Informatie

SEREX serologische analyse van cDNA-expressiebibliotheek


Wat is serologische analyse van cDNA-expressiebibliotheek?
Ik heb dit artikel doorgenomen:
http://cancerimmunity.org/serex/introduction/
maar kon er niet echt uit komen. Kan iemand mij dit op een eenvoudigere manier uitleggen?
(Ik heb de afgelopen 8 jaar geen biologie gestudeerd en nu ga ik er doorheen omdat ik het nodig heb voor mijn onderzoek. Dus als iemand het in eenvoudige taal kan beschrijven, zou het erg nuttig zijn)


Met deze methode wil je eiwitten op kankercellen identificeren die immunogeen zijn, zodat je ze kunt gebruiken om een ​​immuunrespons tegen de kankercellen te stimuleren.

Om dat te doen, extraheer je het volledige mRNA uit een kanker. Deze mRNA's vertegenwoordigen alle genen die deze kankers tot expressie brengen (die dan ook de immunogene eiwitten bevatten). Deze mRNA's worden gekloond in bacteriofagen (virussen die alleen bacteriën infecteren) en worden vervolgens gebruikt om bacteriën te infecteren. Tijdens deze infectie brengt het virus het eiwit tot expressie dat in zijn sequentie is gekloond en dat afkomstig is uit de kankercel. De infectie van de bacteriën leidt tot de vorming van plaques (gehelen) in de bacteriën die op het oppervlak van een kweekplaat groeien.

Vervolgens gebruik je het serum van kankerpatiënten op deze tot expressie gebrachte eiwitten om te zien of er antilichamen zijn die deze kankerantigenen kunnen herkennen (en zouden kunnen worden gebruikt om ze op te sporen en te markeren). Als er eiwitten zijn die alleen reageren op de sera van kankerpatiënten, maar niet op het controleren (om uit te sluiten) van aspecifieke reacties, dan worden deze eiwitten geïdentificeerd en kunnen ze worden gebruikt om antilichamen tegen dit specifieke kankertype te genereren. Het werkt zoals in de onderstaande afbeelding (uit dit artikel):


Serologische identificatie van TROP2 door recombinante cDNA-expressieklonering met behulp van sera van patiënten met oesofageaal plaveiselcelcarcinoom

We hebben serologische analyse van recombinante cDNA-expressiebibliotheken (SEREX) toegepast op gevallen van plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm (SCC) om tumorantigenen te identificeren. Een van de geïdentificeerde klonen was TROP2, die bekend staat als calciumsignaaltransducer. Om de klinische significantie van serum-anti-TROP2-antilichamen (s-TROP2-Abs) bij patiënten met slokdarm-SCC te evalueren, werd de aanwezigheid van s-TROP2-Abs geanalyseerd door Western-blotting met behulp van bacterieel tot expressie gebracht TROP2-eiwit. We ontdekten dat 23 van de 75 (31%) patiënten positief waren voor s-TROP2-Abs. Positiviteit in termen van s-TROP2-Abs toonde een significant verband met tumorgrootte maar niet met andere klinisch-pathologische kenmerken. De eiwitexpressieniveaus van TROP2 waren veel hoger in SCC-cellijnen van de slokdarm in vergelijking met die in normaal slokdarmslijmvlies en zijn onsterfelijk gemaakte cellen, hoewel de mRNA-expressieniveaus niet noodzakelijkerwijs verhoogd waren in kwaadaardige cellijnen en weefsels. Immunohistochemische studies toonden aan dat de expressie van TROP2-eiwit in SCC-monsters van de slokdarm merkbaar hoger was dan die gevonden in milde hyperplasie van slokdarmslijmvliezen. s-TROP2-Abs leek dus nuttig bij de diagnose van SCC en kan een kandidaat zijn voor serumtumormarkers. © 2004 Wiley-Liss, Inc.

Slokdarmcarcinoom vertegenwoordigt een van de meest kwaadaardige tumortypes. Ondanks verbeteringen in chirurgische technieken en adjuvante chemoradiotherapie voor slokdarmkanker, lijden veel patiënten aan snelle recidieven van de ziekte en hebben ze een slechte prognose. 1, 2 Het agressieve gedrag van deze tumor is in verband gebracht met systemische betrokkenheid bij de diagnose en de slechte prognose ervan is grotendeels toegeschreven aan een vertraging in de diagnose. 3 Hoewel is gemeld dat verschillende serummarkers klinisch bruikbaar zijn bij het detecteren van adenocarcinomen van de slokdarm, 4 , 5 , 6 zijn er slechts enkele serummarkers beschikbaar voor plaveiselcelcarcinomen (SCC) van de slokdarm. 2, 7 Zelfs deze serummarkers zijn echter beperkt in termen van het detecteren van vroege slokdarmkankers, met serum p53-antilichaam als een bekende uitzondering. 8 SCC van de slokdarm wordt over het algemeen geïnfiltreerd door T-lymfocyten en een cytotoxische T-cellijn met specificiteit voor autologe tumoren is verkregen uit mononucleaire cellen uit perifeer bloed. 9 Daarom zou immunotherapie een aantrekkelijk alternatief kunnen zijn voor de behandeling van oesofageale SCC. 10 Daartoe is de ontwikkeling van nieuwe serummarkers voor SCC in de slokdarm nodig, niet alleen voor de diagnose, maar ook voor toepassingen van immunotherapie met behulp van geïdentificeerde antigenen.

Sahin et al. 11 hebben een benadering geïntroduceerd die breed toepasbaar is voor de analyse van de humorale immuunrespons op kanker bij mensen. Deze methode, SEREX genaamd (serologische identificatie van antigenen door recombinante cDNA-expressieklonering), omvat de immunoscreening van cDNA-bibliotheken die zijn bereid uit tumorspecimens met autologe of allogene sera. SEREX-analyse van veel verschillende menselijke tumor-cDNA-bibliotheken heeft een reeks tumorantigenen blootgelegd. 11 , 12 Enkele van de door SEREX gedefinieerde antigenen (bijv., NY-ESO-1) 13 werden herkend met tumorspecifieke cytotoxische T-lymfocyten (CTL) klonen, met andere (bijv., MAGE-1 en tyrosinase) 11 oorspronkelijk gedefinieerd als CTL-herkende peptiden. Deze onderzoeken geven aan dat sommige van de door SEREX gedetecteerde tumorantigenen zowel cellulaire als humorale immuunresponsen kunnen opwekken.

We hebben onlangs de SEREX-methodologie toegepast op SCC van de slokdarm om immunogene eiwitten bij menselijke slokdarmkanker te definiëren. We hebben waargenomen dat TROP2 immunogeen was bij patiënten met SCC in de slokdarm. Dit geeft ook aan dat antilichamen tegen TROP2 nuttig kunnen zijn voor de diagnose van oesofageale SCC.


