Informatie

Is de CMV-promotor actief in gist?


Ik wil gist transfecteren en wil mijn efficiëntie controleren. Dus ik dacht pEGFP-N1 als controle te gebruiken. De EGFP wordt aangestuurd door een CMV-promotor. Kan gist CMV-promoters lezen. Bedankt Hermann


Ja (referentie)

Hoewel ik je vraag interessant vond, was dit zo'n beetje de eerste hit toen ik "CMV-gist" typte in Google Scholar. Je moet daar echt eerst kijken voordat je het vraagt!


De CMV early enhancer/chicken β actine (CAG) promoter kan worden gebruikt om transgenexpressie aan te sturen tijdens de differentiatie van muizenembryostamcellen tot vasculaire voorlopers

Embryonale stamcellen van muizen gekweekt in vitro hebben het vermogen om te differentiëren in cellen van de drie kiemlagen en kiemcellen. De differentiatie bootst vroege ontwikkelingsgebeurtenissen na, waaronder vasculogenese en vroege angiogenese, en verschillende differentiatiesystemen worden gebruikt om factoren te identificeren die belangrijk zijn tijdens de vorming van het vasculaire systeem. Embryonale stamcellen zijn moeilijk te transfecteren, terwijl downregulatie van promotoractiviteit bij selectie van stabiele transfectanten is gemeld, waardoor de studie van eiwitten door overexpressie moeilijk is.

Resultaten

CCE-embryostamcellen van muizen werden gedurende 4-5 dagen gedifferentieerd op collageen type IV, Flk1 + mesodermale cellen werden gesorteerd en opnieuw uitgeplaat op collageen type IV in de aanwezigheid van VEGFA om endotheelcellen en gladde spiercellen te veroorzaken, of in collageen type I gels voor de vorming van vasculaire buizen. De activiteit van de CMV- en β-actine-promotors werd neerwaarts gereguleerd tijdens selectie van stabiele transfectanten en tijdens differentiatie naar het Flk1-stadium, terwijl de CMV-directe versterker/β-actine-promoter in de pCAGIPuro-GFP-vector leidde tot 100% stabiel getransfecteerde ongedifferentieerde en gedifferentieerde cellen die GFP tot expressie brengen. Om dit systeem verder te testen brachten we syndecan-2 en -4 in deze cellen tot expressie en toonden hoge niveaus van transgenexpressie in zowel ongedifferentieerde cellen als cellen die gedifferentieerd waren tot het Flk1-stadium.

Conclusie

Vectoren die de CAG-promoter bevatten, bieden een waardevol hulpmiddel voor de langdurige expressie van transgenen tijdens stamceldifferentiatie naar mesoderm, terwijl de CMV- en β-actine-promotors tijdens dit proces tot zeer slechte transgenexpressie leiden.


Achtergrond

Een van de kenmerken van synthetische biologie is de novo ontwerp en synthese van biologische functionele onderdelen en apparaten. Promotors zijn vooral belangrijk voor het regelen van de regulatie-modi en sterke punten van genexpressie, en genereren de juiste hoeveelheden enzymen om het cellulaire metabolisme te optimaliseren. Gist is een van de meest gebruikte chassis in het onderzoek naar synthetische biologie en biedt uitstekende prestaties als celfabrieken om gevarieerde waardevolle biochemicaliën te produceren [1,2,3]. De juiste promotorsterkten hadden een drastische invloed op de efficiëntie van heterologe synthetische routes in gist en de daaruit voortvloeiende productsamenstellingen [4,5,6,7]. Recente werken hebben de modulaire architectuur van gistpromotors vastgesteld, zoals in bakkersgist Saccharomyces cerevisiae, methylotroof Pichia pastoris en olieachtig Yarrowia lipolytica [8,9,10,11,12,13]. Het werk van Redden en Alper is vooral uitstekend omdat ze een ontwerpmodus van een minimale gistpromotor definieerden en bewezen die hoge expressieniveaus behield met bijna 80% reductie in grootte [8]. De minimale modulaire gistpromotor bestaat uit verschillende basisonderdelen, namelijk hybride stroomopwaartse activeringssequentie (UAS), neutrale AT-rijke spacer, TATA-box, N30 kernpromotor en transcriptionele startplaats (TSS). Dit werk biedt een grote kans voor het ontwerpen van kunstmatige promotors met meer algemene sequenties.

Van deze modulaire onderdelen hebben UAS, AT-rijke spacer, TATA-box en TSS onderscheidende conservatieve kenmerken, aangezien slechts een beperkt aantal natuurlijke of kunstmatige sequenties de sterkte van de promoter zou behouden of verbeteren, maar de meeste gemanipuleerde sequenties verminderen de sterkte van de promoter drastisch [6, 8,9 ,10,11,12,13,14,15,16]. Daarentegen beïnvloedde de kernpromotorsequentie stroomafwaarts van de TATA-box de glijsnelheid van RNA-polymerase II voordat het mRNA werd gegenereerd, wat ook de maximale promotoractiviteit bepaalde. Dit gebied biedt meer ruimte voor kunstmatig ontwerp, maar heeft ook zijn eigen beperktheid, omdat de grondig gerandomiseerde sequenties de effectieve sequentie zullen overweldigen die de kracht van de promotor verbetert. Het recente werk van Portela en collega's maakte een opmerkelijke kans om een ​​universele modus van kernpromotor te ontwerpen die in verschillende gistsoorten zou kunnen worden gebruikt [17]. Het blijft de vraag of dit gebied kan worden vervangen door een de novo ontworpen kunstmatige sequentie.

