈨂). Muir (󈧹) ontwikkelde papiervlotverpleegstertechniek voor eencellige kweek.

Bij deze methode werden geïsoleerde enkele cellen op een vierkant filtreerpapier geplaatst, geplaatst op een actief verpleegweefsel, dat de benodigde voedingsstoffen aan de groeiende enkele cel levert. Bij een andere methode werden de cellen opgehangen aan een han­ging-druppel in een microkamer.

Bergman (󈨀) werkt met suspensieculturen van Nicotiana tabacum var. sansum en Phaseolus vulgaris var. 'early golden rod' ontwikkelde een agar-plateringstechniek voor het klonen van één cel. In deze me­thod eencellige fractie werd gescheiden door filtratie, gemengd met warme agar en vervolgens uitgeplaat in een petrischaaltje in een dunne laag.

Melchers en Bergmann (󈧿) merkten op dat na verschillende kweken van de haploïde scheut van Antirrhinum majus er een toename van ploïdie was. Ball (󈧲) merkte de mogelijkheid op van regeneratie van de hele plant in een kweek van de scheutpunt van angiospermische planten. Wetmore en Wardlaw (󈧷), Morel (󈨀) verkregen hele planten uit een kweek van toppen van de scheuten met primordia met 1 of 2 bladeren. Morel (󈨄) gebruikte deze methode voor het kweken van orchideeën.

Een cel die zich door regeneratie tot een heel organisme kan ontwikkelen, wordt een to­tipotente cel genoemd. Deze term werd in 1901 door Morgan bedacht. Volgens White (󈧺) als alle cellen van een meercellig organisme totipotent zijn, herwinnen dergelijke cellen in geïsoleerde toestand hun delende kracht en kunnen ze hele planten voortbrengen. In een organisme blijft dit vermogen onderdrukt.

Er werd opgemerkt dat afzonderlijke cellen in staat zijn nieuwe planten te produceren. Uit stuifmeel- en helmknopkweek werden haploïde embryo's verkregen. Een methode voor het kweken van microsporen van Nicotiana en Datura is ontwikkeld door Nitsch (󈨎, 󈨑). Hij kon het aantal chromosomen verdubbelen en kreeg homozygote diploïde planten.

Uit de helmknopcultuur van tabak Bourgin en Nitsch (󈨇), Nakata en Tanaka (󈨈) verkregen haploïde weefsels en haploïde embryoïden.

Cocking (󈨀) registreerde de afgifte van protoplasten uit wortelpuntcellen met behulp van schimmelcellulase in 0,6 M sucrose. Hij was in staat om geïsoleerde protoplasten te kweken, die nieuwe celwanden regenereren en celkolonies en uiteindelijk plantjes produceren.

In veel plantensuspensieculturen waren celprotoplasten met succes vrijgegeven. Plantenweefselkweektechniek wordt gebruikt voor de studie van tumorfysiologie.

White en Brown (󈧮) waren in staat om een ​​bacterievrije kroongaltumor te kweken. In Scorzonera hispanica merkte Gautheret (󈧲) op dat de calluscultuur die aanvankelijk auxine vereiste, enkele proliferaties produceerde die kunnen groeien in auxine-deficiënt medium.

Dergelijke overgeërfde veranderingen die optreden in de voedingsbehoeften (vooral met betrekking tot auxine) van cellen van een kweek, wordt gewenning genoemd. Een aan auxine gewende cultuur heeft de toevoer van exogene auxine niet opnieuw nodig (Butcher '821777). Butcher merkte op (󈨑) dat wanneer aan auxine en cytokinine gewende weefsels worden geënt in een gezonde plant, er tumoren worden geproduceerd.

Pathogeenvrije planten kunnen worden verkregen door apicaal meristeem te kweken.

Tegen het einde van de jaren 70 was het duidelijk dat de techniek van plantenweefselkweek met succes kan worden gebruikt in verschillende gebieden van de landbouw, zoals de productie van pathogene vrije cultuur, pro­ductie van secundaire producten, klonale vermeerdering, mutantcultuur, haploïde veredeling en genetische manipulatie.

Door weefselkweek zijn pathogeenvrije kweken geproduceerd. Deze techniek is van belang voor plantpathologisch onderzoek. Protoplasten in kweek worden gebruikt voor virusinfectie en biochemische studies.

Uit suspensiecultuur kunnen in grote hoeveelheden secundaire producten worden gesynthetiseerd. Sommige van deze stoffen zijn enzymen, vitamines, voedselaroma's, zoetstoffen, anti-tu­mour-alkaloïden en insecticiden. In Japan is ‘in vitro’ cultuur bereikt op industrieel niveau.

Klonale vermeerdering van orchideeën en verschillende andere sier- en economische planten is bereikt door '8216in vitro'8217 cultuur. In aardappel is klonale vermeerdering bereikt door het kweken van bladcelprotoplasten. Door gebruik te maken van mutagenen in kweek gevolgd door selectie zijn ziekteresistente of stressresistente mutante planten geregenereerd.

