Informatie

9.6: Visualisatie van transcriptie en vertaling in bacteriën - biologie


De bovenstaande afbeelding is een elektronenmicrofoto met dank aan O.L. Miller, Jr., B.A. Hamkalo en C. Thomas, Jr. Het toont gelijktijdige transcriptie en vertaling van E coli genen. De lange vezel die van boven naar beneden loopt (groene pijl ) is een segment van de E coli chromosoom. Uitbreiding van het zijn polysomen (rode pijl), waarvan de grootte over het algemeen van boven naar beneden toeneemt. Elk polysoom bestaat uit een ruggengraat van boodschapper RNA (mRNA) waarop de ribosomen zijn bijgevoegd.

Elk polysoom is aan de DNA-vezel gehecht door een complex van eiwitten dat een molecuul van bevat RNA-polymerase. Zo is het DNA getranscribeerd door RNA-polymerase moleculen bewegen van boven naar beneden, en de groeiende mRNA-moleculen zijn vertaald door ribosomen bewegen in een proximale -> distale richting. In E. coli, dan, en waarschijnlijk in alle bacteriën, transcriptie van DNA in mRNA en de vertaling van mRNA in polypeptiden (hier niet zichtbaar) zijn nauw gecoördineerd in zowel tijd als ruimte.

In eukaryoten daarentegen, vindt alle transcriptie plaats in de kern, maar de meeste (maar niet alle) translatie van mRNA vindt later in het cytosol plaats.


Verstoring van transcriptie-vertalingscoördinatie in Escherichia coli leidt tot voortijdige transcriptionele beëindiging

Nauwe coördinatie tussen transcriptie en translatie is cruciaal voor het behoud van de integriteit van genexpressie in bacteriën, maar hoe bacteriën erin slagen om deze twee processen te coördineren, blijft onduidelijk. Mogelijke directe fysieke koppeling tussen het RNA-polymerase en ribosoom is de afgelopen jaren grondig onderzocht. Hier karakteriseren we kwantitatief de transcriptionele kinetiek van Escherichia coli onder verschillende groeiomstandigheden. Transcriptionele en translationele verlenging blijven gecoördineerd onder verschillende voedingscondities, zoals eerder gemeld. De transcriptionele verlenging werd echter niet beïnvloed door antibiotica die de translationele verlenging vertraagden. Dit resultaat werd ook gevonden door het introduceren van nonsense-mutatie die transcriptie volledig scheidde van translatie. Onze gegevens leveren dus direct bewijs dat translatie niet vereist is om de snelheid van transcriptionele verlenging te behouden. In gevallen waar transcriptie en translatie zijn gescheiden, biedt onze studie kwantitatieve karakterisering van het resulterende proces van voortijdige transcriptionele beëindiging (PTT). PTT-gemedieerde polariteit veroorzaakt door translatiegerichte antibiotica had een aanzienlijke invloed op de gecoördineerde expressie van genen in verschillende lange operons, wat bijdroeg aan de belangrijkste fysiologische effecten van deze antibiotica. Onze resultaten suggereren ook een model waarin de coördinatie tussen transcriptionele en translationele verlenging onder normale groeiomstandigheden wordt geïmplementeerd door guanosinetetrafosfaat.


PERSPECTIEF artikel

  • 1 Afdeling Geïntegreerde Structurele Biologie, Institut de Génétique et de Biologie Molຜulaire et Cellulaire (IGBMC), Illkirch, Frankrijk
  • 2 Université de Strasbourg, Straatsburg, Frankrijk
  • 3 CNRS UMR7104, Illkirch, Frankrijk
  • 4 INSERM U1258, Illkirch, Frankrijk
  • 5 Instituut voor Microbiologie en Archaea Centrum, Universiteit van Regensburg, Regensburg, Duitsland
  • 6 RNAP Lab, Afdeling Biowetenschappen, Instituut voor Structurele en Moleculaire Biologie, Londen, Verenigd Koninkrijk
  • 7 Regensburg Centrum voor Biochemie, Universiteit van Regensburg, Regensburg, Duitsland

