Informatie

Hoe zouden de eerste borstklieren hebben gefunctioneerd?


Ik kwam toevallig een boek tegen (niet over biologie) met deze tekst:

Ongeveer 190 miljoen jaar geleden vond er een levensveranderende geboorte plaats op de planeet [… ] het eerste kleine feeksachtige wezen bracht een baby voort en begon haar jongen te zogen. [… ] dit harige kleine zoogdier belichaamde een enorme sprong in biologische evolutie

De beschrijving is mooi dramatisch, maar het klopt niet voor mij. Hoewel ik weet dat de evolutie waarschijnlijk niet zo geleidelijk verliep als de middelbare schoolboeken het voorstellen, is de gedachte dat een niet-zoogdier een dochter baarde met volledig functionele borstklieren die actief haar jongen zogen, een beetje te veel voor mij om te slikken. Voor andere lichaamssystemen heb ik verhalen gelezen hoe ze geleidelijk ontstonden, bijvoorbeeld de oudste soorten met een paar zenuwcellen, en toen nieuwe met een heel nerveus 'netwerk' met een paar ganglions, voordat echte hersenen ontstonden. Of op dezelfde manier evolueerden wormen met een stukje lichtgevoelige cellen op de huid tot dieren met ogen. Ik weet dat vogelbekdieren borstklieren hebben zonder tepels, maar vermoedelijk zijn ze zelfs al veel geavanceerder dan de eerste borstklieren.

Dus hoe worden proto-borstklieren verondersteld te zijn geweest? Zijn ze de novo speciaal ontwikkeld om baby's te voeden, of waren het misschien hergebruikte zweetklieren of iets dergelijks? Hoe zouden ze hebben gefunctioneerd?


de productie van vloeistoffen om nakomelingen te voeden is in verschillende geslachten afzonderlijk geëvolueerd, zoogdieren zijn eenvoudig verder gegaan dan welke andere groep dan ook. het is vrij eenvoudig om te zien hoe het zou kunnen evolueren, elke manier om zelfs maar sporen van voedingsstoffen of voeding aan jongeren te geven, zal een voordeel hebben in organismen die al bezig zijn met het opvoeden van kinderen. het betekent dat de jongen minder vaak worden blootgesteld aan roofdieren.

Borstklieren zijn gemodificeerde zweetklieren.

Monotremes hebben geen tepels, maar een cluster van borstklieren op een stukje huid. de jongen moeten de melk van de pluk haar opzuigen.

De exacte volgorde van hoe de lactatie is geëvolueerd, is niet goed bekend, aangezien de lactatie geen fossiel bewijs achterlaat.


bronnen:

Lefèvre, C.M., Sharp, J.A. en Nicholas, K.R., 2010. Evolutie van lactatie: oude oorsprong en extreme aanpassingen van het lactatiesysteem. Jaarlijks overzicht van genomica en menselijke genetica, 11, blz. 219-238.

Capuco, AV en Akers, R.M., 2009. De oorsprong en evolutie van borstvoeding. Tijdschrift voor Biologie, 8(4), p.37.


Signaalroutes die betrokken zijn bij vroege borstkliermorfogenese en borstkanker

Specificatie van het lot van borstepitheelcellen vindt plaats tijdens embryogenese als cellen aggregeren om de borstklier te vormen. Binnen de embryonale borstknop bestaat een populatie van epitheelcellen die zich vervolgens zullen vermenigvuldigen om een ​​ductale boom te vormen die het stromale compartiment vult, en die melk kan produceren bij terminale differentiatie na de geboorte. Vervolgens kunnen deze structuren na het spenen opnieuw worden gemodelleerd en in een basale staat worden teruggebracht voordat ze bij toekomstige zwangerschappen worden geregenereerd. De plasticiteit van de borstepitheelcel en zijn reactievermogen op hormoonreceptoren, vergemakkelijkt deze verbazingwekkende biologische prestatie, maar afwijkende signalering kan ook leiden tot onbedoelde gevolgen in de vorm van frequente maligniteiten. Als gevolg van deze intieme verbinding is een aanzienlijk aantal signaalroutes betrokken bij zowel de morfogenese van de borstklier als de carcinogenese.

Citaat: Howard B, Ashworth A (2006) Signaalroutes die betrokken zijn bij vroege borstkliermorfogenese en borstkanker. PLoS Genet 2(8): e112. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.0020112

Editor: Elizabeth M.C. Fisher, University College London, Verenigd Koninkrijk

Gepubliceerd: 25 augustus 2006

Auteursrechten: © 2006 Howard en Ashworth. Dit is een open-access artikel dat wordt gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie in elk medium toestaat, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en bron worden vermeld.

Financiering: Het werk in ons laboratorium wordt ondersteund door The Breakthrough Breast Cancer Research Centre.

Concurrerende belangen: De auteurs hebben verklaard dat er geen concurrerende belangen bestaan.


Stamcellen en de zich ontwikkelende borstklier

De borstklier ondergaat gedurende het hele leven dynamische veranderingen. Bij de muis beginnen deze met de initiële morfogenese van de klier in het midden van de zwangerschap, gevolgd door hormonaal gereguleerde veranderingen tijdens de puberteit en later in de volwassenheid. De volwassen borstklier bevat een hiërarchie van celtypen met verschillende mogelijkheden voor zelfonderhoud en differentiatie. Deze omvatten cellen die in vivo complete, functionele borstklieren kunnen produceren en die dochtercellen bevatten met hetzelfde opmerkelijke regeneratieve potentieel., evenals cellen met een beperktere klonogene activiteit in vitro. Hier bekijken we hoe het toepassen van in vitro en in vivo methoden voor het kwantificeren van deze cellen in volwassen borstweefsel op foetale borstcellen het mogelijk heeft gemaakt dat de eerste cellen die voldoen aan de functionele criteria van transplanteerbare, geïsoleerde borststamcellen een paar dagen voor de geboorte werden geïdentificeerd. Daarna neemt het aantal van deze cellen snel toe. Populaties die deze foetale stamcellen bevatten, vertonen groei- en genexpressieprogramma's die verschillen van hun volwassen tegenhangers, maar kenmerken delen die kenmerkend zijn voor bepaalde soorten borstkanker. Dergelijke waarnemingen versterken het groeiende bewijs van belangrijke verschillen tussen weefselspecifieke foetale en volwassen cellen met stamceleigenschappen en benadrukken de voordelen van het onderzoeken van hun moleculaire basis.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Resultaten

Cycline E transgene muizen, transgene zygositeit en expressie

Zowel de cycline E- als de hyperstabiele cycline E-T380A-allelen (hierna T380A genoemd) zijn inserties met een enkele locus die onafhankelijk van de p53-locus op muischromosoom 11 worden geërfd en zijn niet geslachtsgebonden. Het genotype veranderde de leeftijd van geslachtsrijpheid of worpgrootte niet. Alle hier gerapporteerde muislijnen waren ofwel homozygoot of nullizygoot op de transgene locus en wildtype of heterozygoot op de p53-locus. Deze werden aangeduid als wildtype, CycE, T380A, p53 +/-, p53 +/- CycE en p53 +/- T380A. Expressie van de transgenen werd gedetecteerd in de kernen van het borstepitheel door middel van immunohistochemie, maar niet in andere onderzochte weefsels (alle thoracale en abdominale ingewanden, centraal en perifeer zenuwweefsel, hematopoëtisch weefsel, skeletmusculatuur en integumentaire gegevens niet getoond). Sporenexpressieniveaus van het T380A-allel waren echter detecteerbaar in de longen en lever bij langdurige blootstelling aan immunoblot (≥1000 maal minder expressie dan in de borstklier in het midden van de lactatie door titratie op niet getoonde immunoblotgegevens).

We hebben eerder aangetoond dat een cycline E-transgen bij muizen geassocieerd is met hyperplasie in het borstklierepitheel samen met de expressie ervan onder de op prolactine reagerende β-lactoglobuline promotor (BLG). Dit fenomeen is van voorbijgaande aard en treedt op in het epitheel tijdens de lactogene cyclus, manifesteert zich aanvankelijk in het laatste derde deel van de zwangerschap en houdt aan totdat het nest wordt gespeend op 4 weken na de bevalling. Op dit punt ondergaan het borstepitheel involutie en het hyperplastische epitheel wordt in dit proces opgenomen (Bortner en Rosenberg, 1997). Bij standaard hematoxyline- en eosinekleuring bleek hyperplasie in het epitheel van muizen in het midden van de lactatie (2 weken postpartum) in het algemeen meer wijdverspreid in T380A-transgene muizen dan die met het CycE-transgen, maar niet ernstiger. In de borstklier in het midden van de lactatie werd het T380A-transgen sterk tot expressie gebracht met een lagere expressie van het CycE-transgen (Figuur 1a). Titratie van het T380A-signaal tegen dat van CycE-muizen vertoonde een ongeveer 10-voudig hogere expressie (Figuur 1b). Gelijktijdig met expressie in de borstklier, was transgen-geassocieerde (menselijke Cycline E) kinase-activiteit robuust verhoogd bij muizen met het T380A-allel (Figuur 1c). Kinaseniveaus geassocieerd met het CycE-allel waren echter niet significant verhoogd boven de intrinsieke achtergrond van de test.