Door haploïde veredeling werden weinig cultivers geproduceerd. Hybriden van verwante maar seksueel onverenigbare soorten zijn geproduceerd door protoplastfusie. Door deze techniek is een hybride tussen aardappel en tomaat ontstaan. Door celfusie van geïsoleerde cellen van twee verschillende soorten worden hybride tabaksplanten geproduceerd.

De kiemrustperiode van zaden kan worden verkort door de zaden uit te snijden en het embryo op een kunstmatig medium te kweken (embryocultuur). Abortief embryo kan met succes worden gekweekt door embryocultuur.

Vreemde genen met gewenste kenmerken die aan een plasmide zijn bevestigd, kunnen gewoonlijk door middel van liposomen in de naakte protoplast worden ingebracht. De expressie van het geïntroduceerde gen in de volwassen plant is nog twijfelachtig.

Belang van weefselkweek:

Weefselkweek is van groot belang in studies van plantenmorfogenese, fysiologie, biochemie, pathologie, embryologie, cytologie enz. Uit weefselkweekstudies is het mogelijk om te weten dat eenvoudige cellen differentiëren en gespecialiseerd worden om speciale functies uit te voeren. Verschillende veranderingen die plaatsvinden in een cel kunnen worden opgemerkt uit klonale cultuur.

De onderlinge relatie tussen twee cellen kan worden bestudeerd in weefselkweek. Met behulp van fasecontrast cine-fotomicrografie is een zeer duidelijk begrip van mitose en meiose in weefselkweek mogelijk. Haberlandt wees op het belang van weefselkweek bij het bestuderen van de morfogenese van planten. De relatie tussen groei en differentiatie kan vanuit zo'n cultuur goed worden begrepen.

In vegetatief vermeerderende planten worden veel plantjes zeer snel gevormd uit calluscultuur of cultuur van explantaten. Orchideeën, die zich normaal gesproken zeer langzaam voortplanten, kunnen in de scheutpuntcultuur zeer snel veel plantjes vormen. Dit wordt ook opgemerkt in auto­nation.

Door weefselkweekmethode kunnen nieuwe plantvarianten worden verkregen door gen-shytically-unieke cellen te isoleren. Uit eeltculturen van tabak, wortel, asperges etc. worden nieuwe planten gevormd. Dergelijke planten vertonen genetische variabiliteit.

Uit studies van gemuteerde cellen kan het biochemische en ontwikkelingsproces van een organisme beter worden begrepen. In weefselkweek kan mutatie gemakkelijk worden geïnduceerd en uit dergelijke mutante cellen kunnen mutante planten worden geproduceerd.

In tabak, padie enz. uit helmknopcultuur worden haploïde plantjes geproduceerd. Door verdubbeling van het chromosoom worden homozygote planten het snelst verkregen. Dit proces is dus van enorm belang in de plantenveredeling.

Weefselkweektechniek is met succes gebruikt in voedingsonderzoek. De effecten van verschillende minerale zouten, vitamines enz. op de groei kunnen in cultuur worden bestudeerd. Veel belangrijke informatie over glucosemetabolisme, stikstofmetabolisme en hormoonproductie kan worden verkregen uit '8216in vitro'8217-kweek.

Suspensiecultuur onder gecontroleerde omstandigheden kan worden gebruikt om veel fysiologische of biochemische problemen op te lossen en biedt ook een systeem voor de productie van belangrijke plantaardige producten, zoals plantenalkaloïden.

Vanuit cel- en orgaankweek onder gecontroleerde omgevingscondities kunnen voedings- en stofwisselingsprocessen worden bestudeerd. Sommige mutante cellen kunnen niet groeien in een medium dat geen speciale voedingsstof bevat. Hieruit kunnen biochemische stappen van een proces worden bepaald.

Weefselkweek heeft grote betekenis in pathologische studies. In weefselkweek kan het effect van verschillende medicijnen op door ziekteverwekkers geïnfecteerde cellen worden onderzocht.

Kweek van maïscellen van planten die gevoelig zijn voor het ras T van Helminthosporium maydis werden behandeld met pathotoxine van de schimmel. Wetenschappers waren in staat om cellen te verkrijgen die resistent zijn tegen deze schimmel. Uit dergelijke cellen werden ook resistente planten geproduceerd.

Weefselkweektechniek wordt gebruikt in de studies van plantentumorziekten en de relatie tussen gastheerparasieten. Ziektevrije planten kunnen worden geproduceerd door weefselkweektechniek. Weefselkweek is van groot belang bij de productie van vaccins. In 1949 werd een vaccin tegen poliomyelitis geproduceerd nadat was vastgesteld dat het poliomyelitisvirus menselijke cellen kan aanvallen. Latere vaccins tegen de bof, meseales en griep zijn geprovoceerd.

Het proces van virusaanval, effect van virus op Post-cellen en hoe nieuwe virussen worden geproduceerd etc. zijn bestudeerd in weefselkweek. Het gedrag van stoffen die een virusaanval kunnen voorkomen, is onderzocht op met virus geïnfecteerde cellen.