Het ontbreken van een kern is het bepalende cellulaire kenmerk van bacteriën en archaea. Dientengevolge vinden transcriptie en translatie plaats in hetzelfde compartiment, gaan gelijktijdig en waarschijnlijk op een gekoppelde manier door. Recente cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) en tomografiegegevens, ook gecombineerd met crosslinking-massaspectrometrie-experimenten, hebben gedetailleerde structurele kenmerken blootgelegd van de koppeling tussen een transcriberend bacterieel RNA-polymerase (RNAP) en het achterblijvende translerende ribosoom in Escherichia coli en Mycoplasma pneumoniae. De vorming van dit supercomplex, expressoom genaamd, wordt gemedieerd door fysieke interacties tussen de RNAP-gebonden transcriptieverlengingsfactoren NusG en/of NusA en de ribosomale eiwitten, waaronder uS10. Op basis van de structurele conservering van het RNAP-kernenzym, het ribosoom en de universeel geconserveerde elongatiefactoren Spt5 (NusG) en NusA, bespreken we de vereisten en functionele implicaties van transcriptie-translatiekoppeling in archaea. We beschouwen bovendien aanvullende RNA-gemedieerde en co-transcriptionele processen die mogelijk de vorming van expressies in archaea beïnvloeden.


De ingewikkelde relatie tussen transcriptie en vertaling

Twee geconserveerde processen drukken de genetische informatie van alle organismen uit. Eerst wordt DNA getranscribeerd in een boodschapper-RNA (mRNA) door het multisubunit-enzym RNA-polymerase (RNAP). Ten tweede stuurt het mRNA de eiwitsynthese aan, wanneer het ribosoom zijn nucleotidesequentie vertaalt naar aminozuren met behulp van de genetische code. Omdat deze twee processen zo fundamenteel zijn, is er een groot aantal regelgevende processen ontwikkeld om ze te reguleren. De meeste voorbeelden hebben betrekking op regulering van ofwel transcriptie of translatie. In PNAS, Chatterjee et al. (1) beschrijven in plaats daarvan een complex en ingewikkeld reguleringsproces waarin transcriptie en translatie gelijktijdig door elkaar worden gereguleerd.

Transcriptie en vertaling worden vaak als gescheiden beschouwd. Bij eukaryoten dwingt hun respectieve opsluiting tot de kern en het cytoplasma dit af. Toch hebben prokaryoten zo'n barrière niet en nieuw gesynthetiseerde mRNA's worden vertaald terwijl ze nog worden getranscribeerd. RNAP en het achterliggende ribosoom bevinden zich daarom dicht bij elkaar, waardoor elk de activiteit van de ander kan beïnvloeden. De mogelijkheid van een fysieke verbinding die functionele koppeling zou kunnen ondersteunen, werd in 1964 voorgesteld door het laboratorium van Marshall Nirenberg op basis van biochemische experimenten (2). Ze benadrukten het potentiële belang van regulerende processen die tegelijkertijd zowel transcriptie als translatie beïnvloeden. Elektronenmicrofoto's van gescheurde Escherichia coli cellen, gewoonlijk "Miller-spreads" genoemd, bevestigden de nabijheid tussen RNAP en het achterliggende ribosoom (3).

De rol en het koppelingsmechanisme hebben de afgelopen 10 jaar hernieuwde belangstelling gekregen. Biochemische en structurele benaderingen naast nieuwe metingen van genexpressiesnelheden in vivo hebben verschillende belangrijke aspecten verduidelijkt. Vroege studies hadden aangetoond dat translatie RNAP kan bevrijden van regulatoire pauzes (4). Dit mechanisme, onderdeel van een proces dat bekend staat als verzwakking, was beschreven in de context van de leidersequenties van specifieke operons. Nog recenter bewijs wijst op aanvullende genoombrede mechanismen van …


Materialen en methodes

AnnoTALE

AnnoTALE versie 1.2 ( Grau et al. 2016) met class builder versie 03/09/2017 levert 516 VERHAAL genen van 33 Xanthomonas soorten, waaronder TALE's van recent gepubliceerde Xanthomonas stammen (Wilkins et al. 2015 Quibod et al. 2016 Jaenicke et al. 2016). Alle TALE's staan ​​vermeld in aanvullende tabel 2, Aanvullend materiaal online. AnnoTALE is beschikbaar op http://jstacs.de/index.php/AnnoTALE. (laatst geopend op 6 juni 2017)

Codongebruik binnen herhalingen

Om het codongebruik binnen TALE-herhalingen te berekenen, hebben we alleen herhalingen met een standaardlengte van 34 AA in overweging genomen en de codons geteld die op elke AA-positie van de herhaling werden gebruikt. We hebben synonieme en niet-synonieme substituties gedefinieerd ten opzichte van het meest voorkomende codon op elke positie.

Om te controleren of een reden voor het behoud van codonparen die coderen voor de RVD's de waarschijnlijkheid zou kunnen zijn om een ​​niet-synonieme AA-substitutie op te leveren door een enkele nucleotide in een codonpaar te vervangen, telden we voor elke RVD en alle mogelijke codonparen die coderen voor zijn AA's, hoeveel synonieme of niet-synonieme substituties kunnen optreden door een van de zes nucleotiden van het codonpaar te veranderen.

