Informatie

Waarom zijn grote hoeveelheden DNA nodig voor analyse?


Ik weet dat PCR wordt gebruikt om grote hoeveelheden kopieën van genen te maken en dat het een wetenschappelijke doorbraak is, maar ik wil begrijpen waarom. Waarom hebben we grote hoeveelheden DNA nodig om het te kunnen analyseren, om het te gebruiken. Is een enkel DNA-molecuul niet genoeg?


Ten eerste zal een DNA-monster verkregen uit een cel of wat dan ook nooit alleen de DNA-sequentie bevatten die u wilt, maar in plaats daarvan het volledige genomische DNA, plasmiden, RNA-sequenties en wat dan ook bevatten. Door PCR te gebruiken kunt u selectief de hoeveelheid gewenste DNA-sequentie vermenigvuldigen terwijl de ongewenste sequenties niet worden gekopieerd. Houd de PCR lang genoeg aan de gang en de hoeveelheid ongewenst DNA versus de gewenste DNA-sequentie zal verwaarloosbaar worden. Op dat moment kun je elk experiment doen dat je wilt met je DNA-monster en er redelijk zeker van zijn dat het resultaat dat je krijgt, volledig wordt veroorzaakt door je DNA-sequentie waarin je geïnteresseerd bent.

Ten tweede, zelfs als je een enkel DNA-molecuul zou kunnen isoleren, wat zou je ermee doen? Je zou de lengte niet kunnen bepalen met gelelektroforese, omdat een enkel DNA-molecuul geen zichtbare band zou maken en het inbouwen in een plasmide zal hoogstwaarschijnlijk mislukken omdat je maar 1 kans krijgt. Je zou waarschijnlijk niet eens kunnen zeggen dat je een DNA-molecuul had, aangezien machines in je dagelijkse laboratorium niet gevoelig genoeg zijn om een ​​enkel DNA-molecuul te detecteren.

Ten derde kun je met een grote hoeveelheid DNA verschillende experimenten uitvoeren met hetzelfde monster. De meeste DNA-analysemethoden die ik ken zijn destructief in die zin dat het gebruikte DNA niet opnieuw kan worden gebruikt voor een ander experiment, dus een voldoende grote hoeveelheid DNA om alle geplande experimenten uit te voeren zonder een nieuw monster te hoeven nemen (en allerlei potentiële problemen te introduceren) is bruikbaar.

Kortom, PCR stelt ons in staat om de gewenste DNA-sequentie uit een monster te filteren, zinvolle analyses op deze sequentie uit te voeren en laat ons één monster gebruiken voor meerdere experimenten. Er zijn misschien nog meer voordelen aan PCR die ik heb gemist, maar deze kwamen in me op.


Veel van de methoden die worden gebruikt om de aanwezigheid van DNA te visualiseren, zoals gelelektroforese, zijn gebaseerd op visuele analyse, hetzij door menselijk oog of door een machine. Hiervoor is een aanzienlijke hoeveelheid DNA nodig die verder gaat dan wat rechtstreeks uit een bepaalde bron kan worden geëxtraheerd. Deze behoefte wordt nog versterkt door het feit dat het DNA typisch wordt afgebroken in fragmenten voor analyse.

Scroll naar de onderkant van deze link om een ​​voorbeeld van een gel te zien. https://en.wikipedia.org/wiki/Gel_elektroforese


RFLP en de toepassingen voor DNA-analyse

Restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP) is een moleculaire methode voor genetische analyse waarmee individuen kunnen worden geïdentificeerd op basis van unieke patronen van restrictie-enzymen die in specifieke DNA-gebieden worden gesneden.

Deze techniek, ook wel RFLP-analyse genoemd, maakt gebruik van de polymorfismen in de genetische codes van individuele mensen. Hoewel alle leden van een soort in wezen dezelfde genetische samenstelling hebben, verklaren deze kleine verschillen variaties in fenotype, zoals uiterlijk of metabolisme, tussen individuen.


Waarom zijn grote hoeveelheden DNA nodig voor analyse? - Biologie

Figuur 1. Friedrich Miescher (1844-1895) ontdekte nucleïnezuren.

Ons huidige begrip van DNA begon met de ontdekking van nucleïnezuren, gevolgd door de ontwikkeling van het dubbele-helixmodel. In de jaren 1860 isoleerde Friedrich Miescher (Figuur 1), een arts van beroep, fosfaatrijke chemicaliën uit witte bloedcellen (leukocyten). Hij noemde deze chemicaliën (die uiteindelijk bekend zouden worden als DNA) nucleïne omdat ze geïsoleerd waren uit de kernen van de cellen.

Om Miescher stap voor stap een experiment te zien uitvoeren, klikt u door dit overzicht van hoe hij de sleutelrol van DNA en eiwitten in de kern ontdekte.

Een halve eeuw later, in 1928, rapporteerde de Britse bacterioloog Frederick Griffith de eerste demonstratie van bacteriële transformatie — een proces waarbij extern DNA door een cel wordt opgenomen, waardoor de morfologie en fysiologie verandert. Griffith voerde zijn experimenten uit met Streptococcus pneumoniae, een bacterie die longontsteking veroorzaakt. Griffith werkte met twee stammen van deze bacterie, ruw (R) en glad (S). (De twee celtypen werden "ruw" en "glad" genoemd naar het verschijnen van hun kolonies die op een voedingsagarplaat waren gegroeid.)

