Informatie

3.4: Het celmembraan - biologie


Het plasmamembraan van een cel bepaalt de grens van de cel en bepaalt de aard van het contact met de omgeving. Cellen sluiten sommige stoffen uit, nemen andere op en scheiden weer andere uit, allemaal in gecontroleerde hoeveelheden. Plasmamembranen omsluiten de grenzen van cellen, maar in plaats van een statische zak te zijn, zijn ze dynamisch en constant in beweging. Het plasmamembraan moet voldoende flexibel zijn om bepaalde cellen, zoals rode bloedcellen en witte bloedcellen, van vorm te laten veranderen als ze door nauwe haarvaten gaan. Dit zijn de meer voor de hand liggende functies van een plasmamembraan. Bovendien draagt ​​het oppervlak van het plasmamembraan markers waarmee cellen elkaar kunnen herkennen, wat van vitaal belang is bij de vorming van weefsels en organen tijdens de vroege ontwikkeling, en die later een rol speelt bij het onderscheid tussen ‘zelf’ en ‘niet-zelf’. de immuunrespons.

Het plasmamembraan draagt ​​ook receptoren, die aanhechtingsplaatsen zijn voor specifieke stoffen die een interactie aangaan met de cel. Elke receptor is gestructureerd om te binden met een specifieke stof. Oppervlaktereceptoren van het membraan creëren bijvoorbeeld veranderingen in het interieur, zoals veranderingen in enzymen van metabole routes. Deze metabole routes kunnen van vitaal belang zijn om de cel van energie te voorzien, specifieke stoffen voor de cel te maken of celafval of toxines af te breken voor verwijdering. Receptoren op het buitenoppervlak van het plasmamembraan interageren met hormonen of neurotransmitters en zorgen ervoor dat hun berichten de cel in kunnen worden verzonden. Sommige herkenningssites worden door virussen gebruikt als bevestigingspunten. Hoewel ze zeer specifiek zijn, kunnen pathogenen zoals virussen evolueren om receptoren te exploiteren om toegang te krijgen tot een cel door de specifieke stof na te bootsen die de receptor moet binden. Deze specificiteit helpt verklaren waarom het humaan immunodeficiëntievirus (hiv) of een van de vijf typen hepatitisvirussen alleen specifieke cellen binnendringen.

Vloeibaar mozaïek model

In 1972 stelden S.J. Singer en Garth L. Nicolson een nieuw model van het plasmamembraan voor dat, vergeleken met eerder begrip, zowel microscopische waarnemingen als de functie van het plasmamembraan beter verklaarde. Dit werd het vloeibare mozaïekmodel genoemd. Het model is in de loop van de tijd enigszins geëvolueerd, maar verklaart nog steeds het beste de structuur en functies van het plasmamembraan zoals we ze nu begrijpen. Het vloeibare mozaïekmodel beschrijft de structuur van het plasmamembraan als een mozaïek van componenten - waaronder fosfolipiden, cholesterol, eiwitten en koolhydraten - waarin de componenten kunnen stromen en van positie kunnen veranderen, terwijl de basisintegriteit van het membraan behouden blijft. Zowel fosfolipidemoleculen als ingebedde eiwitten kunnen snel en lateraal in het membraan diffunderen. De vloeibaarheid van het plasmamembraan is noodzakelijk voor de activiteiten van bepaalde enzymen en transportmoleculen binnen het membraan. Plasmamembranen variëren van 5-10 nm dik. Ter vergelijking: menselijke rode bloedcellen, zichtbaar via lichtmicroscopie, zijn ongeveer 8 µm dik, of ongeveer 1000 keer dikker dan een plasmamembraan. (Figuur 3.4.1)

Het plasmamembraan bestaat voornamelijk uit een dubbellaag van fosfolipiden met ingebedde eiwitten, koolhydraten, glycolipiden en glycoproteïnen, en, in dierlijke cellen, cholesterol. De hoeveelheid cholesterol in dierlijke plasmamembranen regelt de vloeibaarheid van het membraan en verandert op basis van de temperatuur van de omgeving van de cel. Met andere woorden, cholesterol werkt als antivries in het celmembraan en komt vaker voor bij dieren die in koude klimaten leven.

Het hoofdweefsel van het membraan bestaat uit twee lagen fosfolipidemoleculen en de polaire uiteinden van deze moleculen (die eruitzien als een verzameling ballen in een artistieke weergave van het model) (Figuur 3.4.1) staan ​​in contact met waterige vloeistof zowel binnen als buiten de cel. Beide oppervlakken van het plasmamembraan zijn dus hydrofiel. Daarentegen is het binnenste van het membraan, tussen de twee oppervlakken, een hydrofoob of niet-polair gebied vanwege de vetzuurstaarten. Dit gebied heeft geen aantrekkingskracht op water of andere polaire moleculen.

Eiwitten vormen de tweede belangrijke chemische component van plasmamembranen. Integrale eiwitten zijn ingebed in het plasmamembraan en kunnen het hele of een deel van het membraan overspannen. Integrale eiwitten kunnen dienen als kanalen of pompen om materialen in of uit de cel te verplaatsen. Perifere eiwitten worden gevonden op de buiten- of binnenoppervlakken van membranen, gehecht aan integrale eiwitten of aan fosfolipidemoleculen. Zowel integrale als perifere eiwitten kunnen dienen als enzymen, als structurele hechtingen voor de vezels van het cytoskelet of als onderdeel van de herkenningsplaatsen van de cel.

Koolhydraten zijn het derde hoofdbestanddeel van plasmamembranen. Ze worden altijd aangetroffen op het buitenoppervlak van cellen en zijn gebonden aan eiwitten (die glycoproteïnen vormen) of aan lipiden (die glycolipiden vormen). Deze koolhydraatketens kunnen uit 2-60 monosacharide-eenheden bestaan ​​en kunnen recht of vertakt zijn. Samen met perifere eiwitten vormen koolhydraten gespecialiseerde plaatsen op het celoppervlak waardoor cellen elkaar kunnen herkennen.

EVOLUTIE IN ACTIE: Hoe virussen specifieke organen infecteren

Specifieke glycoproteïnemoleculen die op het oppervlak van de celmembranen van gastheercellen worden blootgesteld, worden door veel virussen uitgebuit om specifieke organen te infecteren. HIV is bijvoorbeeld in staat om de plasmamembranen van specifieke soorten witte bloedcellen, T-helpercellen en monocyten genaamd, binnen te dringen, evenals in sommige cellen van het centrale zenuwstelsel. Het hepatitisvirus valt alleen levercellen aan.

Deze virussen kunnen deze cellen binnendringen, omdat de cellen bindingsplaatsen op hun oppervlak hebben die de virussen hebben uitgebuit met even specifieke glycoproteïnen in hun vacht (Figuur 3.4.2). De cel wordt misleid door de nabootsing van de moleculen van de virusmantel en het virus kan de cel binnendringen. Andere herkenningsplaatsen op het oppervlak van het virus werken samen met het menselijke immuunsysteem, waardoor het lichaam antilichamen aanmaakt. Antilichamen worden gemaakt als reactie op de antigenen (of eiwitten die zijn geassocieerd met invasieve pathogenen). Deze zelfde plaatsen dienen als plaatsen voor antilichamen om zich te hechten en ofwel de activiteit van het virus te vernietigen of te remmen. Helaas worden deze sites over hiv gecodeerd door genen die snel veranderen, waardoor de productie van een effectief vaccin tegen het virus erg moeilijk is. De viruspopulatie binnen een geïnfecteerd individu evolueert snel door mutatie in verschillende populaties, of varianten, die zich onderscheiden door verschillen in deze herkenningsplaatsen. Deze snelle verandering van virale oppervlaktemarkers vermindert de effectiviteit van het immuunsysteem van de persoon bij het aanvallen van het virus, omdat de antilichamen de nieuwe variaties van de oppervlaktepatronen niet zullen herkennen.

Samenvatting

Het moderne begrip van het plasmamembraan wordt het vloeibare mozaïekmodel genoemd. Het plasmamembraan bestaat uit een dubbellaag van fosfolipiden, met hun hydrofobe vetzuurstaarten in contact met elkaar. Het landschap van het membraan is bezaaid met eiwitten, waarvan sommige het membraan overspannen. Sommige van deze eiwitten dienen om materialen in of uit de cel te transporteren. Koolhydraten zijn gehecht aan sommige van de eiwitten en lipiden op het naar buiten gerichte oppervlak van het membraan. Deze vormen complexen die functioneren om de cel aan andere cellen te identificeren. Het vloeibare karakter van het membraan is te danken aan de configuratie van de vetzuurstaarten, de aanwezigheid van cholesterol ingebed in het membraan (in dierlijke cellen), en het mozaïekkarakter van de eiwitten en eiwit-koolhydraatcomplexen, die niet stevig in plaats. Plasmamembranen omsluiten de grenzen van cellen, maar in plaats van een statische zak te zijn, zijn ze dynamisch en constant in beweging.