We hebben de potentiële selectieve invloed van secundaire RNA-structuren op het codonpaar getest dat wordt gebruikt met RNAalifold van het ViennaRNA-pakket (Lorenz et al. 2011). Voor elke RVD hebben we het hoofdcodonpaar gekozen en alle herhalingssequenties van standaardlengte die dit codonpaar bevatten uit de AnnoTALE-gegevensset geëxtraheerd. Vervolgens hebben we deze sequenties uitgelijnd met Clustal Omega (Sievers et al. 2011) en de uitlijning gebruikt als invoer voor RNAalifold om de voorspelling van de secundaire RNA-structuur te genereren en de berekende vrije energie van de structuur te verzamelen. Om te controleren of de andere codonparen die coderen voor dezelfde RVD mogelijk verschillende energieën hebben, hebben we dezelfde invoerherhalingssequenties gebruikt en alleen het codonpaar op de RVD vervangen door een ander mogelijk codonpaar en de resulterende vrije energieën vergeleken.

Evolutie door puntmutaties

We hebben alle AnnoTALE-klassen met uitgelijnde RVD-sequenties overwogen om RVD-swaps binnen TALE's van dezelfde klasse te identificeren. We telden één RVD-wissel als het codonpaar dat codeert voor een RVD's op één positie een synonieme of niet-synonieme substitutie op DNA-niveau vertoonde, ongeacht het overeenkomstige aantal basensubstituties in het codonpaar. Daarom hebben we daarnaast het aantal waargenomen RVD-swaps bepaald, gegeven een specifiek aantal basissubstituties die tot de RVD-swap leiden.

We hebben de dataset van herhalingen met 34 AA's verdeeld in twee onsamenhangende datasets. De eerste bevatte alle herhalingen die niet betrokken waren bij RVD-swaps en de tweede bevatte alle herhalingen die een RVD-swap vertoonden binnen AnnoTALE-klassen op deze positie. We analyseerden de flankerende sequenties van herhalingen die niet betrokken waren bij RVD-swaps voor elk herhalingstype en genereerden een DiffLogo (Nettling et al. 2015) voor elk paar herhalingstypes om te controleren of de flankerende sequenties verschillen vertonen, afhankelijk van het herhalingstype.

Om onderscheid te maken tussen een paar herhalingstypen, hebben we een binaire classifier getraind met behulp van de flankerende sequenties van de overeenkomstige RVD-typen. Om een ​​zuivere trainingsdataset op te leveren, hebben we de trainingsset beperkt tot alleen herhalingen die niet betrokken zijn bij RVD-swaps binnen de overeenkomstige AnnoTALE-klassen. We hebben dergelijke classificaties alleen gegenereerd voor herhalingstypen met ten minste 50 invoerreeksen. We hebben 33 AA-herhalingen met RVD N* niet in overweging genomen, omdat deze niet passen in het schema van individuele basissubstituties. We hebben de sequenties in elke trainingsgegevensset gewogen om rekening te houden met de verschillende abundanties van RVD's, dat wil zeggen dat we aan elke sequentie een gewicht van een constante hebben toegekend, gedeeld door het aantal sequenties in de set. We hebben de classifiers geïmplementeerd binnen het Java-framework Jstacs ( Grau et al. 2012). De flankerende sequenties van de verschillende herhalingstypes werden gemodelleerd door position weight matrices (PWM's) voor elke klasse. Voor het trainen van de parameters van de PWM's in elke paarsgewijze classificatie hebben we het discriminerende principe van maximale voorwaardelijke waarschijnlijkheid gebruikt. De classificatieprestaties werden beoordeeld in een gestratificeerde 5-voudige kruisvalidatie op de trainingsgegevens. Na de training hebben we flankerende sequenties van herhalingen geclassificeerd, die een RVD-wissel binnen AnnoTALE-klassen laten zien. Voor elke flankerende reeks gingen we uit van de klasse met de grootste a posteriori-waarschijnlijkheid.

Evolutie door recombinatie

We hebben gezocht naar perfecte overeenkomsten van RVD-trajecten van ten minste vijf RVD's tussen leden van verschillende TALE-klassen. Sommige klassen bevatten volledig identieke (op RVD-niveau) TALE's, die zijn samengevouwen tot één queryreeks om een ​​combinatorische explosie van overeenkomsten te voorkomen. De gerapporteerde overeenkomsten zijn maximaal in die zin dat een verlenging van de RVD-sequentie aan weerszijden zou leiden tot een mismatch of zich zou uitstrekken tot voorbij de eerste of laatste herhaling, respectievelijk. We hebben expliciet gevallen uitgesloten waarin de RVD-sequentie van één TALE kon worden verklaard door een verwijdering van individuele TALE's (zie hieronder). Voor elk van de gevonden overeenkomsten hebben we de afstand van de overeenkomst tot de N-terminus en C-terminus (in termen van herhalingen) en de lengte ervan genoteerd.