Transgenexpressie en transgen-afhankelijke kinase-activiteit in de borstklieren tijdens de lactatie (2 weken na de bevalling). (een) Immunoblot-analyse met 15% PAGE van eiwitextracten van wildtype, cycline E en T380A borstklieren met humaan cycline E-specifiek monoklonaal antilichaam HE12. (B) Titratie van T380A-transgenexpressie tegen die in de cycline E-muizen toont aan dat de steady-state-expressie ongeveer 10 keer hoger is in de T380A-muizen. (C) Cycline E-afhankelijke kinase-activiteit is hoger in T380A-muizen. Extracten van 2 weken durende melkklieren in het midden van de lactatie werden geïmmunoprecipiteerd met HE172 humaan cycline E-specifiek IgG. Histon H1-fosforylering in aanwezigheid van radioactief gelabeld ATP was groter bij T380A-muizen dan bij wildtype muizen (zonder het humane cycline E-transgen), terwijl in de cycline E-muizen de transgenafhankelijke kinaseactiviteit niet boven de achtergrond was verhoogd. Kinase-activiteit in p53+/− T380A-muizen was vergelijkbaar met die in de T380A-muizen. ve- en +ve-controles vertegenwoordigen respectievelijk geen toegevoegd eiwit en recombinant CyclinE/Cdk2-extract van SF9-cellen.

Het tumorspectrum in p53+/−-muizen wordt niet beïnvloed door de cycline E-transgenen

Het spectrum van tumoren dat wordt gezien in p53+/−-muizen is goed ingeburgerd. We hebben een tumorspectrum waargenomen dat vergelijkbaar is met dat van gepubliceerde rapporten (Donehower et al., 1992 Jacks et al., 1994). In multipareuze p53+/−-muizen zagen we een matig percentage borstcarcinoom, 7% (3/45). Het tumorspectrum in p53+/−-muizen met ofwel T380A- ofwel CycE-transgen was vergelijkbaar (Tabel 1) met uitzondering van een kleine frequentie van bronchiolaire/alveolaire laesies in de longen van muizen die het T380A-transgen dragen. Deze incidentele bevindingen waren echter kleine (<3 mm) enkele laesies die werden waargenomen tijdens necropsie na 18 maanden. Representatieve secties van niet-borsttumoren (inclusief de longlaesies) waren consistent negatief voor transgenexpressie maar positief voor endogene muiscycline E (gegevens niet getoond). Deze bevindingen tonen aan dat expressie van cycline E onder controle van de BLG-promotor de vorming van niet-borsttumoren niet significant bevordert.

P53 heterozygotie werkt synergetisch met het T380A-allel om borsttumorvorming te bevorderen en de levensverwachting te verlagen

De p53 +/− T380A-muizen vertoonden een lichte, maar significante vermindering van de levensverwachting in vergelijking met p53 +/−-muizen (Figuur 2a P<0.005, log-rank test). Hoewel ongeveer 25% van p53+/− en 70% van T380A-muizen tumorvrij waren na 1,5 jaar, bereikte geen p53+/− T380A-dier deze leeftijd tumorvrij (Tabel 1). Er werd enige vermindering van de levensverwachting verwacht vanwege het toegenomen aantal borsttumoren. Inderdaad, wanneer analyse van overleving werd beperkt tot alleen muizen zonder borsttumoren, was de overleving vergelijkbaar (P=0,212 log-rank testgegevens niet getoond).

p53-heterozygotie is synergetisch met het T380A-cycline E-allel bij het bevorderen van borsttumorvorming en het verminderen van de overleving, maar vermindert de tumorlatentie niet significant. (een) Het T380A cycline E-allel vermindert de overleving (linker paneel) die wordt verklaard door mammaire tumorigenese. p53 +/- T380A-muizen die het transgen tot expressie brengen (rechter paneel) een lichte maar statistisch significante afname in overleving hebben (P<0.005 log-rank test) vergeleken met de niet-transgene controles (p53 +/-). Het verschil is te wijten aan verhoogde tarieven van borsttumorigenese (zie tekst). (B) Synergie bij borsttumorvorming bij p53+/− T380A-muizen significant hoger dan een additief effect van de niveaus waargenomen in p53+/−- en T380A-muizen. (C) De latentie van borsttumorigenese is enigszins verlaagd bij p53T380A-muizen, maar bereikte geen statistische significantie. Elke cirkel vertegenwoordigt het tijdstip van doden en verticale balken vertegenwoordigen middelen.

Hoewel het tumorspectrum ongewijzigd was in p53+/−-muizen, met of zonder cycline E-transgenen, was de frequentie waarmee borsttumoren werden waargenomen aanzienlijk veranderd in de aanwezigheid van het hyperstabiele cycline E-transgen. In p53+/−-muizen zonder transgen werd borsttumorigenese waargenomen bij 7% (3/45). Bij p53+/−-muizen met het wild-type cycline E-transgen was de tumorpenetratie onveranderd met 6% (2/32), terwijl bij muizen met het hyperstabiele T380A-allel de penetrantie werd verhoogd tot 54% (30/56) (Figuur). 2b). Deze toename in tumorpenetratie was synergetisch omdat het significant groter was dan de toevoeging van de frequenties die werden waargenomen in de controlelijnen (P<0.001 Fisher's exact-test en χ 2-test). Het synergetische effect was zelfs nog groter als we bedenken dat drie van de p53 +/− T380A-muizen twee onafhankelijke borsttumoren ontwikkelden, wat een genormaliseerde verhouding van 7:12:59 opleverde (p53 +/− :T380A:p53 +/− T380A). De borsttumorfrequentie bij de muizen die transgeen waren voor het hyperstabiele allel in de afwezigheid van een p53-mutatie was slechts 12% (4/34). De latentie van de borsttumor was licht verlaagd bij p53 +/- T380A-muizen, maar bereikte geen significantie (ANOVA P<0.28 Figuur 2c), mogelijk vanwege het kleine aantal tumoren bij muizen van andere genotypen.

Alle borsttumoren waren middelzware tot hoogwaardige carcinomen (Figuur 3) met hoge mitotische snelheden, aanzienlijke nucleaire atypie, slechte acinaire differentiatie en gebieden met necrose. Lokale invasie van de huid en/of musculatuur werd meestal waargenomen. Ondanks het duidelijke maligne biologische gedrag werden hematogene metastasen echter niet waargenomen door routinematig histologisch onderzoek van long, lever en merg. Lymfatische disseminatie werd in verschillende gevallen opgemerkt, maar was over het algemeen een zeldzame observatie. Er ontstonden meer tumoren in de cervicale borstklieren dan werd verwacht, aangezien de cervicale borstklieren slechts 2 van de 10 borstklieren in de muis vormen. Deze cervicale borsttumoren waren ook geassocieerd met een kleinere gemiddelde worpgrootte (gegevens niet getoond). Veel van de niet-mammaire maligne neoplasmata vertoonden naast lokale invasie zowel hematogene als lymfatische metastatische verspreiding.

Histologie, immunohistochemische en immunoblotanalyse van transgenexpressie in borsttumoren. (een) T380A-expressie in de kernen van borstepitheel in het midden van de lactatie (DAB-bruine vlek). (B) T380A-expressie in de epitheliale component van een borsttumor die ontstaat in een p53+/− T380A-muis. (C) Afwezigheid van kleuring in een tumor van een p53+/− T380A-muis maar met een ablumenale immunoreactieve celpopulatie in aangrenzend ductaal epitheel. (NS en e) Sterke immunoreactieve kleuring van sommige epithelia in borsttumoren van respectievelijk p53 +/− T380A- en T380A-muizen, maar met negatieve kleuring in gebieden met squameuze differentiatie (pijlen). (F) Negatieve kleuring van mitotische figuren (pijlpunten) binnen een in het algemeen transgene immunopositieve tumor in een p53 +/− T380A-muis. Inzet toont vergroting van één metafasecel. De originele vergroting voor elk paneel staat in de rechterbenedenhoek. (G) Westerse analyse van borsttumoren die een goede correlatie laten zien met immunohistochemische beoordeling van transgenexpressie. + en − zijn respectievelijk positieve en negatieve controles. ++ sterke kleuring (≥50% van de epitheliale component), + zwakke kleuring <50% van de epitheliale component, − negatieve kleuring (met een component van niet-betrokken ductale epitheliale kleuring positief). Merk een sterkere expressie op in sommige tumoren dan in de borstklier in het midden van de lactatie (algemeen), hoewel variabele bloed-, stroma- en melkeiwitten met regionale expressievariaties absolute vergelijking uitsluiten.