In weefselkweek kan het gedrag van normale en kankercellen worden bestudeerd. Er is opgemerkt dat sommige virussen en kankerverwekkende chemicaliën kanker kunnen veroorzaken. Het effect van straling en chemicaliën op normale en kankercellen is onderzocht. Uit dergelijke onderzoeken kan wellicht worden afgeleid welke chemische stoffen kankercellen kunnen vernietigen.

Uit weefselkweekstudies is informatie verkregen over enkele erfelijke ziekten bij de mens. Dragers van sommige ziekten kunnen ook worden geïdentificeerd door middel van weefselkweektechniek. Uit de leukocytencultuur is de oorzaak van mongolisme bij de mens opgehelderd. Uit een dergelijke kweek is een abnormaal Philadelphia-chromosoom geïdentificeerd. Dit chromosoom heeft enige relatie met chronische granulocytische leukomie.

Wanneer weefseltransplantatie van de ene persoon naar de andere wordt uitgevoerd, is er soms weefselafstoting. Het is dus noodzakelijk om het weefsel van donor en ontvanger op elkaar af te stemmen voor de daadwerkelijke transplantatie. Dit kan door de gemengde leukocyten van de donor en de ontvanger te kweken.

Ver verwante soorten hybridiseren meestal niet. Deze moeilijkheid kan worden weggelaten door celfusie en protoplastfusietechniek. Carlson produceerde in 1972 met succes hybride planten door protoplastfusie tussen Nicotiana glauca X N. langsdorfii. Power (󈨐) verkreeg hybriden tussen Petunia hybrida en P. parodii door protoplastfusie.

Kaw en Wetter (󈨑) produceerden hybriden tussen tabak en soja door celfusie. Zo zijn celfusie- en protoplastfusietechnieken van groot belang in de plantenveredeling. Tetraploïde vruchtbare Lolium- en Festuca-hybriden werden verkregen door somatische celfusie.

Die embryo's die normaal geen rijpe vruchten produceren, kunnen worden gekweekt en uit dergelijke embryoculturen worden planten geproduceerd. Embryocultuur voorkomt ook kiemrust. Cooper (󈨒) verkreeg hybride planten tussen gerst en rogge door middel van embryocultuur.

Behoud van kiemplasma:

Door weefselkweek kan plantenkiemplasma worden opgeslagen.

Deze methode kan met succes en verlegen worden gebruikt om verschillende problemen op te lossen:

(a) Veel zaden, zoals zaden van Citrus sp., Coffea sp., Hevea brasiliensis enz. behouden hun levensvatbaarheid gedurende een korte periode. Deze kunnen worden geconserveerd door weefselkweek.

(b) Vegetatief vermeerderde planten (zoals banaan, aardappel, zoete aardappel en yam) die geen zaden produceren of die zeer heterozygoot zijn, worden bewaard als stekken of knollen. Dit vereist veel arbeidskosten en is duur om te propageren. Dit probleem kan worden opgelost door weefselkweek.

Veel fruitbomen van Rosaceae worden vermeerderd door knopen, enten en legen. Door weefselkweek is een snelle vermeerdering van dergelijke planten mogelijk.

(c) In veel economische planten, zoals kokosnoot, dadelpalm enz., komt vegetatieve pro­pagatie normaal gesproken niet voor. Het kiemplasma van dergelijke planten kan worden geconserveerd door weefselkweek.

(d) Veel bomen planten zich heel langzaam voort. Door weefselkweek kunnen dergelijke verven snel worden vermeerderd en worden veel planten met oudergenotypes gevormd.

Voor conservering van kiemplasma moeten de cellen worden bewaard in een zodanige toestand dat een minimale celdeling mogelijk is. Een van de geprobeerde methoden is het opslaan van cellen in vloeibare stikstof met een temperatuur van -196°C.

Voor kiemplasmaconservering kunnen scheuttips of plantjes worden bewaard. Dergelijke opgeslagen materialen kunnen naar behoefte worden gebruikt.

In weefselkweek kan celdeling op verschillende manieren worden onderdrukt:

(i) Aan het middelmatige groeivertrager kan worden toegevoegd. De gebruikte stoffen zijn absiciumzuur, mannitol, sorbitol, appelhydrazide, barnsteenzuur enz. Aardappelscheuten worden met succes bewaard in een medium dat appelhydrizide bevat.

(ii) Lage temperatuur is nuttig voor de opslag van cellen in kweek. Met deze methode kunnen culturen van aardappel, zoete aardappel, biet, druif, appel enz. worden bewaard. Gematigde gewassen (bijv. aardappel) worden doorgaans bewaard bij een temperatuur van 0-6°C en tropische gewassen (bijv. zoete aardappel) bij 15-20°C. Door deze methode wordt de meristeemcultuur van aardbei zes jaar geconserveerd.

(iii) De concentratie van voedingsstoffen van het kweekmedium kan worden gewijzigd. Sommige stoffen die nodig zijn voor een normale groei kunnen in een lagere concentratie of helemaal niet worden geleverd.

