Informatie

8.7A: Overzicht van Proteobacteria - Biologie


De Proteobacteriën zijn een belangrijke groep (phylum) bacteriën.

leerdoelen

  • Categoriseer proteobacteriën

Belangrijkste punten

  • Proteobacteriën omvatten een grote verscheidenheid aan pathogenen, zoals Escherichia, Salmonella, Vibrio, Helicobacter en vele andere opmerkelijke geslachten.
  • Alle proteobacteriën zijn Gram-negatief, met een buitenmembraan dat voornamelijk bestaat uit lipopolysacchariden.
  • De afdelingen van de proteobacteriën omvatten: Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Epsilonproteobacteria en Zetaproteobacteria.

Sleutelbegrippen

  • Proteobacteriën: De Proteobacteria zijn een belangrijke groep (phylum) bacteriën. Ze omvatten een grote verscheidenheid aan pathogenen, zoals Escherichia, Salmonella, Vibrio, Helicobacter en vele andere opmerkelijke geslachten. Anderen leven vrij en bevatten veel van de bacteriën die verantwoordelijk zijn voor stikstofbinding.
  • ziekteverwekkers: Een pathogeen of infectieus agens (in de volksmond bekend als een kiem) is een micro-organisme (in de ruimste zin, zoals een virus, bacterie, prion of schimmel) dat ziekte veroorzaakt bij zijn gastheer. De gastheer kan een dier zijn (inclusief mensen), een plant of zelfs een ander micro-organisme.
  • Gram-negatief: Gram-negatieve bacteriën zijn bacteriën die geen kristalviolette kleurstof vasthouden in het Gram-kleuringsprotocol. Bij een Gram-kleuringstest wordt een tegenkleuring (meestal safranine) toegevoegd na het kristalviolet, waardoor alle Gram-negatieve bacteriën een rode of roze kleur krijgen.

De Proteobacteriën zijn een belangrijke groep (phylum) bacteriën. Anderen leven vrij en bevatten veel van de bacteriën die verantwoordelijk zijn voor stikstofbinding.

In 1987 richtte Carl Woese deze groepering op en noemde het informeel de "paarse bacteriën en hun verwanten". Vanwege de grote diversiteit aan vormen die in deze groep worden gevonden, zijn de Proteobacteriën vernoemd naar Proteus, een Griekse god van de zee, die veel verschillende vormen kan aannemen, en is daarom niet vernoemd naar het geslacht Proteus.

Alle proteobacteriën zijn Gram-negatief, met een buitenmembraan dat voornamelijk bestaat uit lipopolysacchariden. Velen verplaatsen zich met behulp van flagella, maar sommige zijn niet-beweeglijk of vertrouwen op bacterieel glijden. De laatste omvatten de myxobacteriën, een unieke groep bacteriën die kunnen aggregeren om meercellige vruchtlichamen te vormen. Er is ook een grote verscheidenheid in de soorten metabolisme. De meeste leden zijn facultatief of obligaat anaëroob, chemoautotrofen en heterotroof, maar er zijn talloze uitzonderingen. Een verscheidenheid aan geslachten, die niet nauw verwant zijn aan elkaar, zetten energie van licht om door middel van fotosynthese. Dit worden paarse bacteriën genoemd, verwijzend naar hun meestal roodachtige pigmentatie.

De groep wordt voornamelijk gedefinieerd in termen van ribosomale RNA (rRNA) sequenties. De Proteobacteriën zijn verdeeld in zes secties, aangeduid met de Griekse letters alfa tot en met zeta, opnieuw gebaseerd op rRNA-sequenties. Deze worden vaak behandeld als klassen. De alfa-, bèta-, delta- en epsilon-secties zijn monofyletisch, maar de Gammaproteobacteriën als gevolg van het geslacht Acidithiobacillus zijn parafyletisch voor Betaproteobacteriën, volgens multigenome-uitlijningsstudies, die, indien correct uitgevoerd, nauwkeuriger zijn dan 16S (merk op dat Mariprofundus ferrooxydans het enige lid van de Zetaproteobacteria is was eerder verkeerd geclassificeerd in de NCBI-taxonomie). Acidithiobacillus bevat 5 soorten en het enige geslacht in de volgorde Acidithiobacillales.

De divisies van de proteobacteriën werden ooit beschouwd als subklassen (bijvoorbeeld de α-subklasse van de Proteobacteria), maar worden nu beschouwd als klassen (bijvoorbeeld de Alphaproteobacteria). Deze klassen omvatten: Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Epsilonproteobacteria en Zetaproteobacteria.


Binnen de prokaryotische organismen zijn er twee hoofdafdelingen: Eubacteria en Archaebacteria. De Eubacteria zijn te vinden in het domein Bacteria, terwijl de archaebacteria te vinden zijn in het domein Archaebacteria. Eubacteriën hebben de typische kenmerken van een prokaryotisch organisme, maar ze hebben ook het vermogen om sporen te vormen en kunnen pathogene organismen zijn (d.w.z. ziekte veroorzaken bij mens en dier). Eubacteriën kunnen zich voortplanten door binaire splitsing of knopvorming, en vormen vaak grote kolonies die extracellulaire structuren kunnen creëren zoals '8220biofilms'8221 die de kolonie op unieke manieren beschermen.

Eubacteriën, of micro-organismen die geen gedefinieerde membraankern hebben, hebben verschillende algemene kenmerken. Als prokaryoten hebben ze geen membraangebonden organellen. De meeste eubacteriën zijn omgeven door een celwand, die bestaat uit peptidoglycanen in een verknoopt kettingpatroon. Dit geeft de wand van de bacterie de kracht die nodig is om zijn vorm en grootte te behouden door veranderende omgevingen. Kleine moleculen kunnen door de celwand diffunderen, maar grotere moleculen en ionen hebben dragereiwitten en kanaaleiwitten nodig om de cel binnen te komen.

Sommige bacteriën kunnen een flagellum hebben (een structuur bestaande uit eiwitfilamenten die wordt gebruikt voor beweging). Andere bacteriën hebben pili, kleine uitsteeksels aan de buitenkant van de cel die worden gebruikt om aan oppervlakken te kleven en DNA over te dragen. Wanneer een groot aantal bacteriën aan een oppervlak is gehecht en omgeven is door een polysacharidezak, wordt dit een biofilm genoemd. Dit complex heeft een hoge antimicrobiële resistentie.