Borsttumoren, vooral bij p53 +/− T380A-muizen, waren agressieve snelgroeiende laesies. Meestal werd een grootte van 1 cm bereikt binnen 2-8 dagen nadat de laesie voor het eerst werd gedetecteerd. Bovendien vertoonden verschillende p53 +/− T380A-laesies buitengewoon hoge mitotische indices, 20-30 mitotische cijfers per × 40 objectief veld, met frequente gebieden van necrose. Daarentegen werden laesies van T380A- of p53 +/- muizen gekenmerkt door meer gematigde mitotische snelheden van 4-20 cijfers per × 40 objectief veld (tabel 2). Hoewel werd gevonden dat verschillende muizen meerdere primaire laesies in verschillende weefsels hadden, ontwikkelden zich meerdere borstlaesies alleen in p53 +/− T380A-muizen (3/56 elke muis werd echter geteld als een enkel gegevenspunt voor penetrantieanalyse). Bij de weinige F1-generatie p53 +/− T380A-muizen, waarbij elke muis heterozygoot is op de locus van transgen-insertie, werd borsttumorvorming waargenomen met een equivalente snelheid van 60% (3/5), wat aangeeft dat hemizygositeit op de transgene locus voldoende kan zijn. voor volledige penetratie.

Histologisch waren de meeste borsttumoren samengesteld uit dichte vellen of nesten van neoplastische cellen, meestal afgewisseld met een fijne stromale component (Figuur 3). De overgrote meerderheid van de borstlaesies waren acinaire adenocarcinomen, hoewel veel sommige gebieden van squameuze metaplasie vertoonden met verschillende gradaties van keratineafzetting. Een diagnose van plaveiselcarcinoom bij afwezigheid van enige duidelijke acinaire differentiatie was zeldzaam, maar werd eenmaal geregistreerd in elk van de p53 +/− , p53 +/− T380A en T380A genotypen. Slechts één acinaire laesie (p53 +/− T380A) en twee van de plaveiselcarcinomen (1 p53 +/− en 1 T380A) werden geclassificeerd als middelmatige graad. Alle overige laesies werden geclassificeerd als hooggradig. Twee gevallen van carcinoom ter plaatse (beide van hoge kwaliteit) werden waargenomen bij p53 +/- T380A-muizen bij necropsie. Deze werden niet waargenomen in de andere genotypen.

Slechts vier p53 +/− T380A-muizen moesten worden gedood vóór de leeftijd waarop de eerste borsttumor werd opgemerkt. Deze muizen boden echter de mogelijkheid om te zoeken naar preneoplastische borstlaesies in de periode tussen de laatste zwangerschap en de relatief lange latentie vóór palpabele tumorvorming. Van deze vier muizen ontwikkelden er twee thymuslymfoom op de leeftijd van 6,8 en 9,8 maanden, één ontwikkelde een osteosarcoom en de vierde werd gedood als gevolg van ernstige dermatitis. Immunohistochemie onthulde de aanwezigheid van enkele humane cycline E-immunoreactieve cellen die zich ablumenaal van de kanalen van alle vier de muizen bevonden (zie hieronder). Bij een van de muizen met lymfoom werd een focus van alveolaire hyperplasie opgemerkt waarbij het epitheel positief kleurde voor expressie van het T380A-transgen (Figuur 3c).

Het vertegenwoordigen van tumorincidentie bij muizen die vatbaar zijn voor neoplastische laesies in meerdere orgaansystemen kan problematisch zijn om ervoor te zorgen dat de juiste conclusies worden getrokken. Het is daarom belangrijk om twee observaties te verduidelijken die niet significant van invloed zijn op onze bevindingen. Ten eerste lijkt de incidentie van osteosarcoom bij de p53+/− T380A-muizen verlaagd in vergelijking met de andere p53+/−-dragende genotypen (Tabel 1). Dit is een gevolg van de eerdere presentatie van borstlaesies en vormt dus een onderstreping van de incidentie van osteosarcoom vanwege de langere latentie van deze laesies. Ten tweede geven de overlevingscurven op vergelijkbare wijze aan dat de p53+/− T380A-muizen een significant verminderde levensverwachting hadden in vergelijking met de p53+/−-muizen die geen transgen droegen. Hoewel dit echter bijna volledig te wijten is aan de verhoogde incidentie van neoplastische borstlaesies, was de vergelijkbare overlevingscurve van de p53 +/− CycE-muizen bijna volledig te wijten aan niet-mammaire neoplasmata en slaagden ze er niet in significantie te bereiken in vergelijking met de p53 + /− genotype.

Borsttumoren vertonen frequent verlies van p53 heterozygotie en constitutieve expressie van het cycline E-transgen

In tegenstelling tot sommige rapporten over het behoud van het wildtype allel in 50% van de tumoren die ontstaan ​​bij p53 +/- muizen jonger dan 18 maanden (Venkatachalam et al., 1998), beoordeelden we p53 LOH als een frequentere gebeurtenis. Het verlies van p53-heterozygositeit werd bepaald in tumorextracten door middel van Southern-analyse (Figuur 4) en een reeks multiplex-PCR-reacties. Ondubbelzinnige p53 LOH (≥50% exon IV signaalafname zie experimentele procedures) werd waargenomen bij 100% (3/3) van de p53 +/− muizen, 100% (2/2) p53 +/− CycE muizen en 93% ( 26/28) van p53 +/- T380A-muizen (Tabel 2). Van de vier T380A-muizen die borsttumoren ontwikkelden, waren beide wildtype p53-allelen in twee gevallen niet detecteerbaar (50% 2/4), zoals bepaald met Southern-analyse. Er was twijfelachtig verlies in één ander geval (ongeveer 50% wat waarschijnlijk het verlies van één allel vertegenwoordigt), maar het vierde geval had ondubbelzinnige retentie van p53 door Southern blot. In dit latere geval werd het wildtype allel inderdaad blijkbaar behouden, zelfs na seriële passage van cellen die uit de tumor waren gekweekt (Figuur 4b). Blootstelling aan 5 Gy ioniserende straling, die krachtig p21-expressie in 10T . induceerde1/2 cellen slaagden er niet in p21-expressie in deze cellen te induceren (gegevens niet getoond), wat suggereert dat p53 functioneel wordt geïnactiveerd door een ander mechanisme dan genomisch verlies van de TRP53 plaats. Het wildtype p53-allel was onveranderlijk afwezig in cellen die waren afgeleid van borstlaesies in heterozygote p53-muizen. In tumoren die het wildtype p53-allel behouden, kunnen we p53-inactivatie of functiewinst door kleine genetische laesies, zoals puntmutaties, niet uitsluiten, hoewel deze gegevens suggereren dat functionele inactivatie in de overgrote meerderheid van de borstlaesies plaatsvond door verlies van een significant chromosomaal gebied of een volledig chromosoom.

LOH van p53 Southern-analyse en PCR. (een) Representatieve Southern-analyse van tumormonsters met exon IV-sonde die gemeenschappelijk is voor de mutant (mut), wildtype (wt) en pseudogen (Ψ), en densitometrische kwantificering. Merk op dat de meeste tumoren ondubbelzinnig verlies van heterozygotie vertonen met een niet-detecteerbaar wildtype allel. Lanen 1 en 7 bevatten controle p53 +/− DNA geëxtraheerd uit gezonde levers post mortem. Lanen 3, 6 en 12 vertonen meer twijfelachtige LOH maar nog steeds significant lager dan het mutante allel. (B) Representatieve Southern-analyse van van tumor afgeleide cellijnen die heldere p53 LOH laten zien in alle geteste lijnen die zijn afgeleid van p53+/− T380A-muizen, terwijl beide kopieën lijken te worden vastgehouden in één lijn die is afgeleid van een T380A-muis (baan 4). (C) Representatieve multiplex PCR-reactie die het deletiegebied overspant. Let op frequente p53 LOH met ondubbelzinnige retentie van het wildtype allel in slechts twee tumoren van p53 +/- T380A-muizen (lanen 5 en 6) en dubbelzinnig verlies in één (laan 29 die ook beter gedifferentieerd is). (NS) Immunohistochemie van humaan cycline E van een tumor met een relatief hoog stromagehalte (overeenkomend met baan 6 in paneel a en laan 29 in paneel c). Originele vergroting × 400.