De R-stam is niet-pathogeen (veroorzaakt geen ziekte). De S-stam is pathogeen (ziekteverwekkend) en heeft een capsule buiten de celwand. Door de capsule kan de cel ontsnappen aan de immuunreacties van de gastheermuis.

Toen Griffith de levende S-stam in muizen injecteerde, stierven ze aan longontsteking. Toen Griffith daarentegen de levende R-stam in muizen injecteerde, overleefden ze. In een ander experiment, toen hij muizen injecteerde met de door hitte gedode S-stam, overleefden ze ook. Dit experiment toonde aan dat de capsule alleen niet de doodsoorzaak was. In een derde reeks experimenten werd een mengsel van levende R-stam en door hitte gedode S-stam in muizen geïnjecteerd, en tot zijn verbazing stierven de muizen. Na het isoleren van de levende bacteriën van de dode muis, werd alleen de S-bacteriestam teruggevonden. Toen deze geïsoleerde S-stam in verse muizen werd geïnjecteerd, stierven de muizen. Griffith concludeerde dat er iets was overgegaan van de door hitte gedode S-stam in de levende R-stam en veranderde het in de pathogene S-stam. Hij noemde dit de transformerend principe: (Figuur 2). Deze experimenten staan ​​nu bekend als de transformatie-experimenten van Griffith.

Figuur 2. Twee stammen van S. pneumoniae werden gebruikt in de transformatie-experimenten van Griffith. De R-stam is niet-pathogeen. De S-stam is pathogeen en veroorzaakt de dood. Toen Griffith een muis injecteerde met de door hitte gedode S-stam en een levende R-stam, stierf de muis. De S-stam werd gewonnen uit de dode muis. Griffith concludeerde dus dat er iets was overgegaan van de door hitte gedode S-stam naar de R-stam, waardoor de R-stam in het proces werd getransformeerd in S-stam. (credit '8220living mouse'8221: wijziging van werk door NIH credit '8220dead mouse'8221: wijziging van werk door Sarah Marriage)

Wetenschappers Oswald Avery, Colin MacLeod en Maclyn McCarty (1944) waren geïnteresseerd in het verder onderzoeken van dit transformerende principe. Ze isoleerden de S-stam uit de dode muizen en isoleerden de eiwitten en nucleïnezuren (RNA en DNA) omdat deze mogelijke kandidaten waren voor het erfelijke molecuul. Ze gebruikten enzymen die elke component specifiek afbraken en gebruikten vervolgens elk mengsel afzonderlijk om de R-stam te transformeren. Ze ontdekten dat wanneer DNA werd afgebroken, het resulterende mengsel de bacteriën niet langer kon transformeren, terwijl alle andere combinaties de bacteriën konden transformeren. Dit bracht hen tot de conclusie dat DNA het transformerende principe was.

Forensische wetenschappers en DNA-analyse

Forensische wetenschappers gebruikten voor het eerst DNA-analysebewijs om een ​​immigratiezaak op te lossen. Het verhaal begon met een tiener die vanuit Ghana terugkeerde naar Londen om bij zijn moeder te zijn. De immigratiediensten op de luchthaven stonden wantrouwend tegenover hem, omdat ze dachten dat hij op een vervalst paspoort reisde. Na veel overreding mocht hij bij zijn moeder gaan wonen, maar de immigratiedienst liet de zaak tegen hem niet vallen. Alle soorten bewijsmateriaal, inclusief foto's, werden aan de autoriteiten verstrekt, maar desalniettemin werden de uitzettingsprocedures gestart. Rond dezelfde tijd had Dr. Alec Jeffreys van de Leicester University in het Verenigd Koninkrijk een techniek uitgevonden die bekend staat als DNA-fingerprinting. De immigratie-autoriteiten benaderden Dr. Jeffreys voor hulp. Hij nam DNA-monsters van de moeder en drie van haar kinderen, evenals een niet-verwante moeder, en vergeleek de monsters met het DNA van de jongen. Omdat de biologische vader niet op de foto stond, is het DNA van de drie kinderen vergeleken met het DNA van de jongen. Hij vond een match in het DNA van de jongen voor zowel de moeder als zijn drie broers en zussen. Hij concludeerde dat de jongen inderdaad de zoon van de moeder was.

Forensische wetenschappers analyseren veel items, waaronder documenten, handschrift, vuurwapens en biologische monsters. Ze analyseren het DNA-gehalte van haar, sperma, speeksel en bloed en vergelijken dit met een database met DNA-profielen van bekende criminelen. Analyse omvat DNA-isolatie, sequentiebepaling en sequentieanalyse. Forensische wetenschappers zullen naar verwachting verschijnen op rechtszittingen om hun bevindingen te presenteren. Ze worden meestal gebruikt in misdaadlaboratoria van stads- en staatsoverheidsinstanties. Genetici die experimenteren met DNA-technieken werken ook voor wetenschappelijke en onderzoeksorganisaties, de farmaceutische industrie en laboratoria van hogescholen en universiteiten. Studenten die een carrière als forensisch wetenschapper willen nastreven, moeten minimaal een bachelordiploma in scheikunde, biologie of natuurkunde hebben en bij voorkeur enige ervaring in een laboratorium.

