Informatie

In welk kankerstadium laten tumoren circulerende tumorcellen vrij in het bloed?


En zou een zeer nauwkeurig gevoelig systeem voor het detecteren van circulerende tumorcellen (die 1 cel per 50 miljard detecteert) nuttig zijn als screeningsinstrument?


Tumorcellen kunnen ook metastaseren via het lymfestelsel. Ze moeten eerst loskomen (enzymen produceren die de extracellulaire matrix of eventuele aanhangende moleculen afbreken, enz.). Dan moeten ze in het bloed overleven, wat heel moeilijk is met alle mechanische stress van het rondgeduwd worden, de totaal verschillende voedingsstoffen, de verschillende niveaus van bloedgassen, de immuuncellen in het bloed en talloze filtermechanismen, om vervolgens echt metastaseren ze zich ergens moeten vestigen en groeien in hun nieuwe omgeving. Dat zijn veel dingen toch? Dus een gevoelige test zoals jij beschrijft, zou die tumorcel in het monster moeten hebben (onwaarschijnlijk, en er is maar één cel nodig om een ​​nieuwe tumor te maken), kan waarschijnlijk niet zeggen dat de cel een tumorcel is, zou niet in staat zijn om onderscheid te maken tussen tumorcellen die wel of niet in het bloed kunnen overleven of onderscheid te maken tussen tumorcellen die dan wel of niet meer in een weefsel zouden kunnen groeien. En natuurlijk mis je het hele lymfestelsel. Als je dat allemaal volgt, waarom maakt het dan uit? Zie een kanker, knip het weg als je kunt en geef chemotherapie om alle mogelijke cellen buiten wat je hebt gesneden kwijt te raken. Als uw test negatief of positief zou zijn, zou de behandeling niet veranderen.


Screeningprogramma's worden uitgesloten op basis van scherpe richtlijnen, zoals de zogenaamde Wilson'-criteria en latere criteria van de WHO. Specifieke documenten met betrekking tot kankerscreening zijn gepubliceerd. Een goede inleiding over wat een screeningsprogramma in de geneeskunde is, is te vinden op wikipedia.

Conventioneel wordt een tumor beschouwd als niet in staat tot uitzaaiing (noch door bloed, noch door lymfevaten), tenzij het niet het basale membraan binnendringt, dat is een dunne laag weefsel die epithelia scheidt van de onderliggende weefsels. Bij invasieve neoplasieën moet de chirurg het snijden totdat de resectiemarges vrij zijn van tumorcellen. Dit wordt bereikt door realtime microscopisch onderzoek door een patholoog tijdens de procedure. Als een ideale resectie niet kan worden uitgevoerd, wordt vaak medische therapie (bijvoorbeeld chemotherapie) aan de patiënt voorgesteld als neoadjuvante therapie. Een neoadjuvante therapie wordt gegeven om niet-optimale resectabele tumoren om te zetten in goed chirurgisch behandelbare tumoren.

Commerciële kits zoals deze 1 , 2 , 3 , 4 zijn op de markt verkrijgbaar voor dit soort tests. Hoewel er deze kit is om deze cellen te vinden, is deze methode niet geschikt voor screening.


Hoe de bloedstroom kanker helpt verspreiden

Metastase is de verspreiding van kanker naar andere delen van het lichaam en de belangrijkste reden waarom de ziekte zo ernstig is. Uit gloednieuw onderzoek blijkt nu dat de bloedstroom een ​​sleutelfactor is in dit proces.

Share on Pinterest Welke rol speelt bloed bij de verspreiding van kanker?

In een paper dat nu is gepubliceerd in het tijdschrift Ontwikkelingscel, beschrijven de wetenschappers - die van het National Institute of Health and Medical Research in Frankrijk zijn - hun tests op zebravissen en mensen.

De experimenten bevestigden dat de bloedstroom van invloed is op de locaties waar migrerende kankercellen in bloedvaten "stoppen".

Ze beschrijven ook hoe deze kankercellen door de bloedvatwanden naar buiten gaan en secundaire tumorplaatsen opzetten.

"Een al lang bestaand idee in het veld", legt senior studie auteur Dr. Jacky G. Goetz, hoofd van het laboratorium aan de Universiteit van Straatsburg in Frankrijk - waar de studie werd uitgevoerd - "is dat arrestatie wordt veroorzaakt wanneer tumorcellen circuleren terechtkomen in haarvaten met een zeer kleine diameter, simpelweg vanwege de beperkte afmetingen.”

Echter, zoals Dr. Goetz uitlegt, tonen hun bevindingen aan dat "fysieke beperking" niet de enige oorzaak is van metastase, omdat "de bloedstroom een ​​sterke invloed heeft op het toestaan ​​dat de tumorcellen adhesie tot stand brengen met de vaatwand."

Metastase is het proces waardoor tumorcellen vertrekken en migreren van hun primaire locaties en door het lymfesysteem of de bloedbaan reizen om secundaire of metastatische tumoren te vestigen in afgelegen delen van het lichaam.

Metastase is een belangrijke doodsoorzaak door kanker en van "primair belang in de prognose van kankerpatiënten."

Het is een complex proces en verloopt als een opeenvolging van stappen, die elk moeten worden voltooid om de secundaire tumor te laten bloeien. De reeks stappen, bekend als de "metastatische cascade", gaat als volgt:

  1. binnendringend nabijgelegen gezond weefsel
  2. het oversteken van de wanden van aangrenzende bloedvaten en lymfeklieren
  3. reizen door de bloedbaan of het lymfesysteem naar verre delen van het lichaam
  4. arresteren in afgelegen, kleine bloedvaten of haarvaten, die hun wanden binnendringen en overgaan in het omliggende gezonde weefsel
  5. het zaaien van een levensvatbare, kleine tumor in het gezonde weefsel
  6. het genereren van een speciale bloedtoevoer door nieuwe bloedvaten te laten groeien om de nieuwe tumor te voeden

De nieuwe studie betreft de vierde stap, waarbij circulerende tumorcellen stoppen in een capillair en door hun endotheel, of de barrière van cellen die de vaatwanden bekleden, naar het omringende weefsel gaan.

In hun studieverslag leggen de auteurs uit dat "er heel weinig bekend is over hoe [circulerende tumorcellen] het endotheel van kleine haarvaten arresteren en eraan hechten en de bloedbaan verlaten door de vaatwand te passeren."

Een gebied dat bijzonder onduidelijk is, voegen ze eraan toe, is de "rol die wordt gespeeld door mechanische signalen die in het bloed worden aangetroffen" tijdens deze stap.

Voor hun studie ontwikkelden de wetenschappers "een originele experimentele benadering" waarin ze circulerende tumorcellen labelden en volgden terwijl ze door bloedvaten in zebravisembryo's reisden. Met het model konden ze ook variëren en de bloedstroom in de bloedvaten meten.

De resultaten toonden aan dat de locaties in de bloedvaten waar de circulerende tumorcellen stoppen met reizen, nauw verband houden met stroomsnelheden.

De auteurs merken op dat de "drempelsnelheidswaarde voor efficiënte hechting […] varieert van 400 tot 600 [micrometer per seconde]."

Het team ontdekte ook dat de bloedstroom essentieel is voor "extravasatie", het proces waardoor de tumorcellen de bloedvaten verlaten.

Dit was duidelijk in timelapse-beeldvorming die endotheelcellen liet zien die rond de gearresteerde tumorcellen in de bloedvaten van de zebravisembryo's "krulden".

“ Bloedstroom bij deze stap is essentieel. Zonder flow vindt endotheliale remodellering niet plaats. Je hebt een bepaalde hoeveelheid stroming nodig om het endotheel actief te houden, zodat het zich rond de tumorcel kan hermodelleren.”

Dr. Jacky G. Goetz

De onderzoekers kwamen tot dezelfde resultaten toen ze het verloop van hersenmetastasen bij muizen observeerden.