We hadden eerder verhoogde expressie van het wild-type humane cycline E-transgen waargenomen in tumoren die ontstonden in transgene muizen die de basis vormden (Bortner en Rosenberg, 1997). We analyseerden daarom borsttumoren op transgenexpressie door immunohistochemie en door immunoblot-analyse. De meeste tumoren die waren afgeleid van transgene lijnen waren positief voor transgenexpressie (Tabel 2 en Figuur 3). Dit was enigszins onverwacht aangezien deze muizen niet drachtig of zogend waren. Indeling van immunohistochemische kleuring (Figuur 3g) correleerde goed met de meer kwantitatieve immunoblot-analyse. Bij de overgrote meerderheid van tumoren die ontstaan ​​in lijnen die het T380A-allel dragen, was meer dan 50% van de tumorepitheelcomponent humaan cycline E immunoreactief (gradatie ++). In de tumoren waar tussen 10 en 50% van de epitheliale component positief testte (gegradeerd +), werd een verscheidenheid aan kleurpatronen waargenomen, hoewel de immunoreactiviteit laag of afwezig was in cellen die squameuze metaplasie vertoonden, in mitose of grenzend aan gebieden met necrose. Tumoren waarvoor de morfologische diagnose plaveiselcarcinoom werd gesteld, testten negatief.

De incidentie van borsttumoren is gerelateerd aan pariteit in cycline E transgene muizen

Verder bewijs dat deregulatie van cycline E en tumorigenese in verband brengt, wordt gezien in de relatie tussen tumorpenetratie en het aantal zwangerschappen dat elk vrouwtje onderging (en dus uitbarstingen van transgeninductie). Hoewel er pogingen werden gedaan om elke vrouw tot twee zwangerschappen te beperken, was een derde zwangerschap als gevolg van copulatie tijdens de postpartum-oestrus relatief gebruikelijk. Bijgevolg hadden verschillende muizen van elk genotype in feite drie nesten en in twee gevallen vier nesten. We waren in staat om deze gegevens te combineren met tumorigenese-snelheden bij de weinige vrouwtjes die waren uitgesloten van de oorspronkelijke analyse, omdat ze slechts één nest hadden om een ​​vermeende relatie tussen pariteit en tumorpenetratie te onderzoeken. We verwachtten dat als tijdens elke zwangerschap nieuwe genetische laesies zouden worden geïnduceerd in cellen die konden blijven bestaan ​​​​door involutie, dit zou kunnen leiden tot een correlatie tussen het aantal nesten en de incidentie van tumoren. Aangezien deze analyse geen primair onderzoeksdoel was, was een statistisch rigoureuze analyse van het relatief kleine aantal muizen met één zwangerschap en het relatief kleine aantal categorieën niet mogelijk. Er was echter een trend tussen pariteit en borsttumorpenetratie in elk van de drie transgene genotypen die borsttumoren ontwikkelden met de hoogste incidentie waargenomen in de groep muizen die het grootste aantal zwangerschappen had gehad (Figuur 5). Verder werd deze trend niet waargenomen bij de p53+/−-muizen zonder transgen. Hoewel pariteit het risico op borstcarcinoom lijkt te verminderen bij de p53+/−-muizen zonder het transgen, is dit in overeenstemming met de verwachtingen van onderzoeken bij knaagdieren en mensen (Moon, 1969 Swanson et al., 1995 Thordarson et al., 1995 Hamilton en Mack , 2003), werd deze bescherming teniet gedaan in T380A-muizen en drastisch omgekeerd in p53 +/− T380A-muizen.

Borsttumorigenese correleert met pariteit in transgene muizen. (een) Pariteit verleent ongevoeligheid voor borsttumorigenese in p53+/−-muizen, wat teniet wordt gedaan in T380A-muizen en omgekeerd in p53+/− T380A-muizen. N staat voor het aantal muizen in elke categorie. (B) Borsttumorigenese neemt toe met pariteit in elk van de transgene lijnen, maar niet met p53+/−-muizen die een cycline E-transgen missen.

Transgen-positieve borstepitheelcellen blijven bestaan ​​​​door involutie

Immunohistochemische analyse van tumoren had onthuld dat sommige niet-aangedane borstepitheel immunopositief waren voor humaan cycline E, wat suggereert dat ofwel het transgen laat in het leven werd geactiveerd, mogelijk door hormonale invloed bij reproductieve veroudering, of dat aanhoudende expressie van het transgen optreedt in cellen die overleven na de lactatie involutie. Om deze hypothese te testen, onderzochten we transgenexpressie door middel van immunohistochemie in muizen van 6 weken (2 weken na de lactatie) en 8 weken post-partum (tegen de tijd dat de involutie voltooid is) en in het borstepitheel van muizen die voortijdig werden gedood als gevolg van vroege niet- mammaire neoplasmata of niet-neoplastische oorzaken. Tijdens het involutieproces op 6 weken na de bevalling waren nog steeds talrijke positieve longblaasjes aanwezig, hoewel in sommige kanalen een subpopulatie van ablumenale immunoreactieve cellen werd gezien (Figuur 6a). 8 weken na de bevalling was de involutie voltooid, zoals bepaald door histologie en analyse van de gehele montage. Een paar epitheelcellen waren echter nog steeds immunoreactief en zelfs in de kleinere kanalen werd een subpopulatie van ablumenale immunoreactieve cellen waargenomen (Figuur 6c). Deze subpopulatie was duidelijk in alle postlactationele T380A-dragende muizen en geeft aan dat sommige cellen waarin genetische laesies kunnen zijn opgetreden, blijven bestaan ​​door involutie. De ablumenale locatie van deze cellen suggereert dat ze mogelijk een multipotent epitheliaal voorloperceltype (basale cellen) vertegenwoordigen, hoewel ze, uit voorlopige analyse (gegevens niet getoond), niet het stamcelantigeen (SCA-1)-positieve kant lijken te vertegenwoordigen bevolking (Welm et al., 2002). Bovendien kleurt de ablumenale zijpopulatie positief voor het cycline E-transgen, zelfs in oude maagdelijke muizen. De borstklieren van verouderde maagdelijke transgene muizen bevatten ook enkele positief kleurende luminale epitheelcellen, hoewel minder dan bij parous muizen. Daarom lijkt het waarschijnlijk dat de BLG-promoter van schapen die in deze onderzoeken en die van anderen wordt gebruikt, elementen mist die nodig zijn om BLG-expressie in borstepitheel-voorlopercellen van muizen te onderdrukken.

Expressie van het transgen in de postlactationele borstklier. (een en B) 6 weken na de bevalling (2 weken na de lactatie) cycline E-immunohistochemie en analyse van de hele berg. Involutie is bijna compleet met de aanwezigheid van een klein infiltraat van ontstekingscellen (pijlen), maar er is al een subpopulatie van immunoreactieve basale cellen aanwezig rond enkele grotere kanalen (pijlpunten). Merk op dat HE12 een monoklonaal muisantilichaam is en dat het gebruik van een secundair anti-muis op muisweefsel aanleiding geeft tot achtergrondkleuring in immunoglobulinerijke melk, bloedserum en sommige lymfocyten. (C en NS) 8 weken postpartum (4 weken na lactatie) cycline E-immunohistochemie en analyse van de hele berg. Involutie is compleet met een gebrek aan ontstekingscellen, maar er blijft een subpopulatie van immunoreactieve basale cellen (pijlpunten) met enkele immunoreactieve alveolaire epitheelcellen. (e) Midlactation T380A immunohistochemie (2 weken post partum) ter vergelijking. (F) Een immunoreactief gebied van focale alveolaire hyperplasie in een p53 +/− T380A-muis die na 9,8 maanden werd gedood met een lymfoom. De originele vergroting voor elk paneel wordt weergegeven in de rechterbenedenhoek.

Vroeg verlies van p53 is verhoogd bij muizen met het T380A-allel

Omdat de latentie van mammaire tumorigenese nog steeds groot was en om onderscheid te maken tussen vroege en late p53 LOH, bepaalden we de snelheid van p53-inactivatie in de borstklieren in het midden van de lactatie van primiparous wild-tpye-, p53-, T380A- en p53 T380A-muizen door een indirecte uitlezing van cycline B1 deregulering. Deze benadering werd aangenomen als directe bepaling van p53 LOH door ter plaatse hybridisatie voor p53-mRNA of immunohistochemie waren om een ​​aantal redenen problematisch. Ten eerste is directe meting van p53 door immunohistochemie technisch uitdagend, aangezien de expressieniveaus normaal gesproken extreem laag zijn. Ten tweede, bepaling van TRP53 locus LOH zou een statistische benadering vereisen waarbij een gebeurtenis die naar verwachting extreem zeldzaam is, zou worden gemaskeerd door een achtergrond van fout-negatieve cellen. Bovendien zou het moeilijk zijn om een ​​relatief klein DNA-gebied te targeten dat in de mutant is verwijderd (ongeveer 350 bp) binnen de achtergrond van signaalruis van de mutante kopie. Ten slotte, directe meting van mRNA ter plaatse zou detectie vereisen van een fragment van 106 bp van exon 5 dat in de mutante stam is verwijderd, maar zou ook worden vertroebeld door het bestaan ​​van een verwerkt pseudogen. Zowel immunohistochemie als ter plaatse hybridisatie van p53-mRNA werd zonder succes geprobeerd.

