Informatie

10.3: Plasmiden worden gemakkelijk geïsoleerd uit bacteriële cellen - Biologie


Plasmide-isolatie maakt gebruik van de unieke structurele eigenschappen van plasmiden. Wat de isolatieprocedure ook is, de algemene principes van plasmide-isolatie zijn hetzelfde.

De figuur en paragrafen op de tegenoverliggende pagina vatten de stappen en algemene principes samen die worden gebruikt voor plasmide-isolatie.

  1. Lysis en denaturatie - Sterke denaturerende omstandigheden worden gebruikt om de taaie bacteriële celwand te verzwakken. De meest voorkomende procedures gebruiken een combinatie van een sterke base en een reinigingsmiddel. De detergentia helpen om lipiden in de celwand op te lossen, waardoor de denatureermiddelen de cel kunnen binnendringen. Eiwitten zijn vanwege hun fragiele structuren onomkeerbaar gedenatureerd. De behandeling verbreekt ook de waterstofbruggen die de twee strengen DNA-helices bij elkaar houden.
  2. Neutralisatie - Neutralisatie zorgt ervoor dat complementaire DNA-strengen opnieuw kunnen hechten en zorgt ervoor dat eiwitten neerslaan. Plasmiden renatureren omdat ze dat hebben supercoiled structuren die de twee strengen van de helix bij elkaar hebben gehouden tijdens denaturatie. Chromosomaal DNA kan echter niet renatureren, omdat de langere strengen vermengd zijn geraakt met gedenatureerde eiwitten. Monsters moeten bij deze stap voorzichtig worden gemengd om fragmentatie van het lange, chromosomale DNA in stukken te voorkomen die mogelijk opnieuw kunnen worden gehybridiseerd en samen met de plasmiden kunnen worden gezuiverd.
  3. Centrifugatie - Plasmide-DNA wordt door centrifugatie gescheiden van grote aggregaten van geprecipiteerde eiwitten en chromosomaal DNA.
  4. Extra zuivering - Plasmiden worden verder gezuiverd door organische extractie of adsorptie aan een hars.

De plasmiden waarmee we in dit lab werken, zijn bewaard in een laboratoriumstam van Escherichia coli. E coli is een proteobacterie die normaal gesproken voorkomt in het darmkanaal van warmbloedige zoogdieren. De virulente stammen van E coli die in het nieuws verschijnen, hebben, vaak door laterale genoverdracht, pathogeniteitseilanden verworven die genen bevatten voor virulentiefactoren, toxines en adhesie-eiwitten die belangrijk zijn voor weefselinvasie. Pathogeniteitseilanden zijn niet aanwezig in laboratoriumstammen, die derivaten zijn E coli stam K12. K12 is een verzwakte stam die de menselijke darm niet kan koloniseren. Het wordt al meer dan 70 jaar veilig in het laboratorium vermeerderd en gebruikt. De E coli stammen die in de moleculaire biologie worden gebruikt, zijn ook geselecteerd om grote aantallen plasmiden te verdragen.

We zullen de ZyppyTM (Zymo Research) kit gebruiken om plasmiden te zuiveren van de getransformeerdeE. coli stammen. De laatste zuiveringsstap in de procedure omvat een spinkolom van silicahars. Nucleïnezuren binden stevig aan silica in aanwezigheid van hoge zoutconcentraties. Na een wasstap die alle resterende eiwitten verwijdert, worden de plasmiden geëlueerd met een zoutarme oplossing. Plasmideoplossingen zijn zeer stabiel en kunnen lange tijd in de koelkast of vriezer worden bewaard.


Bacterietransductie

Genetische analyse van thermofiele bacteriën is beperkt tot slechts enkele soorten: Bacillus stearothermophilus (topt∼60°C), Thermus thermophilus (topt∼70°C), Thermoanaerobacter soort (topt∼60°C), en Thermotoga soort (topt80°C). In alle gevallen zijn de beschikbare genetische hulpmiddelen veel minder geavanceerd dan die welke worden gebruikt om mesofielen te bestuderen, zoals: E coli. Er worden drie methoden gebruikt om DNA in bacteriën te introduceren: transductie, conjugatie en transformatie. Transductie is DNA-overdracht die wordt gemedieerd door een bacterieel virus (bacteriofaag) dat een segment van genomisch DNA bevat dat van zijn vorige gastheer is verwijderd. Hoewel bekend is dat bacteriofagen die sommige thermofielen infecteren, geen enkele in staat is chromosomale genen over te dragen naar een geïnfecteerde gastheer. Echtelijke overdracht van DNA tussen cellen omvat cel-op-cel contact tijdens het overdrachtsproces en is bij sommigen waargenomen Thermus stammen in het laboratorium. Van andere thermofielen is niet aangetoond dat ze dit doen. Ten slotte vindt transformatie, het proces waarbij naakt DNA door cellen wordt opgenomen, plaats in alle hierboven genoemde thermofielen. Echter, alleen Thermus soorten ondergaan een ‘natuurlijke’ transformatie waarbij naakt DNA tijdens de groei door cellen wordt opgenomen zonder voorbehandeling van die cellen in het laboratorium. De andere organismen moeten gedwongen worden om DNA op te nemen door voorafgaande chemische behandeling van de cellen of door het DNA met elektrische kracht in cellen te drijven (elektroporatie).


Toegangsopties

Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

Alle prijzen zijn NET prijzen.
De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

Alle prijzen zijn NET prijzen.


CONTROLE VAN PLASMIDEREPLICATIE

Hoewel het aantal kopieën van het plasmide kan variëren in verschillende bacteriën, binnen een bepaalde gastheer en onder vaste groeiomstandigheden, heeft elk specifiek plasmide een kenmerkend aantal kopieën. Dit wordt bereikt door plasmide-gecodeerde controle-elementen die de initiatie van de replicatiestap reguleren. Controlesystemen handhaven de replicatiesnelheid in de stabiele toestand op gemiddeld één replicatieve gebeurtenis per plasmidekopie en celcyclus door afwijkingen van het gemiddelde aantal kopieën in afzonderlijke cellen te corrigeren. Om het aantal kopieën te definiëren en te behouden, gebruiken plasmiden negatieve regulerende circuits (251). De genetische analyse van replicatiecontrolemechanismen werd eerst uitgevoerd voor plasmide R1 door de isolatie van mutanten die een verhoogd aantal kopieën vertoonden (225). Karakterisering van deze mutanten gaf aan dat de determinanten van de controle van het aantal kopieën zich in het plasmide zelf bevonden en dat negatieve regulatoren (remmers), die bij de initiatiestap werkten, bij deze controle waren betrokken. Een model van controle van replicatie gemoduleerd door negatieve effectoren werd voor het eerst voorgesteld en in kwantitatieve termen beschreven door Pritchard et al. (252). Wanneer een plasmide een nieuwe gastheer koloniseert, zou de concentratie van deze negatieve regulatoren verwaarloosbaar moeten zijn. Dit lijkt wenselijk voor een succesvolle vestiging, aangezien ongehinderde plasmide-replicatie het mogelijk zou maken om het normale aantal kopieën in korte tijd te bereiken. Zodra het karakteristieke aantal kopieën is bereikt, vereist het behouden van het gemiddelde aantal kopieën in de populatie echter aanpassingen aan fluctuaties in deze waarde in individuele cellen. De controlesystemen doen precies dat door de replicatiesnelheid per plasmidekopie en celcyclus te verhogen of te verlagen. Individuele plasmidekopieën worden willekeurig geselecteerd voor replicatie uit een verzameling die gerepliceerde en niet-gerepliceerde kopieën omvat. Er bestaan ​​echter mechanismen die nieuw gerepliceerde moleculen tegenselecteren, bijvoorbeeld hemimethylering en supercoiling (3, 224).