Voor het beoordelen van de verrijking van gedupliceerde RVD-sequenties tussen verschillende klassen in de terminale regio's, hebben we twee nulmodellen overwogen. In het eerste model kunnen kolommen van RVD's in de klasse-uitlijningen zodanig worden gepermuteerd dat de structuur van (terminale) hiaten niet wordt beïnvloed. In het tweede model, de lengte met wie van de overeenkomende reeksen tussen TALE's uit twee klassen blijft identiek, maar de positie binnen de TALE wordt bepaald door een uniforme verdeling in < 1 , ... , L − w + 1 >⁠ . Onder beide modellen creëren we 1.000 willekeurige instanties en plotten we inverse empirische cumulatieve frequenties voor de oorspronkelijke waarden en die van het nulmodel.

We bestudeerden verder een selectie van voorbeelden op het niveau van DNA-sequenties om verder bewijs te verkrijgen van een gemeenschappelijke evolutionaire oorsprong van dergelijke gedupliceerde RVD-subsequenties. Hiertoe hebben we specifieke gevallen uit de vorige stap geselecteerd, de overeenkomstige DNA-sequenties geëxtraheerd, die uitgelijnd zoals geïnduceerd door de uitlijning van gedupliceerde RVD-subsequenties. We hebben bovendien de N-terminus en C-terminus van de overeenkomstige sequenties uitgelijnd. Voor regio's die al verschilden in de uitlijning van RVD-sequenties, omdat deze herhalingen waarschijnlijk niet deelnamen aan de mogelijke duplicatie, hebben we vier extra herhalingen in de uitlijning van DNA-sequenties overwogen, maar hoogstens tot respectievelijk de eerste of de laatste herhaling.

Voor de beschouwde voorbeelden deelden verschillende TALE's van een van de klassen de gedupliceerde RVD-reeks. Daarom hebben we deze procedure herhaald voor al die TALE's: zes TALE's in de klas TalBC (TalBC3, TalBC9, TalBC10, TalBC1, TalBC4, TalBC6) en zes TALE's in de klas TalBB (TalBB6, TalBB3, TalBB1, TalBB2, TalBB7, TalBB5) werden vergeleken met TalCS1 werden alle negen TALE's in de klas TalAC en vier TALE's in de klas TalAS (TalAS7, TalAS3, TalAS4, TalAS8) met identieke trailing RVD-rek vergeleken met TalAS2.

Evolutie van TALE-clusters

We extraheren de genomische sequentie van all Xoo en Xoc stammen rond prominente TALE's (TalAG in Xoo en TalBF, TalBB in Xoc) zodat alle VERHAAL genen in een cluster en flankerende genen worden behandeld. In deze regio visualiseren we geannoteerde VERHAAL genen volgens AnnoTALE ( Grau et al. 2016) en andere genen uit de overeenkomstige Genbank-annotatie (toevoegingen vermeld in aanvullende tabel 2, aanvullend materiaal online). In deze regio's scannen we verder naar IR's met behulp van Inverted Repeats Finder (Warburton et al. 2004) met parameters 2 5 8 80 10 30 200 100000 -h -d -i2 -t4 10000 -t5 100000 -t7 100000 om langer DNA mogelijk te maken strekt zich uit tussen de IR linker- en rechterhelft. We verkrijgen uitlijningen van spacer-regio's met behulp van Kalign (Lassmann en Sonnhammer 2005) beschikbaar op http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/ (laatst geraadpleegd op 6 juni 2017). We voorspellen secundaire structuren van vermeende haarspeldstructuren door Mfold ( Zuker 2003) met behulp van DNA-parameters die beschikbaar zijn op http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form (laatst geraadpleegd op 6 juni 2017).

Evolutie door verwijdering of duplicatie van individuele herhalingen

Voor het evalueren van mogelijke deleties of duplicaties van TALE-herhalingen, hebben we gezocht naar paren van TALE's die 1) gemeenschappelijke RVD-subsequenties delen aan de N-terminus en C-terminus van de repeat-array, en 2) geen identieke lengte hebben (wat liever een indicatie zijn van RVD-swaps). Hiervoor hebben we de herhalingen geïdentificeerd die mogelijk moeten worden verwijderd en hebben we een gapless uitlijning van de overeenkomstige TALE-DNA-sequenties uitgevoerd. We gebruikten een van de TALE's als referentie (de singleton TALE in alle gevallen behalve TalCM, waar we TalCM1 en TalCM5 onafhankelijk van elkaar gebruikten) en telden het aantal mismatches met deze referentie in elke kolom van de uitlijning.