Hoewel de experimenten van Avery, McCarty en McLeod hadden aangetoond dat DNA de informatieve component was die tijdens transformatie werd overgedragen, werd DNA nog steeds beschouwd als een te eenvoudig molecuul om biologische informatie te dragen. Eiwitten, met hun 20 verschillende aminozuren, werden als meer waarschijnlijke kandidaten beschouwd. Het beslissende experiment, uitgevoerd door Martha Chase en Alfred Hershey in 1952, leverde bevestigend bewijs dat DNA inderdaad het genetische materiaal was en geen eiwitten. Chase en Hershey bestudeerden een bacteriofaag — een virus dat bacteriën infecteert. Virussen hebben meestal een eenvoudige structuur: een eiwitmantel, de capside genaamd, en een nucleïnezuurkern die het genetische materiaal bevat (DNA of RNA). De bacteriofaag infecteert de bacteriële gastheercel door zich aan het oppervlak te hechten en injecteert vervolgens zijn nucleïnezuren in de cel. Het faag-DNA maakt meerdere kopieën van zichzelf met behulp van de gastheermachinerie, en uiteindelijk barst de gastheercel, waardoor een groot aantal bacteriofagen vrijkomt. Hershey en Chase selecteerden radioactieve elementen die het eiwit specifiek zouden onderscheiden van het DNA in geïnfecteerde cellen. Ze labelden een batch faag met radioactieve zwavel, 35S, om de eiwitmantel te labelen. Een andere batch fagen werd gelabeld met radioactief fosfor, 32 P. Omdat fosfor in DNA wordt aangetroffen, maar niet in eiwit, zou het DNA en niet het eiwit worden gelabeld met radioactief fosfor. Evenzo is zwavel afwezig in DNA, maar aanwezig in verschillende aminozuren zoals methionine en cysteïne.

Elke batch faag mocht de cellen afzonderlijk infecteren. Na infectie werd de faagbacteriële suspensie in een blender gedaan, waardoor de faagmantel loskwam van de gastheercel. Cellen die lang genoeg waren blootgesteld om infectie te laten optreden, werden vervolgens onderzocht om te zien welke van de twee radioactieve moleculen de cel was binnengekomen. De faag en bacteriële suspensie werden in een centrifuge afgedraaid. De zwaardere bacteriecellen bezonken en vormden een pellet, terwijl de lichtere faagdeeltjes in het supernatant bleven. In de buis die faag bevatte gelabeld met 35S, bevatte het supernatant de radioactief gelabelde faag, terwijl er geen radioactiviteit werd gedetecteerd in de pellet. In de buis die de faag bevatte die was gelabeld met 32P, werd de radioactiviteit gedetecteerd in de pellet die de zwaardere bacteriële cellen bevatte, en er werd geen radioactiviteit gedetecteerd in het supernatant. Hershey en Chase concludeerden dat het het faag-DNA was dat in de cel werd geïnjecteerd en informatie droeg om meer faagdeeltjes te produceren, waarmee ze het bewijs leverden dat DNA het genetische materiaal was en geen eiwitten (Figuur 3).

Figuur 3. In de experimenten van Hershey en Chase werden bacteriën geïnfecteerd met fagen die radioactief waren gelabeld met ofwel 35S, dat eiwit labelt, of 32P, dat DNA labelt. Alleen 32P kwam de bacteriële cellen binnen, wat aangeeft dat DNA het genetische materiaal is.

Rond dezelfde tijd onderzocht de Oostenrijkse biochemicus Erwin Chargaff het DNA-gehalte in verschillende soorten en ontdekte dat de hoeveelheden adenine, thymine, guanine en cytosine niet in gelijke hoeveelheden werden gevonden, en dat de relatieve concentraties van de vier nucleotidebasen per soort verschilden. aan soorten, maar niet binnen weefsels van hetzelfde individu of tussen individuen van dezelfde soort. Hij ontdekte ook iets onverwachts: dat de hoeveelheid adenine gelijk was aan de hoeveelheid thymine, en de hoeveelheid cytosine gelijk aan de hoeveelheid guanine (dat wil zeggen, A = T en G = C). Verschillende soorten hadden gelijke hoeveelheden purines (A+G) en pyrimidines (T + C), maar verschillende verhoudingen van A+T tot G+C. Deze waarnemingen werden bekend als: De regels van Chargaff . De bevindingen van Chargaff bleken enorm nuttig toen Watson en Crick zich klaarmaakten om hun DNA-dubbele helixmodel voor te stellen! U kunt na het lezen van de afgelopen pagina's zien hoe de wetenschap voortbouwt op eerdere ontdekkingen, soms in een langzaam en moeizaam proces.