(iv) De gassamenstelling in het kweekvat kan worden gewijzigd. De atmosferische druk of zuurstofconcentratie kan worden verlaagd om de cellen te sparen.

Productie van secundaire stofwisselingsproducten:

Sommige planten produceren secundaire stofwisselingsproducten, zoals alkaloïde, anti- en shybiotica, glycoside, hars, tannine, saponine, vluchtige olie, enz., die van aanzienlijk economisch belang zijn.

Door celkweek zijn verschillende secundaire metabolieten (bijv. allergine) kunstmatig gesynthetiseerd. De teelt van planten die secundaire metabolieten produceren, kan aanzienlijk worden verbeterd door weefselkweek. Er zijn bepaalde nadelen bij de productie van secundaire metabolieten door weefselkweek.

(i) In celcultuur vindt de synthese van secundaire metabolieten in een lagere snelheid plaats dan in een hele plant,

(ii) Na langdurige kweek ''8216in vitro'8217 kan de productie van secundaire metabolieten afnemen of zelfs stoppen,

(iii) De kosten van grootschalige productie van secundaire metabolieten in celcultuur zijn hoog. Er worden dus alleen zeer zeldzame en dure secundaire metabolieten geproduceerd door weefselkweek.


Wanneer subcultuur?

De criteria voor het bepalen van de behoefte aan subcultuur zijn vergelijkbaar in hechtende en suspensieculturen, maar er zijn enkele verschillen tussen zoogdier- en insectencellijnen.

Cel lijnenceldichtheidUitputting van medium
ZoogdiercellenAanhechtende culturen moeten worden gepasseerd wanneer ze zich in de logfase bevinden, voordat ze samenvloeien. Normale cellen stoppen met groeien wanneer ze samenvloeiing bereiken (contactremming), en het duurt langer om te herstellen wanneer ze opnieuw worden ingezaaid. Getransformeerde cellen kunnen blijven prolifereren, zelfs nadat ze samenvloeiing hebben bereikt, maar ze verslechteren gewoonlijk na ongeveer twee verdubbelingen. Evenzo moeten cellen in suspensie worden gepasseerd wanneer ze in de groei van de log-fase zijn voordat ze confluentie bereiken. Wanneer ze confluentie bereiken, klonteren cellen in suspensie samen en lijkt het medium troebel wanneer de kweekkolf wordt rondgedraaid.Een daling van de pH van het groeimedium duidt meestal op een ophoping van melkzuur, een bijproduct van het cellulaire metabolisme. Melkzuur kan giftig zijn voor de cellen en de verlaagde pH kan suboptimaal zijn voor celgroei. De snelheid van verandering van de pH is in het algemeen afhankelijk van de celconcentratie doordat kweken met een hoge celconcentratie medium sneller uitputten dan cellen met lagere concentraties. U moet uw cellen subculturen als u een snelle daling van de pH (>0.1 – 0.2 pH-eenheden) met een toename van de celconcentratie waarneemt.
insectencellenInsectencellen moeten worden gesubcultureerd wanneer ze zich in de logfase bevinden, voordat ze confluentie bereiken. Terwijl strak hechtende insectencellen bij confluentie kunnen worden gepasseerd, waardoor ze gemakkelijker kunnen worden losgemaakt van het kweekvat, vertonen insectencellen die herhaaldelijk worden gepasseerd bij dichtheden voorbij confluentie verminderde verdubbelingstijden, verminderde levensvatbaarheid en een verminderd vermogen om te hechten. Aan de andere kant vereist het passeren van insectencellen in hechtende cultuur voordat ze samenvloeiing bereiken meer mechanische kracht om ze uit de monolaag te verwijderen. Wanneer ze herhaaldelijk worden gesubcultureerd vóór confluentie, vertonen deze cellen ook verminderde verdubbelingstijden en vertonen ze verminderde verdubbelingstijden, verminderde levensvatbaarheid en worden ze als ongezond beschouwd.Insectencellen worden gekweekt in groeimedia die gewoonlijk zuurder zijn dan die welke voor zoogdiercellen worden gebruikt. TNM-FH en Grace's medium dat wordt gebruikt voor het kweken van Sf9-cellen heeft bijvoorbeeld een pH van 6,2. Unlike mammalian cell cultures, the pH rises gradually as the insect cells grow, but usually does not exceed pH 6.4. However, as with mammalian cells, the pH of the growth medium will start falling when insect cells reach higher densities.

You will get useful cell numbers in various sizes of tissue cell culture dishes, plates and flasks. We provides useful numbers, such as, growth surface area, volumes of dissociation EDTA-Trypsin solution, culture medium, seeding density and cell numbers at 100% confluent, are given below for Greiner Bio One and Nest Biotechnology cell culture dishes, cell culture plates and cell culture flasks. This can be a reference for cell culture dishes, plates, flasks from other companies, such as Corning, TPP, ThermoFisher Scientific, Sigma, etc according to the same cell growth surface area.