Meerkeuze

Welke plasmamembraancomponent bevindt zich op het oppervlak of is ingebed in de membraanstructuur?

A. eiwit
B. cholesterol
C. koolhydraat
D. fosfolipide

EEN

De staarten van de fosfolipiden van het plasmamembraan zijn samengesteld uit _____ en zijn _______?

A. fosfaatgroepen; hydrofoob
B. vetzuurgroepen; hydrofiel
C. fosfaatgroepen; hydrofiel
D. vetzuurgroepen; hydrofoob

NS

Gratis antwoord

Waarom is het voordelig dat het celmembraan van nature vloeibaar is?

De vloeibaarheid van het celmembraan is noodzakelijk voor de werking van sommige enzymen en transportmechanismen binnen het membraan.

Woordenlijst

vloeibaar mozaïek model
een model van de structuur van het plasmamembraan als een mozaïek van componenten, waaronder fosfolipiden, cholesterol, eiwitten en glycolipiden, wat resulteert in een vloeibaar in plaats van statisch karakter

Zuurgraad kan celmembraaneigenschappen veranderen

Van alle verbazingwekkende technologieën die mensen hebben ontwikkeld, heeft geen enkele de complexiteit van de fundamentele bouwsteen van de natuur geëvenaard: de levende cel. En geen van de activiteiten van de cel zou mogelijk zijn zonder dunne lipidemembranen, of dubbellagen, die de delen scheiden en hun functies reguleren.

Veranderingen in de pakking van de staarten in een hexagonaal, rechthoekig-C- of rechthoekig-P-rooster worden waargenomen bij verschillende pH-niveaus.

Het begrijpen en beheersen van de eigenschappen van dubbellagen is van vitaal belang voor vooruitgang in de biologie en biotechnologie. Nu heeft een interdisciplinair team van onderzoekers van de Northwestern University bepaald hoe de kristallisatie van dubbellagen kan worden gecontroleerd door de zuurgraad van hun omgeving te veranderen.

Het onderzoek, gepubliceerd op 24 september in de Proceedings van de National Academy of Sciences, werpt licht op de celfunctie en kan vooruitgang mogelijk maken op het gebied van medicijnafgifte en bio-geïnspireerde technologie.

"In de natuur functioneren levende wezens met een delicaat evenwicht: zuurgraad, temperatuur, alle omgevingen moeten binnen bepaalde grenzen blijven, anders sterven ze", zegt co-auteur Monica Olvera de la Cruz, advocaat Taylor Professor of Materials Science and Engineering, Chemistry , en (met dank) Chemical and Biological Engineering aan de McCormick School of Engineering van Northwestern. "Wanneer levende wezens zich echter kunnen aanpassen, zijn ze functioneler. We wilden de specifieke reeks omstandigheden vinden waaronder dubbellagen, die zoveel van de cel beheersen, in de natuur kunnen veranderen." Het onderzoek, gepubliceerd op 24 september in de Proceedings van de National Academy of Sciences, werpt licht op de celfunctie en kan vooruitgang mogelijk maken op het gebied van medicijnafgifte en bio-geïnspireerde technologie. Het begrijpen en beheersen van de eigenschappen van dubbellagen is van vitaal belang voor vooruitgang in de biologie en biotechnologie. Nu heeft een interdisciplinair team van onderzoekers van de Northwestern University bepaald hoe de kristallisatie van dubbellagen kan worden gecontroleerd door de zuurgraad van hun omgeving te veranderen.

Door gebruik te maken van de lading in de kopgroepen van de moleculen, ontwikkelden de noordwestelijke onderzoekers een nieuwe manier om de fysieke eigenschappen van het membraan te wijzigen. Ze begonnen met het samen assembleren van dilysine (+2) en carboxylaat (-1) amfifiele moleculen van verschillende staartlengtes in dubbellaagse membranen bij verschillende pH-niveaus, wat de effectieve lading van de koppen veranderde. Dubbellagen zijn gemaakt van twee lagen amfifiele moleculen - moleculen met zowel waterminnende als water-hatende eigenschappen - die een kristallijne schil rond de inhoud vormen. Gevormd als een lolly, hebben amfifiele moleculen een geladen, waterminnende (hydrofiele) kop en een waterafstotende (hydrofobe) staart. De moleculen die elke laag vormen, staan ​​​​staart-aan-staart op één lijn met de koppen die de buitenkant van het membraan vormen. De dichtheid en rangschikking van de moleculen bepalen de porositeit, sterkte en andere eigenschappen van het membraan.

Vervolgens analyseerden de onderzoekers met behulp van röntgenverstrooiingstechnologie bij het DuPont-Northwestern-Dow Collaborative Access Team (DND-CAT) bij de Advanced Photon Source van Argonne National Laboratory, de resulterende kristallisatie gevormd door de moleculen van de dubbellagen.

(Om elektronenmicroscoopbeelden van membraanstructuren te maken, hebben onderzoekers ze eerder ingevroren, maar dit proces is arbeidsintensief en verandert de structurele betrouwbaarheid, waardoor het minder relevant is voor het begrijpen van membraanassemblage en gedrag onder fysiologische omstandigheden zoals uitgevoerd in het menselijk lichaam .)

De Noordwest-onderzoekers ontdekten dat de meeste moleculen niet reageerden op een verandering in zuurgraad. Maar degenen die een kritische staartlengte bezaten - een maat die correleert met het hydrofylieniveau van de moleculen - veranderde de lading van de koppen van de moleculen in die mate dat hun tweedimensionale kristallisatie veranderde van een periodiek rechthoekig patroonrooster (gevonden in meer basische oplossingen) tot een hexagonaal rooster (gevonden in meer zure oplossingen). Schelpen met een hogere symmetrie, zoals hexagonaal, zijn sterker en minder bros dan die met minder symmetrie. De verandering in pH veranderde ook de dikte van de dubbellagen en de compactheid van de moleculen.

Het veranderen van de dichtheid en afstand van moleculen in membranen kan onderzoekers helpen de inkapseling en afgifte-efficiëntie van moleculen in een blaasje te beheersen.


De chemie en biologie van fosfatidylinositol 4-fosfaat op het plasmamembraan

Fosfoinositiden zijn een belangrijke klasse van anionische signalerende lipiden met een lage abundantie, verdeeld over intracellulaire membranen. Het plasmamembraan bevat drie fosfoinositiden: PI(4)P, PI(4,5)P2, en PI (3,4,5)P3. Van deze is PI(4)P de meest mysterieuze gebleven, ondanks de karakterisering ervan in dit membraan meer dan een halve eeuw geleden. Gelukkig hebben recente methodologische innovaties op het grensvlak tussen chemie en biologie gezorgd voor een heropleving van de belangstelling voor PI(4)P. Hier beschrijven we deze nieuwe toolsets en hoe ze nieuwe functies hebben onthuld voor de plasmamembraan PI (4) P-pool. We onderzoeken structurele karakterisering met hoge resolutie van het plasmamembraan PI 4-kinase-complex dat PI(4)P produceert, hulpmiddelen voor het moduleren van PI(4)P-niveaus, waaronder isovorm-selectieve PI 4-kinaseremmers, en fluorescerende sondes voor het visualiseren van PI( 4)P. Gezamenlijk hebben deze chemische en biochemische benaderingen inzichten onthuld in hoe cellen de synthese van PI(4)P en zijn stroomafwaartse metabolieten reguleren, evenals nieuwe rollen voor plasmamembraan PI(4)P in niet-vesiculair lipidentransport, membraanhomeostase en mensenhandel, en celsignaleringsroutes.