De vloeistof die het plasmamembraan van de bacterie bevat, is het cytosol. Het bestaat voornamelijk uit water (ongeveer 80%), maar het heeft een gelachtige consistentie omdat het gevuld is met opgeloste voedingsstoffen, cytoskeletelementen, DNA en andere stoffen. Eubacteriën hebben ribosomen - organellen die zijn samengesteld uit RNA en eiwitten die het proces van eiwittranslatie voltooien.

In tijden van extreme omstandigheden die niet bevorderlijk zijn voor replicatie, zoals uithongering, hebben eubacteriën het vermogen om endosporen te worden. In deze toestand kunnen de bacteriën extreem hoge en lage temperaturen, zure en basische omstandigheden en grote hoeveelheden straling verdragen. Endosporen zijn extreem moeilijk te doden. Verrassend genoeg kunnen ze uren worden gekookt en toch overleven. Endosporen kunnen alleen worden gemaakt door Gram-positieve bacteriën. Binnen de endospore blijft het bacteriële DNA, maar het cytosol verliest water en wordt extreem geconcentreerd. Men denkt dat dit helpt bij de bescherming tegen hoge temperaturen. De bacteriën krijgen een taaie coating die bestaat uit calcium en dipicolinezuur, waardoor een dichte en onneembare barrière ontstaat om het DNA in de cel te stabiliseren. DNA-reparatie-enzymen zijn ook nog steeds actief, wat helpt bij de resistentie van de endospore.

Plasmiden worden ook gevonden in bacteriën, los van het circulaire DNA van de bacterie. Ook wel "replicons" genoemd, zijn plasmiden autonoom replicerende DNA-moleculen. In wezen zorgen deze kleine ringen van DNA ervoor dat bacteriën genen tussen organismen kunnen overbrengen. Deze elementen zorgen voor horizontale genoverdracht, wat een manier is voor een bacterie om nieuwe genen en eigenschappen te verwerven, zoals antibioticaresistentie. Ze helpen vooral bij de snelle mutatie van bacteriën in veranderende omgevingscondities. Net als het andere genetische materiaal kunnen de plasmiden tijdens replicatie worden doorgegeven aan dochtercellen.


Groene bacteriën – Energieoverdracht en elektronentransport☆

Hirozo Oh oke, . Chihiro. Azai, in referentiemodule in Life Sciences, 2020

Abstract

Groene bacteriën, waaronder chloorbi, Chloroflexien fototroof Acidobacteriën , bevatten licht-oogstende antennecomplexen, de chlorosomen genaamd, die worden gevormd door zelfaggregaten van de bacteriochlorofylen C, NS, of e en kan lichtenergie zeer efficiënt absorberen. Deze bacteriën zetten lichtenergie om in chemische energie door gebruik te maken van met pigment geassocieerde membraaneiwitcomplexen die bekend staan ​​als fotochemische reactiecentra. Het type-1- of type-2-reactiecentrum stuurt lichtafhankelijke cyclische elektronentransportketens aan om elektrochemische protonen te genereren via verschillende klassen van eiwitcomplexen, waaronder NADH-dehydrogenase, cytochroom bc complex, en/of alternatief complex III, ingebed in membranen.


Resultaten en discussie

Uitgebreide analyse van de O. antropioplosbaar sub-proteoom

In deze studie rapporteren we de eerste op gel gebaseerde vergelijkende proteomische analyse van de α-Proteobacterium O. antropi in twee verschillende groeifasen. Bij deze multidimensionale analyse werd het oplosbare sub-proteoom eerst gescheiden door een eendimensionale PAGE. De resulterende gel werd vervolgens in negen fracties gesneden op basis van de SeeBlue™ Plus 2 molecuulmassamarkers. Elke gelfractie werd vervolgens getrypsiniseerd en de geëxtraheerde peptiden werden gescheiden op een omgekeerde fase C18 kolom gedurende een periode van 60 minuten voordat deze op de massaspectrometer wordt ingebracht. Deze methodologie maakte de identificatie mogelijk van in totaal 131 eiwitten van het oplosbare sub-proteoom onder de twee groeifasen. Deze tot expressie gebrachte subset van genproducten vertegenwoordigt naar schatting 3% van het totaal O. antropi proteoom, gebruikmakend van gegevens op basis van de typische voorspelde genoomgrootte [29]. Er zijn momenteel geen gegevens beschikbaar in de literatuur over de verwachte verdeling van eiwitten binnen sub-proteomische fracties van O. antropi. Als benchmark is echter een studie die zich voornamelijk concentreert op de analyse van de cytosolische eiwitten van Brucella melitensis 16M, een fylogenetisch nauw verwant organisme, identificeerde 187 eiwitten, wat overeenkomt met 6% van zijn voorspelde proteoom [33, 34].

Zoals eerder gemeld [35], worden vanwege de complexe aard van de te analyseren peptidemengsels de scheidingsmogelijkheden van de vloeistofchromatografie (LC)-massaspectrometrie (MS)-systemen vaak overschreden. In deze studie werden alle peptidefracties drie afzonderlijke keren geanalyseerd om de algemene peptide-identificaties te verhogen. In de huidige studie leidde geautomatiseerde curatie van onze initiële dataset door de heuristische bio-informatische tool PROVALT [36], samen met handmatige curatie, tot de positieve identificatie van 89 eiwitten in de vroege fase en 95 eiwitten in de late fase van groei.

Karakterisering van de O. antropioplosbaar sub-proteoom bij vroege en late groeifase

Binnen de eiwitsubset geïdentificeerd uit het oplosbare sub-proteoom, werden 34 eiwitten uniek geïdentificeerd in de vroege groeifase, 55 eiwitten werden gevonden onder beide groeiomstandigheden en 40 bleken uniek te zijn voor de latere groeifase. De geïdentificeerde eiwitten hadden een breed scala aan fysio-chemische eigenschappen met betrekking tot pI en molecuulmassa (MR) (Figuur 1). Deze tweedimensionale visualisatie toonde aan dat het kleinste eiwit dat in de vroege groei werd geïdentificeerd, het 30S-ribosomale eiwit S17 (MR = 9.123 Da) terwijl het in de late groeiconditie het koude shock-eiwit CSPA was (MR = 8.963 Da). Het grootste eiwit dat onder beide omstandigheden werd geïdentificeerd, was de DNA-gerichte RNA-polymerase-bètaketen (MR = 153.688 Da). Het meest zure eiwit dat onder beide omstandigheden werd geïdentificeerd, was het 30S-ribosomale eiwit S1 (pI = 4,28), terwijl het meest basale in de vroege groeiconditie het 30S-ribosomale eiwit S5 was (pI = 10,49) en in de late groeiconditie was het 30S-ribosomale eiwit S20 (pI = 11,63).