In mammalian tissue cell culture, confluence is commonly used to estimate the number of adherent cells in a culture dish, plate or a flask, referring to the proportion of the surface which is covered by cells. For example, 70% confluence means roughly 70 percent of the growth surface is covered by cells, and there is still room for cells to grow. 100% confluence means the cell growth surface is completely covered by the cells, and no more room is left for the cells to grow as a monolayer.

Different cell lines exhibit differences in growth rate. Most cells are typically passaged before becoming fully confluent in order to maintain their proliferative phenotype. Some cell lines are not limited by contact inhibition, such as immortalized cells, may continue to divide and form layers on top of the parent cells. To achieve optimal and consistent results, experiments must be conducted at certain confluence, depending on the cell type. The cell number listed in the growth chart here is based on Hela cells, and provided as a reference. For your specific cell type you may have to gain empirical numbers.


Terminologie

Compiled by the 1990 Terminology Committee
Members: Dr. Stephen Mueller,
Dr. Michael Renfroe, Dr. Jerry W. Shay, and Dr. James Vaughn
(Originally published in In vitro Cell. Dev. Biol. 26:97-101, January 1990)

When areas of research become interdisciplinary their jargon, techniques and bodies of information are utilized widely in diverse disciplines. At such times, reciprocal use of terminology by individuals who had not previously used it is often misused and, therefore, confusion occurs. This confusion is especially acute in the field of vertebrate, invertebrate and plant cell culture. There is hardly a field of biological investigation in which culturing of such cells is not employed. Similarly, molecular biology and molecular genetics are lending their technology to an ever widening group of researchers who are communicating in a more global sense via scientific presentations, publications and research proposals. Unfortunately often the writer and reader represent different areas of specialization who have been brought together by the common technology used in their work. As such, misuse of terminology can prove unfortunate indeed anything from inability to repeat a piece of research to problems in publishing a paper or obtaining funding of a research proposal. The following glossary, approved by the Society for In Vitro Biology, Terminology Committee is published in an effort to increase communication between scientists and between scientists and the lay community.


Abstract

Mechanical phenotyping of adherent cells has become a serious tool in cell biology to understand how cells respond to their environment and eventually to identify disease patterns such as the malignancy of cancer cells. In the steady state, homeostasis is of pivotal importance, and cells strive to maintain their internal stresses even in challenging environments and in response to external chemical and mechanical stimuli. However, a major problem exists in determining mechanical properties because many techniques, such as atomic force microscopy, that assess these properties of adherent cells locally can only address a limited number of cells and provide elastic moduli that vary substantially from cell to cell. The origin of this spread in stiffness values is largely unknown and might limit the significance of measurements. Possible reasons for the disparity are variations in cell shape and size, as well as biological reasons such as the cell cycle or polarization state of the cell. Here, we show that stiffness of adherent epithelial cells rises with increasing projected apical cell area in a nonlinear fashion. This size stiffening not only occurs as a consequence of varying cell-seeding densities, it can also be observed within a small area of a particular cell culture. Experiments with single adherent cells attached to defined areas via microcontact printing show that size stiffening is limited to cells of a confluent monolayer. This leads to the conclusion that cells possibly regulate their size distribution through cortical stress, which is enhanced in larger cells and reduced in smaller cells.


Cell culture basics

Culture conditions


For cell survival and proliferation, it is essential that the culture environment replicates, as best as possible, the physiological environment of cells. Culture conditions that can be controlled include temperature, relative humidity and CO2 levels as well as factors associated with the media, such as nutrient composition, pH, osmolality and the volume and frequency of replenishment. These variables can fluctuate over time so they should be monitored. Table 3 highlights the optimal culture conditions for most mammalian cell cultures, however exceptions do exist. 5

Table 3: Optimal cell culture conditions for most mammalian cells. 1 , 2 , 4 , 8


6. Large-scale retrieval of stem cells for clinical applications

(a) Cell detachment

Cell detachment is a critical step for subculturing surface adherent cells. At a small scale, mechanical detachment methods are well established for different types of cells and are traditionally used for PSCs. However, for large-scale cell expansion these methods cannot be used. In principle, the efficiency of cell detachment depends on the cells to be detached, the microcarrier and carrier surface, and thus the interaction of the cells with the microcarrier and, of course, also the detachment agent. Traditionally, proteolytic enzymes, in particular, trypsine or its recombinant and/or animal-free substitutes, are used for the efficient generation of single cell suspensions.

In addition to genomic instability seen to be readily generated in systems where enzymatic dissociation is used [138], there are further disadvantages when using proteases for cell detachment. Goh et al. [90] showed that trypsin was the most efficient detachment agent with respect to speed and efficiency for detaching human fetal MSCs from Cytodex 3 carriers, followed by collagenase I and TrypLE Express with an overall viability of the detached cells of more than 95% for all agents. However, all of the cells detached with protease showed (osteogenic) differentiation efficiency significantly lower than that observed for the non-treated/non-harvested cells the differentiation efficiencies were 26� µg Ca ++ -deposition/10 6 cells (i.e. indicator for osteogenic differentiation) and 71 ± 4 µg Ca ++ -deposition/10 6 cells, respectively.

