Informatie

Ik probeer het iPS-cellenpapier van Yamanaka te begrijpen


Kan iemand mij uitleggen wat de beta-geo-cassette is en waarom deze wordt gebruikt? Ik begrijp dat het is ingevoegd in het Fbx15-gen, en dit gen is aanwezig in ES-cellen, en ik geloof dat deze cassette wordt gebruikt als een marker van de Fbx15-locus, maar waarom heeft het resistentiegenen (bèta-galactosidase en neomycine), waar zijn ze resistent voor? Wat is hun rol? Bedankt!


Stel, je wilt een cassette in een gen plaatsen. Hoe weet je dat het er is? Wat als slechts een klein percentage cellen met succes wordt getransfecteerd? Wat als uw reagentia slecht waren? U wilt geen tijd verspillen aan cellen die uw cassette niet in beslag namen.

Die resistentiegenen zijn voor de detectie van de aanwezigheid van de cassette in een cel (of kolonie afgeleid van een enkele cel). U kunt andere dingen met uw cassette laten meerijden waarmee u de aanwezigheid ervan kunt detecteren. Neomycineresistentie: als je de cellen laat groeien die je hebt ontwikkeld in aanwezigheid van neomycine, zullen alleen de cellen die je cassette hebben gekregen in leven blijven omdat de cassette ze resistentie gaf. Al degenen die de cassette niet of verkeerd hebben opgepakt, zullen sterven.

Een actief bèta-galactosidase-gen kan op een substraat werken om een ​​blauwe kleur te maken.

Een actief enzym kan worden gedetecteerd met behulp van X-gal, dat een intens blauw product vormt na splitsing door β-galactosidase, en dat gemakkelijk te identificeren en te kwantificeren is.

Hiermee kunt u opnieuw cellen (of kolonies van cellen) detecteren die uw cassette met succes hebben opgenomen.


De zuurtest: gewone cellen in stamcellen veranderen

Bijgewerkt op 2 juli 2014: Aangezien deze twee artikelen in het tijdschrift zijn gepubliceerd, Natuur, hebben meer dan een dozijn onderzoeksteams de STAP-bevindingen niet kunnen repliceren. Op 1 april vond RIKEN de hoofdauteur Haruko Obokata schuldig aan wetenschappelijk wangedrag. Op 2 juli, Natuur accepteerde verzoeken van alle co-auteurs om de artikelen in te trekken en publiceerde een redactioneel commentaar waarin de intrekkingen werden besproken.

30 minuten weken in een zuurbad klinkt misschien niet als een goede zaak. Maar het is toevallig de nieuwste - en de meest schokkend eenvoudige - strategie voor het maken van stamcellen.

De krachtige aantrekkingskracht van stamcellen voor wetenschap en geneeskunde ligt in het feit dat ze zowel zelfvernieuwend als pluripotent zijn, wat betekent dat ze zich kunnen ontwikkelen tot bijna elk type cel in het lichaam. Stamceltechnologie biedt onderzoekers een in wezen onbeperkte voorraad gespecialiseerde cellen voor het verkennen van de grondbeginselen van de biologie, het screenen op nieuwe medicijnen en het ontwikkelen van nieuwe manieren om beschadigd weefsel te regenereren en zieke organen te herstellen.

Toen deze technologie voor het eerst opdook in de jaren tachtig, was de enige manier om stamcellen te verkrijgen door ze uit een embryo te halen. Toen, in 2006, verbaasde Shinya Yamanaka van de Japanse universiteit van Kyoto de wetenschappelijke wereld toen hij erachter kwam hoe volwassen huidcellen te herprogrammeren tot stamcellen met behulp van een 'cocktail' van slechts vier genen. Dit nieuwe soort stamcellen, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) genoemd, leverde Yamanaka in 2012 de Nobelprijs voor Fysiologie of Geneeskunde op.

Nu hebben we nog een andere benadering van stamcelproductie, ontwikkeld door onderzoekers van het RIKEN Center for Developmental Biology in Kobe, Japan en Brigham and Women's Hospital en Harvard Medical School in Boston. En het is er een die nog eenvoudiger en efficiënter lijkt te zijn dan de methode die wordt gebruikt om iPS-cellen te maken.

Denk er eens over na - als u zou proberen een methode te ontwikkelen die bloedcellen in stamcellen zou omzetten, hoe zou u die dan testen? U zou een snelle screeningsassay nodig hebben. Dus gebruikten de onderzoekers cellen van muizen die een groen fluorescerend eiwit (GFP) produceerden wanneer de 4 okt gen (een marker van pluripotentie) actief was. Onderzoekers verzamelden vervolgens witte bloedcellen uit de milt van 1 week oude GFP-4 okt muis en stelde de cellen bloot aan een verscheidenheid aan omgevingsstress. En vooruit! Ze begonnen gloeiende groene cellen te zien. Wat het beste bleek te werken om deze transformatie te stimuleren, was een half uur weken in een mild zure vloeistof met een pH van 5,7 (minder zuur dan zwarte koffie!). Hoewel dit misschien niet al te traumatisch klinkt, doodde de zuurgraad eigenlijk ongeveer driekwart van de witte bloedcellen. Maar verbazingwekkend genoeg veranderde ongeveer 30% van het kwart dat het overleefde in cellen die veel GFP-Oct4 maakten en sterk leken op embryonale stamcellen.

Toch kan schijn bedriegen. Om meer bewijs te leveren dat zo'n eenvoudige procedure witte bloedcellen echt in stamcellen kan veranderen, moesten de onderzoekers aantonen dat een aantal andere genen die geassocieerd zijn met pluripotentie ook waren ingeschakeld. Zij waren. En ze moesten testen of deze cellen teratomen (goedaardige tumoren) zouden maken als ze in muizen werden geïnjecteerd. Dat deden ze.

Onderschrift: Muizenembryo geïnjecteerd met een nieuw type stamcel, STAP genaamd, die is gelabeld met een groen fluorescerend eiwit dat pluripotentie aangeeft.
Credit: Haruko Obokata, RIKEN

Toen kwam de strengste test: onderzoekers injecteerden de cellen in een vroeg muizenembryo om een ​​mengsel of 'chimera' te creëren. Terwijl de muis groeide, vormden de cellen die met zuur waren behandeld op de juiste manier alle weefseltypes in het volwassen dier. Deze chimere muizen werden vervolgens met succes gefokt en produceerden gezonde, normale nakomelingen - afgeleid van de oorspronkelijke met zuur behandelde cellen.