Voor dit experiment gebruikten ze een beeldvormingstechniek genaamd intravitale correlatieve microscopie, die levende celmodellen combineert met elektronenmicroscopie, zodat de dynamiek kan worden waargenomen in een levend dier.

Ten slotte bevestigde het team de bevindingen door secundaire tumoren te observeren in de hersenen van 100 menselijke patiënten, van wie de primaire tumoren zich in verschillende delen van het lichaam bevonden.

Net als bij het zebravismodel gebruikten ze een beeldvormende techniek om de locaties van de secundaire tumoren in kaart te brengen.

Toen ze de kaart met hersenmetastasen samenvoegden met een bloedstroomkaart van een gezonde controlepatiënt, ontdekten de onderzoekers dat deze overeenkwam met wat ze in het zebravismodel vonden, wat bevestigt dat secundaire tumoren het liefst groeien in gebieden waar de bloedstroom binnen een bepaald bereik ligt. .

De auteurs concluderen dat hun bevindingen onthullen dat de bloedstroom niet alleen de locatie regelt, maar ook het begin van "metastatische uitgroei".

Ze willen nu manieren onderzoeken om de hermodellering van endotheel rond de circulerende tumorcel te blokkeren als een manier om de uitgang naar het omliggende weefsel te verstoren. Een dergelijke prestatie zou kunnen voorkomen dat metastase de stappen voltooit die nodig zijn voor de succesvolle groei van een secundaire tumor.


Circulerende tumorcellen

David G. Hicks MD, Susan C. Lester MD, PhD, in diagnostische pathologie: borst (tweede editie), 2016

Prognostische waarde

Nieuw gediagnosticeerde borstkankerpatiënten kunnen CTC's in perifeer bloed aantonen

Detectie van CTC's geassocieerd met slechtere prognose, onafhankelijke voorspeller van progressievrije en algehele overleving -

Prognostische associatie van CTC is onafhankelijk van de nodale status en of de patiënt adjuvante chemotherapie krijgt

Studies hebben > 5 CTC's per 7,5 ml bloed gedefinieerd als grenswaarde voor CTC(+) geassocieerd met een ongunstige prognose

Patiënten met gemetastaseerde borstkanker met CTC's hebben een slechtere prognose dan patiënten zonder verhoogde CTC's ○

In 1 onderzoek vertoonden patiënten die negatief waren voor CTC's een mediane totale overleving van 28,3 maanden –

Patiënten met verhoogde CTC's hadden een mediane totale overleving van slechts 12,8 maanden

CTC-telling correleert met ziekteprogressie tot 7-9 weken voorafgaand aan beeldvorming van bewijs van progressie

Veranderingen in CTC tijdens therapie kunnen dienen als vroege parameter om de respons te evalueren

Prognostische waarde van CTC's kan afhangen van het subtype borstkanker

Detectiemethoden voor circulerende tumorcellen

FunctiesImmunologische detectieRT-PCR-detectie
DetectiemethodologieImmunohistochemie of immunofluorescentiePCR voor RNA-transcripten
DetectiedoelenEpitheliale antigenen, cytokeratine (kan cocktails gebruiken), HER2Cytokeratine, MUC1, mammaglobine, CEA, HER2-transcripten
GevoeligheidMinder gevoeligGevoeliger
Specificiteit:Meer specifiek (mogelijkheid om vastgelegde cellen te bekijken)Minder specifiek (geen mogelijkheid om gevangen cellen te visualiseren)
Detectielimieten∼ 1 tumorcel per 106 niet-tumorcellen∼ 1 tumorcel per 107 niet-tumorcellen
KostenDuurder (vereist beeldanalyseapparatuur)Minder duur
Kwantitatieve resultatenJa: Opbrengstresultaten in termen van aantal tumorcellenJa: opbrengstresultaten in termen van gemeten aantal gentranscripten, kunnen sterk variëren tussen cellen en tussen tumoren

CTC-isolatietechnologieën

CTC's staan ​​bekend als een belangrijke marker voor aanvullende diagnose, prognose-evaluatie, behandelingsbeslissing, enz. Om de klinische toepassing van CTC's verder uit te breiden, is het noodzakelijk om specifieke en effectieve technieken te ontwikkelen om zeldzame CTC's uit perifeer bloed te vangen. Hier classificeren we over het algemeen alle CTC-isolatietechnieken in biologische en fysieke methoden volgens hun verrijkingsprincipes (Fig. 1).

Een mindmap die CTC-isolatietechnologieën samenvat. GEDI: geometrisch verbeterde differentiële immunocapture GO: grafeenoxide VerIFAST: verticaal niet mengbare filtratie ondersteund door oppervlaktespanning ISET: isolatie op grootte van epitheliale tumorcellen FMSA: flexibele microveerarray DFF: Dean Flow Fractionation p-MOFF: parallelle stroomfractionering met meerdere openingen MOFF-DEP: stroomfractionering met meerdere openingen en diëlektroforese

Biologische isolatiemethoden

Biologische isolatiemethoden worden gekenmerkt door het gebruik van specifieke oppervlaktemerkers, zoals EpCAM. CellSearch is de gouden standaard voor CTC's, het vastleggen van cellen met specifieke EpCAM. Het MagSweeper-systeem introduceert EpCAM-gemodificeerde immunomagnetische kralen, die geschikt zijn voor het isoleren van circulerende endotheliale voorlopercellen (CEpC's) met lage tot gemiddelde EpCAM-expressie. De drie generaties van de CTC-chip zijn ontwikkeld om een ​​steeds hogere isolatie-efficiëntie op CTC's te laten zien, waardoor CTC-samples van hogere kwaliteit zijn. De NanoVelcro-chip wordt gekenmerkt door het gebruik van een specifiek antilichaam-gemodificeerd nanomateriaalsubstraat. Een nadeel van bovenstaande werkwijzen is dat ze CTC's met niet-specifieke oppervlakte-antigeenexpressie niet effectief kunnen isoleren. Om dit defect te verhelpen, onderzoeken wetenschappers nieuwe methoden, waarbij zelfs biologische en fysieke isolatie worden gecombineerd, en er zijn prestaties geleverd zoals CTC-iChip (aanvullend bestand 1: tabel S1).

Fysieke isolatiemethoden

Fysische isolatiemethoden zijn gebaseerd op CTC-fysische eigenschappen zoals grootte (microfilter), membraanlading (diëlektroforese) en dichtheid (dichtheidsgradiëntcentrifugatie), enz. De combinatie van fysieke eigenschappen met enkele specifieke platforms, zoals microfluïdica, vertoont ook een groot potentieel bij het vastleggen van CTC's. De meeste van deze methoden vereisen geen specifieke oppervlaktemarkeringen op CTC's. Deze technieken zijn over het algemeen eenvoudig in principe, maar moeten afhankelijk zijn van geavanceerde materialen of ondersteunende technische technologieën voor een betere klinische toepassing (Aanvullend bestand 1: Tabel S1).


Resultaten:

Tussen 10 maart 2014 en 10 april 2018 ondergingen 586 patiënten een geschiktheidsbeoordeling (Figuur 1). Van de 217 deelnemers trokken 7 patiënten hun toestemming in na randomisatie. We hebben uiteindelijk 210 patiënten geïncludeerd voor de intention-to-treat-analyse (107 in de sevofluraangroep 103 in de propofolgroep).


Figuur 1. Stroomschema

De basislijnkenmerken worden weergegeven in Tabel 1. De basislijntellingen en positiviteit van circulerende tumorcellen (met behulp van afkapwaarden van minimaal 1 en minimaal 5 circulerende tumorcellen/7,5 ml bloed) waren vergelijkbaar in de twee groepen. De intraoperatieve en postoperatieve kenmerken van elke groep worden weergegeven in tabel 2.