Vanuit een andere hoek hebben we dit soort de novo ontworpen kunstmatige promotors nodig als streepjescodes om genexpressie op genoomniveau te markeren om de genoomherschikking te onderzoeken [18, 19]. De kunstmatige streepjescodes van promotors zullen de analyse van synthetische genomische evolutie verder helpen. Gezien dit punt zijn we van plan een reeks kunstmatige kernpromotorsequenties te construeren en hun prestaties te karakteriseren om een ​​soort regel te krijgen. In de huidige studie hebben we kunstmatige kernpromotors geconstrueerd in Y. lipolytica, die is ontwikkeld voor het produceren van waardevolle chemicaliën als vetzuurderivaten, organische zuren, terpenoïden en sterolen [20,21,22]. We kozen voor een bestaand object dat de kunstmatige promotors de expressieniveaus van CrtY-enzym zouden kunnen verhogen om een ​​hogere bèta-caroteenproductie van het substraat lycopeen te krijgen (Fig. 1). We konden snel gewenste promotors in de gistkolonies screenen met verschillende kleuren rood-oranje-geel die verschillende lycopeen-caroteensamenstellingen vertoonden (Fig. 1). De kolonies met een lycopeenproductie van 1,2 mg/g DCW en veel hoger 25 mg/g zouden een sterk gedifferentieerd kleurenspectrum vertonen. We ontwierpen twee series van N30 kern promotors. De eerste reeksen bevonden zich stroomafwaarts van een natuurlijke promotor PEXP1 en verving de originele 55 bases tussen TATA-box en TSS in PEXP1. De tweede reeks verving het oorspronkelijke gebied van 61 basen tussen TATA-box en de TSS in een andere natuurlijke promotor PGPD. Beide promotors werden vaak gebruikt en bezaten duidelijk sterkere sterke punten dan andere promotors. sinds N30 grote bibliotheek was, hebben we ons hier gericht op het testen van de invloeden van T-rijke modules en G/C-rijke modules op de kracht van de kernpromotor.

Concept van het screenen van kunstmatige kernpromotors bijgestaan ​​door gistkolonie-kleurenspectrum. De kunstmatige promotors veranderden het expressieniveau van het CrtY-enzym en stemden de lycopeen-caroteensamenstelling af, wat leidde tot een variabele kleurverdeling van de gistkolonie. Bij de soort met een lage lycopeenproductie hebben we twee kleuren waargenomen, namelijk het oorspronkelijke lichtrood en het nieuwe lichtgeel. In de stam met een hogere lycopeenproductie hebben we drie kleuren waargenomen als het originele rood en het nieuwe oranje en geel


Resultaten

Een gemodificeerd retroviraal systeem dat in staat is tot het uitschakelen en uitdrukken van genen

Primaire macrofagen van muizen zijn moeilijk te transfecteren of te nucleofecteren. Ze kunnen echter worden geïnfecteerd met retrovirussen. We vergeleken verschillende gecommercialiseerde retrovirale vectoren en ontdekten dat pSuper-Retro-puro van Oligoengine het beste werkte voor virusproductie. Het heeft ten minste twee bevestigde kenmerken, de ene is de shRNA-expressie die wordt aangestuurd door de H1-promotor, de andere is de expressie van de puromycine-geneesmiddelresistentiemarker die wordt aangestuurd door de PKG-promotor. Het is echter mogelijk dat de H1-promotor niet met dezelfde sterkte werkt als een U6-promotor voor shRNA-expressie (16), en deze vector mist de kloneringsplaatsen voor exogene genexpressie. We hebben deze vector daarom gewijzigd in een nieuwe retrovirale vector, die in staat is tot het uitschakelen en uitdrukken van genen, terwijl de expressiefunctie van puromycineresistentie behouden blijft. Zoals geïllustreerd in figuur 1A, hebben we de H1-promoter in pSuperRetro-puro verwijderd en de meerdere kloneringsplaatsen (MCS1) gereserveerd voor het klonen van de U6-promotor die shRNA-expressie aanstuurt. Het is aangetoond dat de menselijke UbiC-promotor constitutief actief is in een verscheidenheid aan cellen en weefsels (27) en werd geselecteerd om de expressie van een exogeen gen en puromycineresistentiegen aan te sturen, gescheiden door SV40-promoter. MCS2 tussen UbiC en SV40 maakt het kloneren van exogeen gen mogelijk. We hebben vectoren afgeleid met C-terminale Flag-His6 (FH) om immunoblot of immunoprecipitatie van het tot expressie gebrachte eiwit mogelijk te maken, en noemden deze nieuwe vector pFRRu. De andere vector pFRRg heeft dezelfde ontwerpstrategie, maar de UbiC-promotor werd vervangen door PKG-promotor (Figuur 1B). Met deze nieuwe retrovirale vectoren hebben we verschillende muisceltypes getransduceerd (bijv., epitheelcellen, keratinocyten, fibroblasten en hematopoëtische cellen) evenals primaire cellen [bijv., embryonale fibroblasten van muizen en van beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM's)]. De efficiëntie van transductie varieert met het celtype en de toegepaste virustiter. Na puromycineselectie werden echter alle resterende cellen viraal getransduceerd. In deze studie leidde de virale titer die we toepasten tot 30% -60% transductie-efficiëntie voor macrofagen, waardoor meerdere vermeldingen van virale transcripten in één cel werden vermeden.

Een gemodificeerd retroviraal systeem met gen-knockdown en exogene genexpressiefuncties. EEN. Kaart van de gemodificeerde retrovirale vector met UbiC-promotor. pFRRu werd gegenereerd zoals beschreven in Materialen en Methoden. Er zijn twee meervoudige kloneringsplaatsen: het 5′-uiteinde van UbiC heeft de meervoudige kloneringsplaatsen voor shRNA-expressiecassette (MCS1), en het 3′-uiteinde van UbiC heeft de meerdere kloneringsplaatsen voor exogene genexpressie (MCS2) met een in -frame Vlag-His6 (FH) tag. Puromycine (puro) resistentie-expressie werd gereserveerd met SV40-promoter. B. De gemodificeerde retrovirale vector met PKG-promotor. UbiC-promotor zoals hierboven beschreven werd vervangen door PKG-promotor.