Hoe moeten deze speciale cellen heten? De onderzoekers noemden ze STAP's, een afkorting voor Stimulus-Triggered Acquisition of Pluripotency. Wat vooral opviel was dat de STAP's ook in staat lijken bij te dragen aan het extra-embryonale weefsel dat de placenta vormt. Dat is niet het geval met iPS-cellen. Dit is wetenschappelijk enorm interessant, maar heeft ook tot bezorgdheid geleid dat STAP's een gemakkelijke weg zouden kunnen bieden voor het klonen van dieren of zelfs mensen.

Hoewel STAP's een grote doorbraak lijken te zijn, moet dit werk nog steeds worden herhaald in andere laboratoria en worden uitgebreid naar cellen van oudere muizen en van mensen. En hoewel we nog steeds niet precies weten welk type stamcellen het beste zal werken voor welke toepassingen, is één ding duidelijk: het potentieel dat dit veld biedt voor het bevorderen van wetenschap en geneeskunde is verbazingwekkend - en wordt steeds meer.

[1] Stimulus-getriggerde lotomzetting van somatische cellen in pluripotentie. Obokata H, Wakayama T, Sasai Y, Kojima K, Vacanti MP, Niwa H, Yamato M, Vacanti CA. Natuur. 2014 januari 30505 (7485):641-7.

[2] Bidirectioneel ontwikkelingspotentieel in geherprogrammeerde cellen met verworven pluripotentie. Obokata H, Sasai Y, Niwa H, Kadota M, Andrabi M, Takata N, Tokoro M, Terashita Y, Yonemura S, Vacanti CA, Wakayama T. Natuur. 2014 januari 30505 (7485): 676-80.


CReM-wetenschappers veranderen menselijke IPS-cellen in longcellen

Finn Hawkins en Katherine McCauley. Foto door Jackie Ricciardi

Menselijke longen beginnen, net als alle organen, hun bestaan ​​als klompjes ongedifferentieerde stamcellen. Maar binnen een paar maanden zijn de cellen georganiseerd. Ze verzamelen zich, vertakken en ontluiken, sommige vormen luchtwegen en andere longblaasjes, de delicate zakjes waar ons lichaam zuurstof uitwisselt voor koolstofdioxide. Het eindresultaat, idealiter: twee gezonde, ademende longen.

Jarenlang hebben wetenschappers die longziekten zoals cystische fibrose bestuderen, geprobeerd dit proces van begin tot eind in detail te volgen, in de hoop dat inzicht in hoe longen zich normaal gesproken vormen, kan helpen verklaren hoe het mis gaat. Nu hebben wetenschappers van het Center for Regenerative Medicine (CReM) van de Boston University twee belangrijke bevindingen aangekondigd die ons begrip van dit proces vergroten: het vermogen om de vroegste longvoorlopers die uit menselijke stamcellen komen te groeien en te zuiveren, en het vermogen om deze cellen te differentiëren. in kleine "bronchosferen" die cystische fibrose modelleren. Onderzoekers hopen dat de resultaten, afzonderlijk gepubliceerd in de Tijdschrift voor klinisch onderzoek en Cel Stamcel, zal leiden tot nieuwe, "gepersonaliseerde geneeskunde" -benaderingen voor de behandeling van longaandoeningen.

"Het sorteren van deze cellen tot zuiverheid is echt moeilijk en belangrijk", zegt Darrell Kotton, directeur van CReM en co-senior auteur van beide artikelen, met Brian Davis van UTHealth aan de Universiteit van Texas. "Het is de eerste stap in het proberen te voorspellen hoe een persoon zou kunnen reageren op bestaande behandelingen of nieuwe medicijnen."

"Er is een lange lijst van longziekten waarvoor er geen andere behandelingen zijn dan een longtransplantatie", voegde Kotton eraan toe, wiens werk wordt gefinancierd door de National Institutes of Health (NIH), de Cystic Fibrosis Foundation en het Massachusetts Life Sciences Center. "Het is van cruciaal belang om nieuwe hulpmiddelen te ontwikkelen om deze ziekten te begrijpen."

Bekijk video iPS-cellen in longcellen

CReM-wetenschappers werken met geïnduceerde pluripotente stamcellen, of iPSC's, die in 2006 werden ontdekt door Shinya Yamanaka. Yamanaka ontdekte hoe een volwassen cel in het menselijk lichaam kon worden opgenomen - zoals een bloedcel of huidcel - en deze kon 'herprogrammeren' tot een stamcel met het vermogen om uit te groeien tot elk orgaan. In de afgelopen jaren hebben verschillende groepen wetenschappers longcellen gekweekt uit menselijke iPSC's, maar de recepten zijn niet perfect - de resulterende longcellen groeien te midden van een wirwar van levercellen, darmcellen en andere weefsels.

"Dat is een groot probleem", zegt Finn Hawkins, een universitair docent geneeskunde aan de BU School of Medicine (MED) en onderdeel van het CReM-team. Hawkins is co-eerste auteur van de Tijdschrift voor klinisch onderzoek papier, samen met Philipp Kramer, voorheen van UTHealth. "Als je deze cellen wilt gebruiken om de long te bestuderen, moet je van die andere af."

Ten eerste had Hawkins een manier nodig om de longcellen te identificeren. Eerder werk van Kotton en andere CReM-wetenschappers toonden aan dat muisstamcellen een gen genaamd Nkx2-1 tot expressie brengen bij de "lotbeslissing" - op het moment dat ze in longcellen veranderen. "Dat is het eerste gen dat opkomt dat zegt: 'Ik ben een longcel'", zegt Hawkins. Kotton bouwde een reportergen dat groen gloeide toen de stamcellen voor het eerst Nkx2-1 tot expressie brachten, en Hawkins bouwde hetzelfde gen in menselijke cellen. Nu kon hij gemakkelijk de gloeiende groene longcellen zien en zuiveren.