Zie figuur 2 en tabel 3 voor het aantal circulerende tumorcellen in de loop van de tijd. Het type anesthesie heeft geen invloed op het aantal circulerende tumorcellen (mediaan aantal circulerende tumorcellen/7,5 ml bloed [interkwartielbereik]: propofol anesthesiegroep: 0 uur 1[0-4], 48 uur 1[0-2] , 72 uur 0[0-1] Sevofluraan anesthesiegroep: 0 uur 1[0-4], 48 uur 0[0-2], 72 uur 1[0-2] rate ratio, 1,27[95% BI, 0,95-1,71] P=0.103). De toediening van anesthesie met sevofluraan resulteerde echter in een significante toename van het maximale aantal circulerende tumorcellen na de operatie (sevofluraan vs propofol: rate ratio, 1,36 [95% BI, 1,18-1,56] P<0,0001 dat wil zeggen, met propofol Vergeleken met de gebruik van sevofluraan, het maximale aantal circulerende tumorcellen steeg met 1,36 keer).

In het verkennende model is het effect van inhalatie-anesthesie op de maximale waarde van circulerende tumorcellen na operatie nog steeds significant (sevofluraan vs propofol: ratio, 1,26 [95% BI, 1,09-1,47] P=0,002 pas tumortype, grootte en dosering aan van opioïden).


Tabel 1. Kenmerken basislijn


Tabel 2. Intraoperatieve en postoperatieve kenmerken


Figuur 2. Circulerend aantal tumorcellen in de loop van de tijd


Tabel 3. Circulerende tumorceltellingen tijdens de perioperatieve periode

Zestig patiënten (30 in de sevofluraangroep en 30 in de propofolgroep) werden willekeurig geselecteerd voor in vitro verkennende analyse. De twee groepen natuurlijke killercellen induceerden vergelijkbare apoptosepercentages (het gemiddelde apoptosepercentage in de sevofluraangroep was 34,7% 35,7% in de propofolgroep). Er is geen bewijs van lineaire regressie dat er een verband bestaat tussen de apoptosesnelheid en het maximale aantal circulerende tumorcellen (regressiecoëfficiënt, -0,077 95% BI, -0,33-0,17 Figuur 3).


Figuur 3. Scatterplot van natural killer-celactiviteit en maximaal aantal circulerende tumorcellen na behandeling


3. CTC als dynamische prognostische factor bij gemetastaseerde BC

3.1. Klinische validiteit bij gemetastaseerde BC

In 2004 rapporteerde een eerste studie een significante klinische validiteit van het aantal CTC's in gemetastaseerde BC met het CellSearch-systeem (Cristofanilli etਊl., 2004). Bij honderdzevenenzeventig patiënten die een nieuwe behandelingslijn startten, werd hun CTC-telling bij aanvang en na enkele weken behandeling beoordeeld. Een drempel om patiënten met korte versus lange progressievrije overleving te onderscheiden werd onderzocht, vastgesteld bij 𢙕 CTC/7.5 ml bloed op basis van een trainingscohort en bevestigd in een validatiecohort. Deze prognostische waarde werd ook waargenomen tijdens de behandeling (Hayes etਊl., 2006). Door gedichotomiseerde CTC-telling (hoog of laag) op twee tijdstippen (baseline en na 1 behandelingscyclus) te combineren, werden 4 verschillende progressievrije overlevingsprofielen verkregen. De slechtere prognose werd gezien bij patiënten met een hoog aantal CTC's op beide tijdstippen, zoals verwacht. Interessant is dat patiënten met een hoog CTC-aantal bij baseline maar een laag CTC-aantal na één therapiecyclus een veel betere prognose hadden, bijna gelijk aan die van patiënten met een laag CTC-aantal bij baseline. Samen met analytische validiteitsgegevens tellen deze klinische gegevens van CTC als dynamische prognostische biomarker voor de FDA om de CellSearch-techniek te zuiveren als een hulpmiddel bij het monitoren van patiënten met uitgezaaide borstkanker. De aanvankelijke bewering was dat monitoring van het CTC-aantal tijdens de therapie een vroege detectie van resistentie tegen therapie mogelijk zou maken en uiteindelijk de behandeling van uitgezaaide BC-patiënten zou verbeteren.

Vervolgens werden verschillende rapporten gepubliceerd, de meeste van beperkte omvang (niveau van bewijs II–III) en met enkele tegenstrijdige resultaten. Het IC 2006�-onderzoek was het eerste observationele onderzoek dat specifiek was opgezet en uitgevoerd (267 patiënten) met het CTC-aantal als primair eindpunt (studieniveau van bewijs 1) en bevestigde de meeste van de eerste bevindingen (Pierga etਊl., 2012a). Tien jaar na de baanbrekende studie leverde een gepoolde analyse van 1944 individuele patiëntgegevens uiteindelijk onbetwistbare resultaten op voor CTC in gemetastaseerde BC en toonde voor het eerst de superioriteit van het CTC-aantal aan ten opzichte van serumtumormarkers (CEA, CA15.3). Ten eerste kan CTC worden gedetecteerd bij ongeveer 70% van de stadium IV BC-patiënten en het aantal CTC's is geassocieerd met de prestatiestatus, het aantal metastatische locaties, verhoogde LDH, verhoogde serumtumormarkers, maar niet met het tumorsubtype. Bovendien is het aantal CTC's een dynamische prognostische marker van progressievrije overleving en algehele overleving. Hazard ratio van overleving tussen hoge en lage CTC-tellingen neemt toe samen met de drempel die wordt gebruikt om een ​​hoge CTC-telling te definiëren. Ten slotte, in tegenstelling tot serumtumormarkers, verhoogt het toevoegen van CTC-telling en de verandering ervan tijdens therapie aan een geoptimaliseerd klinisch pathologisch model de prognostische waarde van het model aanzienlijk (Bidard etਊl., 2014).

3.2. Klinisch nut bij gemetastaseerde BC

De eerste proef die werd gestart om de klinische bruikbaarheid van vroege CTC-veranderingen na één chemotherapiecyclus aan te tonen, werd in de VS uitgevoerd door de SouthWest Oncology Group. In het SWOG S0500-onderzoek werden gemetastaseerde BC-patiënten bij wie het CTC-aantal boven de 5 CTC/7,5 ml bloed bleef na de eerste cyclus van de eerste lijn chemotherapie, uiteindelijk gerandomiseerd naar een vroege overstap naar de tweede lijn chemotherapie. Er werd verondersteld dat een dergelijke omschakeling de algehele overleving van de patiënt aanzienlijk zou verbeteren in vergelijking met de standaard op beeldvorming gebaseerde behandeling (gerichte risicoverhouding: 0,6). De onderzoeksresultaten werden in 2014 gepubliceerd en er werd geen overlevingsverschil gezien tussen de twee armen (Smerage etਊl., 2014). Om deze negatieve resultaten te verklaren, is door de onderzoekers van het onderzoek besproken dat het onwaarschijnlijk is dat tweedelijns chemotherapie een significant effect zal hebben (zelfs wanneer eerder geïntroduceerd op basis van een verhoogd CTC-aantal) op BC's die een primaire resistentie hebben tegen eerstelijns chemotherapie. Er zijn andere opmerkingen gemaakt over het ontwerp en de concepten van de proef (Alunni�roni etਊl., 2014 Bidard en Pierga, 2015). Op basis van deze negatieve resultaten achtten de klinische praktijkrichtlijnen van de American Society of Clinical Oncology 2015 voor het aantal CTC's het redelijk voor clinici om het aantal CTC's niet te gebruiken bij vrouwen met uitgezaaide BC (Van Poznak etਊl., 2015). Hoewel deze negatieve studie een grote impact had op het gebruik van CTC-telling door Amerikaanse clinici, lopen er momenteel twee andere klinische bruikbaarheidsonderzoeken op basis van CTC-telling in Frankrijk:

Het 𠇌irCe01”-onderzoek ( <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT01349842","term_id":"NCT01349842">> NCT01349842) is ook gebaseerd op de vroege veranderingen van de CTC-telling, maar patiënten worden ingeschreven vóór het begin van de derde lijn van chemotherapie en worden gevolgd met de CTC-test gedurende de opeenvolgende lijnen van chemotherapie.