Bij menselijke tumoren is vastgesteld dat deregulering van cycline B1, althans acuut, gecorreleerd is met een negatieve p53-status (Innocente et al., 1999 Cui en Donehower, 2000 Krause et al., 2000 Park et al., 2000 Yin et al. ., 2001 Yu et al., 2002). In deze tumoren is cycline B1 zowel gedereguleerd met betrekking tot de celcyclus als massaal tot overexpressie gebracht, zelfs tot het punt waarop verkeerd gevouwen eiwit wordt verwerkt en gepresenteerd aan het celoppervlak om een ​​immuunrespons op te roepen (Covini et al., 1997 Yu et al. , 2002). Dienovereenkomstig herstelt het toevoegen van functioneel p53 de juiste cycline B1-regulatie (Yu et al., 2002). We hebben het complementaire experiment uitgevoerd om de p53-functie gedeeltelijk weg te nemen in embryonale fibroblasten van wildtype muizen door retrovirale expressie van humaan papillomavirus E6 (Figuur 7c). Na 3 dagen groei met herhaalde dagelijkse infectie, toonde Western-analyse verhoogde niveaus van cycline B1 in de E6-geïnfecteerde cellen in vergelijking met die geïnfecteerd met de lege vector. Cyclin A levels were comparable between the cultures indicating that this was not due to significant perturbation of the cell cycle. Furthermore, immunofluorescence microscopy demonstrated that this was the case throughout the cell cycle (Figure 7d). Thus even with only partial knockdown of p53 function typical of HPV E6 expression, there is a significant deregulation of cyclin B1 expression. Analysis of midlactation mammary glands by cyclin B1 immunohistochemistry revealed occasional intensely staining cells individually or in clusters (Figure 7a). This staining is distinct from cyclin B1 immunopositivity associated with cell proliferation, as similar analysis of rapidly proliferating tissues by the same technique revealed much lower staining intensities (data not shown). Staining in the tumors of the present study showed little or no expression except in occasional isolated foci of cells with low staining intensities in comparison to the midlactation studies. We interpret this as a transient and acute phenomenon that may be selected against with further tumor growth as cyclin B1 may act as a tumor antigen (Yu et al., 2002).

Indirect assessment of p53 loss by cyclin B1 immunohistochemistry. (een) Cyclin B1 immunohistochemistry in 2-week post-partum midlactation mammary glands showing isolated (arrows) strong staining in glands from T380A and multicellular clusters staining positive in p53 +/− T380A mice. (B) The number of cyclin B1-positive cells was increased in the glands of p53 +/− T380A mice. Data represent the normalized means of 2–4 mice from each genotype five sections per primiparous mouse corresponding to the five glands from the right side of each animal. (C en NS) Increased cyclin B1 expression in mouse embryonic fibroblasts with E6 at all stages of the cell cycle correlating B1 overexpression with p53 inactivation (C) by Western blot (WB), and immunofluorescence (IF), and (NS) quantitation of IF cyclin B1 staining intensity. * P<0.001 by ANOVA.

Assessing p53 loss of function by cyclin B1 immunopositivity in midlactation mammary glands provided a number of important mechanistic insights. First, the frequencies of cyclin B1 immunopositive (presumably p53 null) cells associated with the different genotypes mirrored to a striking extent the relative frequencies of mammary tumorigenesis (compare Figure 7b to 2b). The frequency of strongly cyclin B1 immunopositive cells in the p53 +/− T380A mammary glands vastly exceeded combined frequency associated with the p53 +/− and T380A glands. These data suggest, therefore, that the number of p53 null cells generated underlies the probability of developing a mammary tumor. These data are consistent with deregulation of cyclin E driving LOH. Of course, a caveat inherent in these interpretations is that the assumption that cyclin B1 immunoreactivity is always equivalent to p53 nullizygosity cannot be proven. However, the remarkable parallel between cyclin B1 immunoreactivity and mammary tumor frequency strongly supports the validity of this assumption.


Resultaten

A population of freshly isolated mouse mammary gland cells forms mammospheres. Based on the established culture condition for human mammospheres ( 10), we tested various conditions for growing mouse mammospheres and opted to use the optimized medium containing 20 ng/mL EGF and 20 ng/mL bFGF. After 7 days of culture in this medium in a low-attachment culture plate, about 6 mammospheres with diameters >40 μm were formed per 10,000 freshly isolated mammary epithelial cells ( Fig. 1 Table 1, Experiment 1). The mammospheres contained an average of ∼250 cells, and similar numbers of sphere-forming cells were observed using cells isolated from C57BL/6J and FVB mice.

We attempted to use immunostaining and FACS to identify the fraction of mouse mammary gland cells that could form mammospheres. The tested antigens for immunostaining included CD24, a marker whose absence or expression at low levels characterizes human tumorigenic breast cancer cells ( 4) PrP and endoglin, both surface markers for mouse HSCs ( 12, 13, 17) and CD49f, a marker for in vivo repopulating mammary gland epithelial stem cells ( 7). The surface expression of these antigens in freshly isolated cells was analyzed by flow cytometry ( Fig. 1).

A representative FACS plot showed that 39.9% of total cells were negative for CD24 staining (CD24 − Fig. 1, CD24). Cells staining positively for CD24 (CD24 + ) could be further fractionated into CD24 med (4.2% of total cells) and CD24 high (54.0% of total cells) based on the relative levels of CD24 surface expression. The whole-cell population could also be fractionated into PrP − (92.5% of total cells), PrP med (5.1% of total cells), and PrP high (1.8% of total cells) based on PrP staining ( Fig. 1, PrP). Use of endoglin as a marker allowed fractionation into endoglin − (93.4%) and endoglin + (5.1%) subpopulations ( Fig. 1, Endoglin) similarly, scoring for the CD49f marker allowed fractionation into CD49f − (94.8%) and CD49f + (4.7%) subpopulations ( Fig. 1, CD49f). We also obtained the profiles of cells stained for CD24, PrP, endoglin, and CD49f in combination. We found that 4.2% of total mammary epithelial cells were CD24 + CD49f + , of which 8.4% and 20.7% were PrP + endoglin + and PrP + endoglin − , respectively ( Fig. 1, CD24 PrP Endoglin CD49f).

To identify the subpopulations of cells in the mouse mammary glands that were capable of forming mammospheres, we first plated freshly isolated CD24 − , CD24 med , and CD24 high cells in sphere-forming conditions. Only CD24 + cells, including both CD24 med and CD24 high cells, grew into typical mammospheres ( Fig. 1, Rechtsaf Table 1). The majority of sphere-forming ability resided in the CD24 high cells. In one of our experiments ( Table 1, Experiment 1), 10,000 CD24 high or CD24 med cells generated an average of 9.2 or 1.2 spheres, respectively, whereas the same numbers of CD24 − cells formed no spheres. Hence, freshly isolated mammosphere-initiating cells expressed CD24 at readily detectable levels.

We also tested the mammosphere-forming abilities of cells fractionated based on their cell surface expression of either PrP or endoglin. Whereas cells with no or high PrP staining formed none or few spheres, respectively ( Table 1), PrP med cells were capable of generating far more spheres, yielding ∼8.5 mammospheres per 10,000 cells in a representative experiment ( Fig. 1 Table 1, Experiment 1). Sphere-forming cells also resided in the endoglin + fraction (8.2 ± 1.6 spheres/10,000 cells) but very few in the endoglin − fraction (0 sphere/10,000 cells Fig. 1 Table 1, Experiment 1) as well as in the CD49f + fraction (4.2 ± 1.5 spheres/10,000 cells Table 1, Experiment 1) conversely, almost no mammosphere-forming cells were present in the CD49f − population (0.7 ± 0.2 sphere/10,000 cells Fig. 1 Table 1, Experiment 1). We repeated the mammosphere-forming experiment and observed the same trend ( Table 1, Experiment 2).

When we fractionated cells based on their cell surface expression of the CD24, PrP, endoglin, and CD49f markers, 10,000 CD24 + PrP + endoglin + CD49f + cells were capable of forming an average of 19.2 spheres ( Table 1, Experiment 1). This sphere-initiating activity is higher than that of CD24 high , PrP med , or endoglin + cells. We noticed that the CD24 + endoglin + CD49f + fraction contains largely PrP med cells ( Fig. 1). Overall, this indicated that CD24 + PrP med endoglin + CD49f + mouse mammary epithelial cells are enriched for mammosphere-initiating cells.

Cultured mammary gland cells have altered surface phenotype of mammosphere-initiating cells. We next tested whether in vitro culture of the mouse mammary gland cells could affect their display of critical cell surface markers as well as sphere-forming activity. To this end, mouse mammary glands were isolated and organoids were cultured for 6 days before immunostaining. The surface expression of CD24, PrP, endoglin, CD49f, and CD44 in cells from cultured organoids was then analyzed, as before, by flow cytometry ( Fig. 2EEN).