Remming van U6-promotoractiviteit door uiteenlopende promotorrangschikking van U6 en UbiC

Gewoonlijk kunnen drie promotorarrangementen tot TI leiden, namelijk convergente promotors, tandempromotors en overlappende (divergente) promotors (26) . Omdat convergente promotorarrangementen voor U6 en andere promotors zeldzaam zijn in virale vectoren, hebben we ons gericht op tandem- en divergente promotorarrangementen om te onderzoeken welke arrangementen leidden tot significante verslechtering van U6-promotoractiviteit. We construeerden een U6-promoter die de mCIN85 shRNA-expressiecassette aanstuurt en plaatsten deze expressiecassette in MCS1 van pFRRu in verschillende oriëntaties. De ene was een divergente promotoropstelling waarin U6 en UbiC in tegengestelde richting waren (pU6sh-pUbiC divergent), en de andere was tandem in dezelfde richting als UbiC (pU6sh-pUbiC-tandem). We hebben ook een luciferase-shRNA-expressievector gegenereerd als een niet-specifieke shRNA-controle en een pFRRrfp-U6-mCIN85-shRNA als een controle om de promotorinteractie te minimaliseren door de UbiC-promotor te vervangen door een niet-promotor-DNA-fragment (Figuur 2A). Deze vectoren werden in Plat E-cellen geïntroduceerd om virussen te produceren. BMDM's werden getransduceerd met respectieve virues en vervolgens geselecteerd met puromycine om de niet-getransduceerde cellen te verwijderen. Na vier dagen selectie werden de resterende cellen gelyseerd voor eiwitextractie. Western-blots werden uitgevoerd met behulp van konijnen-anti-CIN85-antilichaam (Figuur 2B). Relatieve U6-promotoractiviteit werd bepaald met behulp van endogeen mCIN85-eiwitniveau genormaliseerd tegen het α-tubuline-niveau als laadcontrole. Zoals getoond in figuur 2C had de rangschikking van de U6-promotor ten opzichte van de UbiC-promotor in de vector een significante invloed op de activiteit van de U6-promotor. Tandemopstelling handhaafde een veel hogere U6-promotoractiviteit dan divergente opstelling. Dit suggereerde dat U6-promoteractiviteit door TI kan worden gereguleerd op een promotorrangschikking-afhankelijke manier.

Uiteenlopende promotorrangschikking van U6 en UbiC remt U6-promotoractiviteit. EEN. Diagram van U6- en UbiC-promotorregelingen. mCIN85 shRNA-expressiecassette werd geconstrueerd zoals beschreven in Materialen en Methoden, en werd in pFRRu ingevoegd om divergente en tandempromoterrangschikkingen te vormen. De controle van de activiteit van de U6-promotor werd minimaal verstoord door de UbiC-promotor te vervangen door een niet-promotor-cDNA-fragment van RFP. B. Resterend endogeen mCIN85-eiwitniveau om U6-promotoractiviteit weer te geven. Muizen-BMDM's werden getransduceerd met retrovirussen geproduceerd met verschillende vectoren zoals aangegeven. Vier dagen na virale transductie en geneesmiddelselectie werden resterende cellen verzameld en gelyseerd. Western-blots werden uitgevoerd met behulp van gezuiverd konijnen-anti-CIN85 als primair antilichaam. C. Genormaliseerde mCIN85-efficiëntie die de relatieve U6-promotoractiviteit weerspiegelt. Monstersequenties zijn zoals aangegeven in Panel B. Waarden zijn statistieken van drie onafhankelijke experimenten.

CMV-enhancer heeft een negatieve invloed op de activiteit van de U6-promotor in aanwezigheid van een UbiC-promotor

Eerdere studies hebben aangetoond dat de CMV-versterker een positief effect heeft op de activiteit van de U6-promotor (23) . Het effect van de CMV-versterker op U6-promotoractiviteit in aanwezigheid van TI is echter niet bekend. Om deze vraag te beantwoorden, hebben we een CMV-enhancer tussen U6- en UbiC-promotors in beide promotorarrangementen geplaatst door de versterker te fuseren met de stroomopwaartse UbiC- of U6-promotor (Figuur 3A). Vervolgens hebben we de U6-promotoractiviteit getest. Tot onze verbazing versterkte CMV-enhancer in alle vier de configuraties, in plaats van de U6-promotoractiviteit te versterken, het UbiC-remmende effect op de U6-promotoractiviteit in beide promotorarrangementen (Figuur 3B en C). Het niveau van remming varieerde echter met de promotorarrangementen. Het fuseren van de CMV-enhancer stroomopwaarts van U6 en het behouden van de tandemrangschikking van de promoters gaf relatief minder remming, terwijl de divergente configuratie de hoogste remming gaf. Dit resultaat geeft aan dat de CMV-enhancer TI kan stimuleren en de U6-promoteractiviteit significant kan remmen in de aanwezigheid van UbiC-promotor in beide promotorarrangementen.

Negatieve impact van UbiC op U6-promotoractiviteit versterkt in aanwezigheid van CMV-versterker. Legenda's in figuur 2 werden gevolgd, behalve dat CMV-enhancer werd geplaatst tussen U6 en UbiC-promoter of gefuseerd met de stroomopwaartse van U6 zoals uitgezet. EEN. Diagram van U6-promotor-, CMV-enhancer- en UbiC-promotorarrangementen. CMV-enhancer werd gefuseerd aan de stroomopwaartse van ofwel U6-promotor of UbiC-promotor, waardoor divergerende of tandemarrangementen werden gevormd, zoals aangegeven. B. Western-blot van mCIN85 om het resterende mCIN85 dat in de cellen is achtergebleven, weer te geven. Monsters werden gegenereerd met gebruikmaking van verschillende virustransductie zoals aangegeven. C. Relatieve U6-promotoractiviteit na normalisatie tegen α-tubuline. Waarden zijn statistieken van drie onafhankelijke experimenten.