Het “STIC CTC”-onderzoek ( <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT01710605","term_id":"NCT01710605">> NCT01710605) onderzoekt de klinische bruikbaarheid van de prognostische waarde van baseline CTC-telling. In dit onderzoek wordt de keuze van de eerste behandelingslijn (hormoontherapie of chemotherapie) voor het terugvallen van hormoon-positieve BC bepaald door de clinicus of door de baseline CTC-telling.

De onderzoeksopzet is elders gerapporteerd (Bidard etਊl., 2013b) en de resultaten worden binnen de komende 2 jaar verwacht.


Materialen en methodes

PATINTWERVING EN MATERIAALINZAMELING

Een totaal van 115 mannen met verhoogde serum-PSA-concentraties (>4 ng/mL) of abnormale bevindingen bij digitaal rectaal onderzoek verdacht voor PCa werden voor dit onderzoek gerekruteerd nadat schriftelijke geïnformeerde toestemming was verkregen. De studie werd goedgekeurd door de lokale ethische beoordelingsraad onder nummer PV3779. TRUS-geleide diagnostische kernbiopten werden uitgevoerd tussen augustus 2012 en januari 2016. Histologische diagnose van 8 tot 12 weefselkernen werd uitgevoerd volgens de Gleason-score door een ervaren patholoog. Twee CellSave-conserveringsbuizen werden elk gevuld met 7,5 ml perifeer bloed, 1 vóór en 1 binnen 30 minuten na het uitvoeren van een prostaatbiopsie. De buizen bevatten Na2EDTA voor preventie van stolling en een celconserveermiddel om de morfologie en celoppervlakantigeenexpressie van epitheelcellen voor fenotypering te behouden. De monsters werden direct verwerkt om CTC's te detecteren met behulp van het CellSearch-systeem. Onderzoekers die de monsters analyseerden, waren geblindeerd voor alle patiëntgerelateerde gegevens, inclusief het tijdstip van bloedafname. Kenmerken van het patiëntencohort worden weergegeven in Tabel 1. Patiënten met histologische diagnose van PCa werden behandeld met radicale prostatectomie, bestralingstherapie of actief toezicht.

Kenmerken van het totale cohort deelnemers. een

. PCa− (n = 40) . PCa+ (n = 75) . Totaal (n = 115) . P waarde .
Leeftijd bij diagnose, jaren (gemiddelde) 40–82 (61.4) 46–79 (66.1) 40–82 (64.5) 0.0086
Totaal PSA, ng/ml (mediaan) 1.9–13.4 (7.1) 2.5–304.6 (7.7) 1.9–304.6 (7.7) 0.0586
Gratis PSA, ng/ml (mediaan) 0.2–2.8 (1.1) 0.2–3.2 (0.9) 0.2–3.2 (0.9) 0.2438
Vrije PSA/totale PSA-ratio, % (mediaan) 7.8–25.9 (14.9) 2.2–35.6 (10.8) 2.2–35.6 (12.9) <0.001
Gleason-score
3 + 3 n = 24
3 + 4 n = 26
4 + 3 n = 5
≥4 + 4 n = 20
T-fase:
T1 n = 10
T2 n = 34
T3 n = 20
Behandeling
Prostatectomie n = 46
Prostatectomie + andere n = 7
Radiotherapie n = 13
Andere/geen n = 9
. PCa− (n = 40) . PCa+ (n = 75) . Totaal (n = 115) . P waarde .
Leeftijd bij diagnose, jaren (gemiddelde) 40–82 (61.4) 46–79 (66.1) 40–82 (64.5) 0.0086
Totaal PSA, ng/ml (mediaan) 1.9–13.4 (7.1) 2.5–304.6 (7.7) 1.9–304.6 (7.7) 0.0586
Gratis PSA, ng/ml (mediaan) 0.2–2.8 (1.1) 0.2–3.2 (0.9) 0.2–3.2 (0.9) 0.2438
Vrije PSA/totale PSA-ratio, % (mediaan) 7.8–25.9 (14.9) 2.2–35.6 (10.8) 2.2–35.6 (12.9) <0.001
Gleason-score
3 + 3 n = 24
3 + 4 n = 26
4 + 3 n = 5
≥4 + 4 n = 20
T-fase:
T1 n = 10
T2 n = 34
T3 n = 20
Behandeling
Prostatectomie n = 46
Prostatectomie + andere n = 7
Radiotherapie n = 13
Andere/geen n = 9

Significante test voor gemiddelde: Welch 2-monster t-test significante test voor mediaan: Wilcoxon rank-sum test met continuïteitscorrectie.

Kenmerken van het totale cohort deelnemers. een

. PCa− (n = 40) . PCa+ (n = 75) . Totaal (n = 115) . P waarde .
Leeftijd bij diagnose, jaren (gemiddelde) 40–82 (61.4) 46–79 (66.1) 40–82 (64.5) 0.0086
Totaal PSA, ng/ml (mediaan) 1.9–13.4 (7.1) 2.5–304.6 (7.7) 1.9–304.6 (7.7) 0.0586
Gratis PSA, ng/ml (mediaan) 0.2–2.8 (1.1) 0.2–3.2 (0.9) 0.2–3.2 (0.9) 0.2438
Vrije PSA/totale PSA-ratio, % (mediaan) 7.8–25.9 (14.9) 2.2–35.6 (10.8) 2.2–35.6 (12.9) <0.001
Gleason-score
3 + 3 n = 24
3 + 4 n = 26
4 + 3 n = 5
≥4 + 4 n = 20
T-fase:
T1 n = 10
T2 n = 34
T3 n = 20
Behandeling
Prostatectomie n = 46
Prostatectomie + andere n = 7
Radiotherapie n = 13
Andere/geen n = 9
. PCa− (n = 40) . PCa+ (n = 75) . Totaal (n = 115) . P waarde .
Leeftijd bij diagnose, jaren (gemiddelde) 40–82 (61.4) 46–79 (66.1) 40–82 (64.5) 0.0086
Totaal PSA, ng/ml (mediaan) 1.9–13.4 (7.1) 2.5–304.6 (7.7) 1.9–304.6 (7.7) 0.0586
Gratis PSA, ng/ml (mediaan) 0.2–2.8 (1.1) 0.2–3.2 (0.9) 0.2–3.2 (0.9) 0.2438
Vrije PSA/totale PSA-ratio, % (mediaan) 7.8–25.9 (14.9) 2.2–35.6 (10.8) 2.2–35.6 (12.9) <0.001
Gleason-score
3 + 3 n = 24
3 + 4 n = 26
4 + 3 n = 5
≥4 + 4 n = 20
T-fase:
T1 n = 10
T2 n = 34
T3 n = 20
Behandeling
Prostatectomie n = 46
Prostatectomie + andere n = 7
Radiotherapie n = 13
Andere/geen n = 9

Significante test voor gemiddelde: Welch 2-monster t-test significante test voor mediaan: Wilcoxon rank-sum test met continuïteitscorrectie.