Met behulp van een flowcytometer scheidden Hawkins en zijn collega's de groene cellen uit de mix en groeiden ze vervolgens in een matrix. Het resultaat: kleine groene bolletjes van ongeveer een halve millimeter groot, "een populatie van pure, vroege longcellen", zegt Hawkins. Het team noemt de kleine bolletjes 'organoïden', vereenvoudigde en geminiaturiseerde versies van een orgaan, dat belangrijke soorten longcellen bevat. De organoïden zijn hulpmiddelen en dienen ten minste twee belangrijke doelen. Ten eerste stellen ze wetenschappers in staat om in detail een kritiek punt in de menselijke longontwikkeling te bestuderen waarover zeer weinig bekend is. "We ontdekten dat veel van de genen die de longontwikkeling bij andere soorten, zoals muizen, regelen, ook in deze menselijke cellen tot expressie komen", zegt Hawkins.

De organoïden dienen ook nog een ander doel: wetenschappers kunnen ze uitgroeien tot meer volwassen, specifieke celtypen, zoals luchtwegcellen of alveolaire cellen, die cruciaal zijn voor de longfunctie. "Nu kunnen we echt naar ziekte gaan kijken", zegt Hawkins. Daar komt Katherine McCauley (MED’17), vijfdejaars promovendus bij CReM, in beeld.

McCauley's interesse is cystische fibrose, een ziekte die wordt veroorzaakt door mutaties in een enkel gen, CFTR. De mutatie zorgt ervoor dat de longen van een persoon dik, stroperig slijm produceren dat leidt tot infectie, ontsteking en uiteindelijk longfalen. Voor veel patiënten is er geen remedie.

McCauley, die naar de vroegste stadia van de ziekte keek, wilde de gezuiverde longcellen van Hawkins naar de volgende stap brengen en uitzoeken hoe ze luchtwegcellen werden. Door middel van vele nauwgezette experimenten, richtte ze zich op een signaalroute genaamd Wnt, waarvan bekend is dat het belangrijk is bij de ontwikkeling van de longen van muizen. Door het pad uit te schakelen, leidde ze de onvolgroeide longcellen om luchtwegcellen te worden. Daarna liet ze ze groeien tot kleine bolletjes cellen, die ze 'bronchosferen' noemde.

Net als de organoïden van Hawkins gedragen de bronchosferen zich niet als een bronchus, maar zijn ze gewoon een verzameling specifieke cellen. Maar hun specificiteit maakt ze buitengewoon nuttig. "We wilden kijken of we deze konden gebruiken om luchtwegaandoeningen te bestuderen", zegt McCauley. "Dat is een van de grote doelen: deze cellen van patiënten ontwikkelen en ze vervolgens gebruiken om de ziekten van die patiënten te bestuderen."

Als proof of concept verkreeg McCauley twee cellijnen van een patiënt met cystische fibrose, één waarin de CFTR-mutatie die de ziekte veroorzaakte was gecorrigeerd, en één waarin dat niet het geval was, en groeide ze uit tot bronchosferen. Om te zien of haar recept werkte, voerde ze een test uit, waarbij ze een medicijn gebruikte dat ervoor zou moeten zorgen dat bollen gemaakt van normale, functionerende cellen zich met vloeistof vullen. Het werkte: de "vaste" bronchosferen begonnen op te zwellen, terwijl de cystic fibrosis-sferen niet reageerden. "Het leuke is dat we dit hebben gemeten met behulp van microscopie met hoge doorvoer, en vervolgens de verandering in oppervlakte in de tijd hebben berekend", zegt McCauley, die deze resultaten publiceerde in Cel Stamcel en is hoofdauteur van het onderzoek. "Dus nu kunnen we de CFTR-functie op een kwantitatieve manier evalueren."

De volgende stap, zegt McCauley, is om de test te verbeteren en op te schalen, en soortgelijke tests voor andere longziekten te creëren. "Het einddoel is om cellen van een patiënt te nemen en vervolgens verschillende combinaties van medicijnen te screenen", zegt ze. "Het idee dat we de cellen van een patiënt zouden kunnen nemen en niet twintig, maar honderden of duizenden medicijnen zouden kunnen testen, en eigenlijk zouden begrijpen hoe de patiënt zou reageren voordat we ze zelfs maar de behandeling gaven, is gewoon een ongelooflijk idee."


Klonen en stamcelwerk levert Nobel op

Twee wetenschappers die maandag de Nobelprijs voor Fysiologie of Geneeskunde ontvingen, hielpen de basis te leggen voor regeneratieve geneeskunde, het fel nagestreefde maar nog verre idee om het lichaam opnieuw op te bouwen met weefsels die uit zijn eigen cellen worden gegenereerd. Het zijn John B. Gurdon van de Universiteit van Cambridge in Engeland en Shinya Yamanaka van de Universiteit van Kyoto in Japan.

Hun ontdekkingen betreffen de manipulatie van levende cellen en liggen aan de basis van de technieken voor het klonen van dieren en het genereren van stamcellen, de primitieve cellen waaruit de volwassen weefsels van het lichaam ontstaan. Dr. Gurdon was de eerste die een dier, een kikker, kloonde en Dr. Yamanaka ontdekte de eiwitten waarmee een volwassen cel kan worden omgezet in een ei-achtige toestand. De prijs werd in Stockholm bekendgemaakt.

Beide mannen moesten een valse start in het leven overwinnen. Dr. Gurdon kreeg als jongen te horen dat hij totaal ongeschikt was voor biologie, en Dr. Yamanaka volgde een opleiding tot chirurg, maar ontdekte dat hij er niet zo goed in was.

De technieken die ze ontwikkelden, reiken tot aan het begin van het leven en hebben bezwaren opgeroepen bij mensen die op ethische of religieuze gronden vrezen dat wetenschappers te ver doordringen in de mysteries van de natuur en het vermogen om het leven kunstmatig te creëren.

De ontdekking van Dr. Gurdon kwam in 1962, toen hij levende kikkervisjes produceerde uit de volwassen cellen van een kikker. Zijn werk werd aanvankelijk met scepsis begroet, omdat het in tegenspraak was met het leerboek dogma dat volwassen cellen onherroepelijk zijn toegewezen aan hun specifieke functies en geen nieuwe kunnen aannemen. (Zijn prijs was de eerste Nobelprijs die aan een kloner werd toegekend.)