Regulering van U6-promotoractiviteit door TI is promotorspecifiek

TI wordt vaak veroorzaakt door de asymmetrische sterkte van twee dicht bij elkaar liggende promotors, de sterkere promotor vermindert de activiteit van de zwakkere (26) . UbiC-promotor is alomtegenwoordig actief in een verscheidenheid aan cellen en is een relatief sterke promotor (27) . Vervolgens vroegen we of de activiteit van de U6-promotor kan worden behouden als we de UbiC-promotor vervangen door een zwakkere PKG-promotor om de voorheen asymmetrische sterkte in evenwicht te brengen. We construeerden vergelijkbare virale vectoren in beide U6-promotorarrangementen met PKG-promotor zoals weergegeven in figuur 4A en testten U6-promotoractiviteit in getransduceerde BMDM's. Zoals verwacht werd geen significante remming van U6-promoteractiviteit waargenomen in beide rangschikkingen (Figuur 4B en C). Dit resultaat suggereert dat regulering van U6-promotoractiviteit door TI promotorspecifiek is. Het in evenwicht brengen van de kracht van de twee aangrenzende promotors is de sleutel. PKG, een zwakkere promotor, heeft een minimaal TI-effect op de activiteit van de U6-promotor.

U6-promotoractiviteitsrespons op TI is promotorspecifiek. Legenda's in figuur 2 werden gevolgd, behalve dat UbiC-promotor werd vervangen door PKG-promotor. EEN. Schema van U6- en PKG-promotorregelingen. B. Resterend endogeen mCIN85-eiwitniveau om U6-promotoractiviteit weer te geven. C. Relatieve U6-promotoractiviteit na normalisatie tegen α-tubuline. Waarden zijn statistieken van drie onafhankelijke experimenten.


Visualisatie van genactiviteit in levende cellen

Aangenomen wordt dat de chromatinestructuur een cruciale rol speelt bij genexpressie. De ... gebruiken lac operator/repressorsysteem en twee kleurvarianten van groen fluorescerend eiwit (GFP), ontwikkelden we een systeem om een ​​gen en zijn eiwitproduct direct in levende cellen te visualiseren, waardoor we de ruimtelijke organisatie en timing van genexpressie kunnen onderzoeken in vivo. Dynamische morfologische veranderingen in de chromatinestructuur, van een gecondenseerde naar een open structuur, werden waargenomen bij genactivering, en targeting van het genproduct, cyaan fluorescerend eiwit (CFP) reporter naar peroxisomen werd direct in levende cellen gevisualiseerd. We ontdekten dat de geïntegreerde genlocus werd omgeven door een kernlichaam van promyelocytische leukemie (PML). De associatie was transcriptie-onafhankelijk maar was afhankelijk van de directe in vivo binding van specifieke eiwitten (EYFP/lac repressor, tetracyclinereceptor/VP16-transactivator) naar de locus. De mogelijkheid om genexpressie direct in levende cellen te visualiseren, biedt een krachtig systeem om de dynamiek van nucleaire gebeurtenissen zoals transcriptie, RNA-verwerking en DNA-reparatie te bestuderen.


DISCUSSIE

Mitochondriale targeting van C-verankerde buitenmembraaneiwitten is nog niet grondig onderzocht. Als eerste stap naar het verduidelijken van hun targetingmechanismen, hebben we het mitochondriale targetingsignaal gekarakteriseerd door de GFP-Tom5-fusies als model te gebruiken. Omdat fluorescerende GFP-fusies die in vivo tot expressie worden gebracht een "strakke vouw" hebben en het Tom5-peptide dat aan het C-uiteinde van GFP is bevestigd zo kort kan zijn als 50 residuen, moet het C-uiteinde van Tom5 altijd worden blootgesteld aan het oppervlak van de fluorescerende actieve stof. molecuul. De fluorescentie vertegenwoordigt dus correct gevouwen eiwitten en daarom verdisconteert de huidige test niet-specifieke associatie van de ongevouwen eiwitten met verschillende organellen. Onze resultaten toonden aan dat het TMS met 18-20 hydrofobe residuen en positieve ladingen in het volgende C-segment beide belangrijke determinanten zijn voor mitochondriale targeting. Het belang van het C-segment als het mitochondriale targeting-signaal werd het duidelijkst aangetoond door het experiment in figuur 2, het C-segment van Tom5 getransplanteerd naar de C-terminal van cytochroomB5, gericht anders ER-gericht eiwit naar de mitochondriën, of vice versa. Na vermindering van het aantal positieve ladingen in het C-segment, verloren de mutanten geleidelijk de membraanspecificiteit en werden niet alleen naar de mitochondriën maar naar het ER gedistribueerd, wat aangeeft dat er ten minste drie basische aminozuren op het C-segment nodig zijn voor de specifieke richten van Tom5 op de mitochondriën.

De membraanspecificiteit ging ook verloren wanneer het TMS langwerpig was, hoewel het C-segment intact bleef (Figuur 4). Met het oog op het rapport dat hydrofobe krachten spontane membraaninsertie stimuleren (Enoch et al., 1979 Rachubinski et al., 1980 Anderson et al., 1983), verwachten we dat het langwerpige TMS functioneert als een dominant, niet-specifiek membraaninsertiesignaal (Blobel, 1980) door zijn verhoogde affiniteit met de lipidedubbellaag, en gemuteerde eiwitten werden verspreid over de membranen, inclusief mitochondriën en ER, hoewel of deze constructen die ook in de andere membraansystemen zijn gelokaliseerd, moeten nog worden bepaald.