Controle van replicatie door negatieve regulatoren en willekeurige selectie van plasmiden voor replicatie hebben een bijkomend gevolg: twee plasmiden met identieke replicons kunnen niet stabiel naast elkaar bestaan ​​in een bepaalde cel in afwezigheid van selectieve druk. Dit leidt tot segregatie van plasmiden binnen de gastheerpopulatie, een fenomeen dat bekend staat als plasmide-incompatibiliteit. De remming van plasmide-replicatie, geassocieerd met een verhoging van de gendosering van kopie-aantalcontrolegenen, is gebruikt om deze genen te identificeren (besproken in referenties 12, 51, 155, 222, 227 en 251).

Controle van replicatie door remmers zou vereisen dat ze de concentratie van plasmidekopieën in de cel zouden kunnen meten. Dit zou kunnen worden bereikt door een onstabiele remmer die constitutief tot expressie wordt gebracht of door een stabiele remmer die kort na elke initiatiegebeurtenis wordt gesynthetiseerd (252). Elk van deze alternatieven zou de initiatiefrequentie na elke initiatiegebeurtenis verminderen en zou de initiatiesnelheid van replicatie verhogen of verlagen wanneer het gemiddelde kopieaantal respectievelijk lager of hoger is dan vereist. Wanneer de frequentie van initiatie wordt bepaald door het niveau van een initiatoreiwit, zou een mechanisme voor gecontroleerde plasmidereplicatie (in tegenstelling tot faagreplicatie) zijn om het initiatoreiwit na elke replicatiegebeurtenis te inactiveren (255, 319).

Mechanismen die replicatie controleren zijn onderzocht in verschillende systemen (besproken in referentie 293a), en er zijn verschillende soorten remmers gedetecteerd: (i) antisense RNA (ColE1, R1 en pT181) (ii) zowel een antisense RNA als een eiwit (pMV158 en pIP501), en (iii) DNA-plaatsen voor het binden van initiatoreiwitten (F, P1, RK2 en R6K). Een schematische weergave van deze regelkringen is weergegeven in Fig. ​ Fig.9. 9 . Controle van replicatie door een eiwit (lambda-dv) is goed gedocumenteerd en gekwantificeerd (222), maar het is niet beschreven in natuurlijke plasmiden en wordt hier niet besproken. Accessoire-elementen die ook replicatie kunnen moduleren, maar die niet direct betrokken zijn bij het regelen van de initiatiefrequentie, worden evenmin besproken.

Controle van plasmide-DNA-replicatie. Voorbeelden van controle door Rep-DNA-bindingsplaatsen (plasmide P1), door antisense-RNA's (plasmiden R1 en pT181) en door een duaal systeem (plasmide pMV158) worden weergegeven. Transcripties worden weergegeven als doorlopende lijnen, met pijlpunten die de richting van de synthese aangeven. mRNA's worden getoond met dikkere lijnen dan antisense RNA's tegengeschreven RNA's (dunne lijnen met kleine pijlpunten) zijn aangegeven. Andere symbolen als volgt: vaste ellipsen, rechthoeken van oorsprong, promotors a.r.b.s., atypische ribosoom-bindingsplaats parallelle verticale lijnen, mRNA-ctRNA-interacties plus, positieve interacties minus en remmende RNA-RNA- of eiwit-DNA-interacties.

Controle door Antisense RNA

Interacties tussen RNA's kunnen de beschikbaarheid van ofwel een pRNA ofwel het niveau van een snelheidsbeperkend Rep-eiwit moduleren, die essentieel zijn voor replicatie. Antisense-RNA's die het aantal kopieën van het plasmide controleren, zijn complementair aan een gebied in het 5′-uiteinde van het doeltranscript (preprimer-RNA voor replicatie of rep mRNA) en worden tegengeschreven RNA's'x0201d (ctRNA's) genoemd (227, 228, 309). In sommige gevallen wordt remming door ctRNA's bereikt in het gebied van paring met het doel-RNA. In andere gevallen leidt de vorming van de remmer-doelwitduplex tot een conformationele verandering in het doeltranscript, dat inactief wordt gemaakt. Voorbeelden van deze controlemechanismen worden hieronder beschreven.

Controle van primer-RNA-verwerking: plasmide ColE1.

ColE1 was het eerste voorbeeld waarbij controle van replicatie bleek te worden uitgeoefend door RNA (170, 296). In feite leidden de analyses van kopie-aantalcontrolecircuits van ColE1 tot de identificatie van antisense-RNA's, een mijlpaalontdekking in de moleculaire biologie. trans-werkende antisense RNA's maken het mogelijk om specifieke genen tot zwijgen te brengen door ze te koppelen aan mRNA-moleculen. De bases van de controle van ColEl-replicatie zijn algemeen bekend (besproken in referenties 47 en 82). Initiatie van replicatie wordt op gang gebracht door een transcript van 550 nucleotiden, RNA II, dat wordt gemaakt door RNAP en specifiek wordt verwerkt door RNase H. Deze verwerking is vereist voor de overgang van RNA naar DNA-synthese, omdat het een 3′-OH genereert einde waarop Pol I de synthese van de leidende streng initieert. De beschikbaarheid van dit 3′-OH-uiteinde is snelheidsbeperkend voor initiatie en wordt gemoduleerd door een RNA van 108 nucleotiden, het antisense RNA I, dat volledig complementair is aan een gebied in het 5′-uiteinde van het pRNA II. Hybride vorming tussen het antisense en het preprimer-RNA verandert de algehele secundaire structuur van de preprimer. Als gevolg van deze conformatieverandering kan het 3′ uiteinde van de preprimer niet hybridiseren met het DNA. Dit remt op zijn beurt de initiatie van replicatie omdat, bij afwezigheid van DNA-RNA hybride vorming, de preprimer niet wordt verwerkt door RNase H. Genetische en biochemische analyses toonden aan dat interacties van het antisense RNA met de complementaire sequenties van de preprimer optreden aanvankelijk op gebieden die zijn blootgesteld als enkelstrengs lussen op beide gevouwen RNA-moleculen. De vorming van dit eerste contact (of “kissing” complex) is de snelheidsbeperkende stap van de interactie en leidt tot de volledige annealing van het antisense RNA I met het preprimer RNA II, in een proces dat begint bij de 5′ einde van het RNA I. Het RNA I wordt gesynthetiseerd vanuit een constitutieve promotor (daarom is het niveau ervan evenredig met het aantal kopieën van het plasmide) en is onstabiel. Een hulprol wordt geleverd door een klein basiseiwit, Rop of Rom genoemd (276, 304). Rop interageert met het antisense RNA en met de preprimer, waardoor de efficiëntie van de vorming van het complex wordt verhoogd en dus de efficiëntie van de replicatie afneemt. Het gen dat codeert voor dit eiwit is geen incompatibiliteitsdeterminant, maar het kan de antisense RNA I-gemedieerde incompatibiliteit versterken.

Kopieer nummercontrole van plasmide R1.