De techniek van Dr. Gurdon was om de celkern, die het DNA van de kikker bevat, uit een volwassen darmcel te extraheren en de kern te injecteren in een kikkerei waarvan de eigen kern was verwijderd. Het ei was duidelijk in staat om de geïntroduceerde kern te herprogrammeren en zijn genen te sturen om over te schakelen van de taken van een darmcel naar die welke geschikt zijn voor een zich ontwikkelend ei.

Maar hoe heeft het eicellichaam deze herprogrammering tot stand gebracht? Het antwoord moest 44 jaar wachten, terwijl moleculair biologen een beter begrip kregen van genen en de agentia die ze controleren.

Dr. Yamanaka werkte met muizen en ontdekte in 2006 dat de herprogrammering kan worden bereikt door slechts vier specifieke gencontrolemiddelen in het ei. De middelen, bij biologen bekend als transcriptiefactoren, zijn eiwitten die door hoofdgenen zijn gemaakt om andere genen te reguleren. Door de vier middelen in een volwassen cel te injecteren, toonde Dr. Yamanaka aan dat hij de cel kon terugbrengen naar zijn primitieve of stamcelvorm.

Stamcellen die met deze methode worden gegenereerd, bekend als geïnduceerde pluripotente cellen of iPS-cellen, kunnen vervolgens worden gemaakt om te rijpen tot elk type volwassen cel in het lichaam, een bevinding met duidelijk potentieel voor medische voordelen.

Afbeelding

Biologen hopen dat de techniek het mogelijk zal maken om vervangende weefsels te genereren uit de eigen cellen van een patiënt voor gebruik tegen een breed scala aan degeneratieve ziekten. Dat blijft voorlopig een ver vooruitzicht. Maar de cellen zijn al nuttig gebleken bij het bestuderen van het ontstaan ​​van ziekten. Cellen die door een patiënt worden gegenereerd, worden aangedreven om het zieke weefsel te vormen, waardoor biologen in sommige gevallen de stappen kunnen volgen waarin de ziekte zich ontwikkelt.

De vroege academische carrière van Dr. Gurdon liet niet vermoeden wat de toekomst zou kunnen brengen. "Ik geloof dat Gurdon ideeën heeft om op dit moment wetenschapper te worden, waaruit blijkt dat dit nogal belachelijk is", schreef zijn biologieleraar op de middelbare school. "Als hij geen eenvoudige biologische feiten kan leren, zou hij geen kans hebben om het werk van een specialist te doen, en het zou pure tijdverspilling zijn, zowel van zijn kant als van degenen die hem zouden moeten onderwijzen."

Aan de universiteit van Oxford moedigde een positievere mentor hem aan om te proberen de kern van volwassen cellen in kikkereieren te transplanteren. Het idee was om te kijken of het genoom - de erfelijke informatie - onveranderd bleef tijdens de ontwikkeling of onomkeerbare veranderingen onderging. Bij het produceren van levende kikkervisjes uit de kern van volwassen kikkercellen, toonde Dr. Gurdon aan dat het genoom van zowel eicellen als volwassen cellen in wezen onveranderd bleef.

Maar de mogelijkheid dat dieren, inclusief mensen, konden worden gekloond, maakte geen ernstige indruk op de publieke verbeelding totdat zijn werk in zoogdieren werd gereproduceerd met de generatie van Dolly, het gekloonde schaap, in 1997. Het jaar daarop werden de eerste menselijke embryonale stamcellen, die zijn afgeleid van het vroege menselijke embryo. Dergelijke cellen worden pluripotent genoemd omdat ze zich kunnen ontwikkelen tot een van de volwassen weefsels van het lichaam.

De twee ontwikkelingen leidden tot het concept van therapeutisch klonen - neem bijvoorbeeld de huidcel van een patiënt, steek deze in een onbevrucht menselijk ei om het terug te programmeren naar pluripotente staat, en ontwikkel vervolgens embryonale stamcellen voor omzetting in het weefsel of orgaan dat de patiënt moest worden vervangen. Aangezien het nieuwe weefsel het eigen genoom van de patiënt zou dragen, zou er geen probleem moeten zijn van immuunafstoting.

Maar menselijke eieren zijn niet zo gemakkelijk te verkrijgen. Natuurlijk zou de herprogrammering kunnen worden bereikt zonder menselijke eieren als alleen de relevante factoren in het ei konden worden geïsoleerd. Maar dat leek een ver vooruitzicht totdat dr. Yamanaka ontdekte dat 24 transcriptiefactoren, later teruggebracht tot vier, een kern konden herprogrammeren wanneer ze in cellen op de rug van een virus werden geïntroduceerd.

Dr. George Daley, een stamcelonderzoeker in het Children's Hospital Boston, prees de creativiteit van het experiment van Dr. Yamanaka. In die tijd probeerden hij en anderen cellen te herprogrammeren door één gen tegelijk toe te voegen. Het idee om in één keer 24 genen in te voegen "is het soort experiment dat zou zijn uitgelachen" tijdens een vergadering van een subsidiecommissie, zei hij.

Rudolf Jaenisch, een bioloog aan het Whitehead Institute in Cambridge, was een ander die van mening was dat het verrassende experiment van dr. Yamanaka correct was, ondanks wijdverbreide twijfels. "Ik geloofde het meteen omdat ik wist dat hij heel voorzichtig was en er zat een logica in", zei hij.

Dr. Gurdon en Dr. Yamanaka zullen een mooie geldprijs ontvangen, maar een prijs die met 20 procent is verlaagd ten opzichte van voorgaande jaren. De Nobel Foundation maakte in juni bekend dat haar investeringen het afgelopen decennium geen gelijke tred hadden gehouden met de uitgaven en dat het prijzengeld zou worden verlaagd van 10 miljoen naar 8 miljoen Zweedse kroon. Toch is zelfs dit tegen de huidige wisselkoers $ 1,2 miljoen waard.

In een kort interview vandaag zei Dr. Yamanaka, die in 1962 in Higashiosaka, Japan werd geboren, dat hij een opleiding tot chirurg had gevolgd, maar "het opgaf omdat ik ontdekte dat ik niet getalenteerd was." Nadat hij had gezien hoe weinig de beste chirurgen konden doen om sommige patiënten te helpen, besloot hij fundamenteel onderzoek te doen en een postdoctorale opleiding te volgen aan de Gladstone Institutes in Californië.