Samengenomen functioneerden drie basische aminozuurresiduen die aan het C-uiteinde van het TMS waren gepositioneerd met een geschikte lengte als het mitochondriale richtsignaal. Dit structurele kenmerk is ook geconserveerd in mitochondriaal VAMP-1B (Figuur 1). Wanneer beide arginine-residuen of alle drie de residuen werden veranderd in threonine, werden de mutanten via het ER naar de membranen van de secretoire organellen getransporteerd (Isenmann en Wattenberg, 1998). De huidige studie toonde aan dat lengte, in plaats van hydrofobiciteit, de belangrijkste determinant is voor de TMS-functie [Figuur 4, TM(H)]. Ter ondersteuning hiervan heeft VAMP-1B een TMS van 17 residuen met een gemiddelde hydrofobiciteit van 3,20, maar het is gelokaliseerd in de mitochondriën. Daarom lijkt het eerder de lengte dan de hydrofobiciteit te zijn die de targeting op het mitochondriale buitenmembraan bepaalt. De lengte kan nodig zijn om zich aan te passen aan de dikte van de lipide dubbellaag van het mitochondriale buitenmembraan.

Insertie van vijf serineresiduen tussen het TMS en C-segment interfereerde ernstig met mitochondriale targeting van Tom5, terwijl hun toevoeging aan het C-terminale uiteinde niet effectief was. De afstand tussen het hydrofobe TMS en het basis C-segment is dus een kritische factor voor mitochondriale targeting. Deze observatie is consistent met de eerdere observatie dat de arginine-lokalisatie net na de TMS in OMb kritischer is voor de mitochondriale targeting dan een andere arginine die zich aan de distale C-terminale kant bevindt (Kuroda en Ito, 1998 Figuur 1).

Er was een verschil tussen de eerste en de tweede helft van de TMS in de gevoeligheid voor de geïntroduceerde mutatie. Een deletie van een enkel aminozuur in de tweede helft van het TMS (40 M-45V) interfereerde sterker met de mitochondriale targetingfunctie dan een deletie van een enkel aminozuur in de eerste helft van het TMS (Figuur 6). Deze resultaten gaven opnieuw aan dat het TMS en het basis C-segment zich binnen een geschikte afstand of context zouden moeten bevinden. Alles bij elkaar genomen, zouden sommige factoren in het cytosol deze structurele kenmerken kunnen herkennen en ze naar het mitochondriale buitenmembraan kunnen leiden.

Het C-terminale domein van Tom5, bestaande uit het TMS en C-segment, functioneerde bij transplantatie naar de N-terminal van GFP als een ER-targeting-signaal, waarschijnlijk als het signaalanker (Kida et al., 2000). Daarom moeten deze segmenten zich aan het C-uiteinde bevinden om correct te worden herkend als het mitochondriale targetingsignaal. De structurele vereisten van de mitochondriale targetingsignalen voor N-verankerde en C-verankerde eiwitten zijn duidelijk verschillend. Aangezien de grote ribosomale subeenheid het verlengde peptide van 39 residuen herbergt (Blobel en Sabatini, 1970), wordt het aldus gekarakteriseerde mitochondriale targetingsignaal van Tom5 bijna volledig beschermd binnen de grote ribosomale subeenheid. De targetingreactie zou dus moeten plaatsvinden tijdens posttranslationele verwerking, wat waarschijnlijk herkenning door SRP ontwijkt, omdat herkenning door SRP van het signaalpeptide cotranslationeel plaatsvindt op het ribosoom-ontluikende ketencomplex (Walter en Johnson, 1994).

De structurele kenmerken van het aldus gedefinieerde signaal met behulp van gist Tom5 waren goed geconserveerd in zoogdier C-staartankereiwitten Vamp1B (Isenmann en Wattenberg, 1998 hierboven besproken) en OMP25. De membraanverankerde GFP-Tom5-constructen en GFP-OMP25 waren in de gedispergeerde toestand aanwezig in de buitenmembranen en waren niet geïntegreerd in het TOM-complex. Daarom kan GFP-Tom5 worden beschouwd als het model dat algemene C-staartankereiwitten vertegenwoordigt die niet beperkt zijn tot de TOM-importmachines, maar uiteindelijk worden verspreid in de lipidedubbellagen. Deze eiwitten leken het doelwit te zijn via een identieke route omdat ze werden geïmporteerd in mitochondriën die waren behandeld met trypsine om de importreceptoren van het buitenmembraan rTOM70, rTOM20, rTOM22 en OM37 (onze niet-gepubliceerde gegevens) te verwijderen, hoewel de betrokkenheid van de kanaalcomponent rTOM40 moet nog worden geanalyseerd.

Het heterologe testsysteem met gist Tom5 stelde ons in staat om onderscheid te maken tussen targeting- en membraanintegratiestappen in mitochondriën van zoogdieren. Wildtype GFP-Tom5 tot expressie gebracht in COS-7-cellen was correct gericht op mitochondriën zoals waargenomen onder confocale microscopie, maar was inefficiënt geïntegreerd in het mitochondriale membraan, terwijl hetzelfde construct dat tot expressie werd gebracht in gistcellen efficiënt werd geïntegreerd in het mitochondriale membraan. Bij toename van de hydrofobiciteit van het TMS was het fusieconstruct TM(H) nu stevig verankerd aan het mitochondriale membraan. Deze resultaten suggereren dat de kenmerken van het richtsignaal van de C-staartankereiwitten verschillend zijn tussen gist en zoogdieren. In feite waren basische aminozuurresiduen in het C-segment van GFP-Tom5 niet vereist voor correcte mitochondriale targeting en insertie van GFP-Tom5 in gist (Horie, Sakaguchi en Mihara, niet-gepubliceerde gegevens). De karakterisering van het mitochondriale richtsignaal van de C-staartankereiwitten in gist is aan de gang.