A representative FACS plot of such precultured mammary gland cells revealed that 12% of total cells were CD24 − ( Fig. 2A, plot 1). In either the CD24 − or the CD24 + fraction, about two thirds of the cells were PrP + (plot 1). PrP + and PrP − cells could be further fractionated by endoglin staining (plot 2). In addition, we also examined the surface coexpression of CD44 or CD49f with CD24, PrP, and endoglin. Two thirds of CD44 + cells were CD24 − (plot 3). Half of CD49f + cells were also endoglin + (plot 4). Hence, such in vitro culture resulted in an increase in those cells expressing certain markers, such as CD24, PrP, endoglin, and CD49f.

We undertook to investigate the effects of this in vitro culture on the subsequent ability of the mammary cells to generate spheres in vitro. In these experiments, we chose to focus on CD24, PrP, and endoglin as cell surface markers. Using the same sphere-forming conditions as in Fig. 1 and Table 1, we observed that precultured cells formed numbers of mammospheres comparable with those arising from freshly isolated cells. Thus, whereas 10,000 freshly isolated mammary epithelial cells yielded an average of 6.1 spheres, an average of 4.1 mammospheres were generated from 10,000 precultured mammary gland cells ( Fig. 2B, left). This indicated that propagation of mouse mammary epithelial cells in monolayer cultures did not yield a significant change in the proportion of sphere-forming cells. The mammospheres formed by precultured cells had an average diameter of 100 μm ( Fig. 2B, left).

We then examined which subpopulations of precultured cells could form mammospheres. When we plated precultured CD24 + and CD24 − cells in sphere-forming conditions, to our surprise, only CD24 − cells grew into mammospheres ( Fig. 2B, right). CD24 − cells (10,000) generated an average of 16.7 spheres with a diameter of 162 μm. In contrast, CD24 + cells formed only small irregular aggregates composed of several cells ( Fig. 2B, middle). Hence, after preculturing (6 days of in vitro growth of organoids before mammosphere culture), mammosphere-initiating cells resided exclusively in the CD24 − fraction. This was in contrast to the behavior of freshly isolated mammary epithelial cells, in which the sphere-initiating activity resided in the CD24 + fraction.

We further subfractionated the CD24 − fraction of precultured cells into PrP + and PrP − populations and tested the sphere-initiating capability of each of these subpopulations. Whereas CD24 − PrP − cells were capable of growing into larger spheres, CD24 − PrP + cells produced smaller spheres. In a representative experiment ( Fig. 2C), 400 precultured CD24 − PrP − cells generated 1 sphere with an average diameter of 201 μm, whereas the same number of precultured CD24 − PrP + cells generated spheres with an average diameter of 146 μm. When we plated 200, 100, or 50 cells from these CD24 − PrP + and CD24 − PrP − fractions, they all generated a single sphere. In addition, in all cases, CD24 − PrP − cells formed larger spheres ( Fig. 2C). Therefore, in contrast to freshly isolated cells, in which the sphere-initiating cells are enriched in the PrP med fraction, precultured cells contain PrP − cells as their major sphere-initiating population.

When we fractionated precultured cells based on their cell surface expression of CD24, PrP, and endoglin, the CD24 − PrP − endoglin + cells formed the greatest numbers of mammospheres these were also the largest in size. Table 2 summarizes the results of mammosphere formation by these various cell populations in a representative experiment. For example, 2,000 of CD24 − PrP − endoglin + cells generated an average of 1 sphere with an average diameter of 138 μm. The same number of CD24 − PrP − endoglin − cells produced 1 sphere with a diameter of 70 μm. As expected, CD24 − PrP + endoglin + and CD24 − PrP + endoglin − cells produced smaller spheres at lower frequencies than CD24 − PrP − endoglin + cells. Therefore, the CD24 − PrP − endoglin + fraction of the precultured cells is enriched for sphere-initiating cells.

In summary, the surface phenotype of mammosphere-initiating cells changes dramatically following in vitro cultuur. For freshly isolated cells, CD24 + PrP med endoglin + cells are enriched for sphere-initiating cells following culture, sphere-initiating cells are enriched in the CD24 − PrP − endoglin + population.

Table 2 also shows that, as we progressively reduced the number of cells introduced into the sphere culture, we observed fewer and smaller spheres. Nevertheless, a sphere could be generated by as few as five plated precultured CD24 − PrP − cells ( Table 2), indicating that this cell population is highly enriched for sphere-forming cells. We were therefore intrigued to know whether a mammosphere can be formed from a single initiating cell introduced into the sphere culture.

Two approaches were adopted to address this possibility. In the first, mammary gland cells isolated from GFP + and control non–GFP-expressing mice were mixed in a ratio of 1:10 and plated for sphere formation. If the sphere is initiated from a single cell, then ∼10% of finally formed spheres should be formed exclusively by GFP + cells. However, as the result showed, 9% of spheres were composed largely of GFP + cells, and 10% of these were formed exclusively from GFP + cells ( Fig. 3EEN), whereas the remainder was a mix of GFP + and GFP − cells. Therefore, only 0.9% of spheres contained exclusive GFP + cells. This suggests that the majority of spheres were formed by more than a single initiating cell.

In the second approach, we isolated cells from the primary mammospheres and plated individual cells into each well of a 96-well plate by serial dilution. We observed that 5% of the wells inoculated with single cells formed sphere-like structures ( Fig. 3B). However, these sphere-like structures were generally smaller in size compared with the mammospheres that we typically observed. Because of the positive correlation of the size of the sphere structure and the introduced cell number ( Table 2 data not shown), we propose that single cells generally tend to form smaller spheres or sphere-like structures and that accessory cells may help to form the larger mammospheres that we typically observed. Alternatively, smaller sphere-like structures may adhere to one another and grow into larger mammospheres.

Mammospheres contain mammary gland–repopulating cells. We sought to determine whether the cells present in mammospheres could repopulate the entire mammary gland following engraftment into cleared mammary fat pads. To this end, we isolated mammospheres formed by precultured GFP + CD24 − PrP − cells and also collected all the precultured GFP + CD24 − PrP + cells, which only formed the amorphous nonsphere cell aggregates. We then trypsinized these various cells and transplanted 2,000 of each of these dissociated cell populations into cleared fat pads of recipients. Whereas 2,000 cells from mammospheres derived from the CD24 − PrP − fraction generated entire mammary ductal trees, 2,000 of the cultured CD24 − PrP + cells failed to do so ( Fig. 4EEN). This suggests that some mammospheres contain stem cells that have the in vivo repopulating activity.

In other studies, Mani et al. (ref. 18 and footnote 5 ) suggested that there is a link between the property of MGSCs and epithelial-mesenchymal transition (EMT). It was shown that freshly isolated MGSCs reduced expression of E-cadherin and increased expression of N-cadherin and Smad-interacting protein 1 (SIP1 ref. 18 and footnote 5 ). We therefore examined the expression of relevant genes in cultured sphere-forming cells. As Fig. 4B shows, when compared with freshly isolated nonstem cells, cultured sphere-forming cells had increased expression of EMT markers N-cadherin, vimentin, and SIP1 but decreased levels of epithelial-specific transcription factors, such as E-cadherin, cytokeratin 14, and cytokeratin 18. This further suggests that cultured sphere-forming cells shared the similar molecular machinery as freshly isolated stem cells.

Cytogenetic analysis of mammosphere-forming cells. To get insight into karyotype constitution of mouse mammary cells after culture, we sought to conduct spectral karyotyping of freshly and precultured mammosphere-forming cells. Due to the very small numbers and very slow proliferation of these cells, it was practically impossible to undertake cytogenetic analysis immediately after the FACS. Accordingly, we expanded both FACS-fractionated freshly isolated and precultured mammosphere-forming cells by additionally culturing them until we could obtain minimal numbers of mitotic cells for harvest and analysis. After ∼3 weeks in culture, we were able to obtain a few metaphase spreads from both cell types. All available metaphases were counted for chromosome number, whereas a limited number of metaphases with less contracted chromosomes were hybridized for SKY analysis. Under those experimental conditions, both originally freshly isolated and precultured cells exhibited aneuploidy (Supplementary Fig. S1) with chromosome numbers ranging from hypodiploid (35) to hypertetraploid (88). Yet, both samples contained a distinct fraction of true diploid and tetraploid cells.

The SKY analysis provided an insight, albeit limited in size and scope, into structural karyotypic features of freshly isolated and precultured mouse mammary cells. None of the karyotypes from freshly isolated cells (Supplementary Fig. S2EEN en B), regardless of their ploidy status, contained structurally rearranged chromosomes, such as derivatives resulting from deletions or translocations. Precultured cells, on the other side, in addition to diploid or near-diploid karyotypes without structural rearrangements (Supplementary Fig. S2C), exhibited sporadic, nonrecurrent structural chromosomal rearrangements (Supplementary Fig. S2NS en E), such as translocations t(619), t(612), and t(78).