Een fluorescente membraanspanningssonde

Cellen en organellen worden begrensd door lipidedubbellagen waarin een hoge vervormbaarheid essentieel is voor veel celprocessen, waaronder motiliteit, endocytose en celdeling. Membraanspanning is daarom een ​​belangrijke regulator van de celprocessen die membranen hermodelleren, zij het een die zeer moeilijk in vivo te meten is. Hier laten we zien dat een planariseerbare push-pull fluorescerende sonde genaamd FliptR (fluorescerende lipidenspanningsreporter) veranderingen in membraanspanning kan volgen door de fluorescentielevensduur te veranderen als een functie van de twist tussen de fluorescerende groepen. De levensduur van de fluorescentie hangt lineair af van de membraanspanning in cellen, waardoor een gemakkelijke kwantificering van de membraanspanning mogelijk is door middel van fluorescentie-levensduurbeeldvormingsmicroscopie. We laten verder zien, met behulp van modelmembranen, dat deze lineaire afhankelijkheid tussen levensduur van de sonde en membraanspanning afhankelijk is van een membraanspanningsafhankelijke lipidefasescheiding. We bieden ook kalibratiecurven die een nauwkeurige meting van de membraanspanning mogelijk maken met behulp van fluorescentie-levensduurbeeldvormingsmicroscopie.

Belangenconflict verklaring

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële en niet-financiële belangen.

Figuren

Figuur 1. De FliptR-sonde.

Figuur 1. De FliptR-sonde.

( een ) Chemische structuur. De koolstofbinding waarrond…

Afbeelding 2. Verschillende FliptR-levensduren komen overeen met...

Figuur 2. Verschillende FliptR-levensduren komen overeen met verschillende lipidesamenstellingen in cellen.

Figuur 3. Reactie van FliptR-fluorescentielevensduur...

Figuur 3. Reactie van FliptR-fluorescentielevensduur op osmotische schokken op cellen en GUV's.

(een) FLIM-beelden van MDCK en GUV's (POPC:SM:CL 57:14:29) in isoosmotische buffer en na hyper- of hypo-osmotische schokken. (B) FliptR fluorescentie levensduur τ1 als functie van de osmotische druk Π toegepast op Hela-cellen (, helling hypo= -0,27 ± 0,13 ns·Osm –1 , helling hyper: -0,59 ± 0,04 ns·Osm –1 , gemiddelde ± SD zoals in de rest van de metingen, N=20), MDCK-cellen (, helling hypo= -0,50 ± 0,33 ns·Osm –1 , helling hyper: -0,88 ± 0,07 ns·Osm –1 , N=6) en GUV's (, helling hypo= -0.19 ± 0.18 ns·Osm –1 , helling hyper: -0.22 ± 0.03 ns·Osm –1 , N=4), met lineaire curve fit, zwarte lijn vertegenwoordigt de begintoestand. (C) Om osmotische druk te correleren Π met membraanspanning σ, werden cellen verbonden met een optisch pincet via uitgetrokken lipide nanobuisjes, en σ werd berekend uit de buiskracht gemeten als reactie op toegepaste osmotische schokken. (NS) FliptR fluorescentie levensduur τ1 als functie van de membraanspanning σ toegepast door osmotische schokken op Hela (, helling hypo= 0,26 ± 0,06 ns·m·mN –1 , helling hyper: 0,78 ± 0,14 ns·m·mN –1 , N=7) en MDCK-cellen (, helling hypo= 0,16 ± 0,07 ns·m·mN –1 , helling hyper: 2,38 ± 0,18 ns·m·mN –1 , N=11) met uitgetrokken buisjes aangesloten op optische pincet (C), met aanpassing aan het lineaire bereik vóór het begin van de verzadiging hierboven τ1 = 5,5 ns).

Figuur 4. Mogelijke structurele veranderingen van lipide...

Figuur 4. Mogelijke structurele veranderingen van lipide dubbellaagse membranen als reactie op spanning gerapporteerd door...

Afbeelding 5. Reactie van FliptR-levensduur op...

Figuur 5. Reactie van FliptR-levensduur op membraanspanning in GUV's met en zonder fase...


Varnai, P. et al. Inositol lipidenbinding en membraanlokalisatie van geïsoleerde pleckstrin homologie (PH) domeinen. Onderzoek naar de PH-domeinen van fosfolipase C delta 1 en p130. J. Biol. Chem. 277, 27412–27422 (2002).

Levine, TP & Munro, S. Targeting van Golgi-specifieke pleckstrin-homologiedomeinen omvat zowel PtdIns 4-kinase-afhankelijke als -onafhankelijke componenten. Curr. Biol. 12, 695–704 (2002).

Godi, A. et al. FAPP's regelen het verkeer van Golgi-naar-celoppervlakmembraan door ARF en PtdIns (4) P te binden. Natuur cel biol. 6, 393–404 (2004).

Malecz, N. et al. Synaptojanin 2, een nieuwe Rac1-effector die door clathrine gemedieerde endocytose reguleert. Curr. Biol. 10, 1383–1386 (2000).

Godi, A. et al. ARF bemiddelt rekrutering van Ptdlns-4-OH kinase-beta en stimuleert de synthese van Ptdlns(4,5)P2 op het Golgi-complex. Natuur cel biol. 1, 280–287 (1999).

Christoforidis, S. et al. Fosfatidylinositol-3-OH-kinasen zijn Rab5-effectoren. Natuur cel biol. 1, 249–252 (1999).

Donaldson, J.G. Meerdere rollen voor Arf6: sorteren, structureren en signaleren op het plasmamembraan. J. Biol. Chem. 278, 41573–41576 (2003).

Aikawa, Y. & Martin, T.F. ARF6 reguleert een plasmamembraanpool van fosfatidylinositol(4,5)bisfosfaat die nodig is voor gereguleerde exocytose. J. Cell Biol. 162, 647–659 (2003).

Simonsen, A. et al. EEA1 koppelt de PtdIns (3) K-functie aan Rab5-regulatie van endosoomfusie. Natuur 394, 494–498 (1998).

Cremona, O. & De Camilli, P. Phosphoinositides in membraanverkeer bij de synaps. J. Cel Wetenschap. 114, 1041–1052 (2001).

Gaidarov, I., Smith, M.E., Domin, J. & Keen, J.H. De klasse II fosfoinositide 3-kinase C2alpha wordt geactiveerd door clathrine en reguleert door clathrine gemedieerde membraantransport. Mol. Cel 7, 443–449 (2001).

Kihara, A., Kabeya, Y., Ohsumi, Y. & Yoshimori, T. Beclin-fosfatidylinositol 3-kinase-complex functioneert aan de trans-Golgi-netwerk. EMBO-rep. 2, 330–335 (2001).

De Matteis, M., Godi, A. & Corda, D. Phosphoinositides en het Golgi-complex. Curr. Opin. Cel Biol. 14, 434–447 (2002).

Martin, T. F. PtdIns(4,5)P(2)-regulatie van oppervlaktemembraanverkeer. Curr. Opin. Cel Biol. 13, 493–499 (2001).

Botelho, R.J. et al. Gelokaliseerde bifasische veranderingen in fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat op plaatsen van fagocytose. J. Cell Biol. 151, 1353–1368 (2000).

Vieira, O.V. et al. Verschillende rollen van klasse I en klasse III fosfatidylinositol 3-kinasen in fagosoomvorming en rijping. J. Cell Biol. 155, 19–25 (2001).

Gillooly, DJ et al. Lokalisatie van fosfatidylinositol 3-fosfaat in gist- en zoogdiercellen. EMBO J. 19, 4577–4588 (2000).

Mishra, SK et al. Disabled-2 vertoont de eigenschappen van een lading-selectieve endocytische clathrine-adapter. EMBO J. 21, 4915–4926 (2002).

Nishikawa, K. et al. Associatie van proteïnekinase Cmu met type II fosfatidylinositol 4-kinase en type I fosfatidylinositol-4-fosfaat 5-kinase. J. Biol. Chem. 273, 23126–23133 (1998).

Hao, W. et al. Regulering van de AP-3-functie door inositiden. Identificatie van fosfatidylinositol 3,4,5-trifosfaat als een krachtig ligand. J. Biol. Chem. 272, 6393–6398 (1997).

Ford, M.G. et al. Kromming van met clathrin beklede putjes aangedreven door epsin. Natuur 419, 361–366 (2002).

Matsuoka, K. et al. COPtdInsI-gecoate blaasjesvorming gereconstitueerd met gezuiverde manteleiwitten en chemisch gedefinieerde liposomen. Cel 93, 263–275 (1998).

Chaudhary, A. et al. Specifieke interactie van Golgi-coatomeer-eiwit alfa-COP met fosfatidylinositol 3,4,5-trisfosfaat. J. Biol. Chem. 273, 8344–8350 (1998).