Theoretische tweedimensionale kaart van het oplosbare sub-proteoom van O. antropi. Ruiten, vroege groeifase vierkanten, beide groeicondities driehoeken, late groeifase.

Eiwitten die binnen de twee groeiomstandigheden werden geïdentificeerd, werden gekwantificeerd met behulp van de Exponentially Modified Protein Abundance Index (emPAI) en zijn te zien in Tabel 1 (voor die eiwitten die uniek zijn voor vroege groeifase), Tabel 2 (voor die eiwitten die gemeenschappelijk zijn voor beide groeiomstandigheden) en Tabel 3 (voor die eiwitten die uniek zijn voor groei in de late fase) [37]. Deze methode maakt de kwantificering van individuele geïdentificeerde eiwitten mogelijk door gebruik te maken van database- en Mascot-outputinformatie om een ​​emPAI-waarde te geven. De emPAI-waarde kan vervolgens worden gebruikt om het eiwitgehalte in het monstermengsel in molaire fractiepercentages te schatten. Bovendien kan de veelvoudige verandering in het expressieniveau van eiwitten die onder beide groeiomstandigheden worden geïdentificeerd, worden geschat, waardoor meer inzicht wordt verkregen in cellulaire processen. Het meest voorkomende eiwit zoals berekend door molaire fractiepercentages onder beide omstandigheden was het 30S-ribosomale eiwit S1 (Tabel 2). Het minst overvloedige eiwit onder omstandigheden van vroege groei was 30S-ribosomaal eiwit S17 (Tabel 1) en onder omstandigheden van groei in de late fase was Valyl-tRNA-synthetase (Tabel 3).

Proteomische analyse van de oorsprong van de geïdentificeerde eiwitten in deze studie ondersteunt eerdere genomische studies die aantonen dat, fylogenetisch, het geslacht Ochrobactrum is het nauwst verwant aan Brucella, waarbij 93,9% van de geïdentificeerde eiwitten het meest overeenkomen met dit geslacht. De resterende eiwitten werden gematcht met andere leden van de α-2-subgroep van de Proteobacteria (Rhizobacteriën (3.8%), Bartonella (1,5%) en Agrobacterium (0.8%)).

Van de 131 eiwitten die in deze studie werden gedetecteerd, waren functionele rollen voor 125 eiwitten (95,4%) bekend of konden ze worden voorspeld uit database-analyse. Eiwitten binnen dit oplosbare sub-proteoom werden toegewezen aan functionele categorieën met behulp van methodologieën zoals eerder beschreven door Takami et al. [38] en Wasinger et al. [39]. Figuur 2 laat zien dat eiwitten van de grootste categorie van geïdentificeerde eiwitten onder beide groeiomstandigheden betrokken waren bij eiwitsynthese (ribosomale eiwitten), gevolgd door eiwitten die betrokken zijn bij het metabolisme van nucleotiden en nucleïnezuren, en vervolgens degenen die betrokken zijn bij het metabolisme van aminozuren en verwante moleculen. De overige eiwitten werden verdeeld over de andere functionele categorieën. De functionele categorieën metabolisme van nucleotiden, DNA-replicatie, RNA-synthese (verlenging), eiwitmodificatie en eiwitvouwing blijken in de vroege groeifase op hogere niveaus aanwezig te zijn dan in de late groeifase. In de late groeifase zijn Transporteiwitten, Specifieke routes, Metabolisme van aminozuren, Eiwitsynthese (ribosomale eiwitten) en Eiwitsynthese (tRNA-synthetasen) beter vertegenwoordigd. Bovendien was de late groeifase de enige met eiwitten uit de functionele categorieën Aanpassing aan atypische omstandigheden (2,1%) en Ontgifting (4,2%). Het is vermeldenswaard dat de toewijzing van eiwitten aan functionele categorieën gecompliceerd is, zoals geïllustreerd in het geval van de categorie Metabolisme van nucleotiden, door de anaplerotische aard van bacteriële enzymen met een aantal eiwitten die ook zouden kunnen worden ingedeeld in de Metabolisme van aminozuren categorie.

Functionele categorisatie van geïdentificeerde eiwitten uit het oplosbare sub-proteoom van O. antropi. Grijze balken, vroege groeifase zwarte balken, late groeifase.

De snelle toename van genomische gegevens in het afgelopen decennium heeft veel belangrijke aspecten van microbiële cellulaire processen aan het licht gebracht, maar er zijn nog steeds een aanzienlijk aantal potentiële genproducten waarvan we niets weten, behalve dat ze worden geclassificeerd als 'hypothetische eiwitten'. Inderdaad, binnen de genoomsequentie van B. melitensis stam 16M, fylogenetisch het dichtste verwant van O. antropi waarvoor genomische gegevens beschikbaar zijn, wordt voorspeld dat ongeveer 716 voorspelde genproducten, gelijk aan 22% van het totale genoom, hypothetische eiwitten of eiwitten met onbekende functie zijn. In eerder werk hebben we de noodzaak onderstreept om, waar mogelijk, een element van biologische functionaliteit toe te kennen aan dergelijke genproducten om zowel systeembiologie als ons begrip van cellulaire processen binnen deze organismen te ontwikkelen. Binnen de huidige studie hebben we de aanwezigheid vastgesteld van zes eiwitten die eerder waren geannoteerd als hypothetisch geconserveerde eiwitten. De identificatie van dergelijke eiwitten in het celextract van O. antropi stelt de biologische functionaliteit vast van deze 'hypothetische' voorspelde eiwitcoderende sequenties, en toont nogmaals op elegante wijze het potentieel aan van proteomics om bioinformatica-voorspellingen te valideren.

Nadat we de aanwezigheid van dergelijke eiwitten hadden vastgesteld en wilden begrijpen hoe ze bijdragen aan functionele processen, hebben we ze verder onderzocht met behulp van NCBI BLASTp [40]. Een dergelijke benadering maakt het mogelijk geconserveerde domeinen binnen eiwitsequenties te identificeren en maakt daardoor een zekere mate van afgeleide functionaliteit mogelijk. Door deze methodologie te gebruiken, konden we echter een vermeende functie toewijzen aan slechts één van deze eiwitten, NCBI: 23463995. De zoekopdracht identificeerde twee geconserveerde domeinen, pfam 01480, GFO_IDH_MocA Oxidoreductase-familie die betrokken is bij het gebruik van NADP of NAD en COG 1748 Saccharopinedehydrogenase en verwante eiwitten die betrokken zijn bij aminozuurtransport en -metabolisme.