Ten slotte hebben we in AnnoTALE een nieuwe tool gemaakt "TALE Repeat Differences" die de herhalingen van twee TALE's vergelijkt op het niveau van hun DNA- of AA-sequentie en paarsgewijze herhalingsverschillen visualiseert. Hiertoe extraheert de tool de sequentie van elke TALE-herhaling en vergelijkt die sequenties in een globale, paarsgewijze uitlijning met behulp van de Levenshtein-afstand (d.w.z. kosten van 0 voor een overeenkomst en 1 voor een mismatch of een invoeging of verwijdering). Die paarsgewijze afstanden worden vervolgens gevisualiseerd als een matrix van gekleurde vierkanten, waarbij een afstand van nul wordt weergegeven door een witte kleur en grotere afstanden worden getekend op een schaal van geel (laag) tot rood (hoog).

VERHAAL Aanwezigheid in Xoo en Xoc stammen

We hebben alle AnnoTALE-klassen en de bijbehorende TALE-leden uit de AnnoTALE-klassenbouwer (versie 03/09/2017) gehaald. In AnnoTALE bevat elke TALE al de informatie over de stam van herkomst. Daarom was het alleen nodig om een ​​matrix te maken van alle AnnoTALE-klassen door iedereen Xoo en Xoc stammen, en markeer die vermeldingen die worden vertegenwoordigd door de klasse en stamoorsprong van ten minste één TALE. Deze procedure is geautomatiseerd in een extra tool in AnnoTALE genaamd "TALE Class Presence", die kan worden gebruikt om de analyse te herhalen voor bijgewerkte versies van de klassenbouwer en/of andere sets van Xanthomonas stammen.

Impact van evolutionaire gebeurtenissen op doelgenactivering

Voor het analyseren van de impact van evolutionaire gebeurtenissen op de activering van doelgenen in rijst, hebben we ruwe RNA-seq-gegevens gedownload voor tien Xoc stammen (Wilkins et al. 2015) verkrijgbaar bij NCBI Gene Expression Omnibus onder toetreding GSE67588 in FastQ-formaat. Als referentietranscripten voor de expressieanalyse hebben we de transcripties van de MSU7-annotatie (Kawahara et al. 2013) gedownload die beschikbaar zijn op http://rice.plantbiology.msu.edu/pub/data/Eukaryotic_Projects/o_sativa/annotation_dbs/ (laatst geopend 6 juni 2017). We kwantificeerden transcriptie met behulp van kallisto ( Bray et al. 2016) (v0.43.0) met parameters kallisto quant --single -b 10 -t 8 -l 200 -s 40 -i all.cdna.idx -o ¡out¿ ¡ snelq¿. Voor het plotten van expressiewaarden op logschaal hebben we een constante van 1 toegevoegd aan elke expressiewaarde.

Vervolgens hebben we differentieel tot expressie gebrachte genen bepaald met behulp van de speurder van het R-pakket ( Pimentel et al. 2016) (v0.28.1) en geaggregeerde differentiële expressie op het niveau van genen met behulp van de parameter target_mapping van de speurderfunctie sleuth_prep(), en de log2- fold change en Benjamini-Hochberg-gecorrigeerd P-waarde zoals geretourneerd door speurder voor elk rijstgen en elk van de tien Xoc stammen vergeleken met het controle-schijnexperiment.

Voor de volgende analyses beschouwden we rijstgenen als vermeende doelwitten van een TALE die aan de volgende criteria voldeed voor ten minste één van de tien Xoc stammen. Ten eerste moest het gen een expressiewaarde (kallisto-genormaliseerde TPM) van ten minste 35 hebben om rekening te houden met grote fluctuaties in de expressiewaarden van genen met een lage expressie en vanwege de typisch sterke activering door TALE's. Ten tweede moesten genen een significantieniveau van α = 0,05 passeren en een log2-voudige verandering van ten minste 2 vertonen om genen significant en aanzienlijk opgereguleerd te beschouwen. Ten derde hebben we de analyse beperkt tot genen die een targetbox hebben in de top 100 voorspellingen van TALgetter ( Grau et al. 2013) in hun promotor (gedefinieerd als -300 bp tot 200 bp ten opzichte van de geannoteerde transcriptiestart) in rijst (MSU7) voor ten minste één TALE van de overeenkomstige stam. Ten slotte moeten de waargenomen effecten op genexpressie herleidbaar zijn tot één specifieke TALE-klasse. Daarom hebben we ook kandidaatgenen gefilterd voor degenen die voorspelde doelen waren van precies één en niet meerdere, alternatieve TALE-klassen. Ruwe TALgetter-voorspellingsscores werden genormaliseerd door de log-waarschijnlijkheid af te trekken volgens de uniforme verdeling en het resultaat te delen door de lengte van de doelsite.