In een interview zei Dr. Gurdon dat hij hersteld was van de tegenslag van het rapport van zijn biologieleraar met de hulp van zijn familie en een oom die slakken bestudeerde. Op de vraag hoe hij het vond om 50 jaar op zijn prijs te moeten wachten, antwoordde hij: "Ik heb geluk dat ik nog leef."


Prijsuitreiking door Harold Varmus

Elke persoon in deze kamer, geen uitzonderingen, is voortgekomen uit een enkele cel, een bevruchte eicel. Hoe heeft die enkele cel de honderden verschillende soorten cellen gegenereerd die onze complexe lichamen bevolken?

De wetenschap biedt nu enkele antwoorden. Een bevruchte eicel bevat een programma voor ontwikkeling, gecodeerd in DNA. Dezelfde instructies zijn te vinden in bijna alle volwassen cellen. Volwassen celtypen verschillen van elkaar omdat verschillende delen van het script, verschillende genen, worden uitgelezen.

Overweeg een ander facet van deze situatie. Als volwassen cellen de instructies voor ontwikkeling behouden, waarom kan dan geen enkele cel, zelfs een zeer gespecialiseerde cel, opnieuw worden geprogrammeerd - zodat ze zich gedraagt ​​als een onvolgroeide cel, voorbereid om veel verschillende soorten cellen te produceren, zelfs een heel organisme?

De twee fundamentele wetenschappers die we vandaag eren, hebben aangetoond dat dit opmerkelijke ding, herprogrammering, inderdaad kan plaatsvinden. Ze hebben het op verschillende momenten in de geschiedenis van de biologie bereikt, op verschillende manieren en met verschillende gevolgen.

Meer informatie

Gurdon kwam dit moeilijke probleem bijna per ongeluk tegen. Op 15-jarige leeftijd vertelde zijn eerste biologieleraar hem dat zijn interesse in een wetenschappelijke carrière "behoorlijk belachelijk" was. Dus studeerde hij Latijn en Grieks. Maar bij zijn toelating tot Oxford ontmoedigde de faculteit hem om verder te gaan met de klassieken. Dus keerde hij terug naar de zoölogie en belandde toevallig in het laboratorium van een embryoloog genaamd Michail Fischberg, die Gurdon vroeg om de Briggs en King-experimenten te herhalen, maar met een ander soort kikker - Xenopus in plaats van Rana. Dit was een goede suggestie. Gurdon toonde aan dat kernen van darmcellen in a Xenopus kikkervisje kon vruchtbare mannelijke en vrouwelijke kikkers produceren na overdracht in eieren.

Het is niet verrassend dat er scepsis was over deze radicale ontdekking, een ontdekking die een pas afgestudeerde student opzette tegen gevestigde wetenschappers. Maar gedurende vele jaren herhaalde Gurdon het experiment op vele manieren. Misschien wel het meest dramatisch, in 1975 gebruikte hij kernen van kikkerhuidcellen die in een petrischaal waren gegroeid. Eieren die met die kernen werden geleverd, produceerden nog steeds zwemmende kikkervisjes.

Een volledige reeks instructies voor ontwikkeling moet dus intact blijven in gespecialiseerde cellen. En het cytoplasma van een ei kan die instructies herprogrammeren om een ​​nieuw organisme te maken.

De implicaties van het maken van nieuwe individuen uit volwassen cellen - klonen - ontsnapten destijds niet aan de aandacht. Maar pogingen om de experimenten met zoogdieren te herhalen mislukten of waren onderhevig aan twijfel. Het concept van herprogrammering kwam onder vuur te liggen. Toen, in de jaren negentig, verbeterden de methoden om zoogdierkernen over te brengen, met als hoogtepunt in 1997 de veel gepubliceerde geboorte van Dolly, een schaap afgeleid van de kern van een borstcel die in een laboratoriumschaal was gekweekt.

Dolly arriveerde in een tijdperk dat heel anders was dan de tijd dat kikkervisjes voor het eerst werden gemaakt van geherprogrammeerde kikkerkernen. De publieke aandacht voor biologisch onderzoek en genetica was veel groter. Over de ethische aspecten van herprogrammering, met name de mogelijkheid van het klonen van mensen, werd meer gediscussieerd, zelfs in het Amerikaanse Congres. En het medische belang van herprogrammeren werd beter gewaardeerd. Zogenaamde '8216pluripotente stamcellen'8217 - cellen die vrijwel elk type weefsel kunnen worden - waren in de jaren tachtig uit vroege muizenembryo's gegroeid. Menselijke embryonale stamcellen waren net om de hoek. Herprogrammering door nucleaire overdracht zou een belangrijke bron kunnen zijn van pluripotente stamcellen van mensen, inclusief patiënten die celtherapieën nodig hebben.

Herprogrammering door nucleaire overdracht heeft belangrijke principes vastgesteld, sommige productielijnen van vee in stand gehouden door klonen, en enkele buitengewone experimenten met muizen mogelijk gemaakt. Maar het is niet gemakkelijk of efficiënt. Het werkt slecht of helemaal niet met menselijke cellen en gebruikt een problematisch product, menselijke eieren. Zou er een betere manier zijn?

Hier komt Shinya Yamanaka het verhaal binnen. Hoewel opgeleid als orthopedisch chirurg, voelde Yamanaka zich aangetrokken tot laboratoriumonderzoek en promoveerde hij in Japan. Begin jaren negentig kwam hij naar het Gladstone Institute for Cardiovascular Disease in San Francisco om een ​​probleem te bestuderen dat schijnbaar niets te maken had met alles wat ik heb besproken. In de loop van dit werk kwam hij een interessant gen tegen dat behoort tot de klasse van genen - ik zal ze 'moleculaire bibliothecarissen'8217 noemen - die een cel vertellen hoe hij zich moet gedragen door de delen van het DNA-script te selecteren om te lezen en de delen om te zwijgen. Terug in Japan ontdekte hij dat zijn moleculaire bibliothecaris helpt om embryonale stamcellen pluripotent te houden. Dit stimuleerde een belangrijk idee. Misschien kan een klein cohort genen elke cel dwingen zich als een stamcel te gedragen. Dit idee leidde tot een gedurfd experiment - het testen van vele kleine combinaties van genen voor een reeks moleculaire bibliothecarissen die volwassen cellen konden herprogrammeren.