Subcellulaire eiwitlokalisatie

Subcellulaire voorspellingstools voor lokalisatie worden al vele jaren gebruikt om die eiwitten te identificeren die worden vastgehouden door en geëxporteerd uit cellen. Ze kunnen ook worden gebruikt bij het identificeren van mogelijke diagnostische en therapeutische doelen en bij het verstrekken van informatie over de functionaliteit van een eiwit [41]. In de huidige studie werden een aantal bioinformatica-tools gebruikt, waaronder PSortB [41, 42], SignalP [43, 44] en SecretomeP [45, 46]. Deze bioinformatica-tools proberen voor elk eiwit een subcellulaire locatie toe te wijzen. Deze tools gebruiken een reeks descriptorregels en een verscheidenheid aan computationele algoritmen en netwerken om de aminozuursamenstelling van een eiwit te analyseren in een poging om bekende motieven of splitsingsplaatsen te identificeren. De eiwitten die in dit onderzoek werden geïdentificeerd, werden in drie groepen verdeeld en geanalyseerd met behulp van de bovenstaande bioinformatica-tools. De groepen waren: die eiwitten die alleen in vroege groei werden geïdentificeerd (bio-informatica-zoekresultaten zijn te zien in tabel 1) die eiwitten die gemeenschappelijk zijn gevonden voor beide groeiomstandigheden (bio-informatica-zoekresultaten zijn te zien in tabel 2) en die eiwitten die pas laat worden geïdentificeerd groeifase (bioinformatica-zoekresultaten zijn te zien in tabel 3). Overzichten van de bioinformatische analyse van de eiwitten uit het oplosbare sub-proteoom van O. antropi worden getoond voor vroege groei (Figuur 3), voor zowel groeiomstandigheden (Figuur 4) als voor late groei (Figuur 5).

Overzicht van geïdentificeerde eiwitten uit het oplosbare sub-proteoom van O. antropi in de vroege groeifase. Cellulaire lokalisatie werd voorspeld op basis van het gebruik van PSortB v2.0.4 [41,42], SignalP v3.0 [43,44] en SecretomeP v2.0 [45,46].

Overzicht van geïdentificeerde eiwitten uit het oplosbare sub-proteoom van O. antropi aanwezig in beide groeiomstandigheden. Cellulaire lokalisatie werd voorspeld op basis van het gebruik van PSortB v2.0.4 [41,42], SignalP v3.0 [43,44] en SecretomeP v2.0 [45,46].

Overzicht van geïdentificeerde eiwitten uit het oplosbare sub-proteoom van O. antropi aanwezig in late groeiomstandigheden. Cellulaire lokalisatie werd voorspeld op basis van het gebruik van PSortB v2.0.4 [41,42], SignalP v3.0 [43,44] en SecretomeP v2.0 [45,46].

Binnen de eiwitsubset die alleen in vroege groei werd geïdentificeerd, werd voorspeld dat negen eiwitten zouden worden uitgescheiden (26,5%), met zes van die eiwitten die werden geïdentificeerd als een aminoterminaal signaalpeptide (tabel 1) van die eiwitten die gemeenschappelijk zijn voor beide groeiomstandigheden, 15 waren waarvan voorspeld werd dat ze zouden worden uitgescheiden (27,3%), met vijf van degenen die werden geïdentificeerd als een aminoterminaal signaalpeptide (Tabel 2) en van degenen die alleen in late groei werden geïdentificeerd, werd voorspeld dat 15 zouden worden uitgescheiden (37,5%), met zes van die geïdentificeerd als het bezitten van een amino-terminaal signaalpeptide (Tabel 3).

De subset van 17 eiwitten waarvan werd vastgesteld dat ze een aminoterminaal signaalpeptide bevatten, werd verder geanalyseerd op de aanwezigheid van lipobox-, RR-motief- en signaalpeptide-splitsingsplaatsen om, waar mogelijk, toewijzing aan een bepaalde secretieroute mogelijk te maken [31, 32] ( Tabel 4). Van deze 17 eiwitten hadden er slechts zeven de vereiste architectuur waarmee ze konden worden toegewezen aan de Sec-route (NCBI:17982453, 17984491, 17982015, 17982340, 17982154, 17983192 en 86283673). De rest van de eiwitten, hoewel ze de juiste splitsingsplaats voor een signaalpeptide bevatten, hadden in feite niet de volledige amino-terminale architectuur die nodig zou zijn om ons in staat te stellen ze te classificeren als uitgescheiden eiwitten [47, 48]. Dit benadrukt nogmaals de beperkingen van enkele van de huidige generatie bio-informatische hulpmiddelen, die momenteel grotendeels zijn geconcentreerd op op motieven gebaseerde voorspellers. Dit toont treffend de absolute noodzaak aan van handmatige interpretatie van resultaten om enig niveau van biologische betekenis te krijgen.

Veranderingen in eiwitexpressie en reconstructie van de route

Door gebruik te maken van de emPAI-berekening voor het meten van eiwitovervloed binnen ons proteomisch onderzoek, konden we de molaire fractiepercentagewaarden gebruiken voor eiwitten die gemeenschappelijk zijn voor beide groeiomstandigheden. Dit stelde ons in staat om de veelvoudige verandering in eiwitexpressie die optreedt onder de twee verschillende omstandigheden te vergelijken [37, 49 , 50]. Twee bereiken worden over het algemeen gebruikt in vergelijkende proteomics om vast te stellen of de veelvoud van verandering in expressie significant is. In de isobare labelingstechnologie iTRAQ™ wordt een verandering van ≥20% als significant beschouwd en voldoende om rekening te houden met systematische fouten. Daarom zijn vouwveranderingen van ≥1,2 of ≤0,8 significant, waarbij een vouwveranderingswaarde van 1 geen verschil in eiwitniveaus vertegenwoordigt tussen de twee staten [51, 52]. In de vergelijkende tweedimensionale PAGE-technologieën wordt een verandering van ≥50% als significant beschouwd en voldoende om rekening te houden met systematische fouten. Daarom zijn vouwveranderingen van ≥1,5 of ≤0,5 significant, opnieuw met een vouwveranderingswaarde van 1 die geen verschil in eiwitniveaus tussen de twee toestanden [53, 54]. De veelvoudige verandering in eiwitexpressie tussen eiwitten van de twee groeiomstandigheden is te zien in Tabel 2. Als we de ≥20% afkapwaarde nemen, veranderden 44 eiwitten significant in expressie bij de ≥50% afkapwaarde, dit wordt teruggebracht tot 19 eiwitten die significant veranderden in expressie tussen de twee groeiomstandigheden. Gebruikmakend van de strengere waarde van ≥50% als een maatstaf voor differentiële eiwitexpressie, kan worden gezien dat 11 eiwitten veel hogere expressieniveaus hebben in de vroege groeiconditie en 6 hogere expressieniveaus in de latere groeiconditie (Figuur 6).