This indicates very clearly the negative impact of protease treatment for cell detachment on cell fate due to the degradation of ECM proteins, destruction of cytoskeletal structures and cell-to-cell contacts. Similar effects caused by proteolytic cell detachment, for instance, have been reported by Canavan et al. [139] for the detachment of bovine aortic endothelial cell monolayers. Specifically for hMSCs, Potapova et al. [140] reported a decrease of CD105 expression with time of exposure to trypsin over a range of 5� min. These results clearly indicate that the exposure to trypsin or any other proteolytic agent should be as short as possible. Based on this observation, Nienow et al. [141] evaluated a novel two-step protocol for trypsinization of hMSCs comprised of the addition of and incubation with trypsin-ETDA for 7 min at a fivefold increased agitation rate (30 → 150 r.p.m., followed by 200 r.p.m. for the last 5 s) leading to an increase in the maximal specific energy dissipation rate (ɛ) from approximately 9 × 10 𢄤 to 0.11 W kg 𢄡 . This equates to a reduction of the Kolmogorov length from about 180 µm (well above the eddy size at which damaging occurs, as suggested by Croughan et al. [31,36]) to 55 µm, which is well above the size critical for isolated cells, however sufficient to detach cells. The second step consisted of the inactivation of trypsin and the removal of the carriers via filtration. Nienow et al. [141] reported a recovery of more than 95% of the cells which maintained their specific characteristics.

With respect to the detachment of hiPSCs, there is only limited literature available. In principle, when aiming to get to a single cell suspension, trypsin or equivalent (recombinant) proteases, including Accutase, Accumax or TrypLE, are preferable because the protein bridges between the cells are also degraded. However, the generation of single cell suspension of hiPSCs is characterized by high cell loss due to dissociation-induced apoptosis after passaging as single cells, which could be solved by the use of Rho kinase inhibitors, such as Y-27632 or ROCKi [142]. Another way to circumvent this problem is dissociation into aggregates because it has been shown that microcarrier cultures of PSCs can also be seeded with cell aggregates/clumps and that single cell suspensions are not required [143]. The only issue of importance is the fact that the size of aggregates has to be uniform during the culture, which is achieved by agitation generating the required turbulences (see above).

Dissociation of cultures into aggregates can be achieved by using other proteases and agents, including collagenase IV, dispase or hypertonic Na-citrate solution. In this context, Nie et al. [106] showed that the use of hypertonic Na-citrate solution led to superior results with respect to viability and total viable cell number obtained over several passages when compared with detachment using collagenase, dispase or mechanical methods (order of decreasing efficiency). The cells detached using the hypertonic citrate solution kept their ability to express pluripotency markers and could differentiate to all three germ layers after 30 passages.

Thus, in general, the use of non-proteolytic cell detachment means (absence of proteases) has an undeniable positive effect on subcultivation and differentiation of stem cells. These few references show very clearly that any proteolytic cell detachment should be avoided in order to maintain the organization of the cellular cytoskeleton as well as the cell-to-cell interaction as much as possible and to reduce cell damage. For regenerative medicine purposes, protocols for non-proteolytic cell sheet detachments have been developed (e.g. [144]), mainly based on the use of a temperature-responsive poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) modified polystyrene surface allowing the detachment of cells by a reduction of temperature (below the lower critical solution temperature) leading to hydrophilic surface properties and cell detachment [145]. Since, no proteases are used, the cells detach as cell sheets because the intercellular proteinous bridges are preserved. In order to improve cell adhesion and proliferation such thermo-responsive surfaces can be functionalized, including grafting on heparine for binding bFGF [146], the cell-binding domain RGDS [147] or the cyclic RGD peptide CRGDC [148] because of its high affinity binding to the αv㬣, αv㬥 or 㬕㬡 integrins of cells, to mention just a few possibilities.

Only recently, microcarriers grafted with poly(N-isopropylacrylamide allowing the non-invasive harvesting of anchorage-dependent cells had been evaluated. That this principle can be implemented was shown by Kenda-Ropson et al. [149] and Tamura et al. [150] for the detachment of CHO-K1 from modified microhex carriers (pNIPAAm-grafted 2D-polystyrene carriers) and from chloro-methylated polystyrene beads (pNIPAAm-grafted), respectively. Furthermore, Yang et al. [151] and Gümü𕿞relioğlu et al. [152] showed the efficient detachment of human bone marrow-derived MSCs from Cytodex 3 grafted with pNIPAAm and of mouse fibroblasts (L929) and human keratinocytes (HS2) from cross-linked poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) beads grafted with pNIPAAm. In all cases, the reduction of the temperature from 37ଌ to less than 30ଌ led to cell detachment, though more in the form of cell clumps than isolated cells. Although this is a very promising development, few advances have been performed in this specific domain with respect to thermo-responsive microcarriers and further efforts are necessary in order to solve many still existing technological hurdles before large-scale implementation.