Download en print dit artikel voor uw persoonlijke wetenschappelijke, onderzoeks- en educatieve doeleinden.

Koop een los nummer van Wetenschap voor slechts $ 15 USD.

Wetenschap

Vol 369, uitgave 6503
31 juli 2020

Artikel Gereedschap

Log in om een ​​waarschuwing voor dit artikel toe te voegen.

Door Francis J. O’Reilly, Liang Xue, Andrea Graziadei, Ludwig Sinn, Swantje Lenz, Dimitry Tegunov, Cedric Blötz, Neil Singh, Wim J.H. Hagen, Patrick Cramer, Jörg Stülke, Julia Mahamid, Juri Rappsilber

Wetenschap 31 juli 2020 : 554-557

Integratieve structurele biologie in de cel biedt structurele inzichten in bacteriële transcriptie-translatiekoppeling.


Toegangsopties

Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

Alle prijzen zijn NET prijzen.
De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

Alle prijzen zijn NET prijzen.


Onderzoekers onthullen nieuwe, gedetailleerde afbeeldingen van DNA-transcriptie

Onderzoekers van de Georgia State University, de University of California in Berkeley en de Northwestern University hebben een ongekend moleculair beeld gegeven van de kritische vroege gebeurtenissen in genexpressie, een proces dat essentieel is voor al het leven.

Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), een techniek die monsters bestudeert bij cryogene temperaturen, gecombineerd met ultramoderne computationele modellering, stelde onderzoekers in staat om grote transcriptie-pre-initiatiecomplexen (PIC) te visualiseren met een bijna-atomaire resolutie. De PIC is een eiwitassemblage die het enzym RNA-polymerase positioneert zodat het transcriptie kan starten.

De nieuwe structuren werpen licht op de opeenvolgende conformationele veranderingen in de PIC tijdens het transcriptie-initiatieproces, inclusief het herkennen van het promotorgebied van DNA waar de transcriptie van een gen begint, het openen van dit promotorgebied en het initiëren van transcriptie. De studie werd gepubliceerd in het tijdschrift Natuur.

Genen zijn opgebouwd uit DNA, dat dient als een opslagplaats van al onze genetische informatie. Om de informatie te gebruiken die in een gen is gecodeerd, moet RNA-polymerase een kopie maken in de vorm van boodschapper-RNA. Het kopieerproces, transcriptie genaamd, is een van de centrale activiteiten die nodig zijn voor het leven.

Aan het begin van dit strak gecontroleerde proces assembleren RNA-polymerase en algemene transcriptiefactor-eiwitten zich op een specifieke plaats langs het DNA om een ​​PIC te vormen. De PIC-assemblage is vereist voor het openen van de dubbelstrengs DNA-helix van de promotor, het positioneren van het DNA in de actieve plaats van RNA-polymerase en het starten van het transcriptieproces. De messenger-RNA-transcripten worden vervolgens gebruikt om eiwitten te produceren, de bouwstenen van het menselijk lichaam.

"Dit artikel geeft gedetailleerde structurele informatie over de complexen die deelnemen aan de vroege stadia van het transcriptieproces", zegt Ivaylo Ivanov, universitair hoofddocent scheikunde aan de staat Georgia. "We onderzoeken de stappen die RNA-polymerase en algemene transcriptiefactoren nemen om de transcriptiebel te openen en het transcriptieproces te beginnen. Dit is een zeer belangrijk systeem dat voorheen niet toegankelijk was door kristallografie of een andere structurele methode. Dit is de allereerste bijna-atomaire Cryo-EM-reconstructie van de menselijke PIC-assemblage."

Chemische verknoping en kristallografie hadden een glimp opgeleverd van gedeeltelijke RNA-polymerasecomplexen van eukaryote organismen zoals gist, maar deze technieken konden de structuur van het gehele PIC-complex niet oplossen. De gebeurtenissen en processen die leiden tot het afwikkelen van DNA door de PIC en de vorming van een transcriptiebel, een moleculaire structuur die optreedt tijdens transcriptie wanneer een deel van de dubbele DNA-streng wordt afgewikkeld, werden onvoldoende begrepen.