Oefenvraag

De experimenten van Hershey en Chase hielpen te bevestigen dat DNA het erfelijke materiaal was op basis van de bevinding dat:

  1. radioactieve fagen werden gevonden in de pellet
  2. radioactieve cellen werden gevonden in het supernatant
  3. radioactieve zwavel werd gevonden in de cel
  4. radioactief fosfor werd gevonden in de cel

Samengevat: De geschiedenis van DNA

DNA werd voor het eerst geïsoleerd uit witte bloedcellen door Friedrich Miescher, die het nucleïne noemde omdat het uit kernen was geïsoleerd. Frederick Griffith's experimenten met stammen van Streptococcus pneumoniae gaf de eerste hint dat DNA het transformerende principe zou kunnen zijn. Avery, MacLeod en McCarty bewezen dat DNA nodig is voor de transformatie van bacteriën. Latere experimenten van Hershey en Chase met bacteriofaag T2 bewezen dat DNA het genetische materiaal is. Chargaff ontdekte dat de verhouding van A = T en C = G, en dat het percentage van A, T, G en C verschillend is voor verschillende soorten.


Wanneer één twee wordt: DNA scheiden voor nauwkeurigere nanoporiënanalyse

Een nieuwe softwaretool ontwikkeld door onderzoekers van het Earlham Institute zal bio-informatici helpen de kwaliteit en nauwkeurigheid van hun biologische gegevens te verbeteren en verkeerde assemblages te voorkomen. De snelle, lichtgewicht, gebruiksvriendelijke tool visualiseert genoomassemblages en genuitlijningen van de nieuwste sequencingtechnologieën van de volgende generatie.

De nieuwe visualisatietool, Alvis genaamd, onderzoekt mappings tussen DNA-sequentiegegevens en referentiegenoomdatabases. Hierdoor kunnen bio-informatici gemakkelijker hun gegevens analyseren die zijn gegenereerd op basis van algemene genomics-taken en -formaten door efficiënte, kant-en-klare vectorafbeeldingen te produceren.

Eerste auteur en postdoctoraal wetenschapper aan het Earlham Institute Dr. Samuel Martin van de Leggett Group, zei: "Normaal gesproken voeren uitlijningstools platte tekstbestanden uit met lijsten met uitlijningsgegevens. Dit is geweldig voor computerparsing en voor opname in een pijplijn, maar het kan moeilijk te interpreteren zijn door mensen.

"Visualisatie van uitlijningsgegevens kan ons helpen het probleem te begrijpen. Als nieuwe technologie zijn verschillende nieuwe uitlijningsformaten geïmplementeerd door nieuwe tools die specifiek zijn voor nanopore-sequencingtechnologie.

"We ontdekten dat bestaande visualisatietools deze formaten niet konden interpreteren. Alvis kan worden gebruikt met alle gangbare uitlijningsformaten en is gemakkelijk uitbreidbaar voor toekomstige formaten."

Een belangrijk kenmerk van de nieuwe opdrachtregeltool is de unieke mogelijkheid om automatisch chimere sequenties te markeren - zwakke schakels in de DNA-keten. Dit is waar twee sequenties - uit verschillende delen van een genoom of verschillende soorten - per ongeluk aan elkaar worden gekoppeld om er een te maken, wat de nauwkeurigheid van de gegevens beïnvloedt.

Chimaera-sequenties kunnen problematisch zijn voor bio-informatici bij het identificeren van specifiek DNA. De chimera-vorming kan fysiek gebeuren met de DNA-moleculen tijdens de voorbereiding van de sequentiebibliotheek, tijdens het sequentieproces op sommige platforms en door assemblagetools bij het samenstellen van een genoom.

Tijdens de ontwikkeling van de tool vergeleek het team genoomassemblages met en zonder Alvis-chimaeradetectie. De geproduceerde vectorafbeelding toont een voorbeelduitvoer, waarbij de intuïtieve tool alle reads volgt die het als chimera's herkent.

"Hoewel chimere sequenties geen groot deel van de monsters uitmaken, kunnen ze een significant effect hebben, dus we moeten voorzichtig zijn dat we ze tijdens de analyse hebben geïdentificeerd", zei Dr. Martin.

"In het Alvis-diagramvoorbeeld van chimera-gegevens vertegenwoordigt elke rechthoek op de pagina een lezing, en de gekleurde blokken erin vertegenwoordigen uitlijningen. De meeste chimeren zijn gemakkelijk te zien omdat hun uitlijningen verschillende kleuren hebben, wat betekent dat ze op verschillende genomen zijn. subtieler omdat beide uitlijningen betrekking hebben op hetzelfde genoom, maar verschillende regio's."

De Alvis-tool kan visualisatie van alleen chimere sequenties lokaliseren voor verdere inspectie en numerieke gegevens uitvoeren die de chimeren beschrijven. Dit toont aan dat door de tool toe te passen en vervolgens de chimera's bio-informatisch te splitsen, de kwaliteit van de assemblages aanzienlijk wordt verbeterd.

Dr. Martin is meer dan 600 keer geraadpleegd sinds het begin maart van dit jaar beschikbaar werd gesteld en voegt eraan toe: "We hopen dat Alvis nuttig blijft voor andere onderzoekers die werken met bijvoorbeeld nanopore-sequencing, waardoor ze hun gegevens beter begrijpen door uitlijningen te visualiseren. ,''.