With respect to the use of such temperature-responsive culture supports for the expansion of iPSCs, it is highly probable that they can be used for this type of cells without any drawbacks, since their differentiation potential as well as genetic stability is not affected by temperature reduction and exposure to 25ଌ and 4ଌ for up to 2 days [153]. More details on the possibilities and use of thermo-responsive and, in general, of stimuli-responsive cell culture supports can be found in the review by Brun-Graeppi et al. [154].

(b) Separation of non-differentiated cells and of carriers: problem of carrier breakage

Removal of undifferentiated cells is a particular concern in clinical applications of differentiated progenies derived from iPSCs because undifferentiated PSCs are teratogenic [78]. On a small scale, fluorescence activated cell sorting for the isolation of differentiated cells, such as cardiomyocytes [155], neural [156] or endothelial cells [157], can be used. A similar technique is immunomagnetic cell sorting [158], allowing separation at a larger scale. The selective removal of undifferentiated cells using cytotoxic antibodies, such as the cytotoxic mAb 84 [159], is also of high interest and can be coupled to immunomagnetic cell sorting [158] reducing further the risk of teratoma formation. In certain cases, such as the separation of PSC-derived cardiomyocytes from non-cardiomyocytes and undifferentiated cells, the separation is enabled by distinct metabolic flow. Tohyama et al. [160] reported that in a glucose-depleted and lactate-enriched medium only cardiomyocytes survived and that no tumours were formed after transplantation. More extended information can be found in recent reviews by Chen et al. [15], Abbasalizadeh & Bahavand [161] and Diogo et al. [162]. Nevertheless, it has to be mentioned that to date no systematic studies on harvesting PSCs and separation their differentiated progenies have been performed.

Another important issue should be touched here very briefly: Gupta et al. [163] found that 𠆎xcessive’ stirring of microcarrier (Cytodex 3) cultures (r.p.m. > 25) in Bellco spinner flasks can lead to bead breakage. This is a known problem for soft carriers like Cytodex 1 or 3, but is also of concern when the expanded and differentiated cells are used in vivo, because these preparations have to be free of any residual microcarrier or sub-particles derived from these carriers. Sieving is a principle way to get rid of entire carriers however, breakage products are removed with difficulty or not at all. There are two main potential solutions to this problem: either using rigid carriers which are resistant to breakage, like beads made from polystyrene or glass, or using soft carriers which can be dissolved using proteases, such as gelatin- or collagen-based carriers. However, it should be recalled that the choice is critical because the rigidity/stiffness of the support may have an influence on the stem cell fate (see above). On the other hand, it is evident that aggregate cultures without using carriers as an initial support would also present a solution for this specific problem.


Cell confluence in cell cultures - myoblast c2c12 in particular (Feb/01/2011 )

Hi to all. I'm a grad student and I work on cell cultures. I'd like to ask you one thing about the tecnique, I hope you can help me to understand sorry if my english is not perfect.

I work with the myoblasts cell line c2c12. I know that cells must not reach confluence becouse otherwise they begin differentiate. furthermore they must be at 60-80% confluence before passing or splitting them.

Does the term "confluence" mean that cells cover the entire surface of the plate?
How can I see when cells reach 60-80% confluence? Do you know if I can find somewhere some images about cell coltures at different grade of confluence?

Thank you very much for your precious help!

Correct, confluency is the amount of culture surface that is covered by cells. Your best bet for learning how to assess the confluency is to get an experienced person to look at your cells and tell you how confluent they are and learn from that.

You can think of it like this. 25% confluent is a quarter of the surface area covered by cells, 50% is half the area and 75% is 3/4 of the area.


Types of Animal Cell Culture

On the basis of cell growth and division, the animal cell culture is subdivided into the following two types:

Primary Cell Culture

It is defined as the cell culturing from the tissue of the host animal. The cells can be obtained directly by the mechanical method and indirectly by the enzymatic action. Once, the cells are obtained, they have to be cultured on a suitable container that must be provided with all the nutrients required for the cell division and growth. The growth of primary cells either occurs as an adherent monolayer on the solid media or as a oponthoud in a liquid medium.

  1. Adherent cells: These cells adhere to the solid surface and produce a cell population in the monolayer pattern. Adherent cells are sometimes called a confluent cell, in which the cells merge or contract to fill the surface area. Fibroblasts and epithelial cells are examples of adherent cells. The properties of the adherent cells include:
    • Adherent cells are anchorage-dependent.
    • Grows in a monolayer pattern.
    • Growth occurs on the solid surface or we can say on the solid media.
    • Adherent cells fill the entire surface area of the container or vessel as a monolayer.
    • Adherent cells follow the property of contract inhibition, in which the cell itself ceases the growth of some cells to maintain the synchronized state through chemical signalling. Once a monolayer is formed, the formation of new cells is inhibited by the adherent cells.
  2. Suspension cells: These are the cells that do not adhere to the surface of the medium. Suspension cells are the type of cells that float as the suspension over the liquid medium. The properties of the suspension cells include:
    • Suspension cells are anchorage-independent.
    • Floats as a suspension of cells over the liquid culture medium.
    • Growth occurs in the liquid nutrient medium.
    • Suspension cells grow much faster than the adherent cells.
    • There is a short lag phase in the suspension cells.
    • Enzyme action is not required for the dissociation of cells.