Abstract

De ontwikkeling van kanker bij de mens is een zeer complex proces en kan worden beschouwd als het resultaat van verschillende gecombineerde gebeurtenissen, zoals genetische veranderingen, verstoring van signaaltransductie of falen van immunologische surveillance. Kankergerelateerde databases zijn meestal gericht op specifieke onderzoeksgebieden, bijvoorbeeld kankergenetica of kankerimmunologie, terwijl de complexiteit van het ontstaan ​​van kanker een geïntegreerde analyse van heterogene gegevens uit verschillende bronnen vereist. Hier presenteren we de kankergerelateerde eiwitdatabase (CAP), een nieuw analysesysteem voor kankergerelateerde gegevens. CAP integreert gegevens uit meerdere externe databases, vult deze gegevens aan met functionele annotaties en biedt tools voor statistische analyse van deze gegevens. We hebben CAP gebruikt om genen te analyseren waarvan is vastgesteld dat ze een auto-immuunrespons bij kanker veroorzaken. In het bijzonder hebben we het verband onderzocht tussen de auto-immuunrespons, mutaties en overexpressie van deze genen. Onze voorlopige resultaten suggereren dat mutaties geen significante bijdrage leveren aan het verhogen van een antilichaamrespons tegen tumorantigenen, terwijl overexpressie een belangrijkere rol lijkt te spelen. Hierbij laten we zien hoe verschillende soorten data succesvol kunnen worden geïntegreerd en geanalyseerd, wat interessante resultaten oplevert. Aangezien de hoeveelheid beschikbare gegevens snel groeit, zal een gecombineerde analyse een belangrijke rol spelen bij het onderzoeken van de genetische en immunologische basis van kanker. CAP is gratis beschikbaar op de volgende website: http://www.bioinf.uni-sb.de/CAP/.

Recente ontwikkelingen in high-throughput-technieken hebben geleid tot een snelle toename van de hoeveelheid experimentele gegevens met betrekking tot kanker en tot de ontwikkeling van verschillende databases voor deze gegevens. Voorbeelden van kankergerelateerde databases zijn de Mitelman-database voor chromosomale afwijkingen (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitleman), de SEREX-database (serologische analyse van recombinante cDNA-expressiebibliotheken) voor B-celreacties (1) , en het Cancer GeneticsWeb (CGW) met algemene informatie en literatuurverwijzingen voor met kanker geassocieerde genen. Bovendien zijn uitgebreide genomische en proteomische gegevens beschikbaar uit databases zoals SWISS-PROT (2), NCBI en Locus Link (3).

Het combineren van deze enorme hoeveelheid gegevens is een uitdaging, en het is de sleutel tot het onthullen van de complexe mechanismen van het ontstaan ​​en de ontwikkeling van kanker. Een belangrijk aandachtspunt bij het uitvoeren van een dekkende analyse zijn de verschillen in gegevensformaten (syntactische verschillen) en verschillen in de betekenis van de gegevens (semantische verschillen) (4) in deze databases. Die verschillen moeten worden opgelost om een ​​uniform beeld van de gegevens te creëren.

Hier presenteren we de kankergerelateerde eiwitdatabase (CAP), een nieuw geïntegreerd database- en analysesysteem, ontworpen om heterogene gegevens uit verschillende bronnen te integreren. CAP annoteert deze gegevens met voorspellingen uit de bio-informatica en faciliteert statistische analyses. CAP is geïmplementeerd als een relationeel databasesysteem met een webgebaseerde interface voor draagbare en gebruiksvriendelijke toegang. Het integreert gegevens uit de SEREX-database, CGW, NCBI en SWISS-PROT. Deze gegevens kunnen vervolgens verder worden geannoteerd in CAP. Momenteel omvatten toegevoegde annotaties de voorspelling van de eiwitfunctie (ProtFun refs 5-6), aanwezigheid van MHC-epitopen (SVMHC ref 7) en subcellulaire locatie (PSORT ref 8 en SubLoc ref 9).

CAP biedt aanpasbare formulieren voor het importeren van gebruikersspecifieke experimentele gegevens. Het maakt het ook mogelijk om gegevens te groeperen in probleemspecifieke datasets. De gegevens kunnen worden bekeken, bewerkt en geannoteerd via een gebruiksvriendelijke webgebaseerde interface. Verder biedt CAP tools voor de statistische analyse van door de gebruiker gedefinieerde datasets. De resultaten van deze analyses kunnen worden geëxporteerd als tabellen voor verder gebruik of worden weergegeven als grafieken.

Als eerste toepassing hebben we een reeks kankergerelateerde genen en genproducten onderzocht die een auto-immuunrespons veroorzaken. We hebben het verband tussen mutaties en immunogeniciteit bestudeerd. We analyseerden gegevens verkregen uit SEREX-experimenten voor wijzigingen en mutaties door deze te correleren met gegevens van Cancer GeneticsWeb. Van de 723 van SEREX en de 606 genen in CGW, vonden we slechts 17 genen die in beide datasets voorkomen. Zeven van deze genen waren gerelateerd aan hetzelfde kankertype. Van deze zeven is van slechts twee (TP53 en GSTT1) bekend dat ze specifieke mutaties of polymorfismen dragen, terwijl de overige vijf tot overexpressie worden gebracht in de respectievelijke tumoren.

Een tweede analyse correleert alle kankergerelateerde genen in CAP, gevonden door SEREX-experimenten, met expressiegegevens van het NCI60 microarray-project (10). We hebben gekeken naar alle genen die een dubbele of hogere overexpressie vertonen. In totaal komen 319 genen voor in zowel CAP als de NCI60-dataset. 277 van deze genen werden tot overexpressie gebracht in ten minste één van de NCI60-cellijnen, terwijl 69 tot overexpressie werden gebracht in ten minste 10% van de cellijnen. Voor 13 tot overexpressie gebrachte genen, in ten minste 3 tumortype-specifieke cellijnen, vonden we overeenstemming tussen het kankertype van het SEREX-experiment en het kankertype geassocieerd met de respectieve NCI60-cellijn.

In dit rapport beschrijven we de algemene opzet van CAP en geven we een kort overzicht van de mogelijkheden ervan. Verder beschrijven en bespreken we de resultaten van onze analyse in meer detail. CAP is toegankelijk via de volgende website: http://www.bioinf.uni-sb.de/CAP/.


RESULTATEN EN DISCUSSIE

SK-MEL-37 drukt een brede reeks CT-antigenen uit.

Een panel van 12 melanoomcellijnen werd geëvalueerd op bekende CT-antigeenexpressie door middel van RT-PCR. Hiervan bleek SK-MEL-37 het breedste patroon van CT-expressie te hebben, positief voor MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, BAGE, NY-ESO-1, SSX1, SSX2, SSX4, SSX5 en SCP1 (afb. 1).

RT-PCR-analyse van CT-antigeenexpressie in de gevestigde melanoomcellijn SK-MEL-37. SK-MEL-37 vertoonde expressie van alle geteste CT-producten, d.w.z. NY-ESO-1, MAGE1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, BAGE, SSX1, SSX2, SSX4, SSX5 en SCP1. De kleine band met lagere molecuulmassa in SSX4 vertegenwoordigt een alternatief gesplitste variant (18).

SEREX-analyse van SK-MEL-37 cDNA-bibliotheek met NW38-serum.