"Afstemmingen zijn zo fundamenteel voor bio-informatica dat het nuttig kan zijn voor iedereen die werkt met lang gelezen sequencing-gegevens, evenals uitlijningen die worden gegenereerd door sequencing-gegevens van short-read-platforms. De diagrammen die Alvis genereert, kunnen eenvoudig worden geëxporteerd om direct te gebruiken in publicaties , al aangetoond in onze studie."


Waar wordt PCR voor gebruikt?

Eenmaal geamplificeerd, kan het door PCR geproduceerde DNA in veel verschillende laboratoriumprocedures worden gebruikt. De meeste mappingtechnieken in het Human Genome Project (HGP) waren bijvoorbeeld gebaseerd op PCR.

PCR is ook waardevol bij een aantal laboratorium- en klinische technieken, waaronder DNA-fingerprinting, detectie van bacteriën of virussen (met name AIDS) en diagnose van genetische aandoeningen.

Eenmaal geamplificeerd, kan het door PCR geproduceerde DNA in veel verschillende laboratoriumprocedures worden gebruikt. De meeste mappingtechnieken in het Human Genome Project (HGP) waren bijvoorbeeld gebaseerd op PCR.

PCR is ook waardevol bij een aantal laboratorium- en klinische technieken, waaronder DNA-fingerprinting, detectie van bacteriën of virussen (met name AIDS) en diagnose van genetische aandoeningen.


Wie heeft de structuur van DNA ontdekt?

De dubbele helixstructuur van DNA werd voor het eerst ontdekt in 1953 door James Watson (een Amerikaanse bioloog), Francis Crick (een Engelse natuurkundige) en Rosalind Franklin (een Engelse chemicus). Hoewel alleen Watson en Crick de ontdekking van de dubbele helix hebben gekregen, wordt aangenomen dat ze hun ontdekking hebben gedaan met behulp van de gegevens van Franklin. Franklin was een expert in een beeldvormende techniek genaamd röntgenkristallografie, die ze gebruikte om het allereerste beeld van de spiraalvorm van DNA te produceren.

Watson en Crick kregen in 1962 de Nobelprijs voor hun werk. Ondanks haar bijdrage aan de ontdekking kreeg Franklin de prijs niet, omdat ze vier jaar eerder aan kanker was overleden.


Prelab vragen

Bespreek het volgende met elkaar. Wees klaar om je gedachten te delen met de rest van de klas.

  1. Ampicilline is een derivaat van het antibioticum penicilliin. Het verstoort de celwandvorming in bacteriecellen die de cellen doodt. Ons recombinante plasmide bevat echter een gen dat antibioticaresistentie biedt door een eiwit te produceren dat ampicilline afbreekt. Waarom nemen we ampicilline op in het testmedium?
  2. Wat gebeurt er als de getransformeerde cellen niet groeien in aanwezigheid van de chemische inductor?
  3. In het experiment voegt u de controle- en experimentele groepen cellen toe aan verschillende mediacombinaties. Wat voorspel je voor elke aandoening? Vul in tafel 1 door aan te geven of je groei of geen groei voorspelt, en als er groei is, zal er sprake zijn van minimale groei of veel groei.

Lees de onderstaande procedures door en schets de stappen, met behulp van woorden en een stroomschema in uw labnotitieboekje.


Hoe DNA is gerangschikt in de cel

DNA is een werkend molecuul dat moet worden gerepliceerd wanneer een cel klaar is om te delen, en het moet worden "gelezen" om de moleculen, zoals eiwitten, te produceren om de functies van de cel uit te voeren. Om deze reden wordt het DNA op zeer specifieke manieren beschermd en verpakt. Bovendien kunnen DNA-moleculen erg lang zijn. Als de DNA-moleculen in een enkele menselijke cel van begin tot eind worden uitgerekt, zouden ze tot een punt komen lengte van ongeveer 2 meter. Het DNA voor een cel moet dus op een zeer geordende manier worden verpakt om te passen en te functioneren in een structuur (de cel) die niet zichtbaar is voor het blote oog. De chromosomen van prokaryoten zijn in veel van hun kenmerken veel eenvoudiger dan die van eukaryoten (Figuur 9.6). De meeste prokaryoten bevatten een enkel, circulair chromosoom dat wordt gevonden in een gebied in het cytoplasma dat de nucleoïde wordt genoemd.

Figuur 9.6 Een eukaryoot bevat een goed gedefinieerde kern, terwijl bij prokaryoten het chromosoom in het cytoplasma ligt in een gebied dat de nucleoïde wordt genoemd.

De grootte van het genoom in een van de best bestudeerde prokaryoten, Escherichia coli, is 4,6 miljoen basenparen, wat een afstand van ongeveer 1,6 mm zou zijn als deze uitgerekt zou worden. Dus hoe past dit in een kleine bacteriële cel? Het DNA wordt voorbij de dubbele helix gedraaid in wat bekend staat als supercoiling. Van sommige eiwitten is bekend dat ze betrokken zijn bij het supercoilen, andere eiwitten en enzymen helpen bij het handhaven van de supercoiled-structuur.