Differentieel expressieprofiel van eiwitten gemeenschappelijk voor beide groeifasen van O. antropi. Vouwveranderingen van ≥1,5 of ≤0,5 zijn significant.

Met behulp van de beschikbare genoomsequentie van B. melitensis 16M, de naaste verwant van O. antropi, en uitgaande van een hoge mate van syntenie tussen de genomen van deze organismen, onderzochten we de genomische context van elk gen dat in deze studie differentieel tot expressie werd gebracht. Op deze manier hoopten we dat voorspelde transcriptie-eenheden voor deze eiwitten zouden worden geïdentificeerd, waardoor ons functionele begrip van de processen die in het organisme plaatsvinden, zou toenemen.

Van de 30S-ribosomale eiwitten die werden geïdentificeerd als differentieel tot expressie gebracht, werd voorspeld dat ze allemaal onafhankelijk zouden worden getranscribeerd [55], en vier (30S-ribosomale eiwitten S3, S5, S7 en S17) werden gevonden in hetzelfde gebied van de B. melitensis 16M genoom. De gerapporteerde differentiële expressie van ribosomale eiwitten is niet ongebruikelijk in proteomics-onderzoeken, maar er is weinig informatie beschikbaar over waarom bepaalde componenteiwitten van het 30S-ribosoom op verschillende niveaus aanwezig zouden moeten zijn. Van de resterende 12 eiwitten die differentieel tot expressie werden gebracht, was de beschikbare in silico bewijs suggereert dat ze onafhankelijk worden getranscribeerd binnen de B. melitensis 16M-genoom [55].

Identificatie van de route

Voorheen Djordjevic et al. [56] rapporteerde de noodzaak om binnen een proteomisch onderzoek drie enzymen te identificeren die aanwezig zijn in een bepaalde biochemische route om definitief vast te stellen dat een dergelijke route aanwezig en actief is in het bestudeerde systeem. Ergo, in combinatie met de routereconstructietool BioCyc [57], hebben we de volgende routes kunnen identificeren: superroute van glycolyse, pyruvaatdehydrogenase en TCA-cyclus (10 eiwitten) (Aanvullend gegevensbestand 1) superroute van glyoxylaatcyclus (3 eiwitten) (Aanvullend databestand 1) vetzuurverlenging (4 eiwitten) (Aanvullend databestand 2) de novo purine nucleotide biosynthese (9 eiwitten) (Extra gegevensbestand 3) arginine biosynthese (3 eiwitten). Buiten onze strikte regels voor identificatie van routes, maar niettemin het vermelden waard zijn, zijn twee extra korte routes waarvoor twee van de vier eiwitten (niet-oxidatieve tak van de pentosefosfaatroute) en twee van de drie eiwitten (fenylalaninebiosynthese II) werden geïdentificeerd in de huidige studie.

Op beide tijdstippen is het duidelijk, zoals te verwachten was, dat centrale metabole routes zoals de TCA-cyclus en vetzuurbiosynthese actief zijn in O. antropi. Bovendien worden ook twee sleutelenzymen gevonden die betrokken zijn bij de oxidatieve pentosefosfaatroute, transketolase en transaldolase. Deze enzymen zijn essentieel bij het recyclen van overtollig pentosefosfaat, gevormd wanneer er veel vraag is naar NADPH2-afhankelijke biosyntheseroutes. Bovendien biedt deze route ook tussenproducten voor nucleotidebiosynthese, en inderdaad zijn nucleotidebiosyntheseroutes blijkbaar ook actief, zoals zou kunnen worden verwacht, op beide bemonsteringspunten [58]. In de vroege groeifase werden specifiek enzymen gedetecteerd die nodig zijn voor peptidoglycaan en lipide A-biosynthese, vermoedelijk vanwege de grote vraag naar nieuwe celwand- en buitenmembraanlaagcomponenten op dit groeipunt [59]. Hoewel de enzymen die essentieel zijn voor de biogenese van ribonucleotiden onder beide omstandigheden aanwezig waren, was nucleosidedifosfaatkinase, de belangrijkste component voor de deoxyribonucleotidesynthese, alleen in de vroege groeifase detecteerbaar, wat wijst op een vraag naar componenten die betrokken zijn bij DNA-replicatie. In de late groeifase werd bewijs gevonden voor de activering van gluconeogenese als een waarschijnlijk gevolg van uitputting van nutriënten, waarbij de expressie van malaatdehydrogenase met een factor 2,4 werd opgereguleerd, en de twee enzymen fosfoenolpyruvaat (PEP) carboxykinase en pyruvaatfosfaatdikinase, essentieel voor de productie van PEP uit respectievelijk oxaalacetaat en pyruvaat, voor het eerst detecteerbaar. Opgemerkt moet worden dat deze route belangrijk wordt geacht voor het tot stand brengen van een gastheerinfectie door bepaalde bacteriën, zoals: Mycobacterium bovis en Xanthomonas campestris [60, 61]. Evenzo werd de aanwezigheid van serine hydroxymethyltransferase, dat glycine omzet in L-serine voorafgaand aan zijn potentiële omzetting in pyruvaat, alleen gevonden in de late fase van groei. Intrigerend genoeg waren de enzymen die betrokken zijn bij de biosynthese van de aminozuren arginine, lysine en fenylalanine ook uniek voor groei in de late fase. Hoewel dit een cellulaire vraag naar deze aminozuren kan weerspiegelen, is het van belang dat het bijproduct van de argininesynthese fumaraat is, dat de dubbele rol heeft van een intermediair in zowel de TCA-cyclus als in gluconeogense.