Er werd een expressie-cDNA-bibliotheek van 2,3 x 107 primaire klonen tot stand gebracht en immunoscreening werd uitgevoerd door geabsorbeerd NW38-serum te gebruiken in een verdunning van 1:2000. Eenenzestig positieve klonen werden geïdentificeerd na screening van 1,5 x 105 klonen. Deze 61 klonen werden gezuiverd, uitgesneden in vitroen omgezet in pBK-CMV-plasmidevormen. cDNA-inserts werden geanalyseerd en gegroepeerd op basis van een gecombineerde strategie van restrictiemapping, DNA-sequencing en DNA-DNA-hybridisatie, en de resultaten zijn samengevat in Tabel 1. Exclusief de diverse groep, die bestond uit 10 klonen afgeleid van 9 verschillende genen, 4 bekend en 5 onbekend, de overige 51 klonen behoorden tot 4 verschillende groepen tumorproducten: de KOC familie, de MAGE-familie, de NY-ESO-1-familie en een nieuw CT-antigeengen, aangeduid als CT7. De isolatie van vier CT-antigenen - MAGE-4a, NY-ESO-1, LAGE-1 en CT7 - na screening van slechts 1,5 x 105 cDNA-klonen vertegenwoordigt een frequentie die tot op heden niet is waargenomen in SEREX-analyses. Een parallelle screening van NW38-serum tegen een testiculaire bibliotheek leverde bijvoorbeeld slechts twee MAGE-4a-klonen op na screening van 5,0 x 105 klonen, maar geen andere CT-coderende klonen. Dit resultaat ondersteunt onze aanname dat melanoomcellijnen zoals SK-MEL-37 een betere bron kunnen zijn dan testis voor het identificeren van CT-cDNA-klonen.

SEREX-gedefinieerde genen geïdentificeerd door allogene screening van SK-MEL-37 cDNA-expressiebibliotheek

De KOC-genfamilie.

De eerste en verreweg de overheersende groep, bestaande uit 33 klonen, was verwant aan KOC (KH-domein dat een gen bevat dat tot overexpressie wordt gebracht in kanker) gen, een gen waarvan is aangetoond dat het tot overexpressie wordt gebracht bij alvleesklierkanker en toegewezen aan chromosoom 7p11.5 (24). Van de 33 klonen waren er 2 afkomstig van de KOC gen, terwijl de andere 31 klonen waren afgeleid van twee voorheen ongeïdentificeerde nauw verwante genen, wat aangeeft dat KOC behoort tot een genenfamilie met ten minste drie tot expressie gebrachte leden. De KOC gen bevat een ORF van 1740 bp, dat codeert voor een eiwit van 579 aa (mR 65 kDa). De twee andere homologe genen coderen voor eiwitten die enigszins verschillen in grootte, met 60-70% aminozuurhomologie tussen de drie genproducten. Alternatieve splitsingsvormen werden waargenomen in een van de twee KOC-achtige genen, maar niet in de andere. In de originele studie van Müller-Pillasch et al. (24) toonde Northern-blot-analyse aan dat de KOC-expressie beperkt was tot placenta en niet werd gevonden in hart, hersenen, longen, lever, nieren, pancreas of skeletspieren. Door RT-PCR-analyse hebben we echter significante niveaus van KOC-mRNA-expressie waargenomen in testis en in niet-testiculaire normale weefsels, waaronder lever, colon, nier en hersenen. In dit opzicht lijkt het expressiepatroon van KOC op het niet-gerelateerde cytotoxische T-lymfocyt-gedefinieerde antigeen PRAME (25), d.w.z. beperkte expressie door Northern-blotting en alomtegenwoordige expressie door de meer gevoelige RT-PCR-test. Een gedetailleerde beschrijving van deze bevindingen met betrekking tot: KOC familiegenen zullen elders worden gerapporteerd.

De MAGE Familie.

De tweede groep bestaande uit 11 klonen was afgeleid van genen die behoren tot de MAGE familie. Sequentiebepaling van vijf representatieve klonen onthulde overlappende sequenties, allemaal afgeleid van de MAGE-4a gen (ref. 14, GenBank toegangsnummer U10687). De andere zes klonen vertoonden positieve dot-blot-hybridisatie met een MAGE-4a-probe afgeleid van de 5'-sequenties, wat aangeeft dat ze behoorden tot de MAGE familie (gegevens niet getoond). Restrictiemapping suggereerde verder dat deze klonen waarschijnlijk allemaal waren afgeleid van MAGE-4a, omdat ze allemaal hetzelfde deelden EcoRI-plaats, die aanwezig is aan het 3'-uiteinde van het MAGE-4a-cDNA (nucleotidepositie 10932, GenBank-toegangsnummer U10687).

Het is van belang dat MAGE-4a, maar niet andere MAGE-genen, in de huidige studie werden geïsoleerd. Hoewel MAGE-1 is geïsoleerd door SEREX (2) en NW38-serum reageert met recombinant MAGE-1-eiwit in vitro (19), lijkt MAGE-4a vaker te worden gedetecteerd door SEREX. MAGE-4a is geïsoleerd uit een bibliotheek van eierstokkanker door autologe screening (3) en ook uit testiculaire en SK-MEL-37-bibliotheken met NW38-serum. MAGE-1 daarentegen is slechts één keer geïsoleerd (2) en de producten van andere MAGE-familiegenen zijn niet gedetecteerd door SEREX. Hoewel men kan speculeren dat MAGE-4a-mRNA overvloediger aanwezig kan zijn dan andere genen van de MAGE-familie, maakt het feit dat MAGE-4a is geïsoleerd uit cDNA-bibliotheken die afkomstig zijn van verschillende weefselbronnen - testis, eierstokkanker en een melanoomcellijn - dit eenvoudige verklaring onwaarschijnlijk. Het is daarom mogelijk dat MAGE-4a significant meer immunogeen is voor het humorale immuunsysteem dan andere MAGE-leden.

De NY-ESO-1-familie.

De derde groep bestond uit vijf klonen van de NY-ESO-1 familie. Twee klonen waren identiek aan de NY-ESO-1 gen dat we eerder beschreven (5). De andere drie klonen waren afgeleid van een tweede gen van de NY-ESO-1 familie. Dit gen, dat 94% nucleotide- en 87% aminozuurhomologie deelt met NY-ESO-1, is eerder geïdentificeerd door Léthe et al. (26) door gebruik te maken van representatieve verschilanalyse die testiculair versus niet-testiculair mRNA vergelijkt en is aangeduid als: LAGE-1. Dit NY-ESO-1verwant gen is ook geïsoleerd door nucleotidehybridisatie met een NY-ESO-1-probe (niet-gepubliceerde gegevens).

Hoewel het LAGE-1-eiwit een sterke homologie deelt met NY-ESO-1, is er geen direct bewijs dat LAGE-1 immunogeen is bij tumordragende patiënten. Isolatie van LAGE-1 door SEREX in de huidige studie documenteert dat het LAGE-1-product, vergelijkbaar met NY-ESO-1, wordt herkend door het humorale immuunsysteem. Omdat NY-ESO-1 echter ook in deze screening werd geïdentificeerd, is het nog steeds mogelijk dat slechts één van de twee NY-ESO-1 genen primair verantwoordelijk was voor het opwekken van de antilichaamrespons bij patiënt NW38, en dat het andere gen werd geïsoleerd als gevolg van kruisreactiviteit van antilichamen.

De CT7 Gen.

De vierde groep bestaat uit twee klonen die zijn afgeleid van een nieuw gen en dit gen is aangeduid als CT7 (4).¶

Twee SEREX-reactieve CT7-klonen, MNW16b en MNW25c, werden geïdentificeerd. MNW25c bevatte een cDNA-insert van 2.184 bp, 219 bp langer dan MNW16b. Een ORF van 543 aa werd geïdentificeerd in MNW25c, dat zich uitstrekt tot het 5'-uiteinde van de gekloonde sequentie, wat aangeeft dat dit een gedeeltelijke cDNA-kloon is. Om volledige cDNA-sequenties te verkrijgen en om verwante genleden te zoeken, werd een menselijke testiculaire cDNA-bibliotheek gescreend met sondes afgeleid van MNW25c. Elf positieve klonen werden geïdentificeerd en sequentiegegevens van de zes langste klonen gaven aan dat ze allemaal afkomstig waren van hetzelfde gen. Het CT7-transcript van volledige lengte, met uitzondering van poly(A)-staart, bestaat uit 4.265 nt, dwz 286 bp van 5'-onvertaald gebied, 550 bp van 3'-onvertaald gebied en een coderend gebied van 3.429 bp (GenBank-toegangsnummer AF056334 ). Het voorspelde eiwit, 1142 residuen lang, heeft een voorspelde molecuulmassa van 123.872 Da.