Hoe worden deze kenmerken van het signaal herkend in het cytoplasma tijdens posttranslationele targeting? Het ontluikende polypeptide-geassocieerd complex (NAC), dat is gekarakteriseerd als de heterodimere, ribosoom-geassocieerde chaperonne die promiscue interactie tussen SRP en de ontluikende polypeptiden voorkomt die bestemd zijn voor andere cellulaire compartimenten dan de secretoire route (Wiedmann et al., 1994), is betrokken bij het richten van preproteïnen op de mitochondriën in gist (George et al., 1998Fünfschilling en Rospert, 1999). Gistegd2mutanten, die de NAC-functie missen, accumuleren GFP-Tom22 en GFP-Bcl2 in het cytosol (Egan et al., 1999). De NAC lijkt te functioneren als een algemene chaperonne om de organelgerichte competentie van de voorloper in vivo te behouden. De huidige bevindingen dat het TMS en het basis C-segment zich binnen een geschikte context of afstand moeten bevinden voor mitochondriale targetingfunctie, suggereren dat sommige factoren naast de NAC die deze kenmerken specifiek herkennen en het hydrofobe ontluikende eiwit in het cytosol stabiliseren, deelnemen aan het richten.


Inhoud

Binnen de Herpesviridae, CMV behoort tot de Betaherpesvirinae onderfamilie, die ook de geslachten omvat Muromegalovirus en Roseolovirus (humaan herpesvirus 6 en humaan betaherpesvirus 7). [7] Het is ook gerelateerd aan andere herpesvirussen binnen de Alphaherpesvirinae subfamilie, waaronder herpes simplex-virussen 1 en 2 en varicella-zoster-virus, en de Gammaherpesvirinae subfamilie, waaronder het Epstein-Barr-virus en het Kaposi-sarcoom-geassocieerd herpesvirus. [6]

verschillende soorten Cytomegalovirus zijn geïdentificeerd en geclassificeerd voor verschillende zoogdieren. [7] De meest bestudeerde is humaan cytomegalovirus (HCMV), ook wel bekend als humaan betaherpesvirus 5 (HHV-5). Andere CMV-soorten van primaten omvatten: chimpansee cytomegalovirus (CCMV) die chimpansees en orang-oetans infecteert, en simian cytomegalovirus (SCCMV) en Rhesus cytomegalovirus (RhCMV) die makaken infecteren CCMV staat bekend als beide panine beta herpesvirus 2 (PaHV-2) en pongine betaherpesvirus 4 (PoHV-4). [8] SCCMV heet cercopithecine betaherpesvirus 5 (CeHV-5) [9] en RhCMV, Cercopithecine betaherpesvirus 8 (CeHV-8). [10] Nog twee virussen gevonden in de nachtaap worden voorlopig in het geslacht geplaatst Cytomegalovirus, en worden genoemd herpesvirus aotus 1 en herpesvirus aotus 3. Knaagdieren hebben ook virussen die voorheen cytomegalovirussen werden genoemd en die nu opnieuw zijn geclassificeerd onder het geslacht Muromegalovirus dit geslacht bevat muis cytomegalovirus (MCMV) is ook bekend als murid betaherpesvirus 1 (MuHV-1) en de nauw verwante Murid betaherpesvirus 2 (MuHV-2) die bij ratten wordt gevonden. [11]

Soort Bewerken

Het geslacht bestaat uit deze 11 soorten: [5]

  • Aotine betaherpesvirus 1
  • Cebine betaherpesvirus 1
  • Cercopithecine betaherpesvirus 5
  • Humaan betaherpesvirus 5
  • Macacine betaherpesvirus 3
  • Macacine betaherpesvirus 8
  • Mandriline betaherpesvirus 1
  • Panine betaherpesvirus 2
  • Papiine betaherpesvirus 3
  • Papiine betaherpesvirus 4
  • Saimirine betaherpesvirus 4

Virussen in Cytomegalovirus zijn omhuld, met icosaëdrische, sferische tot pleomorfe en ronde geometrieën, en T=16 symmetrie. De diameter is ongeveer 150-200 nm. Genomen zijn lineair en niet-gesegmenteerd, ongeveer 200 kb lang. [4]

Geslacht Structuur Symmetrie Capsid genomische rangschikking Genomische segmentatie
Cytomegalovirus sferische pleomorfe T=16 omhuld Lineair monopartiet

Herpesvirussen hebben enkele van de grootste genomen onder menselijke virussen, vaak coderend voor honderden eiwitten. Het dubbelstrengs DNA-genoom (dsDNA) van wildtype HCMV-stammen heeft bijvoorbeeld een grootte van ongeveer 235 kb en codeert voor ten minste 208 eiwitten. Het is dus langer dan alle andere menselijke herpesvirussen en een van de langste genomen van alle menselijke virussen in het algemeen. Het heeft de karakteristieke herpesvirus klasse E-genoomarchitectuur, bestaande uit twee unieke regio's (unieke lange UL en unieke korte US), beide geflankeerd door een paar omgekeerde herhalingen (terminale/interne herhaling lange TRL/IRL en interne/terminale herhaling korte IRS/ TRS). Beide sets herhalingen delen een gebied van een paar honderd bps, de zogenaamde "a-reeks", de andere gebieden van de herhalingen worden soms "b-reeks" en "c-reeks" genoemd. [12]

Virale replicatie is nucleair en lysogeen. Binnenkomst in de gastheercel wordt bereikt door hechting van de virale glycoproteïnen aan gastheerreceptoren, die endocytose bemiddelt. Replicatie volgt het dsDNA bidirectionele replicatiemodel. DNA-matrijstranscriptie, met een alternatief splitsingsmechanisme, is de transcriptiemethode. De vertaling vindt plaats door middel van leaky scanning. Het virus verlaat de gastheercel door nucleaire uitgang en ontluikende. Mensen en apen dienen als de natuurlijke gastheren. Transmissieroutes zijn afhankelijk van het in contact komen met lichaamsvloeistoffen (zoals speeksel, urine en genitale afscheidingen) van een geïnfecteerd persoon. [4] [13]