Secondary Cell Culture

It is defined as the subculturing of the primary cells, which later produce secondary cells lines. The passaging or subculturing of the primary cells result in a phenotypic and genotypic uniformity of the cell population. After the subculturing, the cell-lines will become different from the original cells. Based on the cell’s life span, the cell lines can be categorized into:

  1. Finite cell lines: Here, the cells possess a limited life span and show a limited cell division. Passaging value is less because the cells after some time lose the ability to grow or proliferate and enter into the phase of senescence or ageing.
    Example: Normal cells produce finite cell lines.
  2. Continuous cell lines: In continuous cell lines, the number of cell division and passaging value is indefinite. The passaging value is more because the continuous cells do not lose the ability to divide, i.e. these can grow and divide by an infinite number of times.
    Example: Cancerous cells produce infinite or continuous cell lines.

Proces

The process of animal cell culture can be summarized into the following series:

  1. Tissue explant: It involves the removal of tissue from the organ.
  2. Cell extraction: It is carried out either mechanically or enzymatically. The extraction is mostly carried out by the enzyme action or by the process of trypsinization.
  3. Culturing in a nutrient medium: After that, the cells are cultured either on a solid nutrient medium or liquid nutrient medium. The primary cells form a monolayer over a solid nutrient medium, whereas appears as a cell suspension over the liquid medium.
  4. Subculturing: It is also called cell passaging. The subculturing is carried out after the formation of primary cells and it is important to continuously study or to grow the cells. This is the most important step in cell culture, which helps us to understand the cell type.

Normal cells: These cells possess a low passaging value because they lose their ability to divide after some time due to cell ageing. Therefore, the cell divides to produce definite cell lines.

Continuous cells: These cells possess a high passaging value because the cells have the ability to continuously divide. Therefore, the cell divides to produce indefinite cell lines.

Passaging value is directly proportional to the cell type and cell division.

  • For continuous cells, the passaging value increases, by which the cell division will be more.
  • For normal cells, the passaging value decreases as the cell ages, by which the cell division capacity will also decrease.

Difference Between Normal and Continuous Cells

  • The normal cell produces a monolayer, whereas the continuous cell does not.
  • The continuous cell does not follow the property of contract inhibition, while the normal cells follow.
  • A normal cell has a property to divide for definite times, whereas the continuous cell has a property to divide again and again.
  • The continuous cells possess a high passage value, whereas the normal cells possess a low passage value.
  • The capacity of dividing in the continuous cell remains the same as the first passaging, whereas the capacity of dividing decreases as a result of cell ageing in the normal cells.

Advantages

  • Animal cell culture makes the use of a low amount of reagents.
  • Serial passaging maintains the homogeneity of the cell types.
  • Provides controlled physiological conditions.
  • Provides controlled physiochemical conditions like temperature, oxygen concentration, ph etc.

Nadelen

  • Animal cell culture requires high technical skills to interpret and to regulate the animal cell culturing.
  • It is a very duur method to carry out.

Applications

The animal cell culture provides a model to study the effects of drugs, biochemistry etc. of the cell. By animal cell culture, we can perform tissue engineering. It also helps us to identify the cancerous cell as both the normal and continuous cells can be grown in the animal cell culture.

We can also study the replication and life cycle of the virus, so it plays an important role in the field of virologie. In animal cell culture, we can also study the effect of different drugs on different cell types, so it also helps in toxicity testing.


2 - Cell culture techniques

Cell culture is a technique that involves the isolation and maintenance in vitro of cells isolated from tissues or whole organs derived from animals, microbes or plants. In general, animal cells have more complex nutritional requirements and usually need more stringent conditions for growth and maintenance. By comparison, microbes and plants require less rigorous conditions and grow effectively with the minimum of needs. Regardless of the source of material used, practical cell culture is governed by the same general principles, requiring a sterile pure culture of cells, the need to adopt appropriate aseptic techniques and the utilisation of suitable conditions for optimal viable growth of cells.

Once established, cells in culture can be exploited in many different ways. For instance, they are ideal for studying intracellular processes including protein synthesis, signal transduction mechanisms and drug metabolism. They have also been widely used to understand the mechanisms of drug actions, cell–cell interaction and genetics. Additionally, cell culture technology has been adopted in medicine, where genetic abnormalities can be determined by chromosomal analysis of cells derived, for example, from expectant mothers. Similarly, viral infections can be assayed both qualitatively and quantitatively on isolated cells in culture. In industry, cultured cells are used routinely to test both the pharmacological and toxicological effects of pharmaceutical compounds. This technology thus provides a valuable tool to scientists, offering a user-friendly system that is relatively cheap to run and the exploitation of which avoids the legal, moral and ethical questions generally associated with animal experimentation.


Bekijk de video: Pemuliaan-ags (December 2021).