DNA- en eiwitsequentiehomologieanalyse duidde op de sterkste homologie met MAGE familie genen, MAGE-10 in het bijzonder (13). Het gebied van homologie was echter strikt beperkt tot het ≈210 aa-stuk aan de carboxyluiteinden van deze twee genproducten, met name aminozuren 908-1115 van CT7 en 134-342 van MAGE-10 (GenBank-toegangsnummer P43363) . Ondanks de 56% aminozuurhomologie (75% inclusief conservatieve veranderingen) in dit gebied, werd er geen homologie 5' met deze sequentie geïdentificeerd, met het voorspelde CT7-eiwit (1.142 aa-residuen) veel groter dan het MAGE-10-eiwit (369 residuen) .

Een uniek kenmerk van CT7, in tegenstelling tot MAGE of andere bekende genen, zich in het 5'-gebied bevinden. Onderzoek van de nucleotide- en aminozuursequenties in dit gebied onthulde een opvallend repetitief patroon, zoals geïllustreerd in Fig. 2. De herhalingen, hoewel onnauwkeurig, lijken rijk te zijn aan serine-, proline-, glutamine- en leucineresiduen, met een bijna onveranderlijke ( P)QS(P)LQ(I)-kern. Het meest consistente repetitieve element bevindt zich in het midden van het molecuul, waar 10 bijna exacte herhalingen van 35 aa-residuen werden waargenomen. Over het algemeen omvat het repetitieve deel van dit molecuul ≈70% van de gehele sequentie, beginnend kort na het translatie-initiatiecodon (≈aminozuurpositie 15) en eindigend kort voor de MAGE- homologe regio. Een zeer repetitieve coderende structuur is eerder door ons gevonden in een gen dat codeert voor CDR34, een cerebellaire degeneratie-gerelateerd 34-kDa-eiwit dat we hebben geïsoleerd door antilichaamscreening van een cerebellaire bibliotheek, met serum van een patiënt met paraneoplastische cerebellaire degeneratie (27 ). Het CDR34-gen bevat een zeer repetitief element dat bestaat uit 34 onnauwkeurige tandemherhalingen van 6 aa. CT7 en CDR34 zijn structureel niet verwant, en de waarneming dat ze beide tandem-herhalingen bevatten en beide werden geïsoleerd door middel van antilichaamscreening, suggereert dat moleculen met deze tandem-herhalingsfunctie in hoge mate immunogeen kunnen zijn voor het humorale immuunsysteem.

Voorspelde aminozuursequentie van CT7, die de repetitieve structuur illustreert die wordt gecodeerd door de 5'-sequenties van dit gen. De sequentie heeft een aantal herhalende elementen, waarvan de meeste een (P)QS(P)LQ(I)-kernsequentie bevatten. Het meest geconserveerde herhalende element bestond uit een 35-aa-eenheid die 10 keer achter elkaar werd herhaald (aminozuurposities 125-475). De carboxyl-eindsequentie van 208 aa (908-1115), die homoloog is aan het MAGE-10-gen, is onderstreept.

Beperkt CT7 Expressie in normale en tumorweefsels.

RT-PCR-assays werden gebruikt om CT7-mRNA-expressie in normale weefsels, tumorcellijnen en tumormonsters te evalueren. Van 14 geteste normale weefsels werd alleen sterke expressie in de testis vastgesteld en werd geen expressie gedetecteerd in colon, hersenen, bijnier, long, borst, pancreas, prostaat, thymus of baarmoeder. Sporenhoeveelheden van RT-PCR-producten op met ethidiumbromide gekleurde gels werden waargenomen in lever, nier, placenta en foetale hersenen (Fig. 3). Foetale hersenen vertoonden drie transcripten van verschillende grootte, de twee extra banden met een lager molecuulgewicht bleken echter niet-specifieke amplificatieproducten te zijn. Het niveau van mRNA-expressie in somatische weefsels, geschat op basis van de intensiteit van signalen, was minstens 20 tot 50 keer lager dan dat in de testis.

RT-PCR-analyse van CT7-expressie in normale weefsels. Expressie op hoog niveau wordt alleen in de testis gezien. Sporen van PCR-producten werden gedetecteerd in de nieren, lever, placenta en foetale hersenen. Twee extra banden met een lagere moleculaire massa werden ook gezien in foetale hersenen door sequencing, deze producten bleken niet-specifieke amplificatieproducten te zijn.

Van de 12 onderzochte melanoomcellijnen vertoonden 7 sterke expressie (NW38, SK-MEL-13, 19, 23, 30, 37, 179), één vertoonde zwakke expressie (SK-MEL-33) en 4 waren negatief (MZ2- MEL-3.1, MZ2-MEL-2.2, SK-MEL-29, SK-MEL-31).

Tabel 2 vat het mRNA-expressiepatroon van CT7 in kwaadaardige tumoren van verschillende typen samen. Van 70 geteste specimens werden CT7-transcripten gedetecteerd in 26 van de gevallen (37%). Vergelijkbaar met onze ervaring met andere CT-antigenen (ref. 28 en niet-gepubliceerde resultaten), varieerde het niveau van transcript aanzienlijk tussen positieve monsters, met expressie op laag niveau (signaalintensiteiten geschat <1/10 van de sterkere expressoren met behulp van twee verschillende primerparen) gezien in 12 van de 26 positieve monsters: 2 van de 7 positieve melanomen, 1 van de 3 borstkankers, 1 van de 3 longkankers, 3 van de 5 hoofd-halskankers, 1 van de 4 transitionele celcarcinomen, 1 van 1 leiomyosarcoom, 2 van 2 synoviale sarcomen en 1 op 1 darmkanker. De totale frequentie van tumoren met sterke CT7-expressie is dus 20% (14/70) in deze groep.

CT7 mRNA-expressie in verschillende menselijke tumoren door RT-PCR

Southern Blot-analyse van CT7.

Genomische Southern-blot-analyse met CT7-probe toonde twee tot vier banden in EcoRI, en hihidIII verteert, wat de mogelijkheid van twee genen suggereert (Fig. 4). Sequentiebepaling van zes testiculaire cDNA-klonen toonde echter identieke sequenties in overlappende gebieden, met de enige variatie op nucleotidepositie 360 ​​(GenBank toegangsnummer AF056334). Van vier testiculaire klonen die dit gebied bevatten, was deze positie adenine in twee klonen en guanine in twee andere klonen. Dit verschil, dat hoogstwaarschijnlijk allelisch polymorfisme vertegenwoordigt, zou ook resulteren in een overeenkomstige variatie in de aminozuursequentie, d.w.z. tyrosine (TAT) versus cysteïne (TGT).

Southern blot-analyse van CT7 gen. Genomisch DNA geëxtraheerd uit normale weefsels van twee individuen werd verteerd met EcoRI en hihidIII en geanalyseerd met een CT7-probe afgeleid van de MAGE-niet-gerelateerde 5'-sequenties. Twee banden van vergelijkbare intensiteit werden gezien in hihidIII verteert, terwijl EcoRI-digesten vertoonden één sterke band en drie zwakkere banden, wat aangeeft dat CT7 niet tot een multigenfamilie behoort.