CTC-ANALYSE

Bloedanalyse met het CellSearch-systeem werd binnen 96 uur uitgevoerd zoals eerder beschreven (18) met behulp van de CTC-kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Kort gezegd, epitheelcellen onder de cellen gevangen door anti-epitheliale celadhesiemolecuul (EpCAM)-antilichamen werden gedetecteerd door binding van antilichamen C11 en A.53B/A2, gericht tegen keratines 8, 18 en 19, en mogelijk ook door keratines 4 te herkennen tot 6, 10 en 13 (19, 20). Een anti-CD45-antilichaam werd gebruikt om leukocyten te definiëren en uit te sluiten. Kernen werden tegengekleurd met 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Na verrijking en immunocytochemische kleuring werden immunomagnetisch gelabelde cellen in een sterk magnetisch veld gehouden en gescand met behulp van de CellSpotter Analyzer (Menarini-Silicon Biosystems). Ervaren onderzoekers interpreteerden de resultaten van deze analyses. Een bloedmonster van 7,5 ml werd als positief beschouwd met de identificatie van ten minste 1 keratine-positieve, DAPI-positieve, CD45-negatieve cel die geen morfologische tekenen van apoptose vertoonde. Deze grenswaarde is aangepast van onze onderzoeken naar borstkanker in een vroeg stadium, omdat tot nu toe geen andere prognostische grenswaarde is bepaald door eerdere publicaties voor PCa in een vroeg stadium.

STATISTISCHE ANALYSE

Statistische analyses zijn uitgevoerd met Matlab R2016a (The Mathworks), R versie 3.3.3 (R Foundation for Statistical Computing) en In-Silico Online versie 2.0 ( 21). Twee-sample t-tests en Wilcoxon-rank-sum-tests werden gebruikt om het statistische verschil tussen respectievelijk gemiddelden en medianen te berekenen. Om de odds ratio's (OR's) in CTC-verandering te berekenen, werden de CTC-tellingen genormaliseerd naar de hoeveelheid bloedvolume en gecorreleerd met de volgende onafhankelijke variabelen met behulp van een Poisson-gedistribueerd gegeneraliseerd lineair mixed-effect-model, gecorrigeerd voor leeftijd, met patiënten genest in de tijd punt: (een) tijdstip van bloedafname (vóór/na biopsie), (B) aanwezigheid van PCa-cellen in de biopsieën (ja/nee), en (C) interactie-effecten. Progressievrije overleving vanaf de datum van biopsie werd gemodelleerd met behulp van de Kaplan-Meier-functie, en univariabele en multivariabele hazard ratio's (HR's) werden berekend met behulp van Cox proportionele gevarenanalyse. Patiënten die een actieve behandeling ondergingen (radicale prostatectomie of bestralingstherapie zonder gelijktijdige androgeendeprivatietherapie) werden geëvalueerd met betrekking tot het effect van CTC-verhoging na therapie (verhoging van ten minste 1 CTC) op biochemisch recidief voor progressievrije overleving. Biochemisch recidief na radicale prostatectomie werd gedefinieerd als een PSA-verhoging van >gt0.2 ng/ml en een PSA-nadir + 2 na radiotherapie. Covariaten bestonden uit leeftijd, PSA, aantal positieve kernen, biopsie Gleason-score en behandeling (radicale prostatectomie versus bestralingstherapie). Voor het noemen van statistische significantie, werd het α-niveau van 0,005 dat onlangs werd voorgesteld door Benjamin et al. om de geloofwaardigheid te vergroten werd toegepast ( 22).


Karakterisering en moleculaire profilering van CTC's

We hebben verschillende CTC's-verrijkingstechnieken besproken die worden gebruikt voor het isoleren van CTC's van uitgezaaide kankerpatiënten. Geen van hen heeft echter veel kwantitatief succes geboekt. De resultaten hebben een grote variatie laten zien van 10% tot 90% van de geïsoleerde CTC's en daarom is het cruciaal om de verzamelde cellen te analyseren op hun hoeveelheid en hun exacte fenotype. Een numerieke indicatie van verzamelde CTC's kan mogelijk niet het ware beeld onthullen van het type cellen dat is geïsoleerd uit kankerpatiënten. Evenzo kunnen tumorcellen een verscheidenheid aan veranderingen ondergaan en aanwezig zijn in heterogene subpopulaties. Daarom kan slechts een aantal CTC's tot foutieve conclusies leiden. Daarom is er behoefte aan echte karakterisering van deze geïsoleerde CTC-cellen om tot logische conclusies te komen. Moleculaire profilering van deze geïsoleerde cellen zal het beeld kristalliseren, omdat het de ware aard van de geïsoleerde CTC's-cellen onthult.

Een fundamenteel proces in EMT, down-reguleert E-cadherine, wat kan worden bereikt door vele transcriptionele factoren. [39] De meeste moleculaire markers die zijn geïsoleerd voor het karakteriseren van CTC's zijn EMT-indicatoren. Tijdens het EMT-proces ondergaat een metastatische cel veel modificaties op cellulair en moleculair niveau en veel genen ondergaan transcriptionele veranderingen. [39] Sommige van deze genen spelen een rol bij het initiëren van het effect van EMT, terwijl andere een rol spelen bij het reguleren en handhaven van de doorgangstoestand. De andere factoren, zoals inflammatoire cytokines en fysieke veranderingen in de micro-omgeving van de tumor, spelen ook een rol bij de bevordering van EMT. [39] TWIST1 en TWIST2 genen zijn het sterkst tot expressie gebrachte genen in het EMT-proces die verantwoordelijk zijn voor het induceren van transformatie alleen of in samenwerking met andere factoren zoals TGFβ, Wnt, Notch, enzovoort. [40] E-cadherine is een van de belangrijkste eiwitten voor het behoud van de epitheliale aard van cellen. Snail1 en Snail2 onderdrukken zowel de transcriptie van E-cadherine als Zeb1 en Zeb2 genen. Dit resulteert in neerwaartse regulatie van E-cadherine, wat leidt tot het initiëren van het EMT-proces. [41,42] Andere genen van de poortwachter van de epitheliale toestand, zoals alfa- en gamma-catenines, zijn ook neerwaarts gereguleerd, samen met neerwaartse regulatie van E-cadherine in dit proces. [43,44]

Inductie van bepaalde mesenchymale kenmerken tijdens het EMT-proces vereist opregulatie van twee extracellulaire matrixeiwitten, dat wil zeggen vimentine en fibronectine in deze cellen die ontsnappen aan de barrières van lokaal weefsel en doorgaan voor invasie. Evenzo zijn andere genen zoals N-cadherine, CD44, intergrin β6 ook betrokken bij een goede migratie van deze cellen. [43-46] Zelfs als ze de mutatieveranderingen, abnormale grootte en kenmerken van CTC's begrijpen, denken wetenschappers nog steeds na over het feit dat deze cellen kunnen overleven in een omgeving die totaal vijandig voor hen is. Er wordt gepostuleerd dat van de honderden CTC's die door de tumor worden afgescheiden, er slechts een paar in de bloedsomloop blijven. Er zijn rapporten die suggereren dat CTC's die mutaties dragen, zoals opregulatie van CD47, hen helpen te ontsnappen aan een aanval door natuurlijke killercellen en macrofagen. Evenzo helpt downregulatie van chaperonne-eiwit-calreticulin hen opnieuw om het immuunsysteem te ontwijken. [47,48] Scholch et al. [49] hebben in hun studies deze staat als een "immuun-ontwijkend middel" genoemd naar de periode tussen EMT en MET in omloop. Over het algemeen lijkt het er dus op dat CTC's zeer geëvolueerde mechanismen hebben om hun invasieve agressieve karakter te behouden en uit te drukken door het natuurlijke immuunsysteem van het lichaam te overtreffen.