Kopieaantalcontrole in R1 wordt uitgeoefend op het niveau van RepA-synthese, die wordt gemoduleerd door de producten van de kopieaantalcontrolegenen, agentB en copA (beoordeeld in referenties 224 en 309). De producten van agentB en van copA verbieden repA expressie op respectievelijk transcriptioneel en posttranscriptioneel niveau. RepA is snelheidsbeperkend voor replicatie, werkt bij voorkeur in cisen kan niet opnieuw worden gebruikt. Het belangrijkste controlegen voor het aantal kopieën is: copA, terwijl agentB speelt een bijrol. copA wordt getranscribeerd van een constitutieve promotor en het product ervan is een onstabiel (halfwaardetijd, 2 min) RNA, CopA, dat complementair is aan een leiderregio (genaamd CopT) van de repA mRNA. Hybride vorming tussen CopA en zijn CopT-doelwit wordt ook bereikt door de vorming van een complex. De CopA-CopT-hybride remt de RepA-synthese door de translatie van een leider-peptide-coderend gen te belemmeren, tik, die translationeel gekoppeld is aan repA (26). De efficiëntie van remming hangt af van de affiniteit van de vorming van kissing-complexen (besproken in referentie 226). mutaties in copA die de efficiëntie van de complexvorming verminderen, verhogen het aantal kopieën, maar de replicatie wordt nog steeds gecontroleerd. Volledige inactivering van CopA leidt echter tot ongecontroleerde (op hol geslagen) replicatie (besproken in referenties 224 en 226). De duplex CopA-CopT wordt specifiek gesplitst door RNase III, en deze splitsing lijkt een belangrijke stap te zijn in de controle van RepA-synthese (25). Mutatieanalyse uitgevoerd bij copA toonde aan dat de structuur van de belangrijkste stam-lus in CopA belangrijk is voor zijn functie. De aanwezigheid van uitstulpingen in het stamgebied van CopA is vereist voor snelle duplexvorming met zijn CopT-doelwit in vitro, evenals voor effectieve remming in vivo (126). Bovendien lijkt de aanwezigheid van uitpuilende nucleotiden in de CopA-stam te resulteren in een structurele destabilisatie die een beschermende rol speelt tegen afbraak door RNase III (125). Structurele en functionele studies over CopA hebben ons in staat gesteld om een ​​directe correlatie te trekken tussen gendosering (plasmide-kopieaantal) en CopA-niveaus. Dit bepaalt een constante replicatiesnelheid, onafhankelijk van het aantal kopieën van het plasmide of de groeisnelheid van de gastheer. Uit deze resultaten vloeien twee consequenties voort: (i) de frequentie van plasmide-replicatie per kopie is ϡ wanneer het aantal plasmidekopieën per cel onder het gemiddelde ligt en ρ wanneer het aantal kopieën boven het gemiddelde ligt en (ii) het aantal kopieën van R1 neemt toe met afnemende groeisnelheid van de gastheer. Een constante replicatiesnelheid per cel, onafhankelijk van het aantal kopieën, zal langzaam afwijkingen van de gemiddelde frequentie van plasmide-replicatie corrigeren (één per plasmide-kopie per celcyclus), en daarom zal het het gemiddelde aantal kopieën actief constant houden (222). Het tweede regulerende element in R1, het CopB-eiwit, speelt onder normale omstandigheden een ondersteunende rol. Dit kleine dimere en basische eiwit onderdrukt de transcriptie van repA van een promotor, P2, die zich stroomafwaarts van bevindt agentB (Afb. ​ (Afb.9). 9 ). Onder steady-state-omstandigheden is CopB aanwezig in verzadigende concentraties, waardoor transcriptie van volledig wordt onderdrukt P2 tot een basaal niveau. Onder deze omstandigheden is de repA mRNA wordt voornamelijk gesynthetiseerd als een polycistronisch copB-tap-repA RNA. Onder omstandigheden waarin het aantal kopieën daalt of laag is vanwege de vroege stadia van de vorming van plasmiden, is de CopB-gemedieerde repressie echter niet efficiënt. In deze omstandigheden is de P2 promotor is depressief en repA wordt ook getranscribeerd als a tap-repA mRNA. Dit leidt tot een tijdelijke verhoging van de transcriptiesnelheid van repA en als gevolg daarvan tot een tijdelijke toename van de frequentie van plasmide-replicatie. Dus derepressie van de P2 promotor zou een belangrijke rol spelen tijdens de vroege fase van de vestiging van plasmiden of in situaties waarin het aantal kopieën onder het wildtype-niveau valt (224, 320). Een computergebaseerde simulatie suggereerde echter dat de hulpregellus die door CopB wordt gemedieerd, slechts een marginaal effect zou hebben, niet alleen onder steady-state-omstandigheden, maar ook tijdens de vestiging van het plasmide (259).

Andere gevallen van controle door antisense RNA's.

Er zijn andere voorbeelden waarin replicatie wordt gecontroleerd door antisense-RNA. In plasmiden van de IncIα en IncIβ groepen wordt de controle van de replicatie bijvoorbeeld gemoduleerd door een kort ctRNA dat, zoals in R1, de synthese van een snelheidsbeperkend Rep-eiwit remt, dat op zijn beurt translationeel is gekoppeld aan de synthese van een leiderpeptide. Remming door ctRNA wordt uitgeoefend op posttranscriptioneel niveau door de synthese van het leiderpeptide te belemmeren. Bovendien voorkomt ctRNA de vorming van een activator-RNA-pseudoknoop die nodig is voor een efficiënte synthese van het Rep-eiwit (besproken in referentie 309).

Antisense RNA is betrokken geweest bij het tot zwijgen brengen van de ori-γ van plasmide R6K (243, 244). Replicatie vanaf deze oorsprong vereist de synthese van een activator-RNA dat begint binnen de zeven iterons van de oorsprong en tot zwijgen wordt gebracht door het antisense-RNA. Het replicatie-initiator-eiwit, π, lijkt de interactie tussen deze transcripten te bevorderen. Dit regelsysteem is onafhankelijk van het systeem dat wordt gemoduleerd door iterons. R6K is niet het enige theta-replicerende iteron-bevattende plasmide waarin antisense-RNA een rol speelt bij het reguleren van replicatie. In plasmide ColE2 is een ctRNA complementair aan de leider rep mRNA is betrokken geweest bij de controle van replicatie op posttranscriptioneel niveau door het genereren van een ctRNA-mRNA-hybride die een sequentie(s) sequestreert die essentieel zijn voor Rep-synthese anders dan het SD-gebied (287, 323).

Directe remming van Rep-synthese: blokkering rep vertaling.

Een directe manier om het aantal kopieën van het plasmide door een ctRNA te controleren, is de remming van de Rep-synthese door de toegankelijkheid van de ribosomen tot de rep mRNA-translatie-initiatiesequenties. Dit type controle is voorgesteld voor sommige plasmiden die repliceren door de mechanismen van strengverplaatsing (R1162) (154) en RC-replicatie (pMV158) (67). In beide gevallen is de belangrijkste incl determinant is gelokaliseerd in een gebied dat codeert voor een ctRNA, en de vermeende signalen voor de initiatie van rep vertaling worden geplaatst op een voorspelde lus van de rep mRNA. In het geval van R1162/RSF1010 wordt de frequentie van initiatie bepaald door het niveau van het RepC DNA-bindende eiwit (112, 153). Uitdrukking van repC wordt op transcriptioneel niveau gereguleerd door het eerste gen van de repC operon (179) en op translationeel niveau door een ctRNA dat complementair is aan de translatie-initiatiesignalen van repC (154). Welke van deze twee regulerende mechanismen de RepC-synthesesnelheid beperkend maakt, is nog niet goed begrepen. In het RC-replicerende plasmide pMV158 is een ctRNA voorgesteld om de translatie van de repB gen door directe interactie met de initiatie van translatiesequenties die aanwezig zijn in de repB mRNA (67, 71, 72). Secundaire structuren in het ctRNA, anders dan die overeenkomend met de transcriptionele terminator, zijn niet gevonden. Plasmiden zonder het DNA-gebied dat codeert voor deze terminator en de complementaire structuur op de agent-vertegenwoordiger mRNA zijn nog steeds gevoelig voor het wildtype ctRNA dat wordt geleverd in trans, wat suggereert dat de vorming van een kissing-complex belangrijk kan zijn, maar niet essentieel is voor het genereren van het hybride ctRNA-mRNA. Een meer complexe regulerende lus in pMV158, die de gezamenlijke deelname van het ctRNA en van een repressor Cop-eiwit omvat, werd later beschreven (zie hieronder). Analoge genetische structuren in het replicatiegebied zijn gevonden in plasmiden van de pMV158-familie (69). Een tweecomponentensysteem (Cop-eiwit en antisense-RNA) dat de replicatie van plasmide pIP501 regelt, is ook voorgesteld (35 zie hieronder). Voor plasmide pUB110 lijkt de synthese van het initiator RepU-eiwit te worden gecontroleerd door twee antisense-ctRNA's die interfereren met repU translatie, aangezien de vermeende ctRNA's complementair zijn aan repU initiatie van translatiesequenties (178), hoewel een controlemechanisme vergelijkbaar met dat van pT181 ook is gesuggereerd (11, 249). Aangezien de synthese van RepU echter autogereguleerd is (207), moet mogelijk een complexer controleniveau worden overwogen.