Discussie

In the present study, we analyzed development of mammary tumors in a conditional mouse model with the p53.R270H missense mutation, equivalent to human R273H, targeted into the genome of the mouse. Importantly, the wild-type and mutant p53 proteins are expressed at physiologic levels ( 19). Heterozygoot p53 R270H/+ mice developed a high frequency of spontaneous mammary tumors after tissue-specific expression of the p53.R270H mutation using WAPCre muizen. The mean latency time for tumor development in p53 R270H/+ WAPCre mice was strongly reduced when compared with previous studies with tissue-specific transplantation models ( 16), even though the BALB/c mouse strain used in the earlier studies is much more sensitive for mammary tumor development than C57BL/6 / 129 mice ( 11, 36), the genetic background of mice used here.

We here show that heterozygous loss of p53 in p53 F2−10/+ WAPCre mice does not predispose for spontaneous mammary tumors up to 48 weeks after Cre expression, whereas, at this time point, 64% of p53 R270H/+ WAPCre mice had developed one or more mammary gland tumors ( Fig. 3EEN). These observations clearly show that the p53.R270H mutation may have dominant-negative properties. In addition, comparison of mammary tumor development in p53 R270H/+ WAPCre mice with p53 R270H/F2−10 en p53 F2−10/F2−10 mice 5 reveals that latency times are not significantly different between the three genotypes (P = 0.86). These results point towards a lack of gain of function mechanisms of the p53.R270H mutant in the mammary gland. Interestingly, because in a previous study Olive et al. ( 19) did show gain of function properties of this p53 mutant allele mainly in the lung using the same mouse model, gain of function properties of p53 apparently are tissue specific. In summary, mammary tumor development in p53 R270H/+ WAPCre mice is evidently not simply caused by functional inactivation of one p53 allele, but rather shows functional inactivation of both alleles through dominant-negative action of mutant p53, as also described previously for these mice ( 19). Further indication for this was provided by LOH analysis of spontaneous p53 R270H/+ WAPCre tumoren. Although we observed the majority of mammary tumors (partly) losing the wild-type p53 allele, the wild-type fragment could still be detected, indicating that a proportion of tumor cells retained the wild-type p53 allel. We therefore hypothesize that the p53.R270H mutation has a dominant-negative effect in early stages of mammary tumorigenesis, resulting in overall genome instability, followed by LOH later in tumor development. However, to address this, further studies are needed in analyzing LOH in preneoplastic stages of mammary gland development in p53 R270H/+ WAPCre muizen.

Tumor types found were adenocarcinomas and (carcino)sarcomas, the former also frequently found in human breast cancer patients, the latter uncommon in mammary glands of mice and man. In general, sarcomas are often found in p53 +/− mice ( 8) and Li-Fraumeni syndrome patients ( 9), but no sarcomas of the mammary gland were reported thus far. However, (carcino)sarcomas of the mammary gland were found recently in conditional p53 F2−10/F2−10 K14Cre mice, with homozygous p53 deletion of exons 2 to 10 in epithelia, 6 pointing towards a role for defective p53 in mammary sarcoma development.

Apart from mammary gland tumors, some untreated p53.R270H mutant mice developed additional tumors. Expression of the p53.R270H mutation seemed to be not exclusively restricted to the mammary gland, but was also visible in some tumors and kidneys of older mice. This is most likely caused by some Cre expression in other tissues than the mammary gland, as was also described by others ( 18, 27). Another possibility is minor leakiness of the stop cassette, resulting in low levels of transcription of the mutant p53 allele in some tissues when mice age.

Steroid status is one of the main differentiating characteristics of human breast cancer. About 70% of human breast tumors are estrogen receptor α positive and estrogen receptor dependent however, mouse models rarely produce estrogen receptor α–positive mammary tumors ( 32). Therefore, it would be highly valuable to have mouse models developing estrogen receptor α–positive as well as estrogen receptor α–negative mammary tumors to study the factors that control estrogen receptor α expression and the effect of therapeutics. In the present study, mammary tumors of both estrogen receptor types were found in p53 R270H/+ WAPCre mice, with the pattern of estrogen receptor α expression (groups of contiguous cells) similar to that found in human breast carcinomas ( 37). These results resemble those reported recently ( 18), where homozygous conditional deletion of mouse p53 in mammary epithelial cells by WAPCre also led to estrogen receptor α–positive mammary tumors in mice. Apparently, inactivation of p53 induced by WAPCre expression, either through complete loss of both alleles or expression of mutant variants, directs estrogen receptor α–positive tumor development.

It is generally agreed that environmental factors and somatic genetic events are the predominant contributors to the development of sporadic cancer. Whether exposure to environmental compounds also has a significant effect on cancer development in the presence of an inherited, dominant mutant p53 allele was examined by exposing p53 R270H/+ WAPCre mice to the mammary carcinogen DMBA. Others have shown cooperation of DMBA with p53 mutation or p53 deficiency in several studies ( 11, 16). Here, latency time of DMBA-induced mammary tumors in p53 R270H/+ WAPCre mice was shortened compared with untreated mice when mice were treated at a very young age (28-70 days), a period encompassing mammary gland development and terminal end bud proliferation and maturation. Interestingly, the latency time for mammary tumor development in older (98-140 days) DMBA-treated p53 R270H/+ WAPCre mice is similar to untreated p53 R270H/+ WAPCre mice (data not shown), indicating that age at the time of exposure is a significant factor in mammary tumor development. No histologic differences were observed between spontaneous and DMBA-induced mammary tumors, with estrogen receptor α–positive and –negative tumors found in all groups. A small difference was found in the grade of estrogen receptor α positivity: DMBA-induced tumors stained slightly more positive (data not shown).

Expression profiles of specific genes seemed to change during mammary tumor development in both DMBA-treated as well as untreated mice. Interestingly, the breast tumor–related oncogene cyclin D1 is specifically induced in DMBA-treated tumors, in line with previous results obtained with DMBA-treated rats ( 38, 39). In contrast, other cyclins are down-regulated, which was unexpected because expression levels of these genes are frequently induced in mouse mammary tumors ( 40). The clearest example for this is cyclin G. Presumably, this reflects the p53 dependence of this gene because we showed before that p53.R270H embryonic stem cells display diminished activation of cyclin G after γ-irradiation compared with wild-type cells ( 26). As a result, in mammary gland tumors solely consisting of p53 mutant cells, levels of cyclin G will be much lower compared with noncancerous mammary glands also containing cells that do not express the R270H mutant protein. Indeed, comparing expression profiles of p53-mutant mammary glands with those of wild-type littermates reveals cyclin G and other genes differentially expressed, underscoring the p53 dependency of these genes and the disturbance of RNA expression levels in R270H mutant mammary glands.

Differences exist in gene expression profiles in tumors obtained from untreated and DMBA-treated p53 R270H/+ WAPCre mice, limited to a few selected genes like GADD45, cyclin D1 en cyclin D3, Ki67, en Noxa. de niveaus van GADD45, a well-known DNA damage and p53 responsive gene, were slightly induced in untreated tumors, whereas in DMBA-induced tumors levels were decreased. This difference may well be explained by the role GADD45 is playing in nucleotide excision repair, a repair system recognizing DMBA-induced adducts ( 41). Niveaus van GADD45 in normal mammary glands might be higher in DMBA-treated than in untreated mice to facilitate DNA repair in response to the introduction of DNA damage. Indeed, expression levels of GADD45 are twice higher in mammary glands of DMBA-treated mice compared with those of untreated p53 R270H/+ WAPCre mice (data not shown), explaining the relative difference of GADD45 levels in tumors. Another explanation could be the selective proliferation of cells with low repair capacity into preneoplastic lesions. Clearly, these primary expression analyses reveal unique signatures for p53 mutant and carcinogen-induced mammary tumors. In addition, we found some human relevant breast cancer genes up-regulated in mammary tumors of p53 R270H/+ WAPCre mice (i.e., cyclin D1, a breast tumor related oncogene found up-regulated in 35% of human breast cancers, and Ki67, frequently coexpressed with estrogen receptor α in estrogen receptor α–positive human tumors). These results, although the number of genes analyzed is low, are interesting, in that they show that molecular events underlying mammary gland tumor development in the p53 R270H/+ WAPCre mouse model may be, at least to some extent, similar to those occurring in human breast cancer development. However, to identify the cooperating oncogenic events in the development of mammary tumors in p53 R270H/+ WAPCre mice, a genome-wide analysis of both spontaneous and DMBA-induced tumors needs to be done.

In conclusion, conditional knock-in mouse models (as the p53.R270H mutant), with mutations equivalent to those found in humans targeted into the mouse genome, show tumor responses and tumor types highly comparable to human cancer. As such, these models are very suitable to establish precise genotype-phenotype relationships between p53 hotspot mutations found in humans and tumorigenesis in specific tissues like the breast. Ultimately, these highly human relevant mouse models can be used to study the effectiveness of novel cancer therapies.