Iets meer dan drie jaar geleden identificeerde Yamanaka vier 'bibliothecarissen'8217 die samen de huidcellen van muizen die in een petrischaal groeien, dwingen zich als pluripotente stamcellen te gedragen. Zijn methode is eenvoudig, efficiënt en reproduceerbaar. Het vereist geen eieren of embryo's of moeilijke manipulaties van kernen. Het werkt goed met menselijke cellen. Veel andere laboratoria hebben zijn werk al herhaald, met veel soorten rijpe cellen en veel variaties op zijn oorspronkelijke recept. Het is nu bijna routine geworden om huidcellen te kweken van een patiënt met, laten we zeggen, een neurologische ziekte, ze in pluripotente cellen te veranderen in een petrischaaltje de cellen om te zetten in zenuwcellen om het ziekteproces te bestuderen en te overwegen de cellen te gebruiken om de cellen van dezelfde patiënt te herstellen. 8217s beschadigde hersenen.

Natuurlijk zijn dit nog vroege dagen. De methode wordt nog steeds verbeterd. Geherprogrammeerde pluripotente cellen en echte embryonale stamcellen worden nog steeds vergeleken. Er worden nog steeds nieuwe combinaties van moleculaire bibliothecarissen ontdekt om het ene celtype om te zetten in het andere. En geherprogrammeerde celtherapieën blijven in de toekomst.

Het is ongebruikelijk dat een Lasker-prijs zo snel na een ontdekking als Shinya Yamanaka's 8217 wordt uitgereikt - of zo lang daarna als John Gurdon's 8217s. Maar bij elkaar geplaatst, is dit precies goed. Met de opwindende omzetting van volwassen cellen in pluripotente cellen zijn we ver genoeg gekomen om te weten dat het zwaarbevochten principe van nucleaire herprogrammering niet alleen in het algemeen correct is. Het heeft ook een fenomenaal potentieel om wetenschap en geneeskunde vooruit te helpen.


Gebruik bij drugsscreening

Deze cardiomyocyten werden geherprogrammeerd uit monsters van normale volwassen menselijke huid. Foto door Matt Spindler/Gladstone Institutes

De belofte van behandeling met betrekking tot stamcellen omvat de belofte van het testen van geneesmiddelen in volwassen menselijke iPSC-afgeleide cellen in plaats van het gebruik van diermodellen.

Een recent voorbeeld is het werk van Catherine Mummery, een neuroloog in het National Hospital for Neurology and Neurosurgery van Groot-Brittannië, die van iPSC afgeleide volwassen menselijke cardiomyocyten - hartcellen die in een petrischaaltje kloppen - twee verschillende in de handel verkrijgbare geneesmiddelen voor cardiovasculaire ziekte. Ze toonde aan dat elk medicijn bij de ene dosis hetzelfde soort therapeutisch effect had en bij een andere dosis hetzelfde soort toxiciteit als bij patiënten.

"Dit was indrukwekkend", zegt Kriegstein. “Het was een vroege proof-of-principle dat het testen van geneesmiddelen in iPSC-afgeleide volwassen menselijke cellen, in plaats van in diermodellen, betrouwbare resultaten kan opleveren – en resultaten die directer relevant zijn voor patiënten. Geneesmiddelenbedrijven beginnen medicijnen te screenen in van iPSC afgeleide menselijke cellen en organen.”


Vader van iPS-cellen tot nieuwste vernieuwers: ik ben hier om te helpen

OSAKA -- Een Japans onderzoeksteam dat onlangs een doorbraak in stamcellen aankondigde, kan hulp krijgen van een man die zelf een revolutie op dit gebied heeft veroorzaakt: Nobelprijswinnaar Shinya Yamanaka.

Yamanaka, een professor aan de Universiteit van Kyoto, won in 2012 de prijs in fysiologie of geneeskunde voor het ontwikkelen van geïnduceerde pluripotente stamcellen - cellen die kunnen worden afgeleid van volwassen weefsel en kunnen worden omgezet in elke soort cel. Vorige maand onthulde een team onder leiding van Haruko Obokata van het Riken Center for Developmental Biology een eenvoudigere methode om stamcellen te maken, de zogenaamde stimulus-triggered acquisitie van pluripotentie, of STAP.

Obokata ontdekte in samenwerking met onderzoekers van de Harvard University in de VS dat reguliere cellen in muizen door blootstelling aan stress kunnen worden omgezet in stamcellen.

Op een persconferentie op 10 februari bood Yamanaka zijn volledige steun aan Obokata en haar collega's. Yamanaka noemde hun werk een "geweldig succes", zei Yamanaka "er is voldoende ruimte om de STAP-methode te verfijnen."

Een match made in the lab

De hoogleraar suggereerde dat het koppelen van onderzoek naar iPS en STAP-cellen meer inzicht zou kunnen geven in beide typen. Yamanaka toonde interesse in het werken aan de STAP-techniek bij het Centrum voor iPS Cell Research and Application van de Universiteit van Kyoto, dat hij leidt.

Ongeacht de methode is de manier waarop rijpe cellen terugkeren naar stamcellen nog steeds niet helemaal duidelijk. Het vergelijken van iPS- en STAP-cellen en het lokaliseren van gedeelde mechanismen zou licht op de zaak kunnen werpen.

"STAP-cellen," voegde Yamanaka eraan toe, "kunnen dingen aan die moeilijk zijn met iPS-cellen, zoals het regenereren van afgehakte ledematen zoals hagedissen dat doen."

Deze zomer is Riken van plan om 's werelds eerste iPS-celgebaseerde behandeling toe te dienen aan patiënten met een oogziekte. Yamanaka heeft het project bijgestaan ​​door ongepubliceerde iPS-gegevens aan te leveren. Dat zou hij ook graag willen doen met STAP-onderzoek.