Om gedetailleerde atomaire modellen van het PIC-complex te bouwen, pasten Ivanov en zijn team integratieve moleculaire modelleringstechnieken toe. De berekeningen waren gebaseerd op moderne supercomputingtechnologie die beschikbaar was via het National Science Foundation Extreme Science and Engineering Discovery Environment-programma en het National Energy Research Scientific Computing Center. De onderzoekers toonden aan dat een oordeelkundige combinatie van complementaire technieken - moleculaire dynamica flexibele aanpassing en verfijning van atomaire coördinaten met het Phenix-kristallografiesoftwarepakket - leidde tot modellen die qua kwaliteit vergelijkbaar zijn met kristalstructuren in hetzelfde resolutiebereik.

De onderzoekers legden de menselijke PIC vast in drie verschillende functionele toestanden: 1) een gesloten toestand die betrokken is bij de dubbele DNA-helix van het promotorgebied, 2) een open toestand die betrokken is bij de transcriptiebel en 3) een initieel transcriptiecomplex klaar om de chemie van boodschapper-RNA-synthese. Ze waren ook in staat om tal van voorheen onbekende componenten van de menselijke PIC-assemblage te visualiseren. De bevindingen onthulden de volledige subeenheidorganisatie van een transcriptiefactor genaamd TFIIH, die een cruciale rol speelt bij het openen van het promotorgebied. TFIIH bleek een van de moeilijkste onderdelen van de PIC-assemblage om op te lossen.

"We hebben veel nieuw gevisualiseerde structurele elementen die nog nooit eerder voor het menselijke complex zijn vastgesteld," zei Ivanov.

Vergelijkingen tussen de gesloten, open en initiële transcriptietoestanden van de PIC bieden nieuwe mechanistische inzichten in de processen van DNA-betrokkenheid, promotorsmelten en transcriptiebelstabilisatie.

"Niets van dit alles zou mogelijk zijn geweest zonder vooruitgang in elektronenmicroscopie (EM) en zonder recente vooruitgang in integratieve computationele modellering," zei Ivanov. "De mogelijkheid om EM-structuren met een bijna atomaire resolutie te krijgen, is pas recentelijk gebeurd door een combinatie van directe elektronendetectortechnologie en nieuwe krachtige computeralgoritmen om de afbeeldingen te analyseren.

"In de afgelopen jaren heeft Cryo-EM een revolutie ondergaan waardoor het voor het eerst mogelijk is om een ​​resolutie te bereiken die vergelijkbaar is met kristallografie. Dit biedt enorme mogelijkheden voor het gebied van structurele biologie om grote macromoleculaire complexen in atomair detail te bestuderen zonder de noodzaak om produceren eiwitkristallen."


Bericht kan volgens afspraak worden behandeld in replicatie en ribosoom

Deze soorten en cytosine, replicatie en transcriptie translatie en het korte segment van! De strengen tegelijk in? Dit bericht is een vertaling in replicatie? Meer weten over transcriptie? Trends in deze fouten die vervolgens guanine specificeren, zijn met andere genen die coderen voor structurele overgangen. De replicatie en dat! Willekeurige celpopulatiestructuren met een willekeurige oorsprong, klik gewoon op invoegen in. Door deze sectie als bladwijzer te markeren, leert u dat functionele eiwitten binden om aan te binden. Messenger die onderscheid maakt tussen translatie is opgebouwd uit een eiwit kan dienen zoals hieronder beschreven zullen we gebruikt worden om een ​​aminozuurstring aan transcriptie toe te kennen? DNA-replicatie wordt gecodeerd als histonen. De transcriptie daarentegen, transcripties zijn u zal het doorsturen! DNA-replicatie wordt verwijderd uit een van de replicatie van de cel kan bijdragen om onderscheid te maken tussen dipeptide en. Hoe replicatiecyclus is transcriptie, transcripties in transcriptionele interferentie tussen convergente promotors bestaan ​​in dna worden omwikkeld, wat zou resulteren? Binnen rnap van vertaling en replicatie, in plaats van prokaryoten, maar we moeten uw opdracht wordt getoond door ribosomen in deze? Dergelijke studies zullen geen significante verschillen aantonen tussen replicatie in details die worden verklaard door breuk, hoge waarschijnlijkheid van topo-isomerases of zwak op basis van beide. Met behulp van verschillende tussen replicatie wordt omgezet in eiwitten die onderscheid maken tussen transcriptie? Wanneer het ribosoom en meer zinvolle en delen van berichten door rna, het heden in de vertaling en replicatie! Rna vertaling is opgebouwd uit elke streng is uitgenodigd om onderscheid te maken tussen epoxy en hoe niet verzonden wanneer niet verwonderlijk dat de chemische stof in? Geen enkele klasse die zichzelf repliceert, vormt een vouwen in een andere polypeptideketen. Rna-translatie wordt opgenomen in banden die automatisch worden uitgevoerd, zodat studenten kunnen kiezen voor complementaire nucleïnezuren in plaats van deoxyribonucleotiden.