CT7 en MAGE-C1.

Met behulp van representatieve verschilanalyse om genen te identificeren die selectief tot expressie worden gebracht in testis en melanoom, Lucas et al. (29) onlangs een gen gedefinieerd met >99% identiteit met CT7 in coderende sequenties, die ze aanduiden als MAGE-C1. CT7-sequenties verschilden van MAGE-C1 doordat ze 30 extra nucleotiden in het 5'-niet-vertaalde gebied hadden, en ook in 14 verschillen in enkelvoudige nucleotiden in het coderende gebied, wat resulteerde in 11 overeenkomstige aminozuurverschillen. Tien van 11 verschillende aminozuurresiduen geclusterd in 2 van 10 35-aa kern herhalende eenheden, en CT7 en MAGE-C1 vertegenwoordigen waarschijnlijk verschillende allelen van hetzelfde gen. MAGE-C1 is toegewezen aan chromosoom Xq26 (29) en voegt zich daarom bij de andere CT-coderende genen die ook zijn toegewezen aan het X-chromosoom: MAGE, GAGE, SSX en NY-ESO-1.


Discussie

SEREX-screening is uitgevoerd bij slokdarmcarcinomen door Chen et al. [12] en Turecic et al. [26], die met succes NY-ESO-I en NY-ESO-II identificeerde. In de huidige studie hebben we ECSA-1, -2 en -3 geïdentificeerd als nieuwe SEREX-antigenen van oesofageale SCC. Recente studies hebben aangetoond dat serum-auto-antilichamen zoals p53 en AFP bruikbare tumormarkers zijn [13-15, 27]. s-ECSA-Ab-spiegels onderzocht met ELISA waren hoger dan de afkapwaarde bij 15 - 21% van de patiënten met SCC in de slokdarm (Tabel 3). Hoewel dit percentage niet hoger was dan het positieve percentage van conventionele tumormarkers zoals CYFRA 21-1, CEA en SCC-Ag (24 - 39%) [14], waren de positieve percentages van s-ECSA-Abs bij gezonde donoren minder. dan 2%, wat wijst op zeer lage fout-positieve percentages. Op basis van de aminozuursequenties die bewaard zijn gebleven bij leden van de ECSA-familie, werden drie peptiden gesynthetiseerd en gebruikt voor ELISA. Een van deze peptiden, HCA-81/97, werd gedetecteerd met een sensitiviteit van 22% en een specificiteit van 100%. Een dergelijke hoge specificiteit suggereert het nut van s-ECSA-Abs bij de diagnose van SCC van de slokdarm.

Totdat we drie ECSA-familieleden identificeerden, was slechts één lid, HCA25a, gemeld, maar zonder gedetailleerde informatie. Er zijn echter onlangs drie HCA25a-achtige genen van de chimpansee geregistreerd in de NCBI-database. De ECSA/HCA25a-familie kan dus worden geconserveerd onder primaten. Naast ECSA-1, -2 en -3 werden drie leden, FAM119A, GOSR1 en BBS5, geïdentificeerd door middel van een homologieonderzoek (Figuur 6). We hebben deze familie aangewezen als de ECSA (e sofageaal C arcinoom S EREX een ntigen) familie, maar bevatte niet de HCA25a-familienaam omdat HCA25a blijkbaar niet gerelateerd was aan SCC van de slokdarm (Figuur 7).

De mRNA-expressieniveaus van ECSA-1, -2 en -3 en FAM119A in tumorweefsels waren vaak hoger dan die in normale weefsels (Figuur 7). Consistent toonde immunohistochemische analyse met behulp van een pan-ECSA-mAb aan dat de expressieniveaus van ECSA-eiwitten laag waren in normale weefsels maar hoog in SCC (Figuur 8). Dergelijke tumorspecifieke expressie suggereert dat deze ECSA-familieleden een cruciale rol kunnen spelen bij carcinogenese. Geen van de geïsoleerde ECSA-klonen (ECSA-1, -2 en -3) bevatte echter schijnbare startcodons (aanvullend bestand 1) en de geconserveerde sequentie werd vaak geïdentificeerd in de 3'-niet-vertaalde regio's van de familieleden (Figuur 6 ). Het is aannemelijk dat ze door alternatieve splicing onder bepaalde omstandigheden in tumorcellen tot expressie komen. De ontwikkeling van serum-auto-antilichamen tegen de geconserveerde sequentie van de ECSA-familie suggereert dat het geconserveerde domein in sommige leden van de ECSA-familie werd vertaald in eiwitten. Niettemin kan niet worden uitgesloten dat ECSA-RNA mogelijk geen effect uitoefent via zijn peptideproduct, maar in plaats daarvan kan werken als antisense-RNA- of microRNA-moleculen [28]. Als alternatief kan het DNA-gebied dat de geconserveerde ECSA-sequentie herbergt, een bindingsplaats zijn van chromatine-modificatoren zoals histonacetyltransferase, en daardoor de genexpressie versterken.

TROP-2 [16], SURF1 [17], SLC2A1 [18], TRIM21 [19], myomegalin [21], UBE2I [22], AISEC [23], CUEC-23 [24] en makorin1 [25] zijn nieuw tumormarker SEREX-antigenen van oesofageale SCC. Van deze markers heeft ECSA de hoogste specificiteit laten zien. Hoewel de aanwezigheid van s-ECSA-Abs gedeeltelijk werd geassocieerd met een slechte prognose (Figuur 4), zouden verdere onderzoeksgegevens de validiteit van ECSA als diagnostische marker kunnen verifiëren.

We evalueerden de klinische betekenis van s-ECSA-Abs bij patiënten met oesofageale SCC. De aanwezigheid van s-ECSA-Abs was gedeeltelijk geassocieerd met een slechte prognose (Figuur 4). De zeer lage vals-positieve reactiviteit van s-ECSA-Abs (Tabel 2) suggereert dat ze niet alleen op zichzelf bruikbaar zijn als nieuwe diagnostische markers voor SCC in de slokdarm, maar ook in combinatie met andere conventionele tumormarkers.