Wang, YJ et al. Fosfatidylinositol 4-fosfaat reguleert de targeting van clathrine-adapter AP-1-complexen naar het Golgi. Cel 114, 299–310 (2003).

Mills, I.G. et al. EpsinR: een AP1 / clathrine-interagerend eiwit dat betrokken is bij de handel in blaasjes. J. Cell Biol. 160, 213–222 (2003).

Verstreken, P. et al. Synaptojanine wordt gerekruteerd door endofiline om het ontmantelen van synaptische blaasjes te bevorderen. neuron 40, 733–748 (2003).

Schuske, K.R. et al. Endofiline is vereist voor endocytose van synaptische blaasjes door synaptojanine te lokaliseren. neuron 40, 749–762 (2003).

Terebiznik, MR et al. Eliminatie van gastheercel Ptdlns(4,5)P(2) door bacteriële SigD bevordert membraansplitsing tijdens invasie door Salmonella. Natuur cel biol. 4, 766–773 (2002).

Rozelle, A.L. et al. Fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat induceert op actine gebaseerde beweging van met vlot verrijkte blaasjes door WASP-Arp2/3. Curr. Biol. 10, 311–320 (2000).

Klopfenstein, DR, Tomishige, M., Stuurman, N. & Vale, RD De rol van fosfatidylinositol (4,5) bisfosfaatorganisatie in membraantransport door de Unc104-kinesinemotor. Cel 109, 347–358 (2002).

Christoforidis, S., McBride, HM, Burgoyne, RD & amp Zerial, M. De Rab5-effector EEA1 is een kerncomponent van endosoom-docking. Natuur 397, 621–625 (1999).

Mayer, A. et al. Fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat reguleert twee stappen van homotypische vacuolefusie. Mol. Biol. Cel 11, 807–817 (2000).

Boeddinghaus, C., Merz, AJ, Laage, R. & Ungermann, C. Een cyclus van Vam7p-afgifte van en PtdIns 3-P-afhankelijke herbinding aan de gistvacuole is vereist voor homotypische vacuolefusie. J. Cell Biol. 157, 79–89 (2002).

Godi, A. et al. ADP-ribosyleringsfactor reguleert de binding van spectrine aan het Golgi-complex. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 95, 8607–8612 (1998).

Randazzo, P.A., Nie, Z., Miura, K. & Hsu, V.W. Moleculaire aspecten van de cellulaire activiteiten van ADP-ribosyleringsfactoren. Wetenschap. STKE 59, DOI: 10.1126/stke.2000.59.re1 (2000).

Zheng, J. et al. Identificatie van de bindingsplaats voor zure fosfolipiden op het pH-domein van dynamine: implicaties voor stimulatie van GTPase-activiteit. J. Mol. Biol. 255, 14–21 (1996).

Kutateladze, T. & Overduin, M. Structureel mechanisme van endosoom-docking door het FYVE-domein. Wetenschap 291, 1793–1796 (2001).

Cheever, M.L. et al. Phox-domeininteractie met PtdIns (3) P richt de Vam7 t-SNARE op vacuole-membranen. Natuur cel biol. 3, 613–618 (2001).

Dumas, J.J. et al. Multivalente endosoomtargeting door homodimere EEA1. Mol. Cel 8, 947–958 (2001).

Mao, Y. et al. Kristalstructuur van de VHS- en FYVE-tandemdomeinen van Hrs, een eiwit dat betrokken is bij membraantransport en signaaltransductie. Cel 100, 447–456 (2000).

Misra, S. & Hurley, J.H. Kristalstructuur van een fosfatidylinositol 3-fosfaat-specifiek membraangericht motief, het FYVE-domein van Vps27p. Cel 97, 657–666 (1999).

Bravo, J. et al. De kristalstructuur van het PX-domein van p40(phox) bond aan fosfatidylinositol 3-fosfaat. Mol. Cel 8, 829–839 (2001).

Itoh, T. et al. De rol van het ENTH-domein in fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaatbinding en endocytose. Wetenschap 291, 1047–1051 (2001).

Ford, M.G. et al. Gelijktijdige binding van PtdIns(4,5)P2 en clathrine door AP180 bij de nucleatie van clathrineroosters op membranen. Wetenschap 291, 1051–1055 (2001).

Farsad, K. & De Camilli, P. Mechanismen van membraanvervorming. Curr. Opin. Cel Biol. 15, 372–381 (2003).

Petiot, A., Faure, J., Stenmark, H. & Gruenberg, J. PtdIns3P-signalering reguleert receptorsortering, maar niet transport in de endosomale route. J. Cell Biol. 162, 971–979 (2003).

Suchy, SF, Olivos-Glander, IM & Nussabaum, RL Lowe-syndroom, een tekort aan fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat 5-fosfatase in het Golgi-apparaat. Brommen. Mol. Genet. 4, 2245–2250 (1995).

Wishart, MJ & Dixon, JE PTEN en myotubularinefosfatasen: van 3-fosfoinositide-defosforylering tot ziekte. Trends Cell Biol. 12, 579–585 (2002).

Dang, H., Li, Z., Skolnik, E.Y. & Fares, H. Ziektegerelateerde myotubularines functioneren in endocytisch verkeer in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cel 15, 189–196 (2004).

Naga Prasad, S.V. et al. Fosfoinositide 3-kinase reguleert beta2-adrenerge receptor-endocytose door AP-2-rekrutering naar het receptor/bèta-arrestinecomplex. J. Cell Biol. 158, 563–575 (2002).

Arico, S. et al. De tumorsuppressor PTEN reguleert macroautofagie positief door de fosfatidylinositol 3-kinase/proteïnekinase B-route te remmen. J. Biol. Chem. 276, 35243–35246 (2001).

Walker, SM, Downes, CP & Leslie, N.R. TPtdInsP: een nieuwe fosfoinositide 3-fosfatase. Biochem. J. 360, 277–283 (2001).

Wu, Y. et al. PTEN 2, een Golgi-geassocieerde testis-specifieke homoloog van de PTEN-tumoronderdrukker lipidefosfatase. J. Biol. Chem. 276, 21745–21753 (2001).

Pendaries, C., Tronchere, H., Plantavid, M. & Payrastre, B. Phosphoinositide-signaleringsstoornissen bij menselijke ziekten. FEBS Lett. 546, 25–31 (2003).

Norris, FA, Wilson, MP, Wallis, TS, Galyov, EE & Majerus, PW SopB, een eiwit dat nodig is voor de virulentie van Salmonella Dublin, is een inositolfosfaatfosfatase. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 95, 14057–14059 (1998).

Vergne, I., Chua, J. & Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis fagosoomrijping arrestatie: selectieve targeting van PtdIns3P-afhankelijke membraanhandel. Verkeer 4, 600–606 (2003).

Simonsen, A., Wurmser, AE, Emr, S.D. & Stenmark, H. De rol van fosfoinositiden bij membraantransport. Curr. Opin. Cel Biol. 13, 485–492 (2001).

Schu, P. V. et al. Fosfatidylinositol 3-kinase gecodeerd door gist VPS34 gen essentieel voor het sorteren van eiwitten. Wetenschap 260, 88–91 (1993).

Fouraux, MA et al. Rabip4? is een effector van rab5 en rab4 en reguleert het transport door vroege endosomen. Mol. Biol. Cel 15, 611–624 (2004).

Xu, Y., Hortsman, H., Seet, L., Wong, S.H. & Hong, W. SNX3 reguleert de endosomale functie door zijn PX-domein-gemedieerde interactie met PtdIns (3) P. Natuur cel biol. 3, 658–666 (2001).

Rudge, SA, Anderson, D.M. & Emr, SD Vacuole-grootteregeling: regulering van PtdIns (3,5) P2-niveaus door het vacuole-geassocieerde Vac14-Fig4-complex, een PtdIns (3,5) P2-specifieke fosfatase. Mol. Biol. Cel 15, 24–36 (2003).

Panaretou, C. & Tooze, S.A. Regulering en rekrutering van fosfatidylinositol 4-kinase op onrijpe secretoire korrels is onafhankelijk van ADP-ribosyleringsfactor 1. Biochem. J. 363, 289–295 (2002).

Bankaitis, VA, Aitken, JR, Cleves, AE & Dowhan, W. Een essentiële rol voor een fosfolipide-overdrachtseiwit in de Golgi-functie van gist. Natuur 347, 561–562 (1990).


Membraan Architectuur

Membranen zijn van vitaal belang omdat ze de cel scheiden van de buitenwereld. Ze scheiden ook compartimenten in de cel om belangrijke processen en gebeurtenissen te beschermen.