Transcriptionele verzwakking: het pT181-paradigma.

Een enkelvoudig controlemechanisme voor het aantal kopieën, waarbij ctRNA's betrokken zijn, is goed ingeburgerd voor pT181 (119, 169, 227, 228). Het huidige model voor de controle van de replicatie van pT181 (referenties 227 en 228 en referenties daarin) stelt voor dat de synthese van de Rep-initiator wordt beperkt door twee kleine ctRNA's (met hetzelfde 5′ uiteinde maar verschillende 3′ uiteinden), die complementair aan het onvertaalde 5′ einde van de rep mRNA (44, 119, 227, 229). De initiële vorming van kussencomplexen tussen ctRNA's en rep mRNA zou plaatsvinden via nucleotiden die zijn blootgesteld in complementaire lussen van haarspeldstructuren die op beide RNA-soorten kunnen worden gevormd. Vorming van de ctRNA-mRNA-hybride zou leiden tot een conformationele verandering in een gebied van het mRNA dat ver verwijderd is van het gebied van complementariteit. De nieuwe mRNA-configuratie zou zodanig zijn dat een nieuwe haarspeld eindigend op een A(U)6 volgorde zou kunnen vormen. Deze secundaire structuur lijkt op een Rho-onafhankelijke transcriptieterminator en kan daarom de . afkappen rep mRNA (230). Dus transcriptionele verzwakking (zoals gevonden bij de controle van veel biosynthetische operons) (161), in plaats van het blokkeren van de translatie-initiatie, is het mechanisme voor het regelen van het aantal kopieën van pT181. Een soortgelijke controle, door voortijdige beëindiging van de rep mRNA gepromoot door de indirecte werking van een ctRNA, is voorgesteld voor plasmiden van de pIP501/pAM㬡-familie (33). Voor pIP501 is aangetoond dat stappen die plaatsvinden vóór de vorming van stabiele ctRNA-mRNA-duplex voldoende zijn om de mRNA-synthese te verzwakken (34).

Controle door zowel transcriptionele repressor als antisense RNA

Controle door de gezamenlijke werking van een transcriptionele repressor en een antisense-RNA is gekarakteriseerd voor plasmiden R1, pMV158 en, meer recentelijk, pIP501, hoewel verschillen in de rol van de componenten zijn gevonden (35, 69, 71, 72, 224 ). Zoals hierboven beschreven, wordt de belangrijkste controle in R1 uitgeoefend door het ctRNA CopA, terwijl CopB een hulprol speelt. In feite, verwijdering van agentB leidt slechts tot een matige toename van het aantal kopieën van het plasmide, en de agentB gen gekloneerd in een compatibel replicon vertoont geen onverenigbaarheid met R1.

In het geval van pMV158 bindt een transcriptionele repressor, CopG, aan en onderdrukt transcriptie van een enkele promotor voor zowel de copG en repB genen (66). Mutaties of deleties in copG leiden tot een toename van het aantal kopieën van het plasmide (7), en copG oefent slechts een zwakke onverenigbaarheid uit ten opzichte van plasmiden met het pMV158-replicon wanneer het wordt gekloond, onder zijn eigen transcriptie- en translatiesignalen, in een compatibele vector met een hoog aantal kopieën (67). Een tweede element dat betrokken is bij de controle van het aantal kopieën is een klein tegengeschreven RNA, RNA II, dat complementair is aan een gebied van de agent-vertegenwoordiger mRNA tussen genen copG en repB. rnaII is een sterke incl determinant bij levering in trans bij hoge gendosering. Mutaties die de synthese van het ctRNA afschaffen, leiden ook tot een toename van het aantal kopieën, maar de replicatie wordt nog steeds gecontroleerd door CopG. In dit geval werden echter grote fluctuaties in het aantal kopieën binnen individuele cellen waargenomen (71). Er werd geen significante onverenigbaarheid met plasmiden met het pMV158-replicon gevonden toen de rnaII gen werd gekloneerd in een plasmide met een laag aantal kopieën (71). De elementen van het stuurcircuit (copG en/of rnaII) zijn gekloond met een fysiologische gendosering (d.w.z. met een kopieaantal dat vergelijkbaar is met dat van het wildtype plasmide). In dit geval werd een sterke incompatibiliteit met pMV158 gevonden toen het hele circuit was voorzien van trans terwijl beide afzonderlijk gekloonde componenten zwak vertoonden (ctrnaII) of niet (copG) onverenigbaarheid. De hypothese die uit deze experimenten werd afgeleid, was dat de controle van de replicatie van pMV158 wordt uitgeoefend door het gehele regulerende circuit in plaats van door een hiërarchie van een van de componenten (71). Als gevolg van de genetische organisatie van de plasmiden van de pMV158-familie lijkt er in al deze plasmiden een soortgelijk regelcircuit te bestaan ​​(61).

Het theta-replicerende plasmide pIP501 lijkt kenmerken te delen met R1 en pMV158 in hun replicatiecontrolecircuit. Net als R1 is het CopR-eiwit van pIP501 geen regulator van zijn eigen synthese, maar onderdrukt het transcriptie van de essentiële stroomafwaartse rep promotor (31). Echter, en in tegenstelling tot R1, remde de CopR rep promotor wordt niet volledig onderdrukt, een situatie die lijkt op pMV158. Het tweede element dat het aantal kopieën van pIP501 reguleert, is het ongewoon langlevende antisense-RNA III (35). De stabiliteit van dit antisense RNA III vormt het probleem van correcties van neerwaartse schommelingen in het aantal kopieën, aangezien een afname van het aantal plasmidekopieën niet snel zal worden gevolgd door een gelijktijdige verlaging van de niveaus van de remmer. Dit zou leiden tot plasmideverlies, wat niet is waargenomen (139a). Om deze schijnbare paradox op te lossen, zou een model vergelijkbaar met het model dat is voorgesteld voor pMV158 (71), waarin een verlaging van het pIP501-kopieaantal zou leiden tot derepressie van de rep promotor als gevolg van verlaging van de CopR-niveaus, is gepostuleerd (35).

De recente bevinding dat het RepU-eiwit van plasmide pUB110 zijn eigen synthese reguleert, waardoor een extra controle voor het plasmide-kopieaantal (207) wordt geïntroduceerd, zou een ander voorbeeld zijn van dubbele controle (transcriptionele en translationele regulatie). Mechanistisch gezien kunnen de situaties voor pUB110 en pMV158 niet te onderscheiden zijn, wat kan wijzen op een meer algemene controle van het replicatiemechanisme in deze plasmiden die repliceren door de RC-modus.