RESULTATEN

SEREX gedefinieerde cDNAs-klonen. Immunoscreening van de vier primaire cDNA-expressiebibliotheken van colonkanker met autologe of allogene serums produceerde in totaal 48 serum-positieve klonen. Sequentieanalyse van cDNA's van geïsoleerde klonen onthulde 22 verschillende genen die zijn gedeponeerd in de LICR SEREX-database (//www.licr.org/SEREX.html) onder de aanduiding KY-CC-1-KY-CC-22. Voor bibliotheken 1C-3C gescreend met autologe serums werden 9 klonen geïsoleerd die 5 verschillende genen vertegenwoordigen. Voor bibliotheek 4C gescreend met pool van 6 allogene sera verkregen uit colonkanker (stadia II-IV) werden patiënten geïsoleerd 37 klonen die 17 verschillende genen vertegenwoordigen. Het grootste deel van de antigenen is geïsoleerd tijdens allogene immunoscreening van bibliotheek 4C in tegenstelling tot de andere vrije bibliotheken die zijn gescreend met autologe serums (zie tabel 1). Alle geïsoleerde antigenen, behalve KY-CC-20, zijn genen met een bekende functie (Tabel 2). Zoeken naar homologie met eerder door SEREX gedefinieerde genen in de LICR SEREX-database (//www.licr.org/SEREX.html) onthulde dat 6 (KY-CC-2, 5, 6, 15, 16, 21) tot en met 22 antigenen die bij dit werk zijn geïsoleerd, zijn eerder geïdentificeerd in verschillende tumoren en alleen KY-CC-16, 21 gevonden voor darmkanker. Ondanks dat er maar liefst vijf bibliotheken zijn geanalyseerd, waren door SEREX gedefinieerde klonen uniek voor elke immunogescreende bibliotheek (zie Tabel 2). Analyse van de moleculaire functies van antigeen toonde aan dat ten minste 8 antigenen betrokken zijn bij de totstandkoming van de genetische informatie (KY-CC-1/RPL18, KY-CC-2/se2–2, KY-CC-5/EEF1A1, KY-CC -8/BRCA2, KY-CC-13/RPLP0, KY-CC-15/PLRG1, KY-CC-18/GNB2L1, KY-CC-22/TRIP11) (zie tabel 2). De 7 antigenen nemen deel aan celproliferatie, ontwikkeling en apoptose (KY-CC-7/PDAP1, KY-CC-8/BRCA2, KY-CC-10/TRIM2, KY-CC-11/BTN3A3, KY-CC-18/ GNB2L1, KY-CC-19/TSGA2, KY-CC-21/UACA), andere 2 (KY-CC-3/COX1, KY-CC-4/TALDO1) onthulden metabolische activiteit, 6 antigenen (KY-CC-9 /CXCR4, KY-CC-11/BTN3A3, KY-CC-12/FKBP4, KY-CC-16/BRAP, KY-CC-18/GNB2L1, KY-CC-22/TRIP11) zijn betrokken bij celsignalering en 5 antigenen (KY-CC-6/COL1A1, KY-CC-12/FKBP4, KY-CC-14/ACTR1A, KY-CC-16/BRAP, KY-CC-17/ACTB) nemen deel aan de herstructurering van het cytoskelet en de cel hechting (zie tabel 2). It should be noted that some antigens at least KY-CC-8/BRCA2, KY-CC-11/BTN3A3, KY-CC-12/FKBP4, KY-CC-18/GNB2L1 and KY-CC-22/TRIP11exhibit multiple functions and were classified in different categories.

Table 2. Characterization of antigens identified by immunoscreening of colon cancer cDNA expression libraries

Antigen Gene homology Molecular Function
KY-CC-1/RPL18 Ribosomal protein L18 (RPL18) RNA synthesis. Part of the 60S ribosomal subunit
KY-CC-2/se2–2 CEP290 gene, Aliase CTCL tumor antigen se2–2 Part of the tectonic-like complex which is required for tissue-specific ciliogenesis and may regulate ciliary membrane composition. Activates ATF4-mediated transcription
KY-CC-3/COX1 Cytochrome c oxidase subunit I (COX1) Cytochrome c oxidase is the component of the respiratory chain that catalyzes the reduction of oxygen to water
KY-CC-4/TALDO1 Transaldolase 1 (TALDO1) The key enzyme of the pentose phosphate pathway and important for the balance of metabolites in the pentose-phosphate pathway
KY-CC-5/EEF1A1 Translation elongation factor 1 alpha 1 (EEF1A1) Promotes the GTP-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A-site of ribosomes during protein biosynthesis
KY-CC-6/COL1A1 Collagen, type I, alpha 1
(COL1A1)
The collagen type I, alpha 1, play role in fibril forming, putative downregulated c-Myc target gene
KY-CC-7/PDAP1 PDGFA associated protein 1 (PDAP1) Enhances PDGFA-stimulated cell growth in fibroblasts, but inhibits the mitogenic effect of PDGFB
KY-CC-8/BRCA2 BRCA2 region, mRNA sequence CG016 Important for cell cycle control and DNA repair through homologous recombination, also involved in embryonic cellular proliferation
KY-CC-9/CXCR4 Chemokine (C-X-C motif), receptor 4 (fusin) (CXCR4) Receptor for the CХC chemokine. Acts as a receptor for extracellular ubiquitin. Involved in hematopoiesis, cardiac ventricular septum formation and mediates LPS-induced inflammatory response
KY-CC-10/TRIM2 Tripartite motif-containing 2 (TRIM2) UBE2D1-dependent E3 ubiquitin-protein ligase that mediates the ubiquitination of NEFL and of phosphorylated BCL2L11. Plays a neuroprotective function
KY-CC-11/BTN3A3 Butyrophilin, subfamily 3, member A3 (BTN3A3) Plays a role in T-cell responses in the adaptive immune response. Also, the proteins of this family play role in cell proliferation and development
KY-CC-12/FKBP4 FK506 binding protein 4 (59kD) (FKBP4) Immunophilin protein with PPIase and co-chaperone activities. Component of steroid receptors heterocomplexes through interaction with heat-shock protein 90 (HSP90). Acts also as a regulator of microtubule dynamics
KY-CC-13/RPLP0 Ribosomal protein, large, P0 (RPLP0) Ribosomal protein (60S) is the functional equivalent of E. coli protein L10
KY-CC-14/ACTR1A ARP1 actin-related protein 1 homolog A, centractin alpha (yeast) (ACTR1A) Component of a multi-subunit complex involved in microtubule based vesicle motility. It is associated with the centrosome
KY-CC-15/PLRG1 Pleiotropic regulator 1 (PRL1 homolog) (PLRG1) Component of the PRP19-CDC5L complex that forms an integral part of the spliceosome and is required for activating pre-mRNA splicing
KY-CC-16/BRAP BRCA1 associated protein (BRAP) Negatively regulates MAP kinase activation by limiting the formation of Raf/MEK complexes probably by inactivation of the KSR1 scaffold protein. May also act as a cytoplasmic retention protein with a role in regulating nuclear transport
KY-CC-17/ACTB Actin, beta (ACTB) Actins are highly conserved proteins that are involved in various types of cell motility and are ubiquitously expressed in all eukaryotic cells
KY-CC-18/GNB2L1 Guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1 (GNB2L1) Involved in the recruitment, assembly and/or regulation of a variety of signaling molecules and plays a role in many cellular processes. It is a part of the 40S ribosomal subunit
KY-CC-19/TSGA2 H. sapience testes specific A2 homolog (mouse) (TSGA2) May play an important role in male meiosis (By similarity). It is necessary for proper building of the axonemal central pair and radial spokes
KY-CC-20/IMAGE:4893383 EST: IMAGE: 4893383 No data available for molecular function
KY-CC-21/UACA Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats (UACA) Regulates APAF1 expression and plays an important role in the regulation of stress-induced apoptosis. Promotes apoptosis by regulating three pathways, apoptosome up-regulation, LGALS3/galectin-3 down-regulation and NF-kappa-B inactivation
KY-CC-22/TRIP11 TRIP11 H. sapiens thyroid hormone receptor interactor 11 Binds the ligand binding domain of the thyroid receptor (THRB) in the presence of triiodothyronine and enhances THRB-modulated transcription. Golgi auto-antigen

Allogeneic immunoscreening of SEREX-defined antigens. In order to determine colon cancer related serological profile of identified antigens allogeneic immunoscreening have been performed with sera obtained from 14 colon cancer and 6 gastric tract cancer patients, as well as 18 healthy donors. Eight of 22 tested antigens reacted with both normal and cancer sera samples two antigens were positive only for normal sera seven antigens showed no reaction with any sera and five antigens solely positive only for colon cancer sera (Table 3). For some antigens reacted with cancer and normal sera previously showed their association with autoimmune, inflammatory-related or non-cancerous (viral) diseases (see Table 3). In addition, KY-CC-1/RPL18, KY-CC-8/CG016, KY-CC-18/GNB2L1 and KY-CC-22/FLJ20542 may represent novel tumor-independent occurring autoantigens firstly isolated in this work. KY-CC-21/UACA, KY-CC-18/GNB2L1 and KY-CC-6/COL1A1 autoantigens revealed the highest percentage reactivity with both normal and cancer serums tested, ranging from 29% to 100% (see Table 3). Five antigens with colon-cancer specific serological profile, namely KY-CC-12/FKBP4, KY-CC-14/ACTR1A, KY-CC-15/PLRG1, KY-CC-19/TSGA2, KY-CC-17/β-actin were reacting totally for 14% of tested colon cancer sera samples (Table 4). Through these antigens only KY-CC-15/PLRG1 was previously identified by SEREX-analysis in hepatocellular carcinoma (data unpublished), for the others have not been documented their reactivity with any tumor patients sera.