Abstract

Insulin-like growth factor I (IGF-I) is known to regulate mammary gland development. This regulation occurs through effects on both cell cycle progression and apoptosis. Our laboratory has studied the IGF-I-dependent regulation of these processes by using transgenic and knockout mouse models that exhibit alterations in the IGF-I axis. Our studies of transgenic mice that overexpress IGF-I during pregnancy and lactation have demonstrated that this growth factor slows the apoptotic loss of mammary epithelial cells during the declining phase of lactation but has minimal effects during early lactation on milk composition or lactational capacity. In contrast, our analysis of early developmental processes in mammary tissue from mice carrying a targeted mutation in the IGF-I receptor gene suggests that IGF-dependent stimulation of cell cycle progression is more important to early mammary gland development than potential anti-apoptotic effects. With both models, the effects of perturbing the IGF-I axis are dependent on the physiological state of the animal. The diminished ductal development that occurs in response to loss of the IGF-I receptor is dramatically restored during pregnancy, whereas the ability of overexpressed IGF-I to protect mammary cells from apoptosis does not occur if the mammary gland is induced to undergo forced involution. Data from our laboratory on the expression of IGF-signaling molecules in the mammary gland suggest that this effect of physiological context may be related to the expression of members of the insulin receptor substrate family.


Download gratis en vrijblijvend de informatiebrochure

Top 10 meest aangevraagd

Ontdek 90.454 producten om je volledige potentieel mee te bereiken. Bekijk de top 10 gerelateerd aan Biologie:

Lactation Biology

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Coursera (CC)

Proefdierkunde Hbo Biotechnicus

  • BTW: Vrij van BTW
  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
  • Extra informatie:Het minimum aantal deelnemers is drie. Meer informatie lees je bij Overige informatie – Kosten.
Hogeschool Utrecht

Leraar Biologie tweedegraads

  • BTW: Vrij van BTW
  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
  • Extra informatie:Bereken welk tarief voor jou geldt Bekijk de financieringsmogelijkheden van de Lerarenbeurs
Hogeschool Utrecht

Master Leraar Biologie

  • BTW: Vrij van BTW
  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
  • Extra informatie:Dit is het minimale collegegeldtarief per jaar. Bereken welk tarief voor jou geldt Bekijk de financieringsmogelijkheden van de Lerarenbeurs
Hogeschool Utrecht

Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek (Life Sciences)

  • BTW: Vrij van BTW
  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
  • Extra informatie:Dit is het minimale collegegeldtarief per jaar. Bereken welk tarief voor jou geldt. Bekijk de mogelijkheden voor een tegemoetkoming in de studiekosten.
Hogeschool Utrecht

Biology: Animal development: We're just tubes

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Khan Academie

Biology: Natural Selection

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Khan Academie

Biology: Ape clarification

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Khan Academie

Biology: Speciation: Of ligers & men

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Khan Academie

Biology: Variation in a species

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Khan Academie

Verder leren? Het begint op Springest.nl

  • Meer dan 90.000 cursussen, opleidingen, trainers, coaches, e-learning en incompany trainingen.
  • Ruim 115.000 onafhankelijke ervaringen helpen je kiezen voor de beste opleiders.
  • Hulp bij het zoeken en inschrijven
  • Gratis informatie aanvragen
  • Klaar om te gaan leren? Schrijf je direct in, gratis annuleren is mogelijk!
  • Ook voor leren in je organisatie.

Kies de richting van je persoonlijke ontwikkeling

Over Springest

Springest is dé site waar je alles vindt voor je persoonlijke ontwikkeling. Zoek, vergelijk en kies uit 88.000 producten, zoals trainingen, cursussen, opleidingen, webinars, coaches, e-books, incompany trainingen, evenementen en behandelingen van meer dan 8.100 verschillende aanbieders. Bekijk ook onze NL Leert Door pagina, Springest helpt Nederland ook in de coronacrisis met leren.

Ons rapportcijfer Onze bezoekers geven ons een star8,8 in 711 reviews op The Feedback Company. Leren & corona: klassikaal met 1,5m maatregelen. Thuis met:computer 15.000 e-learnings

Discussie

Although several reports have suggested that increased Lcn2 expression in breast cancer may be detrimental (8, 11, 26), the precise in vivo role of Lcn2 in breast cancer initiation and progression has been challenging to define. In this study, we have shown that Lcn2 is important for PyMT-induced mammary tumor initiation and growth. Previous studies employed xenograft models to elucidate the role of Lcn2 in breast cancer, a methodology that cannot emulate the multistage nature of human breast cancer progression. We have used the well-characterized MMTV-PyMT mouse model (12) to show that genetic ablation of Lcn2 leads to a significant reduction in palpable mammary tumors in both the 129/Ola and C57/B6 backgrounds. Interestingly, the development of multifocal dysplastic lesions, the earliest event in PyMT-induced mammary cancer initiation, was not affected by a lack of Lcn2. These results point to the involvement of Lcn2 only in the later stages of primary mammary tumor progression.

The most striking result arising from our study was the dramatic drop in mammary tumor burden in virgin female Lcn2-deficient mice at ∼20 weeks of age. Although almost all Lcn2 +/+ PyMT mice had reached the maximum permitted tumor burden by this age, no Lcn2 −/− PyMT mouse had accumulated sufficient tumors to warrant sacrifice. These data point to a role for Lcn2 in primary tumor development that is consistent with published reports, and confirm Lcn2 as an important oncogenic factor in PyMT-induced mammary tumorigenesis.

Lcn2 reportedly forms a complex with MMP-9 that prevents autodegradation of this enzyme and thus sustains its activity. MMP-9 promotes cancer progression by perforating cellular basement membranes, degrading the ECM, and liberating vascular endothelial growth factor. Angiogenesis, invasion, and metastasis are thus all indirectly enabled by Lcn2. In our study, we detected a statistically significant but slight reduction in MMP-9 activity in the plasma of tumor-bearing Lcn2 −/− PyMT B6 mice compared with Lcn2 +/+ PyMT B6 mice. However, this reduction represents only a small decrease in total MMP-9 activity and likely does not explain the markedly decreased tumor burden in Lcn2-deficient mice. Indeed, Martin et al. showed that MMP-9 −/− MMTV-PyMT mice do not show any difference in primary mammary tumor burden compared to MMP-9 +/+ MMTV-PyMT controls (20), indicating that MMP-9 is not critical for PyMT-induced mammary tumor formation. Consequently, Lcn2’s oncogenic role is at best only partly dependent on its ability to stabilize MMP-9. Intriguingly, MMP-9 −/− MMTV-PyMT mice do show a decrease in mammary tumor-derived lung metastases but only in mice of the C57BL/6 background (20). In our study, we were unable to detect a statistical difference in metastasis formation in the absence of Lcn2, regardless of genetic background. These findings reinforce the notion that Lcn2 acts as an oncogene independently of MMP-9.

Several groups have advanced other hypotheses as to how Lcn2 might exert its oncogenic function. These theories include induction of the epithelial-to-mesenchymal transition (11) and inhibition of the PI3K/Akt pathway (19). We are currently investigating these potential mechanisms in our Lcn2 −/− PyMT mice.

In conclusion, our in vivo analyses of genetically modified tumor-prone mice have identified Lcn2 as an oncogene important for the later stages of primary mammary tumor development but not for the formation of lung metastases. The precise mechanism underlying this oncogenic function of Lcn2 appears to differ from its bacteriostatic function but remains to be fully elucidated. Future studies may pinpoint Lcn2 as a candidate therapeutic target for human breast cancer.


Elektronisch aanvullend materiaal

Differentially expressed between time points 1 h and 24 h in un-inoculated control cells

Extra bestand 1: . Lists of differentially expressed genes between time points 1 h and 24 h of un-inoculated control cells. Gene symbol, log2 fold changes as well as Entrez gene names are provided for each of the two paternally inherited SCS-BTA18-QTL alleles. Genes were selected on the basis of FDR adjusted p-values of q ≤ 0.05. (XLS 55 KB)

List of genes showing a significant co-expression in time-course after inoculation with heat inactivated

Additional file 2: E coli en S. aureus in SCS-BTA18-Q and SCS-BTA18-q cells, respectively. Significantly co-expressed genes in S. aureus en E coli inoculated SCS-BTA18-Q and SCS-BTA18-q cells identified using the clustering algorithm implemented in the short time-series expression miner STEM [28, 29] (version 1.3.6). Only genes with a fold change of log2 fc ≥ 0.75 in time-course were considered. Significance was assessed based on the non-random co-expression of genes by comparing the number of genes assigned to a specific co-expression profile model to the expected number of genes assigned to the co-expression profile model quantified by permutation. The number of the profile, the human gene symbol and the log fold changes for time points 0 h, 1 h, 6 h and 24 h are shown. (XLS 134 KB)


Bekijk de video: 500 jaar Geschiedenis - Lezing Maarten van Rossem (November 2021).