Invoering

Vaste tumoren kunnen elke dag een verrassend hoog aantal circulerende tumorcellen (CTC) in de bloedsomloop afgeven (1). Hoewel CTC's die afkomstig zijn van primaire tumoren als overgangsverschijnselen worden beschouwd bij het zoeken naar een nieuw huis, zijn de meeste van deze cellen gedoemd om in de bloedsomloop te sterven als gevolg van mechanische en omgevingstrauma zoals schuifkrachten, oxidatieve stress en aanval door het immuunsysteem. In feite is slechts een klein deel van de CTC's in staat om te overleven, verre organen te zaaien en uiteindelijk aanleiding te geven tot openlijke metastatische ziekte. De meeste CTC's hebben een korte halfwaardetijd van minder dan 2,5 uur in omloop (2) en zijn apoptotisch (3, 4). Daarom kunnen alleen de CTC's met een overlevingsvoordeel tijdens hun doorvoer in de bloedstroom en een beter potentieel voor kolonisatie in de verre locaties waarschijnlijk bijdragen aan metastase. Om betere prognostische en voorspellende markers van vroege metastatische recidief en nieuwe doelen voor de preventie en behandeling ervan te ontdekken, is het van cruciaal belang om de CTC-populatie met het hoogste metastatische potentieel te identificeren en te karakteriseren. Recente preklinische en klinische studies suggereren een verband tussen CTC-clusters en slechtere klinische resultaten (3, 5). CTC clusters are defined as groups of two or more aggregated CTCs found in the blood of patients with solid tumors (6). Despite the prognostic implications for CTC clusters, the molecular mechanisms responsible for their formation or dissemination and the pathways conferring their survival advantage and metastatic potential remain largely unknown. Here, we examine preclinical evidence on the sources of CTC clusters, potential mechanisms of CTC clusters formation (genesis), transit to distant sites (dissemination), their survival advantage, and increased metastatic potential. We also deliberate open questions (Table 1), unmet research needs, and future directions (in italics) to delineate the clinical significance of CTC clusters in the metastatic cascade. We finally discuss methods that are most common and clinically relevant or novel and promising for isolating CTC clusters and describe clinical evidence for their prognostic value.

Open questions in various areas of CTC cluster research

Sources of CTC clusters

Both primary and metastatic tumors may constitute the source of CTC clusters forming multidirectional transit routes (Fig. 1A). CTC clusters originating from a primary tumor could “self-seed” the original site or travel to distant sites of metastasis. CTC clusters arising from a (micro)metastatic site could return to the primary tumor site or the original (micro)metastatic site or could travel to another distant site of metastasis. To support this hypothesis, tumor self-seeding has been a well-accepted concept for CTCs in general (7). The self-seeding potential (7) and the oligoclonality of CTC clusters (5) were both demonstrated in the same mouse xenograft model of MDA-MB-231 LM2 cell line. Although CTC clusters were found to be a minority (2.6%) in the overall CTC population in this model, their calculated probability of metastatic formation was 50 times higher, as suggested by formation of dual-color metastasis from dual-color primary tumors (5). Although the study evaluated self-seeding concept only for the primary tumors, cross-seeding of primary and (micro)metastatic tumors can also be envisioned. This multisite exchange of CTC clusters may allow communication between each tumor site to collectively acquire capability of surviving the tremendous treatment pressures, and eventually promoting the tumor growth and progression.

Sources and potential mechanisms of CTC clusters origin. A, Multidirectional transit routes of CTC clusters. CTC clusters originating from a primary tumor could “self-seed” the original site or travel to distant sites of metastasis. CTC clusters arising from a (micro)metastatic site could return to the primary tumor site or the original (micro)metastatic site or could travel to another distant site of metastasis. This multisite exchange of CTC clusters may allow communication between each tumor site to collectively acquire capability to survive the tremendous treatment pressures, eventually promoting the tumor growth and progression. B, Origin of CTC clusters due to “cell jamming.” The “cell jamming” principle proposes that increasing confinement from the growing mass of tumor or higher density of extracellular matrix may promote grouping of the cells. In this context, higher mammographic density may facilitate CTC cluster formation. C, Orchestrated origin of CTC clusters through activation of tissue development and regeneration pathways. These pathways include (i) intact cell polarization (not graphically represented in the figure), (ii) acquired expression of cell surface proteases and various cell adhesion molecules, (iii) the presence of adherens junctions for which plakoglobin is an important mediator, and (iv) remodeling of tissue/tumor architecture to clear the track, which is facilitated by a keratin-14–positive leader cell. These mechanisms may in turn facilitate tumor cell cooperativity and their collective cell migration as CTC clusters.

Genesis of CTC clusters

The physiological events by which CTC clusters originate are still largely unknown. The concept that CTC clusters could form by intravascular grouping of single CTCs has been disproven by a recent study (5). However, that still does not address the question about the exact steps leading to CTC cluster formation. An emerging hypothesis is that CTC clusters are formed due to “cell jamming” (Fig. 1B). This principle proposes that increasing confinement from the growing mass of tumor or higher density of extracellular matrix (ECM) may control the mode of tumor cell dissemination. Higher ECM density was shown to shift the preference of mesenchymal tumor cells to collective invasion whereas lower ECM density was associated with single cell invasion in an in vitro model (8). This principle may also apply to mammographic breast density, which is an important prognostic factor for locoregional recurrence in early-stage breast cancer and of progression-free survival in metastatic breast cancer at initial diagnosis (9, 10). However, the influence of breast density on “cell jamming” and preference for CTC cluster formation is an open question, which can be investigated in animal models with collagen I defects, LOX-mediated collagen crosslinking, or CD36 repression (11–13).

A more strategic preparation for the tumor cells to form a cluster may involve activation of pathways involved in tissue development and regeneration. These molecular mechanisms may in turn facilitate tumor cell cooperativity and collective cell migration (14). A few decades ago preclinical studies focusing on wound healing and morphogenesis have shown that epithelial cell aggregates are capable of spreading movements in vitro en in vivo (14). These aggregates are able to migrate while maintaining cell–cell interactions (15). Some of the mechanisms proposed for this collective cell migration include (i) intact cell polarization, (ii) acquired expression of cell surface proteases and various cell adhesion molecules, (iii) presence of adherens junctions, and (iv) remodeling of tissue/tumor architecture to clear the track (Fig. 1C). Interestingly, some of these pathways seem to be also important for ECM-induced collective invasion (8). If present in CTC clusters, these processes may allow cell–cell coupling and multicellular organization and ultimately facilitate the formation of CTC clusters. More research is needed to address the exact cellular events leading to CTC cluster formation, with a possibility of multiple passive and active modalities supported by ECM, tumor microenvironment, and/or tumor cells themselves.

Similar to morphogenetic movements, collective movement occurs in many cancers in which cells are not completely de-differentiated (16). In this regard, collective cell migration may be led by a keratin 14-positive leader cell, which may create a path for the other tumor cells in its group through the surrounding tissue, in the blood stream, and potentially in the invaded site (Fig. 1C ref. 17). Interestingly, ECM-induced “cell jamming” is shown to also require track clearance by leader cells (8). Plakoglobin, which is involved in cell–cell junction and is highly expressed in CTC clusters compared to single CTCs, may also provide a preference for CTC clusters formation and integrity throughout their transit in the blood (5) (Fig. 1C). Keratin 14, plakoglobin, E-cadherin, and other epithelial cytoskeletal and adhesion proteins form the core of the machinery necessary for formation and dissemination of CTC clusters. Here, the unexplored research topics include the molecular processes by which the epithelial framework facilitates CTC cluster formation and its dependence on various mechanisms of cell invasiveness and migration.

Dissemination of CTC clusters

The access of CTC clusters into the blood stream could be made possible by the porous and leaky blood vessels formed within rapidly growing tumor masses, via hasty neoangiogenesis (Fig. 2A ref. 18). This supports the tumor self-seeding hypothesis to allow the entry of CTC clusters back to the original site. Conversely, a choreographed entry through invadopodia and macrophage-dependent transendothelial migration (19) may also be possible for CTC clusters to gain the access to circulation (Fig. 2A). The invadopodia are the protrusive and adhesive structures of cancer cells thought to arise in response to a range of signals primarily from tumor microenvironment. The proteolytic function of invadopodia through localized activity of matrix metalloproteases and their role in transendothelial migration of individual tumor cells are particularly important for metastasis. However, whether similar invadopodia-based and/or macrophage-dependent pathways are involved in intravasation of CTC clusters for dissemination remains to be explored. Future studies may also include capturing the live events of CTC clusters in transit by utilizing recent advances in the three-dimension real-time microscopy imaging in vivo (20).