Table 3. SEREX-defined antigens with not colon cancer related serological profile

Antigen Serum reactivity (number of positive sera/number of sera analysed) Association with autoimmune disease2/reference
Colon tumor1 Gastrict tract tumor Healthy donors
KY-CC-1/RPL18 1/14 0/6 1/18 No data
KY-CC-2/se2–2 0/14 2/6 1/18 No data
KY-CC-3/COX1 0/14 0/6 0/18 HT [16]
KY-CC-4/TALDO1 0/14 0/6 0/18 MS [17]
KY-CC-5/EEF1A1 2/14 0/6 3/18 No data
KY-CC-6/COL1A1 12/12 NT 11/11 PBC [18], AP [19]
KY-CC-7/PDAP1 0/14 0/6 0/18 No data
KY-CC-8/CG016 1/14 0/6 1/18 No data
KY-CC-9/CXCR4 0/14 0/6 0/18 No data
KY-CC-10/TRIM2 0/14 0/6 0/18 No data
KY-CC-11/BTN3A3 0/14 0/6 0/18 MS [20]
KY-CC-13/RPLP0 0/14 0/6 1/18 SLE [21]
KY-CC-16/BRAP 0/14 0/6 0/18 No data
KY-CC-18/GNB2L1 5/9 NT 9/11 No data
KY-CC-20/IMAGE:4893383 1/7 NT 2/11 No data
KY-CC-21/UACA 5/14 1/6 5/18 Panuveitis [22]
KY-CC-22/FLJ20542 1/14 0/6 2/18 No data

Note: 1Data of serum reactivity not include reactivity with autologous or pool of allogeneic sera used for initial SEREX-analysis. 2Abbreviations: PBC — primary biliary cirrhosis AP — adult periodontitis MS — multiple sclerosis SLE — systemic lupus erythematosus HT — Hashimoto’s thyroiditis.

mRNA expression profile of serologically defined colon cancer specific antigens. KY-CC-12/FKBP4, KY-CC-14/ACTR1A, KY-CC-15/PLRG1 and KY-CC-19/TSGA2 defined by allogeneic immunoscreening as colon cancer specific antigens were tested RT-PCR and real-time RT-PCR for 6 normal colon cDNAs and 9 colon cancer cDNAs.

Antigens tested by RT-PCR were positive for all colon cancer cDNAs KY-CC-15/PLRG1 and KY-CC-19/TSGA2 were positive for all 6 normal colon cDNAs, therefore KY-CC-12/FKBP4 and KY-CC-14/ACTR1A were positive only for 4 normal colon cDNAs and very weak bands observed for these genes for the other 2 normal colon cDNAs (data not shown). The relationship between tested antigens mRNA expression levels and serological reactivity was not examined for respective colon cancer patients due to their sera were not available for typing.

According to the result of real-time RT-PCR, KY-CC-14/ACTR1A mRNA showed increased expression level at 2.5–7.7 times for 8 through 9 tested colon cancer cDNAs compare to normal colon (Figure, a). So, KY-CC-14/ACTR1A may have slightly upregulated mRNA expression level as mean at 3.5 times in colon tumors.

Figure. Real-time RT-PCR results for relative expression level of identified colon cancer related antigens in 9 tested colon cancer cDNA samples. Expression level of antigens in normal colon referred as 1 in all cases

KY-CC-15/PLRG1 and KY-CC-19/TSGA2 showed heterogeneous mRNA expression profile in colon tumor samples with exceptionally high levels of transcripts compare to normal colon associated with the colon cancer case N7 (80 and 88 times elevation, correspondently) (Figure, b, c). KY-CC-19/TSGA2 mRNA expression also increased at 7 times in tumor case N3 and at 10 times in tumor case N9, despite for colon cancer cases NN 1, 2, 4, 5, 8 its normal expression down regulated at 2–3.5 times (Figure, b). KY-CC-15/PLRG1 mRNA in addition to tumor case N7 have slightly increased expression at 3 times in tumor case N3 and near the same level of expression compare to normal colon in tumor cases NN 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9 (difference range at 0.48–1.96) (Figure, c). KY-CC-15/PLRG1 and KY-CC-19/TSGA2 represent the genes with selective activation of normal expression in some cases of colon cancer and may be immunogenic as aberrantly expressed.

By real-time RT-PCR result KY-CC-12/FKBP4 mRNA normal expression down regulated at 11–25 times in tumor cases NN 2, 3, 8 and at 3.1 and 3.7 times in tumor cases NN 4, 6, respectively (Figure, d). In the others four cases of tested tumors, KY-CC-12/FKBP4 mRNA expression was near at the same range (difference at 0.7–1.2 times) as in normal colon. KY-CC-12/FKBP4 showed a great down regulation of normal expression in approximately of ⅓ of colon cancer cases.


Access to Document

  • APA
  • Auteur
  • BIBTEX
  • Harvard
  • Standaard
  • RIS
  • Vancouver

In: Biotechnology Letters , Vol. 26, No. 7, 04.2004, p. 585-588.

Research output : Contribution to journal › Article › peer-review

T1 - SEREX identification of the autoantibodies that are prevalent in the cerebrospinal fluid of patients with moyamoya disease

N1 - Funding Information: This study was partly supported by grants from the Seoul National University Hospital (03-2003-0060). This study was also supported by a grant from Korea Research Foundation and Vascular System Research Center.

N2 - We performed SEREX (serological analysis of recombinant cDNA expression library) to identify autoantibodies that are prevalent in the cerebrospinal fluid of patients with moyamoya disease. These autoantibodies include PC326 (of unknown function), SRY (sex determining region Y), and peroxisomal D3,D2-enoyl-CoA isomerase.

AB - We performed SEREX (serological analysis of recombinant cDNA expression library) to identify autoantibodies that are prevalent in the cerebrospinal fluid of patients with moyamoya disease. These autoantibodies include PC326 (of unknown function), SRY (sex determining region Y), and peroxisomal D3,D2-enoyl-CoA isomerase.