Celmembranen hebben verschillende functies in de verschillende regio's en organellen van een cel. Op elektronenmicroscopisch niveau delen ze echter een gemeenschappelijke structuur na routinematige voorbereidende stappen. De bovenstaande afbeelding toont het typische "Unit" -membraan. die lijkt op een spoorlijn met twee dichte lijnen gescheiden door een vrije ruimte. Deze figuur toont eigenlijk twee aangrenzende plasmamembranen, die beide de "eenheidsmembraan" -structuur hebben.

(Bovenstaande afbeelding overgenomen uit Bloom en Fawcett, A Textbook of Histology, Chapman en Hall, N.Y., 12e editie, 1994, Afbeelding 1-2.)

Om je voor te bereiden op dit deel van de discussie over membranen, lees je pagina's 477-488 van je tekst

(Alberts et al. Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y. Derde editie, 1994.)

Hoe leidden vroege celbiologen de membraanstructuur af uit elektronenmicroscopische beelden en de kennis dat membranen lipoproteïnecomplexen waren?

Let op het materiaal dat zowel binnen als buiten de cel uit het plasmamembraan steekt. Wat denk je dat dit is? Buiten de cel bevindt zich ook in de bovenste helft van de foto. Kun je een blaasje vinden met een eenheidsmembraanstructuur?

Een historisch perspectief

In het begin van de jaren dertig en veertig bestudeerden Danielli en Davson triglyceriden-lipidedubbellagen boven een wateroppervlak. Ze ontdekten dat ze zich schikten met de poolkoppen naar buiten gericht. Ze vormden echter altijd druppeltjes (olie in water) en de oppervlaktespanning was veel hoger dan die van cellen. Als je echter eiwitten toevoegt, wordt de oppervlaktespanning verlaagd en worden de membranen plat.

Hier is een diagram van hun vroege model van het celmembraan.

Welke membraanfuncties kunnen door dit model worden toegestaan?

In de jaren vijftig merkte Robertson de structuur van membranen op die te zien zijn in de bovenstaande elektronenmicrofoto's. Hij zag geen ruimtes voor poriën in de elektronenmicrofoto's. Hij veronderstelde dat het uiterlijk van het spoor afkomstig was van de binding van osmiumtetroxide aan eiwitten en polaire groepen van lipiden.

Wat ontbreekt er in het model van Robertson?

In 1966 merkten Lenard en Singer op dat meer dan 30% van de membraaneiwitten in een alfa-helix waren gedraaid. Dit maakte het waarschijnlijk dat er veel bolvormige eiwitten waren.

Zou je een Davson-Danielli- of Robertson-model kunnen bouwen met bolvormige eiwitten? Wat zou er gebeuren met de grootte van het membraan?

Bovendien, wat zou er gebeuren als je de eiwitten zou ontvouwen en niet-polaire (hydrofobe aminozuurzijketens) groepen zou blootstellen aan de waterige omgeving?

Wat voor soort energie zou de cel moeten verbruiken om eiwitten in deze toestand plat te houden?

Singer bestudeerde fosfolipide dubbellagen en ontdekte dat ze een afgeplat oppervlak op water kunnen vormen, zonder dat er een eiwitlaag nodig is. Het keerpunt in de modellering kwam met de komst van vriesbreuktechnieken. Deze figuur toont de binnenkant van een membraan en de "hobbels, groeven, ribbels". Dit bleken later eiwitten te zijn.

Welke conclusies zou je kunnen trekken over de membraanstructuur op de foto links?

Basismembraan architectuur Het doel van deze presentatie is om te laten zien hoe membranen worden bestudeerd door de celbioloog. Eerst zullen we kijken naar de membraanarchitectuur van de basiseenheid. Alle membranen bevatten eiwitten en lipiden. Het aandeel van elk varieert echter afhankelijk van het membraan. Bijvoorbeeld: Myeline, dat zenuwvezels isoleert, bevat slechts 18% eiwit en 76% lipiden. Een elektronenmicrofoto van myeline is aan de rechterkant. Het mitochondriale binnenmembraan bevat 76% eiwit en slechts 24% lipide. Plasmamembranen van menselijke rode bloedcellen en muizenlever bevatten bijna gelijke hoeveelheden eiwitten (respectievelijk 44, 49%) en lipiden (respectievelijk 43, 52%). Als je bedenkt wat je al weet over deze cellen of organellen, wat zou dan de betekenis zijn van deze verschillende verhoudingen van lipiden en eiwitten?

Zoals we hierboven al zeiden, is de membraanarchitectuur die van een lipidedubbellaag. De lipiden zijn amfipathisch omdat ze hydrofiele polaire koppen hebben die naar buiten wijzen en het hydrofobe deel de kern vormt.

Bekijk naast deze figuur ook uw tekst (Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, Third edition, Garland Publishing, N.Y. 1994) op pagina 55 voor een cartoon van een lipidedubbellaag gevormd door fosfolipiden en glycolipiden. Deze cijfers zijn ontleend aan uw tekst, figuur 10-1, pagina 477. Eiwitten zijn ingebed in de dubbellaag. Ze kunnen door de dubbellaag gaan (als transmembraaneiwitten), of ze kunnen in het cytoplasmatische of buitenoppervlak worden ingebracht.

In deze figuur is een dwarsdoorsnede van de dubbellaag te zien. Zoals we hieronder in meer detail zullen zien, hebben de lipidemoleculen een bolvormige (polaire) kop en een recht gebied (niet-polair). Elke rij lipiden is een folder. Daarom bestaat het plasmamembraan uit twee blaadjes met de niet-polaire gebieden naar binnen gericht.

Laten we het membraan uit elkaar halen en elk van zijn componenten onderzoeken. Een van de belangrijkste soorten lipiden in het membraan zijn de fosfolipiden. Deze hebben een polaire kopgroep en twee koolwaterstofstaarten. Een voorbeeld van een fosfolipide wordt getoond in deze figuur (rechts). Het bovenste gebied dat begint met de NH3 is de polaire groep. Het is door glycerol verbonden met twee vetzuurstaarten. Een van de staarten is een vetzuur met rechte keten (verzadigd). De andere heeft een knik in de staart vanwege een cis dubbele binding (onverzadigd). Deze knik beïnvloedt de pakking en beweging in het laterale vlak van het membraan. Afbeelding links is gewijzigd van

Alberts et al. Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y., 1994, derde editie, figuur 10-10.

Onderstaande figuur is van Wolfe S.L., Molecular and Cellular Biology, Wadsworth Publishing Company, 1993, p 155.

De figuur in deze paragraaf laat zien hoe de fosfolipiden samenpakken in de twee blaadjes in het membraan. De aanwezigheid van de dubbele cis-binding voorkomt een strakke pakking en maakt de dubbellaag moeilijk te bevriezen. Afbeelding gewijzigd van

Alberts et al. Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y., 1994, derde editie, figuur 10-7.

The lipid bilayer gives the membranes its fluid characteristics. The following cartoon shows the effect of temperature on the packing of the hydrocarbons. Note that a low temperatures, the bilayer is in a gel state and tightly packed. At higher (body) temperatures, the bilayer actually "melts' and the interior is fluid allowing the lipid molecules to move around, rotate, exchange places. This also allows movement of other components of the membrane. The figure below is from Wolfe S.L., Molecular and Cellular Biology, Wadsworth Publishing Company, 1993.

Membrane Cholesterol

Another type of lipid in the membrane is cholesterol. The amount of cholesterol may vary with the type of membrane. Plasma membranes have nearly one cholesterol per phospholipid molecule. Other membranes (like those around bacteria) have no cholesterol. The following figure shows the steroid structure of cholesterol. The non-polar and polar regions are also illustrated in b) (Figure modified from

Alberts et al. Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y., 1994, Third Edition, Figure 10-8.

The cholesterol molecule inserts itself in the membrane with the same orientation as the phospholipid molecules. The figures show phospholipid molecules with a cholesterol molecule inbetween. Note that the polar head of the cholesterol is aligned with the polar head of the phospholipids. Figure modified from

Alberts et al. Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y., 1994, Third Edition, Figure 10-9 or

Wolfe S.L., Molecular and Cellular Biology, Wadsworth Publishing Company, 1993 (figure below).

Cholesterol molecules have several functions in the membrane:

  • They immobilize the first few hydrocarbon groups of the phospholipid molecules. This makes the lipid bilayer less deformable and decreases its permeability to small water-soluble molecules. Without cholesterol (such as in a bacterium) a cell would need a cell wall.
  • Cholesterol prevents crystallization of hydrocarbons and phase shifts in the membrane.