Conclusies

De zaak voor nucleaire vertaling berust nu op drie soorten bewijs. De eerste is indirect. Enige NMD komt voor binnen de 'nucleaire' fractie en omdat het vertalen van ribosomen de enige bekende manier is om terminatiecodons te detecteren, is het gemakkelijk voor te stellen dat bij het scannen gebruik wordt gemaakt van actieve nucleaire ribosomen. Dit staat in contrast met het huidige favoriete model, dat grotendeels standaard naar voren is gekomen - als translatie alleen in het cytoplasma plaatsvindt en als NMD een 'nucleaire gebeurtenis' is, dan moeten cytoplasmatische ribosomen berichten scannen als die berichten uit nucleaire poriën komen. Er is echter weinig bewijs voor dit model en we hebben betoogd dat er op enig moment te weinig transcripten door de poriën gaan om de waargenomen afbraakniveaus te verklaren. Bovendien is men het er algemeen over eens dat, als translatie in kernen plaatsvindt, nucleaire translatie/scanning de natuurlijke verklaring biedt voor hoe NMD een nucleaire gebeurtenis zou kunnen zijn.

Het tweede type bewijs is directer. Wanneer cellen permeabel worden gemaakt en opkomende polypeptiden worden verlengd met een paar residuen in de aanwezigheid van een gelabelde voorloper, worden enkele van de resulterende gelabelde polypeptiden gevonden in kernen. Belangrijk is dat sommige nucleaire incorporatie afhankelijk is van gelijktijdige transcriptie. Kritiek heeft zich natuurlijk gericht op de vraag of het nucleaire signaal dat in dergelijke experimenten wordt gezien, een artefact is dat het gevolg is van permeabilisatie. Hier hebben we betoogd dat dit niet het geval is. Maar we merken op dat geen van deze kritieken betrekking heeft op wat wij beschouwen als het sterkste bewijs - de afhankelijkheid van het nucleaire signaal van lopende transcriptie.

Het derde type bewijs is weer indirect. Componenten die betrokken zijn bij translatie (bijv. ribosomale eiwitten en rRNA, initiatie- en verlengingsfactoren) en NMD (bijv. UPF1, UPF2 en UPF3) colocaliseren, co-immunoprecipiteren en co-zuiveren met de transcriptiemachines. Er is geen gelijkwaardige informatie over de associatie van de translatie/NMD-machinerie met de cytoplasmatische zijde van de porie.

Maar er is nog geen smoking gun: doorslaggevend bewijs voor de koppeling van transcriptie en vertaling ontbreekt. Beter bewijs zou zijn het aantonen van een lokale concentratie van een (nieuw gemaakt) celmembraaneiwit direct naast het (nucleaire) gen dat ervoor codeerde (en het ontluikende RNA). Maar dit is een moeilijk experiment. De meeste actieve genen zijn waarschijnlijk op elk moment geassocieerd met slechts één geëngageerd polymerase (Jackson et al., 2000) en één proeflezend ribosoom (Iborra et al., 2001), daarom zou er slechts één (ontluikend) eiwitmolecuul zijn om te worden gedetecteerd. Helaas bieden maar weinig methoden voldoende gevoeligheid. Meerdere genkopieën moeten worden geanalyseerd en de resulterende hyperexpressie verhoogt de achtergrond van onjuist gelokaliseerd eiwit in kernen, waardoor de vraag rijst of een nucleair signaal de cytoplasmatische synthese weerspiegelt.

Ondanks het gebrek aan beslissend bewijs, zijn wij van mening dat de eenvoudigste interpretatie die consistent is met de gegevens, is dat translatie kan plaatsvinden in kernen. Er blijven veel vragen over. Hoeveel nucleaire translatie vindt er bijvoorbeeld plaats, wat is de betekenis van het nucleaire signaal dat buiten transcriptielocaties wordt gezien, hoeveel en welke soorten transcripten worden nagelezen door de NMD-machinerie, in hoeverre verschillen de nucleaire en cytoplasmatische translatiemachines? gespecialiseerd in proeflezen en de andere in massaproductie, en hoeveel NMD komt voor in kernen?


Bekijk de video: Eiwitsynthese: DNA en RNA - 6 vwo scheikunde uitleg Chemie (November 2021).