Controle door Iterons

De Rep-eiwitten van de theta-replicerende iteron-bevattende plasmiden worden ofwel automatisch gereguleerd of staan ​​onder transcriptionele controle, en de iterons spelen een rol bij de controle van het aantal kopieën van het plasmide (besproken in referenties 51, 155 en 223). De rol van de iterons werd aanvankelijk beschreven voor plasmide F, gebaseerd op de observatie dat: oriS-afhankelijke replicatie werd geremd wanneer de iterons van oriS werden gekloneerd op een compatibel plasmide (295). Soortgelijke situaties werden ook gevonden voor andere iteron-bevattende plasmiden, zoals P1 of R1162/RSF1010. De mate van remming in P1 bleek evenredig te zijn met het aantal gekloonde iterons (238), terwijl in R1162 de remming werd opgeheven door overproductie van het snelheidsbeperkende Rep-eiwit (153). Deze waarnemingen leidden tot de formulering van het titratiemodel (303). Het model nam aan dat het Rep-eiwit snelheidsbeperkend is voor initiatie en dat iterons het Rep-eiwit titreren, waardoor de frequentie van initiatie wordt beperkt. Er ontstond een paradox toen de Rep-eiwitten van de meeste iteron-bevattende plasmiden autoregulatie bleken te zijn, wat impliceert dat titratie overwonnen zou kunnen worden door derepressie (49). Bovendien was in andere systemen (R6K en RK2) de hoeveelheid Rep-eiwit in de cel blijkbaar te groot om beperkend te zijn voor verzadiging van iteronbinding (88, 190). Dit leidde tot de wijziging van het initiële model en tot het voorstel dat verschillende vormen van het Rep-eiwit betrokken waren bij autoregulatie en initiatie, zodat initiatortitratie geen derepressie veroorzaakt (302). Er is een computermodel ontwikkeld dat zich aanpast aan deze hypothese (321).

Een tweede oplossing voor de titratie/autoregulatie-paradox werd geleverd door het model dat Rep-moleculen gebonden aan de P1-iterons nog steeds in staat waren om de repA promotor (49). Het model was gebaseerd op het vermogen van Rep-eiwitten om gelijktijdig aan twee iterons te binden (in zowel P1 als R6K) (204). Deze eigenschap van de Rep-eiwitten vormde ook de basis voor een nieuw model van negatieve controle van replicatie, het model genaamd 'csteric hindernis' (238) of 'chandcuffing' (155, 191). Volgens dit model, wanneer Rep-eiwitten binden aan de iterons van de oorsprong en deze verzadigen, vindt initiatie plaats als het aantal kopieën van het plasmide laag is. Naarmate het aantal kopieën toeneemt, beginnen Rep-moleculen die aan de iterons van één oorsprong zijn gebonden, een interactie aan te gaan met vergelijkbare complexen die op andere oorsprong zijn gegenereerd. Als gevolg hiervan paren plasmidemoleculen door middel van Rep-Rep-interacties, wat een sterische belemmering veroorzaakt voor de functie van beide oorsprongen (“handcuffing”). De plasmidenparen worden blijkbaar gescheiden tijdens daaropvolgende celgroei en het initiatiepotentieel van individuele moleculen wordt hersteld. Volgens dit model is het de iteronconcentratie, in plaats van het niveau van Rep-expressie, die de replicatiesnelheid bepaalt. De vraag naar de rol van autoregulatie blijft open en er is geen eenvoudig antwoord gegeven. Zoals hierboven vermeld, heeft in RK2 en R6K een aanzienlijke afname van de niveaus van Rep-eiwit geen effect op de snelheid van plasmide-replicatie. In P1 maakt een tweevoudige verlaging van het niveau van het Rep-eiwit echter een einde aan de replicatie en een viervoudige toename kan leiden tot remming van de replicatie (238). Evenzo is in R6K een tweevoudige toename van de initiatorconcentratie remmend voor de initiatie. Deze gegevens geven aan dat autoregulatie, althans in sommige gevallen, belangrijk is om een ​​optimale concentratie van het initiatoreiwit te behouden. Recent is gesuggereerd dat met name plasmiden waarin initiatoren beperkend zijn, initiatortitratie en initiatorparen (handboeien) zouden kunnen samenwerken (51).

Sommige van de replicons die iterons in de oorsprong bevatten, bevatten ook iterons buiten dit gebied, die onverenigbaarheid uitdrukken en de replicatiesnelheid verder verlagen (237). In principe neemt de kans op Rep-gemedieerde iteron-paring sterk toe bij deze replicons, omdat het kan voorkomen in cis door DNA-looping en in verschillende combinaties in trans. Aangezien controlesystemen het aantal kopieën moeten meten en aangezien intramoleculaire koppeling onafhankelijk is van deze parameter, kan deze koppeling afwijkingen van het gemiddelde aantal kopieën niet corrigeren. Intramoleculaire koppeling kan echter het niveau regelen waarop de kopieercontrole werkt (besproken in referentie 223). Een andere vraag is of de iterons binnen en buiten het oorsprongsgebied even effectief zijn als replicatiecontrole-elementen. Recent data on RK2 and P1 plasmids indicate that iterons outside of ori are more effective as negative regulators of replication than are iterons present in the origin region, probably due to differences in the quantitative and structural features of the two sets (5, 273). It has been proposed that in RK2 these auxiliary iterons stimulate initial pairing between origins. The data for P1 indicate that the concentration of the auxiliary iterons rather than their relative arrangements is the deterministic factor for replication control (51).

The role played by Rep proteins of iteron-containing plasmids in the control of replication and in autoregulation implies that specific rep mutations affecting protein-protein or protein-DNA interactions could increase the plasmid copy number. In R6K, copy-up mutations affecting the plasmid initiator protein have been obtained (87). Most of the copy-up mutations affected a 32-amino-acid region placed between the LZ motif and the putative DNA-binding domain of the π protein, a region that seems to be involved in high-order oligomerization of the initiator protein (199). Mutations that affect the LZ motif of the Rep protein and lead to copy-up phenotypes in pSC101 have been described (133). Copy-up mutants of plasmid RK2 containing mutations encoding TrfA variants defective in binding to DNA have been isolated, indicating that copy number control is modulated by TrfA-DNA interactions (46). Copy-up mutations in the trfA gene have also been selected as intragenic suppressors of thermosensitive trfA mutations. Some of these copy-up mutations were proposed to reduce a strong protein-protein inhibitory interaction induced, at the restrictive temperature, by the thermosensitive mutation (114).

Hemimethylation and Regulation of Plasmid Replication

The heptamer repeats containing the methylation sites in the origin of replication of plasmid P1 constitute the target of the host protein SeqA, involved in sequestering hemimethylated oric into the bacterial membrane (37). Methylation seems to regulate replication at two different levels. First, hemimethylation would exert a negative regulation through ori-membrane interactions. The newly replicated, hemimethylated DNA is sequestered in the cell membrane, thus preventing reinitiation. The sequestration is relieved as the hemimethylated DNA undergoes new methylation (51). At a second level, methylation increases the initiation efficiency both in vivo and in vitro. This stimulation could be due to enhanced bending or unwinding of the DNA or to recycling of initiators (3, 51).