Membrane Glycolipids

Glycolipids are also a constituent of membranes. In this figure, they are shown as blue sugar groups projecting into the extracellular space. They may microaggregate in the membrane. These components of the membrane may be protective, insulators, and sites of receptor binding. Among the molecules bound by glycososphingolipids include cell poisons such as cholera and tetanus toxins. The lower figure shows the chemical structure of two examples of glycososphingolipids.

Top Figure modified from Alberts et al. Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y., 1994, Third Edition, Figure 10-11.

Formation of "Microdomains"

Sphingolipids and cholesterol work together to help cluster proteins in a region called a "microdomain". They function as "rafts" or platforms for the attachment of proteins as membranes are moved around the cell and also during signal transduction. For more information about the rafts and "microdomains" see: Simons and Ikonen, Nature 387: 569, 1997. Also, R.E. Brown, J. Cell Science 111: 1-9, 1998

Membraan Eiwitten

As you study different organelles, you will learn about important membrane proteins that function for that particular organelle.

Transmembrane proteins are amphipathic, in that they have hydrophobic and hydrophilic regions that are oriented in the same regions in the lipid bilayer . Another name for them is "integral proteins". Other types of proteins may be linked only at the cytoplasmic surface (by attachment to a fatty acid chain), or at the external cell surface, attached by a oligosaccharide. Or, these non-transmembrane proteins may be bound to other membrane proteins. Collectively these are called "peripheral membrane proteins" .

We will be studying specific membrane proteins in later lectures (ion channels, proteins in endoplasmic reticulum, etc). Therefore, this presentation will not spend much time on them. Review pp 486 and 487 in your text for information on insertion of a transmembrane proteins. Proteins inserted once through the membrane are called "single-pass transmembrane proteins." Those that pass through several times are called "multipass transmembrane proteins". They form loops outside the membrane Later lecturers will spend more time on this as key proteins are introduced.


Discussie

Understanding how the nanoscale structure of biological systems relates to function is a challenging, ongoing pursuit. One difficulty is that only a few probes are capable of directly interrogating structure at this scale: electrons, X-rays, and neutrons. Electrons have enjoyed the widest application in cell biology, and EM remains the single most powerful tool for studying cellular ultrastructure. met betrekking tot de B. subtilis membrane, a cryo-EM study of sectioned, freeze-substituted cells provided a striking picture of the cellular architecture, including the cell wall.[56] However, the structure of the plasma membrane was not well determined, and its thickness was estimated at 66 ± 8 Å, a surprisingly large value. Our results complement this EM picture of the cell envelope by providing a high-resolution hydrophobic thickness determination obtained under physiological conditions.

X-ray and neutron scattering have been widely used for studying the structure of model membranes composed of defined lipid mixtures[3–5,28,29,46] or natural lipid extracts.[6–12] X-ray scattering has also been used recently for the ex vivo study of cellular membranes,[6] but its application to intact cells is confounded by the issue of background scattering from water and biomolecules. Neutron scattering uniquely provides a solution to the background problem in the form of isotopic contrast variation. We have shown here that in vivo contrast variation through metabolic labeling can effectively suppress scattering from the complex cellular milieu, while highlighting specific features of interest, even when they arise from minor components such as lipids (approximately 1% of cellular wet mass). Furthermore, the cold neutrons used for scattering experiments are well suited for studies on living cells because of their low kinetic energy (<0.025 eV) and their nonionizing character—in contrast to high-energy X-ray and electron beams (>5,000 eV).

Prior applications of neutron scattering in vivo have relied upon external solvent contrast, only, which in some cases has been sufficient to observe Bragg scattering from repeat structures in thylakoid membranes[57,58] and mitochondria.[59] These studies have not revealed membrane structure per se, but have provided information on the arrangement of closely packed membranes. By creating internal contrast, i.e., by differentially labeling specific cellular components, we have, for the first time enabled high-resolution ultrastructural measurements on a single membrane. In this work, we demonstrated the power of a chemical-biology–based approach to create selective internal contrast, thereby enabling high-resolution measurements of the in vivo membrane thickness.

Our in vivo contrast variation approach also provides a new tool to study lateral membrane structure in living cells. Neutron-based structural methods offer distinct advantages in that they report nanoscopic lipid structure directly, without the need for models or extrinsic probes. Indications of nonuniform mixing[60,61] within the plasma membrane emerged contemporaneously with the landmark fluid–mosaic model proposed in 1972,[16] the concept of membrane domains became well established by the mid-1970s,[62] and the lipid raft hypothesis was formalized in 1997.[21] Nonetheless, the existence of lipid domains has remained controversial,[63] and because they are believed to be both transient and smaller than the diffraction limit of light (200 nm), they eluded observation by conventional microscopic techniques. Recently, however, ultra-resolution fluorescence microscopy was used to identify diffusionally restricted islands on the scale of 20 nm in the plasma membrane of rat kidney epithelial cells.[6] Our observation of lipid segregation on a comparable scale in the plasma membrane of B. subtilis is consistent with the existence of analogous lipid domains in bacteria and supports the notion that nanoscopic lipid assemblies are an integral feature of biological membranes.

The critical barrier that has prevented application of high-resolution neutron scattering techniques in vivo was lack of a means to create internal contrast. In this work, we overcame the barrier and showed that B. subtilis is an ideal in vivo model system for the application of neutron contrast variation strategies. Through specific growth conditions and select genotypes, we were able to attenuate cellular contrast globally and precisely reintroduce contrast into the membrane. With the ability to control both the chemical and isotopic properties of the membrane lipids, we were able to interrogate both transverse and lateral membrane structure. The same general approach to selective contrast can potentially be extended to other biomolecules and model organisms for applications outside the membrane arena. More immediately, the in vivo experimental platform can be used to investigate the response of the plasma membrane to a diverse range of physical, chemical, genetic, and environmental stimuli. We anticipate that this capability will therefore prove valuable in many areas, such as antibiotic development, biofuel production, membrane protein function, and understanding the interplay between the membrane, cytoskeleton and cell wall in creating a protective, adaptable, multifunctional interface.


WHAT IS BEING DONE TO INVESTIGATE LIPID FUNCTION, AND WHERE DO WE STILL NEED TO GO?

There are many challenges to understanding the roles of lipids in biological processes. We need to 1) identify which lipid families and species participate in the process 2) visualize these lipids in relevant cellular compartments or structures, preferably in live cells so that turnover can be evaluated 3) measure physical and mechanical properties of relevant lipids and membranes, including identification of interaction partners and 4) perturb lipid levels for phenotypic and therefore functional analyses. We highlight some strategies that are beginning to address these challenges.

Lipid identification

Proteins and nucleic acids consist of different subunits that are repeatedly linked by the same type of chemical bond, making them amenable to iterative sequencing. In contrast, different subunits within lipids have many different chemical connectivities made by complex networks of biosynthetic enzymes, which has made systematic lipid identification more challenging. While it is possible to detect some lipid species by nuclear magnetic resonance (NMR), mass spectrometry (MS) is the most general method to assign the chemical structures of different lipids, and advances over the past decade now allow the detection of small quantities in complex mixtures such as cell extracts. Relevant lipids can be identified in global or targeted lipid-profiling analyses, and we can determine which lipids are enhanced or depleted across multiple samples using software to identify compositional changes. The chemical detective work needed to propose a chemical structure for a lipid of interest based on MS fragmentation patterns has been greatly aided by the recent emergence of databases such as Lipidmaps (Fahy et al., 2007) and Metlin (Smith et al., 2005 Tautenhahn et al., 2012). Lipid MS is now getting to a stage where it can be used by a nonspecialist chemical or cell biology lab such as ours. For example, we were able to show that dividing cells regulate their lipid content and identified which lipids change with the cell cycle (Atilla-Gokcumen et al., 2014).

Wat is het volgende? Next-generation MS toward spatial resolution

Although the compositional analysis of lipids, especially in tissues, has been informative, it is not yet at the resolution that would allow systematic mechanistic insights. Usually analyses are conducted with total lipid extracts, meaning that they contain lipids from all cellular lipid compartments. To analyze specifically the composition of a region or membrane of interest, we need either to improve our ability to isolate this region biochemically for subsequent MS or to couple MS with techniques providing spatial resolution. Both strategies are gaining traction. As we learn more about membrane-based processes, we identify the proteins involved and can use these proteins as markers in biochemical isolations.