De professor probeerde wel de lucht te klaren over kanker. "Er is een misvatting dat iPS-cellen een hoger risico hebben om kanker te worden dan STAP-cellen," zei Yamanaka. Hij benadrukte dat het iPS-onderzoek snel is gevorderd, tot het punt waarop er weinig reden is tot bezorgdheid over het gebruik van de cellen in klinische onderzoeken. De productiesnelheid - de verhouding van cellen die in stamcellen veranderen - verbeterde ook van 0,1% in eerste instantie tot 20% vanaf 2009.

Meld u aan voor onze nieuwsbrieven om onze beste verhalen rechtstreeks in uw inbox te ontvangen.


Geïnduceerde pluripotente stamcellen: kansen en uitdagingen

Somatische cellen zijn geherprogrammeerd tot pluripotente stamcellen door een combinatie van verschillende transcriptiefactoren te introduceren, zoals okt3/4, Sox2, Klf4 en c-Myc. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) uit de somatische cellen van een patiënt kunnen een nuttige bron zijn voor het ontdekken van geneesmiddelen en celtransplantatietherapieën. De meeste menselijke iPS-cellen worden echter gemaakt door virale vectoren, zoals retrovirus en lentivirus, die de herprogrammeringsfactoren in de gastheergenomen integreren en het risico op tumorvorming kunnen verhogen. Several non-integration methods have been reported to overcome the safety concern associated with the generation of iPS cells, such as transient expression of the reprogramming factors using adenovirus vectors or plasmids, and direct delivery of reprogramming proteins. Although these transient expression methods could avoid genomic alteration of iPS cells, they are inefficient. Several studies of gene expression, epigenetic modification and differentiation revealed the insufficient reprogramming of iPS cells, thus suggesting the need for improvement of the reprogramming procedure not only in quantity but also in quality. This report will summarize the current knowledge of iPS generation and discuss future reprogramming methods for medical application.

1. Inleiding

Reprogramming has been studied extensively for decades. Nuclear transfer into an oocyte gives somatic cells pluripotency to produce cloned animals. For example, Dr J. Gurdon and his colleagues showed that frog somatic cell nuclei can be reprogrammed after transfer into enucleated oocytes, and they develop into feeding tadpoles [1]. Reprogramming in vertebrates was also proven by the creation of cloned animals from sheep [2] and mice [3]. In addition to oocytes, human [4] and mouse embryonic stem (ES) [5] cells also can reprogramme somatic cells into an ES cell-like state after cell fusion. These results demonstrate that terminally differentiated cells can revert to a state of pluripotency in response to external stimulation.

The accumulated understanding of the mechanisms underlying pluripotency in ES cells led to attempts to revert somatic cells into a pluripotent state using defined factors. Twenty-four candidate factors were transduced into mouse embryonic fibroblasts (MEFs) by retroviral delivery and this identified four factors that can convert fibroblasts into induced pluripotent stem (iPS) cells [6]. iPS cells have been generated from mouse [6], rat [7,8], monkey [9], pig [10], dog [11], rabbit [12] and human [13,14]. Most of the iPS cells are derived using the Oct3/4, Sox2, Klf4 en c-Myc reprogramming factors. The original iPS cell induction system used retroviral vectors, which integrate transgenes into the host genome. The insertion of tumorigenic genes, like c-Myc, and activation of proto-oncogenes by LTR increase the risk of tumour formation [15,16].

Mouse iPS cells were generated using a plasmid vector in 2008, showing that iPS cells can be induced by the transient expression of reprogramming factors [17]. The goals of those experiments were to increase transfection efficiency in primary cells and to maintain transgene expression long enough (a few weeks) for iPS cell induction. Three essential reprogramming factors (Oct3/4, Sox2 en Klf4) were connected in a single plasmid using the 2A sequence, which enables expression of multiple proteins from a single RNA transcript. The stoichiometric balance of these core transcription factors is thought to be important for iPS cell induction, and therefore all six possible orders of the factors in the retrovirus system were examined to determine the most effective arrangement. The three factors were then placed into a plasmid vector with a constitutively active CAG promoter, which yielded high expression [18]. This vector ensures co-expression of the three core factors in all of the transfected cells. In addition, another expression vector for c-Myc was constructed. The transfection of the plasmids into MEFs was repeated multiple times to achieve the sustained expression required for iPS cell generation. After four weeks we obtained iPS cell colonies, albeit at a very low frequency. As expected, iPS cell clones in which transgenes had been integrated into the host genome were frequently observed. However, no transgene integration was detected in approximately one-third of the established mouse iPS cell clones. The integration-free iPS cell clones had the potential to differentiate into various cell types of the three germ layers. Furthermore, they were able to form chimeric mice when transplanted into blastocysts, which were competent for germline transmission.

The frequency of iPS cell generation by plasmids, however, was very inefficient. The estimated efficiency is less than 0.0002%, which is at least 1000-fold lower than that of viral induction. The fact that reprogramming efficiency of human fibroblasts with retrovirus is approximately 10-fold lower than that of mouse fibroblasts suggested that the generation of integration-free human iPS cells would be extremely inefficient using the same method. Subsequently, several methods for integration-free human iPS cell generation have been reported. The approach can be divided into four groups based on delivery methods of the reprogramming factors: (i) virus [13,19,20], (ii) DNA [21–24], (iii) RNA [25], and (iv) protein [26] (table 1). We calculated induction efficiency of the methods from the best result reported in each article. Because of the differences in their experimental settings, it is hard to compare their efficiency correctly. However, as predicted, non-integration methods are extremely inefficient in general. Notably, recent reports showed significant improvement of non-integration method. Sendai virus is a minus strand RNA virus. Fusaki et al. [20] infected Sendai virus vectors encoding reprogramming factor into human fibroblasts and obtained iPS cells. Because Sendai virus replicates its genome in the cytoplasm of infected cells, this vector system can stably express reprogramming factors and achieve high reprogramming efficiency. The established iPS cells, on the other hand, tended to carry the virus genome even after long-term culture. To obtain viral-free cells, an additional approach was needed such as the elimination of virus-containing cells through negative selection against virus antigen hemagglutinin–neuraminidase or using a temperature sensitive mutant. Direct delivery of synthetic mRNA also generated iPS cells at high efficiency [25]. The mRNA sustained high and relatively long expression of encoding reprogramming factors by using modified ribonucleotides. However, reprogramming via modified RNAs is technically difficult, sensitive to reagents and requires labour-intensive procedures. Therefore, further improvements in reprogramming methods are absolutely required for reproducible generation of integration-free human iPS cells. A summary of several topics associated with iPS cell generation and a discussion of the future in reprogramming methods for medical and other applications are herein provided.