Synopsis

Plasmid DNA replication occurs coupled to the cell cycle of the bacterial host in such a way that a fixed concentration of plasmids is maintained in the bacterial population. This is achieved by mechanisms that monitor the initiation frequency and adjust this frequency to an average of one replication per plasmid copy and cell cycle. The control of plasmid replication is plasmid encoded and is performed by molecules (antisense RNA, proteins, or DNA sequences) that inhibit the initiation of replication in a dose-dependent way. This inhibition can limit the level of active Rep protein, the availability of the primer for the leading strand, or the number of active origins. Control of plasmid replication may be exerted (i) by a single inhibitor, (ii) by a main controller and an auxiliary element, or (iii) by the concerted action of two inhibitors (a protein and an antisense RNA or two sets of iterons). In general, any model on control of plasmid replication should explain how the average plasmid copy number is maintained in a growing population and how fluctuations on this average are corrected.


Biology of Serpins

Sangeeta R. Bhatia , . Cliff J. Luke , in Methods in Enzymology , 2011

2.2.2 Generation of transgenic lines for purification of serpin targets

Plasmid DNA microinjection is an essential tool for C. elegans research and is a straightforward technique for incorporating exogenous DNA into worms ( Kimble et al., 1982 Mello and Fire, 1995 Stinchcomb et al., 1985 ). Transgenic animals are created by microinjection of the plasmid DNA directly into the distal arm of the gonad ( Berkowitz et al., 2008 ). The plasmid DNA encoding a given gene of interest is usually coinjected with another plasmid that serves as a transformation marker, providing either a physical ( Kramer et al., 1990 ) or visual ( Gu et al., 1998 ) phenotype by which to selectively identify transgenic animals. The plasmid DNA undergoes recombination to form extrachromosomal arrays that contain multiple copies of the coinjected DNAs in transgenic animals produced via microinjection ( Mello et al., 1991 ). However, extrachromosomal arrays are not passed on to all progeny. Therefore, to maximize the amount of serpin that can be purified, it is advisable to integrate the array into the genome of the animal. For purification of serpin:protease complexes, it is necessary to create transgenic lines expressing the TrAP tag::serpin fusion protein with the knockout allele, for example, TrAP::SRP-6 in the srp-6(ok319) knockouts. This will then maximize the yield of serpin:protease complexes obtained by eliminating the native serpin that will not be purified by the TAP procedure. The methods for creating transgenic lines and integration of the extrachromosomal array are discussed in detail in Chapter 13 .


What is Recombinant DNA Technology

Recombinant DNA technology is a molecular biology technique used to produce recombinant DNA molecules that carry the desired characteristic to a particular organism. Molecular cloning is the laboratory technique used to produce a large copy number of recombinant DNA coupled with PCR. The process of molecular cloning consists of seven steps as described below.

  1. Choice of host organism and cloning vector – The host organism is mainly bacteria. The choice of cloning vector depends on the choice of the host organism, the size of the foreign DNA fragment, and the level of expression.
  2. Preparation of vector DNA – The cloning vector is digested with restriction enzymes to make compatible ends with the foreign DNA fragment.
  3. Preparation of DNA to be cloned – The desired DNA fragment to be cloned can be amplified by PCR and digested with the restriction enzymes to generate compatible ends with the cloning vector.
  4. Creation of recombinant DNA – The digested cloning vector and the PCR fragment are ligated by treating with DNA ligase.
  5. Introduction of recombinant DNA into the host organism – The recombined DNA molecules are transformed into bacteria to obtain a large number of copies.
  6. Selection of transformed organisms – a selectable marker such as antibiotic resistance can be used to select the transformed bacteria in a culture.
  7. Screening for clones with desired DNA – The blue-white screening system, PCR, restriction fragment analysis, nucleic acid hybridization, DNA sequencing, and antibody probes can be used to screen the clones with desired DNA fragment.

The steps of recombinant DNA technology is shown in Figuur 1.

Figure 1: Recombinant DNA Technology


Method #4: A quick way

Colony screening with Polymerase Chain Reaction (PCR) is the most rapid initial screen to determine the presence of the DNA insert. Colony PCR involves lysing the bacteria and amplifying a portion of the plasmid with either insert-specific or vector-specific primers. If you need to determine the orientation of your insert, it is recommended to combine both types of primers for your analysis.

If selecting colony screening by PCR, make sure that your insert is shorter than 3 kb. Some PCR reagents will allow you to add a portion of your individual colony directly to a PCR master mix, with the remaining portions being used to inoculate a culture plate or liquid media with appropriate antibiotic for downstream applications.


Move over CRISPR, the retrons are coming

3D-model of DNA. Credit: Michael Ströck/Wikimedia/ GNU Free Documentation License

While the CRISPR-Cas9 gene editing system has become the poster child for innovation in synthetic biology, it has some major limitations. CRISPR-Cas9 can be programmed to find and cut specific pieces of DNA, but editing the DNA to create desired mutations requires tricking the cell into using a new piece of DNA to repair the break. This bait-and-switch can be complicated to orchestrate, and can even be toxic to cells because Cas9 often cuts unintended, off-target sites as well.

Alternative gene editing techniques called recombineering instead perform this bait-and-switch by introducing an alternate piece of DNA while a cell is replicating its genome, efficiently creating genetic mutations without breaking DNA. These methods are simple enough that they can be used in many cells at once to create complex pools of mutations for researchers to study. Figuring out what the effects of those mutations are, however, requires that each mutant be isolated, sequenced, and characterized: a time-consuming and impractical task.

Researchers at the Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University and Harvard Medical School (HMS) have created a new gene editing tool called Retron Library Recombineering (RLR) that makes this task easier. RLR generates up to millions of mutations simultaneously, and "barcodes" mutant cells so that the entire pool can be screened at once, enabling massive amounts of data to be easily generated and analyzed. The achievement, which has been accomplished in bacterial cells, is described in a recent paper in PNAS.

"RLR enabled us to do something that's impossible to do with CRISPR: we randomly chopped up a bacterial genome, turned those genetic fragments into single-stranded DNA in situ, and used them to screen millions of sequences simultaneously," said co-first author Max Schubert, Ph.D., a postdoc in the lab of Wyss Core Faculty member George Church, Ph.D. "RLR is a simpler, more flexible gene editing tool that can be used for highly multiplexed experiments, which eliminates the toxicity often observed with CRISPR and improves researchers' ability to explore mutations at the genome level."

Retrons: from enigma to engineering tool

Retrons are segments of bacterial DNA that undergo reverse transcription to produce fragments of single-stranded DNA (ssDNA). Retrons' existence has been known for decades, but the function of the ssDNA they produce flummoxed scientists from the 1980s until June 2020, when a team finally figured out that retron ssDNA detects whether a virus has infected the cell, forming part of the bacterial immune system.

While retrons were originally seen as simply a mysterious quirk of bacteria, researchers have become more interested in them over the last few years because they, like CRISPR, could be used for precise and flexible gene editing in bacteria, yeast, and even human cells.

"For a long time, CRISPR was just considered a weird thing that bacteria did, and figuring out how to harness it for genome engineering changed the world. Retrons are another bacterial innovation that might also provide some important advances," said Schubert. His interest in retrons was piqued several years ago because of their ability to produce ssDNA in bacteria—an attractive feature for use in a gene editing process called oligonucleotide recombineering.

Recombination-based gene editing techniques require integrating ssDNA containing a desired mutation into an organism's DNA, which can be done in one of two ways. Double-stranded DNA can be physically cut (with CRISPR-Cas9, for example) to induce the cell to incorporate the mutant sequence into its genome during the repair process, or the mutant DNA strand and a single-stranded annealing protein (SSAP) can be introduced into a cell that is replicating so that the SSAP incorporates the mutant strand into the daughter cells' DNA.