Dissemination, survival advantage, and increased metastatic potential of CTC clusters. A, Dissemination of CTC clusters. CTC clusters may enter the circulation either by porous and leaky blood vessels formed by hasty neoangiogenesis required by the growing mass of tumor or by a choreographed entry through invadopodia and macrophage-dependent transendothelial migration, which has been demonstrated for single CTCs. When in circulation, a CTC cluster may act like a thrombus and get arrested in the small veins or capillaries. Here, they may find residence and give rise to overt metastasis. An (re)arrangement of the CTCs within a cluster in a linear fashion as a single-cell file may allow the grouped cells to pass through microvessels to reach more distant sites. B, Survival advantage and increased metastatic potential of CTC clusters. Persistent adhesion-dependent survival signals in CTC clusters can provide survival stimuli and thus contribute to effective metastatic spreading. Although epithelial cell–cell interactions may be important, cellular plasticity of CTCs within clusters have also been seen as in form of expression of EMT markers and presence of hybrid cells with both epithelial and EMT characteristics. Disaggregation of CTC clusters by uPA or plakoglobin knockdown or any other method may give rise to single CTCs. Although single CTCs may experience many survival challenges such as shear forces, environmental or oxidative stresses, and immune assault leading to apoptosis, CTCs within clusters may be shielded from them. This does not rule out the possibility that a few single CTCs may still be able to colonize a distant site. Cellular heterogeneity [such as undifferentiated vs. differentiated and epithelial vs. EMT] for homotypic clusters made up of only tumor cells and interaction between tumor cells and other nontumor cells (such as stromal or immune cells) for heterotypic clusters may offer competitive advantage for colonization at distant sites. Furthermore, activation of tumor dormancy program could favor formation of micrometastatic niche and escape from immunosurveillance at the distant sites.

Once in circulation, CTC clusters have slower flow rate than single CTCs within the blood vessels (21), which suggests its embolus/thrombus-like behavior. In support of this, administration of a thrombolytic agent called urokinase-type plasminogen activator (uPA) is effective at breaking down CTC clusters into single cells as well as modestly reducing the numbers of metastatic lesions and improving survival (21). Contrariwise, uPA expression is associated with enhanced tumor migration and invasion and higher rates of tumor progression and metastasis (22, 23), suggesting a differential role of uPA in early versus metastatic stage. Disaggregation of CTC cluster has also been reported with genetic knockdown of plakoglobin, which leads to their compromised metastatic efficiency in the animal models (5). The observation of reduced metastasis and improved survival by disrupting CTC clusters directly, either by systemic uPA administration or by genetic knockdown of plakoglobin (Fig. 2B), in animal models raises interesting questions: Can disaggregation of CTC clusters in circulation provide an advantage in preventing metastatic disease? What are the “druggable” targets that can dissociate CTC clusters? Are there any FDA-approved drugs that can disaggregate CTC clusters? In this regard, CTC clusters are often found to be associated with platelets (24, 25). It is not clear if platelets play any role in maintaining their integrity during the transit or their dissemination ability. Whether currently available anti-platelet agents can dissociate CTC clusters may be an interesting question to evaluate in preclinical models.

Slowly moving CTC clusters if arrested in small veins or capillaries may find residence and give rise to overt metastases from within the vessel (Fig. 2A). Because lung is the first organ encountered by these CTC clusters released from various organs, this potentially could be one of the mechanisms by which they are responsible for lung metastases. Indeed, a preclinical study has demonstrated that lung metastasis originates from the intravascular proliferation of endothelium-attached tumor cells rather than from CTCs that were able to extravasate and invade lung parenchyma (26). This phenomenon might also explain the formation of brain metastases despite the presence of an intact blood brain barrier. However, a deliberate movement of a group of tumor cells through microvessels is also possible due to CTC clusters organized in a linear arrangement of single-cell files (27, 28), which may also explain the trans-pulmonary passage of CTC clusters into other organs and rise of metastases in other distant site (Fig. 2A). What factors influence the structure of CTC clusters and possibly the site of colonization for CTC cluster is another important area of research.

Survival advantage for CTC clusters

CTC death may be in part due to the loss of adhesion-dependent survival signals leading to anoikis (29), which might explain apoptotic CTCs of epithelial phenotype (Fig. 2B refs. 30, 31). This supports the hypothesis that persistent epithelial cell–cell interactions in the form of clusters can provide survival stimuli and thus contribute to effective metastatic spreading (16). However, CTC clusters also express more mesenchymal versus epithelial markers compared to single CTCs (31). How would that provide additional survival advantage from anoikis during the transit is not known. Although epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in CTC clusters is counterintuitive because it is expected to result in high propensity of single cells, the cellular plasticity and cooperativity within a cluster may confer resistance to various stresses within the circulation (32). In support of this, the hybrid epithelial/mesenchymal state of CTC clusters has recently been described (Fig. 2B ref. 25) however, its direct association to increased survival advantage is less clear. The molecular mechanism(s) allowing the cells to have the plasticity is a highly important area of investigation as they may provide additional pharmacological targets for the prevention of metastasis.

Other conceivable mechanisms for the survival advantage of clusters include the cooperation between cells within CTC clusters shielding from shear forces, environmental or oxidative stresses, and immune assault (Fig. 2B). Indeed, tumor fragments are found to survive and grow better after they are transplanted (33) or injected (34, 35) into a new host. In this context, heterotypic clusters containing more durable stromal or immune cells aggregated with CTCs may provide additional advantage (36, 37). It can also be hypothesized that paracrine interactions between cells of various origin in heterotypic clusters may play a pivotal role in seeding of tumor clusters and in the evasion of immunosurveillance at the distant site, further providing a survival advantage (Fig. 2B). The mechanisms that regulate these interactions and their influence on survival advantage and colonization potential of CTC clusters also remains unknown.

A predominantly glycolysis-driven cell metabolism of a cancer cell allows the cells to survive in hypoxic conditions while being maintained in the tumor microenvironment. While in circulation, the oxygen deprivation may be even more severely restricted so that only the toughest cells survive. Significant work has been done to understand how cancer cell metabolism affects the tumor cell growth as well as its migratory or invasive capability (38, 39). The role of EMT in rewiring of the cancer cell metabolic network and, vice versa, the importance of metabolic reprogramming on EMT are also starting to be deciphered (40). On one hand, EMT controls the expression of genes involved in metabolic pathways such as glycolysis, lipid metabolism, mitochondrial metabolism, and glutaminolysis. However, deregulated expression of metabolic enzymes in these pathways promotes EMT. Although these pathways are shown to be relevant in migrating single CTC with mesenchymal characteristics, the differences in cancer cell metabolism between single CTCs and CTC clusters need to be investigated.

Enhanced metastatic potential of CTC clusters

The polyclonal tumor cell cooperativity and crosstalk within the network of migrating homotypic (made of only CTCs) or heterotypic clusters (made of CTCs and other stromal/immune cells) may facilitate stabilizing and initiating metastatic growth (27). For homotypic clusters, cellular heterogeneity (such as undifferentiated vs. differentiated and epithelial vs. EMT) may offer competitive advantage for colonization at distant sites (Fig. 2B). While expression of stem cell markers within some CTCs has been described, this remains an important area of future investigation for CTC clusters. Single cell analysis of stem cell marker expression and the localization of tumor-initiating cells within the cluster may be an important factor to examine. For heterotypic clusters, interaction between tumor cells and other nontumor cells (such as stromal or immune cells) may also be important for colonization and escaping immunosurveillance (Fig. 2B). Given the recent findings of the various tumor-suppressive/promoting roles played by different tumor-associated immune cells (41), identifying the nontumor cell types, especially immune cells, and their interactions within clusters will shed light on their biological functions and clinical significance in metastasis. With the latest advances in single-cell molecular profiling technologies, analysis of each cell within clusters may reveal mechanisms of cooperativity and define the roles of nontumor cells within CTC clusters.