Een bijkomend kenmerk van groei in de late fase is de aanwezigheid van een aantal stressrespons-eiwitten, in het bijzonder die welke van belang zijn bij de weerstand tegen oxidatieve stress. Van de eiwitten thioredoxine (TrxC), alkylhydroperoxidereductase (AhpC) en thiolperoxidase is gemeld dat ze belangrijk zijn voor de overleving van pathogene bacteriën in een gastheerorganisme [62, 63]. Deze eiwitten zijn inderdaad ook gedetecteerd in zowel transcriptomische als proteomische studies die de rol van oxidatieve stress in een aantal belangrijke pathogene organismen onderzoeken, waaronder Escherichia coli, Candida albicans en Porphyromonas gingivalis [64-68]. De TrxC en AhpC genen zijn onderhevig aan controle door de oxyR regulon, dat wordt geïnduceerd als reactie op oxidatieve stress als gevolg van waterstofperoxide en andere vrije zuurstofradicalen. Tijdens dit proces wordt het regulerende eiwit oxyR geoxideerd door deze reactieve zuurstofsoorten om een ​​intramoleculaire disulfidebinding te vormen, waardoor de activering van expressie van trxC, grxA, gorA en dus andere genen van de OxyR regulon (Figuur 7). Glutathion is een essentieel element in de regulerende cyclus van oxyR, wat de aanwezigheid van N-methylhydantoïnase in de late fasegroei kan verklaren, aangezien het een integraal onderdeel is van de γ-glutamylroute, die verantwoordelijk is voor de aanmaak van glutathion uit 5- oxoproline. Tijdens oxidatieve stress wordt thioredoxine geproduceerd en in zijn gereduceerde vorm werkt het als een acceptor van zuurstofradicalen die worden gegenereerd als gevolg van de katalytische activiteit van thiolperoxidase op H2O2, waardoor de schadelijke zuurstofradicalen worden weggevangen en ontgift en tegelijkertijd H . wordt gevormd2O en thioredoxinedisulfide [69]. Thioredoxines kunnen ook betrokken zijn bij een cascade die de transcriptie van andere ontgiftende genen in gang zet, omdat is aangetoond dat ze een interactie aangaan met DNA-gyrase en zo een groot aantal transcriptionele reacties in de cel beïnvloeden door de DNA-supercoiling te verhogen of te verlagen. Dit suggereert sterk dat het door gyrase gemedieerde effect van thioredoxines op genexpressie een veel voorkomende redox-afhankelijke signaalroute is bij bacteriële adaptatie [70]. Intrigerend is dat AhpC ook een belangrijk geconserveerd bacterieel allergeen is dat interageert met Toll-achtige receptoren van zoogdieren, met name het MyD88-eiwit, waardoor aangeboren en adaptieve immuunresponsen in de gastheer worden geactiveerd [71].

Voorgesteld model voor inductie van de OxyR regel in O. antropi. Geoxideerde oxyR reguleert de expressie van de OxyR regulon in reactie op oxidatieve en nitrosatieve stress, inducerende trxC, grxA, gorA en andere OxyR regulon genen. ahpC, alkylhydroperodidereductase I fhuF, ferri-reductase vacht, ijzeropnamerepressor GSSH/GSH, geoxideerd/gereduceerd glutathion GorA, glutathionreductase GrxA, glutaredoxine A katG, katalase (hydroperoxidase I) OMP agn43, buitenmembraaneiwit oxyS, regulerend RNA RNO, reactieve stikstofsoorten ROS, reactieve zuurstofsoorten TP, thiolperoxidase TR, thioredoxine 2. (Aangepast (met vriendelijke toestemming van Springer Science and Business Media) van figuur 2a [70].)


Discussie

Samenvattend onthullen verzwakkingsbeëindigers een opvallend patroon dat verschilt van beide plooien van willekeurig geshufflede sequenties en intragene regio's. In verhouding tot hun lengte hebben terminatorplooien een veel lagere vrije energie (ΔG) dan willekeurige vouwen of die binnen cistronische gebieden. Dit stelt ons in staat om veel nieuwe verzwakkingsregulatie-sites in een verscheidenheid aan vermeende operons te differentiëren en te voorspellen en zou een 5-voudige toename zijn van het aantal bekende verzwakkingsstructuren in B. subtilis en E coli. Deze maatregel werkt in twee zeer uiteenlopende soorten met verschillende mechanismen van verzwakking en antiterminatie, en verschillende GC-inhoud. Daarom is het mogelijk om een ​​dergelijke analyse uit te breiden tot alle bacteriële genomen. Uitbreiding van het onderzoek naar een diverse collectie en nog eens 24 volledige genomen suggereert dat verzwakking en antiterminatie waarschijnlijk wordt gebruikt in de meeste genomen, met de mogelijke uitzondering van M. tuberculose, als een vorm van regulering.

Het standaard transcriptieterminatiemechanisme kwam waarschijnlijk vroeg in de evolutie van bacteriën en regulatie door verzwakking en antiterminatie ontstond hoogstwaarschijnlijk door bestaande terminators en het transcriptieterminatiemechanisme te coöpteren. Hoe en wanneer verzwakking en antiterminatie zich hebben ontwikkeld in individuele genomen en taxa en hoe dit mechanisme is ontstaan ​​in specifieke operons en biochemische systemen, is een vraag die nu verder kan worden geanalyseerd en onderwerp is van toekomstig werk.

Deze studie stelt ons ook in staat om sterke voorspellingen te doen voor specifieke gevallen van verzwakking en antiterminatieregulering. Eerder hebben Merino et al. [14] publiceerde een hoofdstuk in TITLE over orthologe genen van genen waarvan bekend is dat ze worden gereguleerd door verzwakking en antiterminatie en vond een aanzienlijk aantal vermeende verzwakkers. These were reported also on a web site (http://cmgm.stanford.edu/

merino). The results of our research reported here confirm most of those predictions. In addition, as shown in this paper, since the conservation of attenuation and antitermination regulation across a taxa is weak, looking at orthologous genes in other genomes will miss many potential attenuators. This report greatly extends the predictions of attenuation and antitermination. These predictions can be very useful in directing future research. As proof of point, one such prediction made by our study was for attenuation regulation in the gene ctrA (pyrG) in B. subtilis. In the course of our study a recent report confirmed this prediction [23].

This research also enables a better understanding of the evolution and distribution of attenuation and antitermination regulation. Such predictions can be very beneficial in directing research into operon regulation, assisting in predicting gene function, understanding the evolution of regulation in general and heightening our understanding of regulons.


3 METHODS

3.1 Strains and growth conditions

All mutants described in this study were constructed using wild-type Halothiobacillus neapolitanus (Parker) Kelly and Wood (ATCC® 23641™) purchased from ATCC. Cultures were grown in ATCC® Medium 290: S-6 medium for Thiobacilli (Hutchinson et al., 1965 ) and incubated at 30°C, while shaken at 130 RPM in air supplemented with 5% CO2. Strains were preserved frozen at −80°C in 10% DMSO.