"We figured that retrons should give us the ability to produce ssDNA within the cells we want to edit rather than trying to force them into the cell from the outside, and without damaging the native DNA, which were both very compelling qualities," said co-first author Daniel Goodman, Ph.D., a former Graduate Research Fellow at the Wyss Institute who is now a Jane Coffin Childs Postdoctoral Fellow at UCSF.

Another attraction of retrons is that their sequences themselves can serve as "barcodes" that identify which individuals within a pool of bacteria have received each retron sequence, enabling dramatically faster, pooled screens of precisely-created mutant strains.

To see if they could actually use retrons to achieve efficient recombineering with retrons, Schubert and his colleagues first created circular plasmids of bacterial DNA that contained antibiotic resistance genes placed within retron sequences, as well as an SSAP gene to enable integration of the retron sequence into the bacterial genome. They inserted these retron plasmids into E. coli bacteria to see if the genes were successfully integrated into their genomes after 20 generations of cell replication. Initially, less than 0.1% of E. coli bearing the retron recombineering system incorporated the desired mutation.

To improve this disappointing initial performance, the team made several genetic tweaks to the bacteria. First, they inactivated the cells' natural mismatch repair machinery, which corrects DNA replication errors and could therefore be "fixing" the desired mutations before they were able to be passed on to the next generation. They also inactivated two bacterial genes that code for exonucleases—enzymes that destroy free-floating ssDNA. These changes dramatically increased the proportion of bacteria that incorporated the retron sequence, to more than 90% of the population.

Name tags for mutants

Now that they were confident that their retron ssDNA was incorporated into their bacteria's genomes, the team tested whether they could use the retrons as a genetic sequencing "shortcut," enabling many experiments to be performed in a mixture. Because each plasmid had its own unique retron sequence that can function as a "name tag", they reasoned that they should be able to sequence the much shorter retron rather than the whole bacterial genome to determine which mutation the cells had received.

First, the team tested whether RLR could detect known antibiotic resistance mutations in E coli. They found that it could—retron sequences containing these mutations were present in much greater proportions in their sequencing data compared with other mutations. The team also determined that RLR was sensitive and precise enough to measure small differences in resistance that result from very similar mutations. Crucially, gathering these data by sequencing barcodes from the entire pool of bacteria rather than isolating and sequencing individual mutants, dramatically speeds up the process.

Then, the researchers took RLR one step further to see if it could be used on randomly-fragmented DNA, and find out how many retrons they could use at once. They chopped up the genome of a strain of E. coli highly resistant to another antibiotic, and used those fragments to build a library of tens of millions of genetic sequences contained within retron sequences in plasmids. "The simplicity of RLR really shone in this experiment, because it allowed us to build a much bigger library than what we can currently use with CRISPR, in which we have to synthesize both a guide and a donor DNA sequence to induce each mutation," said Schubert.

This library was then introduced into the RLR-optimized E coli strain for analysis. Once again, the researchers found that retrons conferring antibiotic resistance could be easily identified by the fact that they were enriched relative to others when the pool of bacteria was sequenced.

"Being able to analyze pooled, barcoded mutant libraries with RLR enables millions of experiments to be performed simultaneously, allowing us to observe the effects of mutations across the genome, as well as how those mutations might interact with each other," said senior author George Church, who leads the Wyss Institute's Synthetic Biology Focus Area and is also a Professor of Genetics at HMS. "This work helps establish a road map toward using RLR in other genetic systems, which opens up many exciting possibilities for future genetic research."

Another feature that distinguishes RLR from CRISPR is that the proportion of bacteria that successfully integrate a desired mutation into their genome increases over time as the bacteria replicate, whereas CRISPR's "one shot" method tends to either succeed or fail on the first try. RLR could potentially be combined with CRISPR to improve its editing performance, or could be used as an alternative in the many systems in which CRISPR is toxic.

More work remains to be done on RLR to improve and standardize editing rate, but excitement is growing about this new tool. RLR's simple, streamlined nature could enable the study of how multiple mutations interact with each other, and the generation of a large number of data points that could enable the use of machine learning to predict further mutational effects.


Understanding the New Technologies for RNA Isolation/Extraction

The quest for new viral disease therapies and test kits has placed greater emphasis on RNA isolation and extraction. New technologies have been introduced that offer greater
simplicity, cost savings, and product availability over commercial kits, while achieving equivalent RNA quality and quantity. These technologies use single devices in addition to the laboratory’s leftover or preferred reagent kits.

One such technology, the nucleic acid extraction filter plate, can deliver high-quality isolation and purification of RNA and genomic DNA from mammalian cells at high throughput without sacrificing results. In cases where nucleic acid preparations require low to medium throughput, users frequently must employ kits containing expensive centrifugal devices that generate leftover reagent waste. Another new technology, the nucleic acid extraction spin column, can enable one device to perform these experiments with the laboratory’s own reagents.

High-throughput RNA purification with a nucleic acid extraction filter plate

The transcription of genes into RNA is an important step in the synthesis of functional gene products, which can be functional RNA species themselves or protein products formed after translation of messenger RNAs.

In many high-throughput gene expression analysis studies, cultured mammalian cells are exposed to different growth conditions. Reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is used to measure the influence of the various conditions on the expression of genes of interest. Viral RNA isolation and extraction are essential prior to RT-qPCR in the detection of a virus in a sample.

This workflow is commonly performed in the development of vaccines and test kits for viral diseases. The studies are greatly aided by the availability of multiwell nucleic acid extraction filter plates with silica-based media that permit high-throughput total RNA isolation in a robust fashion.

Our study evaluated the performance of extraction filter plates versus commercially available RNA isolation kits. The filter plate contains a silica-based quartz glass fiber media for the isolation of total RNA from cultured mouse bEnd.3 endothelioma cells.

Robustness of the nucleic acid extraction filter plate as an RNA isolation medium was shown through the use of a protocol that relies on standard reagents readily obtained and prepared in-house by the researcher in an economically favorable manner. The latter protocolwas also implemented in an industrial process to isolate RNA from
mouse embryonic fibroblasts at a range of cell concentrations, and to
subject this RNA to one-step RT-qPCR assays for three genes.

Filter plate results

RNA isolation performance from cultured mouse bEnd.3 endothelioma cells was evaluated over a range of cell amounts employing two isolation protocols: the first with commercial reagents and the second with standard reagents prepared in-house.

Results of the RNA concentration measurements using the Quant-iT RiboGreen RNA assay are shown in Figuur 1. The results indicate that regardless of whether commercial reagents or standard reagents were used with the nucleic acid extraction filter plate, RNA yields were similar to those obtained with the commercial kit.

Figure 1. RNA concentrations of samples isolated from 3.1–400× 10 3 cells were determined via Quant-iT RiboGreen RNA assay. Samples were isolated with a nucleic acid extraction filter plate using either a commercial reagent protocol (blue squares) or standard reagent protocol (blue triangles) or with a commercially available bundled plate/reagent kit (red squares).

RNA samples isolated with the nucleic acid extraction filter plate were separated on a DNA 5K/RNA/CZE LabChip in the LabChip GX II Touch HT instrument to determine sample integrity. The instrument’s GX Touch software further assessed RNA integrity by performing a smear analysis of the electropherogram traces. An internal algorithm was used to calculate the RNA Integrity Number (RIN). The electropherograms showed two distinct RNA peaks corresponding to 18S and 28S rRNA with little to no evidence of a smear to indicate RNA degradation (Figure 2A). For samples derived from 100–400 × 10 3 cells, RIN numbers varied from 8.0 to 9.6 (Figure 2B), indicating that the RNA was of high quality.