Geslacht Hostgegevens Weefseltropisme Toegangsgegevens Details vrijgeven Replicatiesite Montageplaats: Overdragen
Cytomegalovirus mensen apen epitheliale mucosa Glycoproteïnen ontluikend Kern Kern urine speeksel

Alle herpesvirussen hebben het kenmerkende vermogen om gedurende lange perioden latent in het lichaam te blijven. Hoewel ze door het hele lichaam kunnen worden aangetroffen, worden CMV-infecties vaak geassocieerd met de speekselklieren bij mensen en andere zoogdieren. [7]

De CMV-promotor wordt gewoonlijk opgenomen in vectoren die worden gebruikt bij genetisch manipulatiewerk dat wordt uitgevoerd in zoogdiercellen, omdat het een sterke promotor is en de constitutieve expressie van genen onder zijn controle aanstuurt. [14]

Cytomegalovirus werd voor het eerst waargenomen door de Duitse patholoog Hugo Ribbert in 1881 toen hij vergrote cellen met vergrote kernen in de cellen van een baby opmerkte. [15] Jaren later, tussen 1956 en 1957, isoleerde Thomas Huckle Weller samen met Smith en Rowe onafhankelijk van elkaar het virus, dat daarna bekend stond als "cytomegalovirus". [16] In 1990 werd de eerste versie van het menselijk cytomegalovirus-genoom gepubliceerd, [17] het grootste aaneengesloten genoom waarvan de sequentie op dat moment werd bepaald. [18]


Abstract

We hebben de transcriptionele activiteit onderzocht van humaan cytomegalovirus, herpesthymidinekinase, humaan choriongonadotrofine , somatostatine, immunoglobuline -keten, α-kristalline, albumine en interferon-β-promotors in de splijtingsgist Schizosaccharomyces pombe. Hiervan bleken het humaan cytomegalovirus, humaan choriongonadotrofine en somatostatine-promotors zeer actief te zijn, respectievelijk ongeveer 11-, 9- en 0,9-voudig zo actief als de vroege promotor van SV40. De rest van de onderzochte promotors was zwak en had slechts 10-20% van de SV40-promotoractiviteit. Primerverlengingsanalyse toonde aan dat de sterke promotors transcriptie initiëren in S. pombé op dezelfde plaatsen als in zoogdiercellen, wat de grote overeenkomst tussen beide transcriptiesystemen aangeeft.


Sperma-specifieke promotor van het SP-10-gen functioneert als een isolator in somatische cellen

Spermatide differentiatie markers zoals het acrosomale eiwit SP-10 vertonen opmerkelijke testis- en kiemcel-beperkte genexpressie. Er is echter weinig bekend over de mechanismen die hun expressie in somatische weefsels voorkomen. We hebben eerder opgemerkt dat de -408/+28 of de -266/+28 promotor van SP-10 strikt spermatide-specifieke transcriptie regisseerde in transgene muizen, Biol. Weergeven. 61, 1256-1266). Lack of ectopic expression in these mouse lines implied that the SP-10 promoter might have protected the transgene from the influence of neighboring enhancers. The present study tested this directly by performing enhancer-blocking assays. In transiently transfected COS cells, the -408/-92 SP-10 promoter, but not stuffer DNA, blocked the transcriptional activity of a heterologous enhancer (CMV) in a position- and orientation-dependent manner. In transgenic mice, despite integration adjacent to the pan-active CMV enhancer, the -408/+28 promoter maintained spermatid-specificity and no ectopic expression of the transgene resulted. Enhancer blocking is a characteristic feature of insulators. Our results show that the SP-10 proximal promoter, which activates transcription in spermatids, functions as an insulator in somatic cells. Insulator activity mapped to the -186/-135 region and mutation of two ACACAC motifs compromised the insulator function. In conclusion, the evolutionarily conserved SP-10 insulator is novel and is the first one shown to regulate transcription of a germ cell differentiation marker.


The Molecular Basis of Endocrinology

Transcriptie

RNA polymerase II binds downstream of the TATA box and initiates transcription of the RNA copy of one strand of the gene. Transcription continues some way downstream of the end of the gene and the transcript is processed while being exported from the nucleus. The 5′–end is modified (capped), introns are removed (splicing) and the 3′–end is trimmed and tailed with 5- to 25-adenosine residues (polyadenylation).

RNA processing

The splicing process involves a complex series of reactions catalysed by a set of small nuclear ribonuclear protein particles (SNRPS pronounced snurps). These recognize sequences at the ends of introns enabling the precise removal of the intron sequence with reconnection of the ends of the two exons. The 5′–sequence is: Exon NNNNN^ guaagunnnnn Intron whereas the 3′–sequence is Intron nnnnnneennnnnn(c/u)NcaĝNNNNN Exon. The excised intron forms a lariat in the process ( Figure 2.2) .

Figure 2.2 . Transcription and RNA processing: the primary transcript starts close to the site of RNA polymerase binding and extends beyond the polyadenylation signal. The transcript is cleaved and polyadenylated close to the signal AAUAAA the 5′-end is modified by addition of a deoxyguanosine residue ‘capping’. 5′ untranslated 3′ untranslated

Mutations of the sequences shown are a common cause of genetic disease leading to abnormal processed RNA transcripts which cannot be translated and which are often unstable leading to low levels of RNA.