3.2 Construct designs and cloning

All constructs were generated using Gibson Assembly and verified by sequencing. Fragments for assembly were synthesized by PCR or ordered as a gBlock (IDT). Constructs contained flanking DNA that ranged from 750 to 1,100 bp in length upstream and downstream of the targeted insertion site to promote homologous recombination into target genomic loci. Cloning of plasmids was performed in chemically competent E coli Top10 or Stellar cells (Takara Bio).

3.3 Transformation in H. neapolitanus

Competent cells of H. neapolitanus were generated by growing 1 L of log culture in 2.8 L baffled flasks. Cultures were harvested by centrifugation at 3,000G for 45 min. Cell pellets were resuspended and washed twice with 0.5 volumes of ice-cold Millipore water. The resulting pellet was resuspended in 1 × 10 –3 volumes (1 ml) of ice-cold Millipore water. These competent cells were used immediately or frozen at −80°C for future use. Frozen competent cells were thawed on ice for 4 hr or overnight at 4°C. Competent cells were mixed with 5 µl plasmid DNA (1.5–5 µg) and incubated on ice for 5 min. This mixture was then transferred to a tube containing 5 ml of ice-cold S6 medium without antibiotics and incubated on ice for 5 min. Cells were then incubated for 16–36 hr at 30°C, while shaken at 130 RPM in air supplemented with 5% CO2. Transformants were selected by plating on selective S6 medium with antibiotics. Colonies were restreaked. Restreaked colonies were verified for mutation by PCR.

3.4 Native fluorescent fusions

For the native CbbS fluorescent fusion, the sequences encoding the fluorescent protein mTurquoise (mTq) were attached to the 3ʹ region of the native cbbS coding sequence, separated by a GSGSGS linker. A kanamycin resistance cassette was inserted immediately downstream of the cbbS coding sequence. The mutant was selected by plating on S6 agar plates supplemented with 50 µg/ml of kanamycin. The CbbS-mTQ fusion was verified by PCR.

3.5 Single gene deletions of mcdA en mcdB

mcdA (Hn0912) and mcdB (Hn0911) are the second and third genes in their operon. The deletion construct of mcdA (Hn0912) was created by replacing the mcdA coding sequence with a spectinomycin resistance cassette. The promoter upstream of Hn0913 was duplicated and inserted downstream of the antibiotic cassette to minimize disruption of downstream genes. The deletion construct of mcdB was created by removing mcdB (Hn0911), along with the two upstream genes (Hn0913 and Hn0912). These genes were replaced with a spectinomycin resistance cassette, followed by the promoter upstream of Hn0913 and the codon-optimized genes Hn0913 and Hn0912. This allowed for a clean deletion of the mcdB coding sequence. Mutants were selected by plating on S6 agar plates supplemented with 50 µg/ml of spectinomycin. The mutations were verified by PCR.

3.6 Exogenous expression of mNG-McdB

The sequence encoding the fluorescent protein mNeonGreen (mNG) was attached to the 5ʹ region of the mcdB coding sequence, separated by a GSGSGS linker. The gene was codon-optimized, placed under the expression of a Ptrc promoter, and inserted into a neutral site, located between genes Hn0933 and Hn0934. Mutants were selected by plating on S6 agar plates supplemented with 25 µg/ml of chloramphenicol. The insertion was verified by PCR.

Exogenous expression of mNG-McdB was not induced. All images obtained resulted from leaky expression of the Ptrc promotor. Exogenous expression images of mNG-McdB were compared back to empty vector control, which showed no fluorescence signal.

3.7 Nucleoid staining

Cells were harvested by centrifugation at 5,000G for 5 min. Following centrifugation, the cells were washed in PBS. The resulting cell pellet was resuspended in 50 µl PBS and stained with DAPI at a final concentration of 25 µM for 5–10 min immediately prior to imaging.

3.8 Ciprofloxacin and cephalexin treatments

Cells were collected at an OD of 0.05–0.1 and treated with 50 µM ciprofloxacin or with 8 µM cephalexin for 24 hr. Cells were then stained with 2 µg/ml of DAPI for 15 min and imaged.

3.9 Fluorescence imaging

All live-cell microscopy was performed using exponentially growing cells. Three microliters of cells were dropped onto a square of 2% agarose + S6 pad and imaged on a glass-bottom dish (MatTek Life Sciences). All fluorescence and phase contrast imaging were performed using a Nikon Ti2-E motorized inverted microscope controlled by NIS Elements software with a SOLA 365 LED light source, a 100X Objective lens (Oil CFI Plan Apochromat DM Lambda Series for Phase Contrast), and a Photometrics Prime 95B Back-illuminated sCMOS camera or a Hamamatsu Orca Flash 4.0 LT + sCMOS camera. mNG-McdB was imaged using a “YFP” filter set (C-FL YFP, Hard Coat, High Signal-to-Noise, Zero Shift, Excitation: 500/20nm [490-510 nm], Emission: 535/30 nm [520-550 nm], Dichroic Mirror: 515 nm). CbbS-mTQ labeled carboxysomes were imaged using a “CFP” filter set (C-FL CFP, Hard Coat, High Signal-to-Noise, Zero Shift, Excitation: 436/20 nm [426-446 nm], Emission: 480/40 nm [460-500 nm], Dichroic Mirror: 455 nm). DAPI fluorescence was imaged using a standard “DAPI” filter set (C-FL DAPI, Hard Coat, High Signal-to-Noise, Zero Shift, Excitation: 350/50 nm [325-375 nm], Emission: 460/50 nm [435-485 nm], Dichroic Mirror: 400 nm). All videos were taken at one frame per minute for a duration of 15 min.

3.10 Transmission electron microscopy

Log cultures of H. neapolitanus were pelleted and fixed overnight at 4°C in 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M Sorensen's buffer (pH 7.4). After several washes in 0.1 M Sorensen's buffer, cells were post-fixed overnight at 4°C in 1% osmium tetroxide in 0.1 M Sorensen's buffer. Cells were washed until the solution became clear. Cells were then immobilized in 1% agarose and sliced thinly into 0.5 mm slices. Slices were dehydrated in an increasing series of ethanol or acetone (30%–100%) washes for 10 min each. Slices were infiltrated with Embed812 resin (25% increments for 1–16 hr each at room temperature). A final incubation in full strength resin was performed at room temperature under vacuum. Cells were then embedded in blocks, incubated under vacuum overnight, and transferred to a 60°C oven to polymerize for 1–2 days. Thin sections of approximately 50 nm were obtained by a Leica UC7 Ultramicrotome. Sections were post-stained with 7% uranyl acetate for 10 min, Reynold's lead citrate for 5 min, and visualized on a JEOL 1400-plus transmission electron microscope equipped with an XR401 AMT sCMOS camera.