Combining MS with imaging is a promising way to assess lipid distribution in two-dimensional space. Secondary ion mass spectrometry (SIMS) can visualize the organization of isotope-labeled lipids in very high lateral resolution (∼50 nm Klitzing et al., 2013). Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) imaging also allows visualization of the spatial distribution of different biomolecules, especially large ones. It has been mostly used to characterize phospholipids in tissues at 10- to 50-μm lateral resolution (reviewed in Berry et al., 2011). Combining the detailed chemical information of MS measurements with spatial resolution will become even more important as our understanding of the localization of different lipids and their interactions with different partners during biological processes improves.

Lipid visualization

With most biological molecules, function depends on localization, and this is truer for lipids because they cannot diffuse freely across the cytoplasm. Lipids can be visualized by fluorescently tagging either lipid-binding proteins or lipids directly. Although both approaches have furthered our understanding, neither is ideal because both can perturb local interactions and packing within ensembles. Lipids can be chemically linked to a fluorophore, and fluorescent lipid derivatives are commercially available. For solubility and ease of introduction into cells, fluorescent lipids often have short hydrophobic side chains. Because it is becoming clear that cells carefully and specifically regulate their lipid side chains, suggesting that they have important functions, fluorescent lipids with short side chains have limited applications. Fluorescent fusion proteins are extensively used to investigate the localization of lipids in live and fixed cells. For example, the tagged PH domain of PLCδ1 coupled to a fluorescent protein is used to study PIP2 lipids (Stauffer et al., 1998), important regulators of the actin cytoskeleton (Varnai et al., 1999 Schultz et al., 2010).

Wat is het volgende? Functional fluorescent tags visualized by superresolution microscopy

As we better understand lipid function, it will be possible to design markers with minimal functional disruption—for example, by identifying new lipid binding domains. Caged lipids (discussed later under Lipid perturbation/functional studies) are also promising, as is click chemistry to synthesize tagged lipids in situ. A bio-orthogonal chemical functionality (meaning that it does not occur in nature—e.g., alkyne or azide) can be introduced into a lipid of interest, which is then reacted or “clicked” with a corresponding probe such as a fluorophore or an affinity tag, ideally after it is in the right cellular context and bound to its interaction partners (Prescher and Bertozzi, 2005). Model lipids with “clicked” tags have been synthesized and visualized in cells (Neef and Schultz, 2009 Haberkant et al., 2013). Once the specific introduction of bio-orthogonally derivatized lipids into cells, preferably at physiological levels, has been optimized, this approach will be applicable to many different lipids because it is less disruptive of lipid packing (and therefore potentially function) due to the small size and minimal local perturbation of the “clickable” azide or alkyne groups (Grammel and Hang, 2013).

As lipid tagging improves, better imaging techniques are also needed. A major limitation of visualizing cellular lipids has been that they often localize to vesicles or small structures below the detection limit of conventional fluorescence microscopy. Recent advances in superresolution microscopy (e.g., stochastic optical reconstruction microscopy [STORM] and photoactivated localization microscopy [PALM]) are promising and can decrease the resolution limit to ∼20 nm (Sengupta et al., 2012 Owen and Gaus, 2013). Because few lipid markers exist and not all dyes are suitable for this technique, there are not yet many examples of direct lipid visualization. The development of new lipid tags suitable for PALM/STORM will be key. Other superresolution approaches are also options (Eggeling et al., 2009).

Lipid biophysical properties

The physical properties of lipids are essential because they dictate how lipids interact with other lipid and protein partners. In most protein–protein interactions relatively small parts of each protein participate in the interaction. Lipids are much smaller than proteins, and therefore a larger percentage of their total surface engages with binding partners. This makes small changes in the structure and therefore biophysical properties of individual lipids and their ensemble proportionally more relevant. Much excellent work has been done in model membranes, and this work is being translated into more complex biological systems.

The lateral organization of lipids in a membrane can give some clues about their functions and can be measured by atomic force microscopy (AFM) at nanoscale resolution. Much has been learned by AFM in model membranes (Garcia-Manyes and Sanz, 2010), and we used this technique to show that, surprisingly, lipids isolated from dividing cells form different and more rigid domains than lipids isolated from nondividing cells, even though the total change in cellular lipids was quite small (Atilla-Gokcumen et al., 2014). AFM is beginning to be used to investigate mechanical properties directly in cells—for example, at the plasma membrane. Our study showed that the force needed to break the plasma membrane in dividing versus nondividing cells was higher, consistent with the observations we made with isolated lipids (Atilla-Gokcumen et al., 2014).

Wat is het volgende? Combining current techniques to address increased complexity in cells

We are only just beginning to correlate the biophysical properties of cellular lipids with function in complex systems (i.e., live cells), and it has only recently become possible to use approaches such as AFM to measure these. Other physical and analytical techniques, such as Raman spectroscopy, for example, have the potential to add valuable complementary information. Coupling some of the different techniques we discuss will help us to understand the roles of lipids and link them with protein function in specific cellular compartments. We expect that this will become possible soon: AFM and SIMS have already successfully been used together, as has been superresolution microscopy with AFM (Anderton et al., 2011 Hodges et al., 2013).

To investigate how the physical properties of lipids affect membrane organization, different dyes to sense the membrane environment are being developed. For example, Laurdan and molecular rotor dyes can be used to assess quantitatively the lipid organization state in membranes (Owen et al., 2012 Lopez-Duarte et al., 2014). Both dye families report on the plasma membrane and internal membrane compartments. It will be very informative to develop environmentally sensitive dyes compatible with superresolution microscopy.

Lipid perturbation/functional studies

To understand the function of lipids, we need to be able to manipulate their cellular and ideally subcellular levels. Unlike biomolecules for which synthesis is streamlined, for example, by the ribosome, lipids are synthesized by many different enzymes, making systematic lipid deletions analogous to RNA interference (RNAi) impossible. This leaves us with three options to modify the amounts of a lipid of interest: chemical sequestration (deplete), perturbation of biosynthetic enzymes (increase or deplete), and lipid addback (increase). For example, methyl-β-cyclodextrin is commonly used to remove cholesterol from membranes, but this approach is not general, and the lipid specificities are poorly understood. Altering the lipid composition by inhibiting lipid biosynthetic enzymes via small molecules or RNAi is more promising if some caveats are kept in mind. Lipid biosynthesis is tightly regulated, with many possible synthetic routes and interconnected feedback loops, which will likely result in different lipid profiles if short small-molecule or longer RNAi experiments are used (Eggert et al., 2006 Atilla-Gokcumen et al., 2011 Castoreno and Eggert, 2011). It is not straightforward to predict the lipid composition of cells in cases in which biosynthesis has been inhibited. For example, when we analyzed cells where we had perturbed biosynthesis, we found that their lipids were not as expected by traditional biochemistry (i.e., depletion of substrate and accumulation of product Atilla-Gokcumen et al., 2011, 2014). However, substrate/product specificities are a secondary consideration when enzymes are used for lipid perturbation because phenotypes can be directly correlated with lipid composition as determined by MS. At present, perturbing biosynthetic enzymes or lipid-transport/binding proteins is the most systematic and comprehensive way of changing lipid levels, but it is imprecise because we do not know the specificities or regulation, including localization, of most of these proteins. As our understanding grows, we should be able to perturb lipid levels and therefore functions more accurately.

Wat is het volgende? Targeted delivery of caged lipids

The major next challenges in manipulating lipid levels are the need to do this with spatial, temporal, and quantitative control in different membrane structures. A direct strategy is to simply add lipids to cells, which is not as straightforward as it may seem because many lipids are not commercially available or have limited solubility or it cannot be predicted if/where a lipid will be transported into cells. Photoactivation of chemically cloaked (or caged) lipids involves the (not trivial) synthesis of a lipid derivative with a chemical tag that can be removed upon irradiation. This approach not only allows the generation of endogenous lipids at specific times and locations in cells, but it also serves as a delivery tool because the cellular permeability of the lipid is enhanced. Further optimization may also allow control over how much lipid is delivered to a desired location. Caged lipids are promising and have been successfully used to study several lipid-mediated signaling pathways (Subramanian et al., 2010 Mentel et al., 2011).


Science and Biology: The Function of a Cell Membrane

The function of a cell membrane, also referred to as the plasma membrane, is to protect the structures within the cell, give shape to the cell and support its structure.