Eukaryoten, waarvan de chromosomen elk bestaan ​​uit een lineair DNA-molecuul, gebruiken een ander type verpakkingsstrategie om hun DNA in de kern te passen. Op het meest basale niveau is DNA gewikkeld rond eiwitten die bekend staan ​​als histonen om structuren te vormen die nucleosomen worden genoemd. Het DNA is strak om de histonkern gewikkeld. Dit nucleosoom is verbonden met het volgende door een korte DNA-streng die vrij is van histonen. Dit staat ook bekend als de "kralen aan een touwtje" -structuur, de nucleosomen zijn de "kralen" en de korte stukjes DNA ertussen zijn het "snoer". De nucleosomen, met hun DNA om zich heen gewikkeld, stapelen zich compact op elkaar om een ​​30 nm brede vezel te vormen. Deze vezel wordt verder opgerold tot een dikkere en compactere structuur. In het metafasestadium van mitose, wanneer de chromosomen in het midden van de cel zijn opgesteld, zijn de chromosomen het meest compact. Ze zijn ongeveer 700 nm breed en worden gevonden in combinatie met steigereiwitten.

In interfase, de fase van de celcyclus tussen mitosen waarin de chromosomen worden gedecondenseerd, hebben eukaryote chromosomen twee verschillende regio's die kunnen worden onderscheiden door kleuring. Er is een dicht opeengepakt gebied dat donker kleurt, en een minder dicht gebied. De donkergekleurde gebieden bevatten meestal genen die niet actief zijn en worden aangetroffen in de gebieden van het centromeer en telomeren. De lichtgekleurde gebieden bevatten meestal genen die actief zijn, met DNA verpakt rond nucleosomen maar niet verder verdicht.

Figuur 9.7 Deze figuren illustreren de verdichting van het eukaryote chromosoom.


Genetische manipulatie in planten

Vanwege hun economische betekenis zijn planten lange tijd het onderwerp geweest van genetische analyse, gericht op het ontwikkelen van verbeterde rassen. Recombinant-DNA-technologie heeft een nieuwe dimensie aan deze inspanning toegevoegd omdat de genoommodificaties die door deze technologie mogelijk worden gemaakt, bijna onbeperkt zijn. Het fokken beperkt zich niet langer tot het selecteren van varianten binnen een bepaalde soort. DNA kan nu worden geïntroduceerd van andere soorten planten, dieren of zelfs bacteriën.

Ti-plasmide.  

De enige vectoren die routinematig worden gebruikt om transgene planten te produceren, zijn afgeleid van een bodembacterie genaamd Agrobacterium tumefaciens. Deze bacterie veroorzaakt wat bekend staat als kroongalziekte, waarbij de geïnfecteerde plant ongecontroleerde gezwellen (tumoren of gallen) produceert, normaal gesproken aan de basis (kroon) van de plant. De sleutel tot tumorproductie is een groot (200 kb) circulair DNA-plasmide - het Ti (tumor-inducerende) plasmide. Wanneer de bacterie een plantencel infecteert, wordt een deel van het Ti-plasmide —, een regio genaamd T-DNA —, overgebracht en schijnbaar min of meer willekeurig in het genoom van de waardplant geplaatst (Figuur 13-14 ). De functies die nodig zijn voor deze overdracht bevinden zich buiten het T-DNA op het Ti-plasmide. Het T-DNA zelf heeft verschillende interessante functies, waaronder de productie van de tumor en de synthese van verbindingen genaamd meent. Opines worden feitelijk gesynthetiseerd tot de waardplant onder leiding van het T-DNA. De bacterie gebruikt de opines vervolgens voor zijn eigen doeleinden en doet een beroep op opine-gebruikende genen op het Ti-plasmide. Twee belangrijke opines zijn nopaline en octopine twee afzonderlijke Ti-plasmiden produceren ze. De structuur van Ti wordt getoond in figuur 13-15.

Afbeelding 13-14

In het proces van het veroorzaken van kroongalziekte, de bacterie A. tumefaciens voegt een deel van zijn Ti-plasmide - een regio genaamd T-DNA - 2014 in een chromosoom van de waardplant in.

Afbeelding 13-15

Vereenvoudigde weergave van de belangrijkste regio's van het Ti-plasmide van A. tumefaciens. Het T-DNA, wanneer het wordt ingevoegd in het chromosomale DNA van de waardplant, stuurt de synthese van nopaline aan, dat vervolgens door de bacterie voor zijn eigen doeleinden wordt gebruikt. T-DNA (meer.)

Het natuurlijke gedrag van het Ti-plasmide maakt het zeer geschikt voor de rol van een plantenvector. Als het DNA van belang zou kunnen worden gesplitst in het T-DNA, dan zou het hele pakket in een stabiele toestand in een plantenchromosoom worden ingebracht. Dit systeem is inderdaad gemaakt om in wezen op deze manier te werken, maar met enkele noodzakelijke aanpassingen. Laten we één protocol onderzoeken.