3.11 Bacterial two-hybrid analysis

N-terminal T18 and T25 fusions of McdA and McdB were constructed using plasmids pKT25, pKNT25, pUT18C, and pUT18, sequence-verified, and co-transformed into E coli BTH101 (Karimova et al., 1998 ). Several colonies of T18/T25 cotransformants were isolated and grown in LB medium with 100 μg/ml of ampicillin, 50 μg/ml of kanamycin, and 0.5 mM IPTG overnight at 30°C, while shaking at 225 RPM. Overnight cultures were spotted on indicator Xgal plates supplemented with 100 μg/ml of ampicillin, 50 μg/ml of kanamycin and 0.5 mM IPTG. Plates were incubated at 30°C up to 48 hr before imaging.

3.12 α-McdAB homolog search and neighborhood analysis

Identification of all α-carboxysome containing proteobacteria within the NCBI and JGI databases was performed via BlastP using the α-carboxysome components CsoS2, CsoS4A, or CsoS4B as queries. Neighborhood analyses for McdA- and McdB-like sequences were then carried out within these resulting genomes by manually searching 4,000 bp upstream and downstream of the cso operon. Multiple sequence alignment for identified putative McdA proteins was performed using MAFFT 1.3.7 under the G-INS-I algorithm (Katoh & Standley, 2013 ), whereas the E-INS-I algorithm was used for McdB proteins due to long gaps caused by intrinsic disorder. Subsequent identification of McdA- and McdB-like sequences away from the cso operon was performed via BlastP using highly conserved regions/features identified from the multiple sequence alignments.

3.13 α-McdB sequence analysis

Coiled-coil predictions for α-McdB proteins were performed using DeepCoil (Ludwiczak et al., 2019 ). α-McdB protein disorder predictions were conducted using PONDR with the VL-XT algorithm (Li et al., 1999 Romero et al., 1997 , 2001 ). Analysis of α-McdB hydrophobicity was performed using ProtScale using the Kyte and Doolittle scale (Gasteiger et al., 2005 Kyte & Doolittle, 1982 ).

3.14 Phylogenetic inference

Ortholog sequences for H. neapolitanus CbbL (Hneap_0922), CbbS (Hneap_0921), CsoS3 (Hneap_0919), CsoS4A (Hneap_0918), and CsoS4B (Hneap_0917) were obtained via BlastP for each proteobacterium and cyanobacterium. Multiple sequence alignments for each protein sequence were performed using MAFFT 1.3.7 (Katoh & Standley, 2013 ) under the G-INS-I algorithm and BLOSUM62 scoring matrix. The five resulting alignments were then concatenated into one alignment using Geneious 11.1.5 (https://www.geneious.com). Regions of low conservation within the resulting alignment were removed using gBlocks 0.91 b (Castresana, 2000 Talavera & Castresana, 2007 ). A phylogenetic tree was then estimated with maximum likelihood analyses using RAxML 8.2.11 (Stamatakis, 2014 ) under the LG + Gamma scoring model of amino acid substitution. Bootstrap values were calculated from 500 replicates.

3.15 Expression and purification of McdB homologs

All McdB proteins were expressed with an N-terminal His-SUMO tag off a pET11b plasmid. The expression plasmids were transformed into competent BL21-AI cells. Expression cultures were grown in 2 L of LB + carbenicillin (100 µg/ml) at 37°C to an OD600 of 0.6. Cultures were then induced with final concentrations of IPTG at 1 mM and L-arabinose at 0.2% (w/v) and allowed to grow for 4 hr at 37°C. Cultures were pelleted and resuspended in 80 ml of lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 300 mM KCl, 5 mM 2-Mercaptoethanol (BME), 0.05 mg/ml of lysozyme, 0.05 µl/ml of Benzonase, protease inhibitor) on ice. Cells were lysed using a tip sonicator at 50% power with 10s on/20s off cycles for 6 min at 4°C. Lysates were spun down at 35,000G at 4°C, and supernatants loaded onto 5 ml HP HIS-TRAP columns (GE Healthcare Life Sciences) equilibrated in buffer A (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 300 mM KCl, 5 mM BME, 20 mM imidazole). Proteins were eluted using a 5%–100% gradient of buffer B (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 300 mM KCl, 5 mM BME, 500 mM imidazole) via an AKTA pure system (GE Healthcare Life Sciences). Peak fractions were pooled and diluted in buffer A to a final imidazole concentration < 100 mM. Purified His-Ulp1 (300 µl) was added and reactions were incubated at 30°C to cleave the His-SUMO tag. Reactions were then passed over 5 ml HP HIS-TRAP columns to remove both the His-SUMO tag and His-Ulp1 enzyme. Flow-through was concentrated and passed over an SEC column (HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare Life Sciences) equilibrated in buffer C (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 150 mM KCl, 5 mM BME, 10% glycerol) using an AKTA pure system. Peak fractions were pooled, flash-frozen with liquid N2, and stored at −80°C.

3.16 Microscopy of McdB phase separation in vitro

Images were taken of 450 µM McdB in a buffer consisting of 20 mM HEPES (pH 7.0) and 100 mM KCl, with or without the addition of either 15% (w/v) PEG-8000 or Ficoll-400 as indicated. All samples were left to incubate for 2 hr prior to imaging at room temperature. Imaging was performed using 16 well CultureWells (Grace BioLabs). Wells were passivated by overnight incubation in 5% (w/v) Pluronic acid (Thermo-Fischer), and washed thoroughly with the corresponding buffer prior to use. Imaging of McdB droplet formation was performed using a Nikon Ti2-E motorized inverted microscope (60 × DIC objective and DIC analyzer cube) with a Transmitted LED Lamp house and a Photometrics Prime 95B Back-illuminated sCMOS Camera. Image and video analyses were performed using Fiji v 1.0.

3.17 Size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC–MALS)

For each McdB homolog analyzed, 500 µl of the sample at 1.5 mg/ml was passed over an SEC column (Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences) at a flow rate of 0.15 ml/min in buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 150 mM KCl, 5 mM BME) at 4°C. Following SEC, the samples were analyzed using an A280 UV detector (AKTA pure GE Healthcare Life Sciences), the DAWN HELEOS-II MALS detector (Wyatt Technology), and the Optilab rEX refractive index detector (Wyatt Technology). The data were analyzed to calculate mass using ASTRA software (Wyatt Technology). Bovine serum albumin was used as the standard for calibration.