Structures of Cell Membranes

The cell membrane is composed of a double layer of lipids and proteins. There are three different types of proteins found within a cell membrane: structural protein, transport protein and glycoprotein. These layers of lipids and proteins allow the cell membrane to perform its main function, which is to surround the cell and protect it from the outside environment. A cell membrane is selectively permeable, only allowing certain substances to enter and exit the cell. In some cases, a cell membrane can also control the amount of a certain substance allowed to pass through it.

Function of a Cell Membrane

The cell or plasma membrane is meant to protect the cell from its outside environment, while also giving the cell structure and regulating the materials that enter and leave the cell. This regulation ensures that harmful substances don't enter the cell and that essential substances don't leave the cell. Oxygen can easily pass through the cell membrane, because it is necessary for cellular respiration, which is a primary function of a cell. The byproducts of these functions, such as carbon dioxide, are allowed to exit the cell after cellular respiration takes place. Unlike oxygen, water and carbon dioxide, highly charged ions and larger macromolecules can't pass directly through the cell membrane. Instead, they are allowed to enter the cell via proteins embedded in the membrane. Because the cell membrane is essential in protecting the cell and its structure, a hole or rupture in a cell membrane can cause the cell to stop functioning properly and eventually die.

Another essential function of a cell membrane is communication or cell signaling. The cell membrane's receptor proteins bind to molecules from other areas of the body and communicate with them to send a signal inside the cell, telling the cell to perform a certain function. A cell membrane's receptors can be taken over by harmful viruses, such as the human immunodeficiency virus (HIV), causing an infection.

The overall function of a cell membrane can be compared to the function of a castle's drawbridge and outer wall. Just as a drawbridge and wall protect a castle and ensure only certain individuals enter and exit the castle, the cell's membrane offers protection to the cell and regulates which substances are allowed to enter and exit the cell. Cell signaling is similar to using a lookout tower on a castle wall to communicate with neighboring castles.

Cellular Transport

Cellular transport, one of the main functions of a cell membrane, can occur in multiple ways. The first type of cellular transport is passive osmosis and diffusion. This is when substances, such as water and oxygen, pass easily into the cell directly through the cell membrane. The next type of cellular transport is called transmembrane protein transport, which is when small organic molecules are transported into the cell. Endocytosis is the third type of cellular transport. This kind of transport is similar to the cell "eating" other substances and is characterized by the cell engulfing and then absorbing large molecules or even entire other cells. The last type of cellular transport, exocytosis, occurs when a cell removes or secretes substances.


Movement across Cell Membranes [terug naar boven]

Cell membranes are a barrier to most substances, and this property allows materials to be concentrated inside cells, excluded from cells, or simply separated from the outside environment. Dit is compartmentalisation is essential for life, as it enables reactions to take place that would otherwise be impossible. Eukaryotic cells can also compartmentalise materials inside organelles. Obviously materials need to be able to enter and leave cells, and there are five main methods by which substances can move across a cell membrane:

1. Lipid Diffusion (or Simple Diffusion) [terug naar boven]

A few substances can diffuse directly through the lipid bilayer part of the membrane. The only substances that can do this are lipid-soluble molecules such as steroids, or very small molecules, such as H2O, O2 and CO2. For these molecules the membrane is no barrier at all. Since lipid diffusion is (obviously) a passive diffusion process, no energy is involved and substances can only move down their concentration gradient. Lipid diffusion cannot be controlled by the cell, in the sense of being switched on or off.

2. Osmosis [terug naar boven]

Osmosis is the diffusion of water across a membrane. It is in fact just normal lipid diffusion, but since water is so important and so abundant in cells (its concentration is about 50 M), the diffusion of water has its own name - osmosis. The contents of cells are essentially solutions of numerous different solutes, and the more concentrated the solution, the more solute molecules there are in a given volume, so the fewer water molecules there are. Water molecules can diffuse freely across a membrane, but always down their concentration gradient, so water therefore diffuses from a dilute to a concentrated solution.

Water Potential. Osmosis can be quantified using water potential, so we can calculate which way water will move, and how fast. Water potential ( Y , the Greek letter psi, pronounced "sy") is simply the effective concentration of water. It is measured in units of pressure (Pa, or usually kPa), and the rule is that water always "falls" from a high to a low water potential (in other words it's a bit like gravity potential or electrical potential). 100% pure water has Y = 0, which is the highest possible water potential, so all solutions have Y < 0, and you cannot get Y > 0.

Osmotic Pressure (OP). This is an older term used to describe osmosis. The more concentrated a solution, the higher the osmotic pressure. It therefore means the opposite to water potential, and so water move from a low to a high OP. Always use Y rather than OP.

Cells and Osmosis . The concentration (or OP) of the solution that surrounds a cell will affect the state of the cell, due to osmosis. There are three possible concentrations of solution to consider:

The effects of these solutions on cells are shown in this diagram:

These are problems that living cells face all the time. Bijvoorbeeld:

3. Passive Transport (or Facilitated Diffusion). [terug naar boven]

Passive transport is the transport of substances across a membrane by a trans-membrane protein molecule. The transport proteins tend to be specific for one molecule (a bit like enzymes), so substances can only cross a membrane if it contains the appropriate protein. As the name suggests, this is a passive diffusion process, so no energy is involved and substances can only move down their concentration gradient. Er zijn twee soorten transporteiwit:

4. Active Transport (or Pumping). [terug naar boven]

Active transport is the pumping of substances across a membrane by a trans-membrane protein pump molecuul. The protein binds a molecule of the substance to be transported on one side of the membrane, changes shape, and releases it on the other side. The proteins are highly specific, so there is a different protein pump for each molecule to be transported. The protein pumps are also ATPase enzymes, since they catalyse the splitting of ATP G ADP + phosphate (Pi), and use the energy released to change shape and pump the molecule. Pumping is therefore an active process, and is the only transport mechanism that can transport substances up their concentration gradient.

The Na + K + Pump. This transport protein is present in the cell membranes of all animal cells and is the most abundant and important of all membrane pumps.

The Na + K + pump is a complex pump, simultaneously pumping three sodium ions out of the cell and two potassium ions into the cell for each molecule of ATP split. This means that, apart from moving ions around, it also generates a potential difference across the cell membrane. This is called the membraanpotentiaal, and all animal cells have it. It varies from 20 to 200 mV, but and is always negative inside the cell. In most cells the Na + K + pump runs continuously and uses 30% of all the cell's energy (70% in nerve cells).

The rate of diffusion of a substance across a membrane increases as its concentration gradient increases, but whereas lipid diffusion shows a linear relationship, facilitated diffusion has a curved relationship with a maximum rate. This is due to the rate being limited by the number of transport proteins. The rate of active transport also increases with concentration gradient, but most importantly it has a high rate even when there is no concentration difference across the membrane. Active transport stops if cellular respiration stops, since there is no energy.

5. Vesicles [terug naar boven]

The processes described so far only apply to small molecules. Large molecules (such as proteins, polysaccharides and nucleotides) and even whole cells are moved in and out of cells by using membrane vesicles.

Sometimes materials can pass straight through cells without ever making contact with the cytoplasm by being taken in by endocytosis at one end of a cell and passing out by exocytosis at the other end.


Wortmannin alters the transferrin receptor endocytic pathway in vivo and in vitro.

Treatment with the phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor wortmannin promotes approximately 30% decrease in the steady-state number of cell-surface transferrin receptors. This effect is rapid and dose dependent, with maximal down-regulation elicited with 30 min of treatment and with an IC50 approximately 25 nM wortmannin. Wortmannin-treated cells display an increased endocytic rate constant for transferrin internalization and decreased exocytic rate constants for transferrin recycling. In addition to these effects in vivo, wortmannin is a potent inhibitor (IC50 approximately 15 nM) of a cell-free assay that detects the delivery of endocytosed probes into a common compartment. Inhibition of the in vitro assay involves the inactivation of a membrane-associated factor that can be recruited onto the surface of vesicles from the cytosol. Its effects on the cell-free assay suggest that wortmannin inhibits receptor sorting and/or vesicle budding required for delivery of endocytosed material to "mixing" endosomes. This idea is consistent with morphological changes induced by wortmannin, which include the formation of enlarged transferrin-containing structures and the disruption of the perinuclear endosomal compartment. However, the differential effects of wortmannin, specifically increased transferrin receptor internalization and inhibition of receptor recycling, implicate a role for phosphatidylinositol 3-kinase activity in multiple sorting events in the transferrin receptor's membrane traffic pathway.


Bekijk de video: Organellen van de cel en hun functies HAVO en VWO (Januari- 2022).