Ti-plasmiden zijn te groot om gemakkelijk te manipuleren en kunnen niet gemakkelijk kleiner worden gemaakt, omdat ze weinig unieke restrictieplaatsen bevatten. Dientengevolge ontvangt een kleinere, intermediaire vector aanvankelijk het van belang zijnde insert en de verschillende andere genen en segmenten die nodig zijn voor recombinatie, replicatie en antibioticaresistentie. Wanneer gemanipuleerd met de gewenste genelementen, kan deze intermediaire vector vervolgens in het Ti-plasmide worden geïnsereerd, waardoor een co-integraatplasmide wordt gevormd dat door transformatie in een plantencel kan worden geïntroduceerd. Figuur 13-16a toont een methode om het co-integraat te creëren. Het Ti-plasmide dat de intermediaire vector zal ontvangen, wordt eerst verzwakt, dat wil zeggen dat het hele rechtergebied van zijn T-DNA, inclusief tumorgenen en nopalinesynthesegenen, is verwijderd, waardoor het niet in staat is tot tumorvorming. “overlastâ€aspect van de T-DNA-functie. Het behoudt de linkerrand van zijn T-DNA, dat zal worden gebruikt als de oversteekplaats voor opname van de intermediaire vector. De intermediaire vector heeft een handig kloneringssegment erin gesplitst, dat een verscheidenheid aan unieke restrictieplaatsen bevat. Het gen van belang is op deze plaats in figuur 13-16 ingevoegd. Ook gesplitst in de vector zijn een selecteerbaar bacterieel gen (spc R ) voor spectinomycineresistentie een bacterieel kanamycineresistentiegen (kan R), ontwikkeld voor expressie in planten en twee segmenten van T-DNA. Eén segment draagt ​​het nopaline-synthese-gen (nee) plus de rechter T-DNA grenssequentie. Het tweede T-DNA-segment komt van dichtbij de linkergrens en biedt een sectie voor recombinatie met een homoloog deel van het linkergebied, dat werd vastgehouden in het ontwapende Ti-plasmide. Nadat de tussenvectoren zijn geïntroduceerd in Agrobacterium cellen die de ontwapende Ti-plasmiden bevatten (door conjugatie met E coli), kunnen plasmide-recombinanten (co-integraten) worden geselecteerd door uitplaten op spectinomycine. De geselecteerde bacteriekolonies zullen alleen het Ti-plasmide bevatten, omdat de intermediaire vector niet in staat is tot replicatie in Agrobacterie.

Afbeelding 13-16

(a) Om transgene planten te produceren, wordt een intermediaire vector van beheersbare grootte gebruikt om het gewenste segment te klonen. In de hier getoonde methode wordt de intermediaire vector vervolgens opnieuw gecombineerd met een verzwakt (𠇍isarmed”) Ti-plasmide om (meer.)

Zoals figuur 13-16b laat zien, worden na spectinomycineselectie op de co-integraten vervolgens bacteriën die het recombinante dubbele, of co-integrant, plasmide bevatten, gebruikt om gesneden segmenten van plantenweefsel te infecteren, zoals uitgestanste bladschijven. Als bacteriële infectie van plantencellen plaatsvindt, kan elk genetisch materiaal tussen de linker en rechter T-DNA-grenssequenties in de plantenchromosomen worden ingebracht. Als de bladschijven op een medium worden geplaatst dat kanamycine bevat, zijn de enige plantencellen die celdeling zullen ondergaan die welke de kan R-gen van T-DNA-overdracht. De groei van dergelijke cellen resulteert in een klont of callus, wat een indicatie is dat transformatie heeft plaatsgevonden. Deze calli kunnen worden geïnduceerd om scheuten en wortels te vormen, waarna ze worden overgebracht naar de bodem waar ze zich ontwikkelen tot transgene planten (Figuur 13-16b). Vaak is er maar één T-DNA-insert detecteerbaar in dergelijke planten, waar het bij meiose segregeert als een gewoon Mendeliaans allel (Figuur 13-17). Het insert kan worden gedetecteerd door een T-DNA-probe in een Southern-hybridisatie of kan worden geverifieerd door de detectie van de chemische nopaline in het transgene weefsel.

Afbeelding 13-17

T-DNA en elk DNA dat erin zit, wordt ingevoegd in een plantenchromosoom in de transgene plant en vervolgens overgedragen in een Mendeliaanse overervingspatroon.

Expressie van gekloond DNA

Het in het T-DNA gekloonde DNA kan elk DNA zijn dat de onderzoeker in de betreffende plant wil invoegen. Een bijzonder opvallend vreemd DNA dat met behulp van T-DNA is ingebracht, is het gen voor het enzym luciferase, dat wordt geïsoleerd uit vuurvliegjes. Het enzym katalyseert de reactie van een chemische stof genaamd luciferine met ATP in dit proces wordt licht uitgestraald, wat verklaart waarom vuurvliegjes gloeien in het donker. Een transgene tabaksplant die het luciferase-gen tot expressie brengt, zal ook oplichten in het donker als hij wordt bewaterd met een oplossing van luciferine (zie foto aan het begin van dit hoofdstuk). Dergelijke manipulatie lijkt misschien een poging om technologie te ontwikkelen voor het maken van kerstbomen die geen verlichting nodig hebben, maar in feite is het luciferase-gen nuttig als een reporter om de functie van elk gen tijdens de ontwikkeling te volgen. Met andere woorden, de stroomopwaartse promotorsequenties van elk gen van belang kunnen worden gefuseerd met het luciferasegen en door T-DNA in een plant worden geplaatst. Dan zal het luciferase-gen hetzelfde ontwikkelingspatroon volgen als dat van het normaal gereguleerde gen, maar het luciferase-gen zal zijn activiteit prominent aankondigen door op verschillende tijdstippen of in verschillende weefsels te gloeien, afhankelijk van de regulerende sequentie.