A Faster Reset Button for Stem Cells

Being able to restore function to organs damaged through disease or injury is a goal that has not only inspired work on programming robots to act on our thoughts (see &lsquo We have the technology&hellip&rsquo ) but has also stimulated scientists to explore whether our bodies&rsquo cells can be reprogrammed to take on the missing functions. The 2012 Nobel Prize committee recognised the potential for therapy in adult cell reprogramming and rewarded John Gurdon and Shinya Yamanaka for their pioneering work in this area. These two stem cell biologists realised that a key step in the process is to return the adult cells to a primitive state voordat persuading them to take on another role, and that this would involve resetting the cells&rsquo nuclear programme.

Shinya Yamanaka published his nobel prize winning work in 2006 , in which he showed that treating fully developed adult cells with four protein factors would drive the necessary changes in the cells&rsquo nucleus to return them to a stem cell-like state called pluripotency and hence the name, &ldquoinduced pluripotent stem cells&rdquo, iPS cells for short. Since then teams the world over have sought to tweak and streamline this promising technology to obtain greater numbers of pluripotent stem cells, in shorter time, from adult tissue.

Reprogrammed adult cells
(Silva et al. PLOS Biology)

Austin Smith and colleagues at the Stem Cell Institute in Cambridge, UK asked whether adult stem cells, such as neural stem cells, which are naturally available in small numbers in adult organs, could be more rapidly and efficiently converted to a state of pluripotency than their fully differentiated neuronal neighbours. As published in their PLOS Biology article in 2008 , the answer turned out to be yes &ndash neural stem cells are easier to reprogram to a pluripotent state and therefore better starting material than mature fully developed adult brain cells are! The team also made some important discoveries along the way.

One such key discovery was that these neural stem cells don&rsquot return to the pluripotent state in a single step. Using the reprogramming treatment identified by Yamanaka&rsquos lab (the use of viral vectors to introduce genes encoding four reprogramming factors ), Smith and his lab found that neural stem cells showed signs of reprogramming much earlier (3 days versus 3 weeks) and at higher frequency than did fully differentiated cells. There was a problem, however, in that these early appearing cells arrested on the verge of full pluripotency.

José Silva, the first author of the PLOS Biology article, told me of his initial disappointment &ldquoMy passion has been the study of the biology of nuclear reprogramming for many years now. When Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka published their seminal work on induced pluripotency, my imagination ran loose with ideas. The irony is that it was the initial failure to generate Induced Pluripotent Stem cells using the conventional Yamanaka factors and traditional Embryonic Stem Cell culture conditions that guided the creation of the PLoS biology work. All we could make initially were highly proliferative cells that looked like Embryonic Stem Cells but were not like these at the molecular level. Somehow these cells were not able to go all the way.&rdquo

To tackle this issue, the team broke down the differentiation process into several steps &ndash starting from embryonic stem cell, and ending with neural stem cell (embryonic stem cells can form any cell type in the body, whereas neural stem cells are restricted to forming only nerve cells ). They then worked out which signals might be getting in the way of complete reprogramming. Using chemicals to neutralize these signals (inhibitors ERK and GSK &ndash termed &ldquo2i&rdquo) and adding a factor called LIF, which encourages self- renewal, the team found that this chemical cocktail (called 2i/LIF) could push the early appearing, partially reprogrammed cells to adopt a fully pluripotent state.

José Silva explains: &lsquowe discovered the importance of the culture environment, together with the Yamanaka factors, in instructing the conversion of a differentiated cell back into an embryonic stem cell. &ldquo

That the group were able to generate greater numbers of iPS cells is down to their recognising the potential in these partially reprogrammed &ldquopre-iPS&rdquo cells which may have been previously dismissed by others as Kathrin Plath and colleagues at UCLA wrote in 2012 , &lsquoWhile it is not absolutely clear that pre-iPS cells represent an intermediate that occurs transiently during the reprogramming process, they are not simply an aborted reprogramming artifact because pre-iPS cells can convert into iPS cells upon addition of ERK and GSK inhibitors.&rsquo

Finally, Austin Smith&rsquos team noticed that their 2i process enabled the complete reprogramming of neural stem cells that intriguingly contained only very few copies of the &lsquoYamanaka factor&rsquo genes, supporting the suggestion that genetic manipulation of cells might not be obligatory for reprogramming them to pluripotency. The use of genetic reprogramming has been a key concern for those in the field, as put forward by distinguished British stem cell biologist, Fiona Watt and her postdoc Ryan Driskell who wrote : &lsquo Discovering how the pluripotent state can be efficiently and stably induced and maintained by treating cells with pharmacologically active compounds rather than by genetic manipulation is an important goal.&rsquo

The paper by Smith and colleagues has gone on to be one of our research gems of the past 10 years and was picked out as a favourite by two of our Editorial Board members, Susan Gasser and Alfonso Martinez-Arias.

Looking back on this research, José Silva, who was a postdoctoral researcher at the time, reminisces: &ldquoThis work had a significant impact on my career, as it helped placing me on the path to becoming a Principal Investigator. Most importantly, it gave me a great platform to interrogate the underlying biology of nuclear reprogramming. &ldquo

See the Tenth Anniversary PLOS Biology Collection or read the Biologue blog posts highlighting the rest of our selected articles.



Silva J, Barrandon O, Nichols J, Kawaguchi J, Theunissen TW, & Smith A (2008). Promotion of reprogramming to ground state pluripotency by signal inhibition. PLoS biology, 6 (10) PMID: 18942890


Auteurs informatie

Voorkeuren

Laboratory of Regenerative Biology, South China Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Guangzhou Institute of Biomedicine and Health, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, 510663, China

Miguel A. Esteban, Yi Gan, DaJiang Qin & DuanQing Pei

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

Corresponderende auteur


Bekijk de video: Boehringer Ingelheim BE De werking van stamceltherapie (December 2021).