The splicing reaction may proceed differently in different tissues leading to different mature RNAs and hence different protein products being produced from the same gene in a process known as alternative splicing, the best known example in endocrinology being the calcitonin/CGRP gene in which calcitonin lies on exon 4 and CGRP (calcitonin gene-related peptide) lies on exon 5. In C cells exon 4 is included in the mRNA and its poly(A) addition site is used thus removing CGRP from the mature mRNA, whereas in the nervous system exon 4 is spliced out leaving exon 5 in the mature mRNA which allows translation of CGRP ( Figure 2.3 ).

Figure 2.3 . Calcitonin gene alternate splicing: the calcitonin gene contains six exons exon 4 codes for calcitonin and contains a polyadenylation signal exon 5 codes for CGRP (calcitonin gene-related peptide) and the next polyadenylation site is in exon 6. Splicing in C cells produces an mRNA containing the first four exons and excludes exons 5 and 6, whereas in nerves exon 4 is excluded by a different tissue–specific splicing pattern, giving an mRNA containing exons 1,2,3,5 (CGRP) and 6. The different mRNAs are translated giving calcitonin or CGRP in association with different flanking peptides


Redox Cell Biology and Genetics Part B

Klaus Felix , . Siegfried Janz , in Methods in Enzymology , 2002

Shuttle Vector and Principle of Assay

In the plasmid-based shuttle vector pUR288, lacZ functions as both target and reporter gene of mutagenesis. The 5346-bp vector contains in addition to lacZ-coding sequences the 35-bp binding site for the LacI repressor, lacO, the binding site for CRP (cAMP receptor protein, which facilitates transcription of lacZ by stimulating the formation of an active promoter complex), an origin of replication (ori), and an ampicillin resistance gene ( Fig. 4A ). The principle of the pUR288 mutagenesis assay is illustrated in Fig. 4B . Briefly, shuttle vectors are excised from the transgenic concatemer by restriction with hihidIII. Linearized plasmids are then separated from bulk genomic DNA with the help of magnetic beads that are coated with a LacI fusion protein that can bind to the lacO sequence of the plasmid. 4 Elution from the beads is achieved by adding isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), an inactivator of LacI that induces an affinity decreasing conformational change in the protein for lacO. Plasmids are circularized at the cohesive hihidIII sites by ligation with T4 ligase and then electroporated into E coli that is (1) deficient in β-Gal (lacZ − ), (2) galactose intolerant due to the absence of galactose epimerase (galE − ), and (3) restriction negative to prevent the degradation of incoming methylated plasmid DNA. De galE − mutation is key 12 because it allows for the positive selection of lacZ − mutants in the presence of the lactose analog P-Gal (phenyl-β-D galactoside), a substrate for β-Gal. LacZ − mutants are unable to cleave P-Gal in contrast, wild-type LacZ + cells are able to cleave it, and thereby release galactose. Galactose is converted to UDP-galactoside, which cannot be further metabolized on the galE − background instead, it is accumulated intra-cellularly to toxic and eventually lytic concentrations. Thus, whereas LacZ + cells are prevented from growth on P-Gal-supplemented agar plates, LacZ − cells are not. To determine the rescue efficiency of plasmids from genomic DNA, a small aliquot (usually 2 ΜL) of a 2-ml suspension of pUR288-transfected E coli is plated on a titer plate that has been supplemented with 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal). X-Gal is cleaved by β-Gal, which produces a blue halo around growing LacZ + colonies. Note that LacZ − mutants will be missed on the dilution plate (no blue halo), but this is negligible because the ratio between LacZ + to LacZ − colonies is on the order of 10 4 :1. Note further that the cleavage of X-Gal releases galactose, which is converted to the same toxic UDP-galactoside derived from P-Gal however, the amounts of galactose liberated from X-Gal are small and therefore compatible with the growth of LacZ + colonies [the molar concentration of X-Gal (183 M 75 μg/ml) is 64 times lower than that of P-Gal (11.7 mm, 3 mg/ml)]. The remaining part of the suspension (1998 μl) is plated on a single P-Gal plate to select for mutants. Mutants grow as small, red, formazan-stained colonies in the presence of a tetrazolium salt that should be added for improved visibility of the sometimes tiny colonies. The mutant frequency is calculated as the ratio of mutants to nonmutants that is, the number of colonies on the P-Gal selection plate to the number of colonies (×1000) on the X-Gal titer plate. To characterize the mutational spectrum, mutant colonies can be picked and used directly as templates in long-range PCR amplifications of the entire lacZ gen. The PCR fragments are useful for restriction analysis and DNA sequencing. Plasmid DNA minipreparations are equally useful if it is decided not to use PCR for template preparation. Excellent reviews of the pUR288 assay including detailed protocols and sections on troubleshooting are available. 13–15 More specialized articles on the detection of so-called color mutants, 16 the nature of background mutations, 17 and sources of assay variability 18 have also been published. In addition, a commercial kit-based version of the assay—together with technical support, a step-by-step protocol, and accessory services, such as mutational analysis by DNA sequencing and two-dimensional electrophoresis—is being offered by Leven ( www.leveninc.com ). Our overall experience with the assay is positive, but attention must be paid to preparing DNA of high quality [even small amounts of impurities (proteins, salts, organic solvents) can sometimes decrease the rescue efficiency of the shuttle vector] and avoiding contamination with unrelated plasmids that are lacZ − , lacO + , and ampicillin resistant. Plasmids of this nature (e.g., derivatives of pBluescript) are in widespread use in many laboratories, and they can easily show up as false “pUR288 mutants” after finding their way into reagents or laboratory space where the mutagenesis assay is performed.

Fig. 4 . In vivo mutagenesis assay, using pUR288. (A) Plasmid-derived shuttle vector pUR288. CRP, cAMP receptor protein ori, origin of replication lacZ, gene encoding β-Gal hihidIII, restriction site used to release the plasmid from genomic DNA. (B) Principle of the assay: LacZ− mutants are positively selected on P-Gal plates. See text for additional details.