Andere genen die als reporters in planten worden gebruikt, zijn de bacterie GUS (β-glucuronidase) gen, dat de verbinding X-Gluc blauw maakt, en de bacteriële lac (β-galactosidase) gen, dat X-Gal blauw kleurt. Cellen waarin deze reporters tot expressie worden gebracht, worden blauw en deze blauwheid kan gemakkelijk worden gezien met het blote oog of onder de microscoop.

Transgene planten die een van de verschillende vreemde genen dragen, worden momenteel gebruikt en er zijn er nog veel meer in ontwikkeling. Niet alleen worden de eigenschappen van planten zelf gemanipuleerd, maar net als micro-organismen worden planten ook gebruikt als handige fabrieken om eiwitten te produceren die worden gecodeerd door vreemde genen.


OVERZICHT VAN DE PRAKTIJK

Eerste praktijksessie

Elke groep studenten krijgt een monster van een plasmide met een enkele EcoRI-plaats van ongeveer 3 kbp. We hebben pUC118 gebruikt voor de hier getoonde gegevens. Ze krijgen de geschatte concentratie van het plasmide en de A . te horen260 voor dubbelstrengs DNA. Na het berekenen van een geschikte verdunning bereiden ze een aliquot van 1 ml voor, dat wordt gebruikt om A . te verkrijgen260 en een280 lezingen. Ze berekenen nu de werkelijke DNA-concentratie van hun monster en maken een reeks verdunningen die bekende hoeveelheden DNA per 10 μl TE-buffer zullen opleveren van 1 μg tot 1 ng. Porties van 10 microliter van de verdunningen worden gemengd met 2 l laadkleurstof en de gemengde monsters werden in de putjes van een agarosegel geladen. Na elektroforese worden de gels gekleurd met ethidiumbromide, gevisualiseerd onder UV-licht en het beeld opgenomen om terug te geven aan de studenten voor hun interpretatie.

Tweede Praktijksessie

In deze sessie krijgen de studenten monsters van het plasmide dat in de eerste sessie is gebruikt en monsters van dubbelstrengs circulair (RFI) en enkelstrengs circulair (SS+) DNA van de bacteriofaag M13.

Elke groep studenten behandelt het covalent gesloten circulaire (ccc, RFI) en het enkelstrengs circulaire (SS+) DNA van bacteriofaag M13 met DNA Topoisomerase I en met het restrictie-endonuclease EcoRI. Plasmide-DNA (pUC118) wordt ook behandeld met EcoRI en met DNA-topoisomerase I. Na digestie worden de verschillende vormen van M13- en pUC118-DNA gescheiden door agarosegelelektroforese in afwezigheid van ethidiumbromide. De gels worden gekleurd na elektroforese en gevisualiseerd en geregistreerd zoals voor de eerste sessie.


De toekomst van DNA-analyse

Voor de eerste DNA-analysetechnieken waren grote hoeveelheden vrij hoogwaardig DNA nodig. Nieuwere procedures kunnen echter DNA-resultaten opleveren met veel kleinere monsters van mindere kwaliteit en in een veel kortere tijdsperiode. Techniques have also been developed to extract usable DNA from difficult-to-access or contaminated sources.

DNA analysis is still not fool-proof and there are instances when it doesn’t live up to expectations. Usually, DNA analysis provides insights or evidence, but it doesn’t always provide definitive answers. The interpretation of DNA results is still largely dependent on experts, but home DNA testing means that the information contained in your DNA is becoming more accessible and affordable all the time.

Dmitri Synogatch
Joseph Kim

You guys did FANTASTIC ! This really helped me understand more about this topic. you guys may not get a lot of credits but I would like to say thank you for your effort to give such information for average joes like us.

How can I start a DNA test lab in India?

Please let me know the procedure to start a DNA testing lab, the equipments required and the licensing authority.

Sonja jurisic

I am enquiring re my cousin who did DNA test. He got a large procentage for Balkan and Greece. Prior to Slavic move to Balkan, there were Ilyrian tribes in the area and others. What period does Balkan and Greek refers to, prior to Slavic move or after? Bedankt
Sonja Jurisic

Mark Hicks

DNA has changed humanity to it’s extinction. It’s how they are thinning the heard.

Alexander abary

My basic knowledge of DNA analysis, after reading your monologue, is now comprehensive, understandably complete, that I can utilize in years to come. One crazy question: Can you tell a living creature to be half human and half animal belonging to the same species? Just my curiosity.


Bekijk de video: Het Wilde Westen van dna-testen (December 2021).