The observation that CTC clusters are nonproliferative (42), which may allow their escape from the pressures of cytotoxic treatments during the transit and at the distant site, is of interest. This may reflect activation of tumor dormancy programs (43), which, in turn, could favor formation of micrometastatic niches and escape from immunosurveillance at the distant sites (Fig. 2B). The clinical relevance of this nonproliferative status of CTC clusters is an area of active research (3). Although CTCs have been reported in cancer survivors 7 to 22 years after their initial treatment (2), whether CTC clusters are present in these survivors and if their presence predicts imminent recurrence is unknown. Because the “nondormant” state of CTCs as assessed by the proliferation index predicts relapse in breast cancer patients (44), the assessment of this dynamic in CTC clusters may provide additional insight into the mechanisms of tumor progression. Recently, it was proposed that cancer of unknown primary may be explained by the presence of dormant CTCs forming a premetastatic niche and giving rise to a metastatic disease before the tumors at the primary site can be detected (45). It will also be important to determine the role of CTC clusters in this process. Furthermore, the mechanisms by which cluster-host cell interaction at the distant site can intervene and facilitate metastatic cascade also need further investigation.

Isolation and detection of CTC clusters

The major challenges in isolating CTC clusters are related to (i) their paucity as they are found in numbers as low as one cluster per over 10 7 leukocytes and 10 10 red blood cells, (ii) the potential for their dissociation during blood processing, and (iii) the variations in their physical, cellular, and molecular characteristics. A desired platform to isolate CTC clusters would be able to isolate live and intact CTC clusters of different size, shape, and composition independently of tumor-specific cell surface markers with reduced processing time, robust clinical feasibility, and demonstrated clinical validity in predicting prognosis in patients. While considerable numbers of platforms have been developed for CTC isolation in general, only some have shown the capacity to detect clusters of CTCs, with only a handful demonstrating the prognostic significance of CTC clusters in patients, as described in the section below. These include (i) immunomagnetic-based isolation methods, such as the CellSearch system, which is currently the only FDA-approved platform for the detection of CTCs as a prognostic marker in metastatic cancer patients (46) (ii) size-based filtration methods, such as the Isolation by SizE of Tumor cells (ISET refs. 47, 48) and (iii) microfluidic devices or chips, operating on various passive or active separation principles (49). These platforms are compared in Table 2 for their desired features for CTC clusters research, which highlights the need to develop a platform specifically for CTC cluster research.

Main features of common methods for the detection and study of CTC clusters

To date, microfluidic devices seem to be the most promising platform for isolating CTC clusters, as they offer several advantages such as (i) ability to process whole blood without the need for red blood cells (RBC) removal, which results in less potential of cluster dissociation from shear or centrifugation forces and faster processing time and (ii) collection of live CTC clusters. The main drawback of this platform has been the need for cell surface marker-based capture. To overcome this limitation, size-based isolation methods using spiral microfluidics have been optimized (50). These spiral systems have shown excellent recovery rates and very efficient depletion of white blood cells. Importantly, these devices can be produced at low cost and be easily operated, making them available for a widespread use. To customize selective capture of CTC clusters, a first generation of platform named Cluster-Chip was developed. Cluster-Chip used specialized bifurcating triangular micropillars acting as traps under low-shear stress to preserve CTC cluster integrity and demonstrated high efficiency capture of clusters in patients with metastatic breast or prostate cancer and melanoma (51). To overcome the physical limitation of Cluster-Chip platform that impact viability of CTC clusters, the same group has recently adapted a two-stage deterministic lateral displacement (DLD) approach in a continuous flow microfluidic device to sort clusters based on size and asymmetry from whole blood (52). Here, the first stage is designed to extract clusters based on size such that larger ones will be moved laterally, while smaller clusters and single cells will follow the streamlines through the device to arrive at the second stage, which captures smaller clusters based on asymmetry. Another microfluidic device purposely developed to isolate clusters of CTCs is a three-dimensional (3D) scaffold chip, which can efficiently capture clusters by combining specific antibody-dependent recognition and physical barricade effect of the 3D scaffold structure (53). Here, the scaffold is uniformly coated with thermosensitive gelatin hydrogel, which dissolves at 37°C, allowing gentle release of the captured cells, and thus assuring high viability for downstream applications, including cell culturing.

The future innovation in microfluidic approach to capture CTC clusters requires integration of multiple separation principles to cover the wide physical variations seen in this rare population and shortening of the processing time. An ideal platform will also have demonstrated clinical feasibility as well as validity by confirming the prognostic value of CTC clusters in cancer patients. Commercialization of this platform will also be critical to undertake multitude of future studies described above to uncover the biological and clinical roles of CTC clusters.

Clinical relevance of CTC clusters

Although it is still unclear which tumor or patient characteristics can predict the presence of CTC clusters, recent clinical studies have demonstrated the prognostic value of CTC clusters (Table 3). The presence and high numbers of CTC clusters at baseline have shown to be associated with shorter progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) in patients with various types of solid tumors (3, 54–60). Moreover, platinum resistance has been observed in patients with primary or recurrent ovarian cancer with CTC clusters (61). Finally, cancer patients with persistence of CTC clusters after treatment initiation and with bigger CTC cluster size are shown to have shorter survival (PFS and/or OS refs. 30, 56, 62). These clinical findings not only suggest the prognostic value of CTC clusters but also emphasize their biological significance in tumor progression and treatment outcome.

Association of CTC clusters and clinical outcomes in cancer patients

Samenvatting

Evidence so far supports a functional role of CTC clusters in surviving pressures of travelling through the bloodstream, such as anoikis, shear forces, and immune attack, as well as colonizing distant organs. The advantage may be offered by the composition and cooperativity among the CTCs within a cluster, compared to the single CTCs. However, much is still unknown about their genesis, transit, and settlement. The clinical data so far also indicate the prognostic value of CTC cluster analysis in predicting treatment resistance and survival outcomes in cancer patients. Nevertheless, the precise cellular and molecular mechanisms enhancing the metastatic ability of clusters remain unclear. A combination of microfluidic and computational simulation of cluster movement with real-time in vivo microscopy may help us understand the early events of CTC cluster formation and dissemination. In addition, comparing molecular profiling of single versus clustered CTCs may reveal the pathways responsible for their extended survival and drug resistance and define the roles of nontumor cells associated with CTCs. The biological studies to answer the open questions related to CTC clusters presented here will allow a deeper understanding of the role of CTC clusters in tumor progression, identify novel therapies, and eventually guide clinical studies for personalization of therapeutic decision-making.


Author information

Daphne W. Bell & Ulysses J. Balis

Present address: Present addresses: National Human Genome Research Institute/NIH Cancer Genetics Branch, Bethesda, Maryland 20892, USA (D.W.B.) Department of Pathology, University of Michigan Health System, Ann Arbor, Michigan 48109, USA (U.J.B.).,

Sunitha Nagrath and Lecia V. Sequist: These authors contributed equally to this paper.

Voorkeuren

Surgical Services and BioMEMS Resource Center, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, and Shriners Hospital for Children, Boston, Massachusetts 02114, USA

Sunitha Nagrath, Daniel Irimia, Ulysses J. Balis, Ronald G. Tompkins & Mehmet Toner

Massachusetts General Hospital Cancer Center, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02114, USA

Lecia V. Sequist, Shyamala Maheswaran, Daphne W. Bell, Lindsey Ulkus, Matthew R. Smith, Eunice L. Kwak, Subba Digumarthy, Alona Muzikansky, Paula Ryan & Daniel A. Haber


Bekijk de video: Een venster op onze gezondheid. Dennis Lo. TEDxCERN (December 2021).