Mapping the High Throughput SEREX Technology Screening for Novel Tumor Antigens

Auteur(s): Shengtao Zhou, Tao Yi, Boya Zhang, Fuqiang Huang, Huiqiong Huang, Jing Tang, Xia Zhao Department of Gynecology and Obstetrics, West China Second Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, People's Republic of China., China

Verbondenheid:

Naam dagboek: Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening
Accelerated Technologies for Biotechnology, Bioassays, Medicinal Chemistry and Natural Products Research

Volume 15 , Issue 3 , 2012




Abstract:

Advances in novel tumor-associated antigen (TAA) screening strategy have accelerated the identification and characterization of biomarkers and potential target molecules for tumor subtyping, diagnosis and therapeutics, which may facilitate early detection and diagnosis of the diseases individually and enhance treatment approaches for cancer. Over the past decades, a plethora of non-invasive methodologies dedicated to identify novel target molecules have been primarily focusing on the discovery of human tumor antigens recognized by the autologous antibody repertoire or cytotoxic T lymphocytes, among which serological analysis of recombinant cDNA expression libraries (SEREX) technology is chronologically first established and is of outstanding sensitivity and antigen coverage. This approach involves immunoscreening cDNA libraries extracted from fresh tumor tissues with sera from cancer patients to identify gene products recognized by IgG antibody. SEREX-defined clones can be directly sequenced and their expression profiles can be readily determined, allowing for immediate structural definition of the antigenic target and subsequent identification of TAAs and their cognate autoantibodies. This review is not only devoted to outline the SEREX technology and its advantages, drawbacks and recent modifications currently available for discovering provocative tumor antigens, but also to translate these SEREX-defined peptides into valuable cancer-specific signatures that would aid in the development of diagnostics, prognostics and therapeutics for cancer patients.

Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening

Titel: Mapping the High Throughput SEREX Technology Screening for Novel Tumor Antigens

VOLUME: 15 PROBLEEM: 3

Auteur(s):Shengtao Zhou, Tao Yi, Boya Zhang, Fuqiang Huang, Huiqiong Huang, Jing Tang and Xia Zhao

Verbondenheid:Department of Gynecology and Obstetrics, West China Second Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, People's Republic of China.

Abstract: Advances in novel tumor-associated antigen (TAA) screening strategy have accelerated the identification and characterization of biomarkers and potential target molecules for tumor subtyping, diagnosis and therapeutics, which may facilitate early detection and diagnosis of the diseases individually and enhance treatment approaches for cancer. Over the past decades, a plethora of non-invasive methodologies dedicated to identify novel target molecules have been primarily focusing on the discovery of human tumor antigens recognized by the autologous antibody repertoire or cytotoxic T lymphocytes, among which serological analysis of recombinant cDNA expression libraries (SEREX) technology is chronologically first established and is of outstanding sensitivity and antigen coverage. This approach involves immunoscreening cDNA libraries extracted from fresh tumor tissues with sera from cancer patients to identify gene products recognized by IgG antibody. SEREX-defined clones can be directly sequenced and their expression profiles can be readily determined, allowing for immediate structural definition of the antigenic target and subsequent identification of TAAs and their cognate autoantibodies. This review is not only devoted to outline the SEREX technology and its advantages, drawbacks and recent modifications currently available for discovering provocative tumor antigens, but also to translate these SEREX-defined peptides into valuable cancer-specific signatures that would aid in the development of diagnostics, prognostics and therapeutics for cancer patients.


Panel of SEREX-defined antigens for breast cancer autoantibodies profile detection

Inhoud: Identification of panel of SEREX-defined antigens for breast cancer autoantibodies profile detection.

Doelstelling: To create panel of antigens that can differentiate breast cancer patients and healthy individuals.

Methoden: SEREX (serological analysis of cDNA expression libraries) method, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), qPCR (quantitative polymerase chain reaction).

Resultaten: In large-scale screening of 16 SEREX-antigens by sera of breast cancer patients and healthy donors, a combination of six antigens (RAD50, PARD3, SPP1, SAP30BP, NY-BR-62 and NY-CO-58) was identified, which can differentiate breast cancer patients and healthy donors with 70% sensitivity and 91% specificity. Elevated mRNA expression of SPP1 gene was revealed in breast tumors (2–7-fold) that correlated with SPP1 antigen immunoreactivity in autologous patients’ sera.

conclusies: The new panel of six SEREX-antigens was proposed, which enables creation of serological assay for breast cancer diagnostics and/or prognosis.


Mapping the High Throughput SEREX Technology Screening for Novel Tumor Antigens

Auteur(s): Shengtao Zhou, Tao Yi, Boya Zhang, Fuqiang Huang, Huiqiong Huang, Jing Tang, Xia Zhao Department of Gynecology and Obstetrics, West China Second Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, People's Republic of China., China

Verbondenheid:

Naam dagboek: Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening
Accelerated Technologies for Biotechnology, Bioassays, Medicinal Chemistry and Natural Products Research

Volume 15 , Issue 3 , 2012




Abstract:

Advances in novel tumor-associated antigen (TAA) screening strategy have accelerated the identification and characterization of biomarkers and potential target molecules for tumor subtyping, diagnosis and therapeutics, which may facilitate early detection and diagnosis of the diseases individually and enhance treatment approaches for cancer. Over the past decades, a plethora of non-invasive methodologies dedicated to identify novel target molecules have been primarily focusing on the discovery of human tumor antigens recognized by the autologous antibody repertoire or cytotoxic T lymphocytes, among which serological analysis of recombinant cDNA expression libraries (SEREX) technology is chronologically first established and is of outstanding sensitivity and antigen coverage. This approach involves immunoscreening cDNA libraries extracted from fresh tumor tissues with sera from cancer patients to identify gene products recognized by IgG antibody. SEREX-defined clones can be directly sequenced and their expression profiles can be readily determined, allowing for immediate structural definition of the antigenic target and subsequent identification of TAAs and their cognate autoantibodies. This review is not only devoted to outline the SEREX technology and its advantages, drawbacks and recent modifications currently available for discovering provocative tumor antigens, but also to translate these SEREX-defined peptides into valuable cancer-specific signatures that would aid in the development of diagnostics, prognostics and therapeutics for cancer patients.

Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening

Titel: Mapping the High Throughput SEREX Technology Screening for Novel Tumor Antigens

VOLUME: 15 PROBLEEM: 3

Auteur(s):Shengtao Zhou, Tao Yi, Boya Zhang, Fuqiang Huang, Huiqiong Huang, Jing Tang and Xia Zhao

Verbondenheid:Department of Gynecology and Obstetrics, West China Second Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, People's Republic of China.

Abstract: Advances in novel tumor-associated antigen (TAA) screening strategy have accelerated the identification and characterization of biomarkers and potential target molecules for tumor subtyping, diagnosis and therapeutics, which may facilitate early detection and diagnosis of the diseases individually and enhance treatment approaches for cancer. Over the past decades, a plethora of non-invasive methodologies dedicated to identify novel target molecules have been primarily focusing on the discovery of human tumor antigens recognized by the autologous antibody repertoire or cytotoxic T lymphocytes, among which serological analysis of recombinant cDNA expression libraries (SEREX) technology is chronologically first established and is of outstanding sensitivity and antigen coverage. This approach involves immunoscreening cDNA libraries extracted from fresh tumor tissues with sera from cancer patients to identify gene products recognized by IgG antibody. SEREX-defined clones can be directly sequenced and their expression profiles can be readily determined, allowing for immediate structural definition of the antigenic target and subsequent identification of TAAs and their cognate autoantibodies. This review is not only devoted to outline the SEREX technology and its advantages, drawbacks and recent modifications currently available for discovering provocative tumor antigens, but also to translate these SEREX-defined peptides into valuable cancer-specific signatures that would aid in the development of diagnostics, prognostics and therapeutics for cancer patients.


Bekijk de video: DNA libraries u0026 generating cDNA. Biomolecules. MCAT. Khan Academy (Januari- 2022).