Figure 2. LabChip analysis demonstrating quality of bEnd.3 RNA isolated with the nucleic acid extraction filter plate. (A) LabChip electropherograms of RNA from 100–400 × 103 bEnd.3 cells isolated with either the commercial reagent protocol or the standard reagent protocol. (B) RNA integrity number.

RNA integrity alone does not guarantee successful amplification in an RT-qPCR application as copurified inhibitors can impede reverse transcription and/or PCR efficiency. Mouse bEnd.3 cells are characterized by the expression of VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1, which is encoded by the Vcam-1 gene). The average Ct values showed a
linear inverse relationship with increasing bEnd.3 cell numbers. In samples
isolated with either protocol or plate, both the abundant GADPH (housekeeping protein glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, which is encoded by Gapdh) and the less abundant VCAM-1 message were detected. The slopes of the curves through points of RNA samples isolated from increasing numbers of cells were equal, indicating that no
inhibitory components copurified.

Figure 3. Expression of GAPDH and VCAM-1 in mouse bEnd.3 cells as determined via RT-qPCR. One-step RT-qPCR was carried out to detect messages encoded by the genes Gapdh and Vcam-1. The mouse bEnd.3 cell RNA samples were derived from 3.1–400 × 10 3 cells and isolated with nucleic acid extraction filter plates, using either a commercial reagent protocol (blue squares) or standard reagent protocol (blue triangles), or with a commercially available bundled plate/reagent kit (red squares).

Nucleic acids prepared with the extraction filter plate technology were of high quality and suitable for common downstream activities such as RT-qPCR, restriction digests, and sequencing (figuur 3).

Low- to medium-throughput RNA purification with a nucleic acid extraction spin column

The nucleic acid extraction spin column purifies RNA and genomic and plasmid DNA from bacteria, yeast, mammalian cultured cells, and plants. It is outfitted with an innovative duallayer, silica-based, quartz glass fiber matrix that enables its use with the buffers available in most currently available commercial kits.

Solid-phase extraction such as the spin-column-based method allows the nucleic acid to bind to the solid-phase matrix, 1,2 limiting the problems associated with liquid-liquid
extraction. 3 Solid-phase extraction facilitates the nucleic acid extraction process, making it fast, efficient, and reproducible compared with conventional methods. 2,3 The extraction device recovers RNA fragments ranging in size from 50 bp to 10,000 bp.

Spin column results

Reagents from commercially available kits (CK1) were used, and RNA from Escherichia coli bacterial cultures, mammalian cultured cells (CHO), and plant leaves (basil) were extracted and purified with the spin column. Zoals getoond in Figuur 4, the nucleic acid yields recovered with the extraction spin column were comparable to those obtained with the spin devices from commercially available kits.

The data shows that the nucleic acid extraction spin column effectively extracts and purifies RNA and genomic DNA from common starting materials (tafel 1).

The spin column has been thoroughly tested to assess performance with RNA extraction and purification from various starting materials. It proves that RNA (and genomic DNA) from bacteria, mammalian cells, and plants can be purified with this single device.

Moreover, the purified nucleic acids were processed in the most common molecular biology applications. The results demonstrated that nucleic acids purified with the extraction spin device meet the yield and purity requirements of the downstream applications.

Conclusies

The nucleic acid extraction filter plate and nucleic acid extraction spin column offer complementary options for high- and low-throughput nucleic acid purification. They are standalone, low-cost alternatives to purchasing full commercial kits. The technologies enable laboratories to perform RNA extraction and isolation with their own reagents and receive the RNA quantity and quality associated with commercial kits. These options are highly attractive at a time when viral research and development has placed a
premium on material availability.

Lori Euler ([email protected]) is the product manager for the molecular portfolio at Pall.

1. Ali N, Rampazzo RCP, Costa ADT, Krieger MA. Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics. biomed. Onderzoek Int. 2017 2017: 9306564. DOI:10.1155/2017/9306564.

2. Zwir-Ferenc A, Biziuk M. Solid phase extraction technique: Trends, opportunities and applications. Pol. J. Env. Stud. 2016 15(5): 677–690.

3. Tan SC, Yiap BC. DNA, RNA, and protein extraction:The past and the present. J. Biomed. Biotechnologie. 2009 2009: 574398. DOI: 10.1155/2009/574398.


Genetic engineering in animals

Some of the animals most extensively used as model systems for DNA manipulation are Caenorhabditis elegans (a nematode), Drosophila, and mice. Versions of many of the techniques considered so far can also be applied in these animal systems.

Transgenic animals.  

There are several ways of producing transgenic animals. An example is the production of transgenic Drosophila by the injection of plasmid vectors containing P elements into the fly egg (described in detail in Chapter 20). Transgenic Drosophila provide us with another illustration of the use of the bacterial lacZ gene as a reporter in the study of gene regulation during development. De lacZ gene is fused to the promoter region of a Drosophila heat-shock gene, which is normally activated by high temperatures. This construct is then used to generate transgenic flies. Subsequent to heat shock, the flies are killed and bathed in X-Gal. The resulting pattern of blue tissues provides information on the major sites of action of the heat-shock gene (Figure 13-19). Another approach to the production of transgenic mammals is by injecting special plasmid vectors into a fertilized egg (considered later in this chapter).

Figure 13-19

Transgenic Drosophila expressing a bacterial β-galactosidase gene. Drosophila was transformed with a construct consisting of the E. coli lacZ gene driven by a Drosophila heat-shock promoter. The resulting flies were heat shocked, killed immediately, (more. )

In both these cases, because it is the egg that is initially made transgenic, the extra DNA can find its way into germ-line cells, is then passed on to the progeny derived from these cells, and behaves from then on rather like a regular nuclear gene. Like plants, animals are being manipulated not only to improve the qualities of the animal itself, but also to act as convenient producers of foreign proteins. For example, mammalian milk is easily obtained, so it is a convenient medium for the collection of proteins that are otherwise more difficult to obtain without sacrificing the animal (Figure 13-20).

Figure 13-20

Production of a pharmaceutically important protein in the milk of transgenic sheep. The gene of interest encodes a protein that is of therapeutic importance, such as tissue plasminogen activator used to dissolve blood clots in humans. The gene is placed (more. )

Gene disruptions and gene replacement in mice.  

Mice are the most important models for mammals generally. Furthermore, much of the general technology developed in mice can be applied to humans. Two key techniques are the abilities to disrupt a gene (perhaps for a reverse genetics study) and to replace one allele with another. We shall consider examples of these techniques.

As mentioned earlier, gene disruptions are sometimes called knockouts. An organism carrying the gene knockout can then be examined for altered phenotypes. Knockout mice are invaluable models for the study of mutants similar to those found in humans. For instance, knockout mice that lack vital DNA repair enzymes (see Chapter 7) have been created to study whether these enzymes control cancer rates.

Figures 13-21 and 13-22 illustrate, step-by-step, the generation of a knockout mouse. First, a cloned, disrupted gene is used to produce embryonic stem (ES) cells containing a gene knockout (Figure 13-21a). Although recombination of the defective part of the gene into nonhomologous (ectopic) sites is much more frequent than its recombination into homologous sites (Figure 13-21c), selections for site-specific recombinants and against ectopic recombinants can be used, as shown in Figure 13-21d). Second, the ES cells that contain one copy of the disrupted gene of interest are injected into an early embryo (Figure 13-22). The resulting progeny are chimeric, having tissue derived from either recipient or transplanted ES lines. Chimeric mice are then mated to produce homozygous mice with the knockout in each copy of the gene (Figure 13-22).

Figure 13-21

The production of cells that contain a mutation in one specific gene, known as a targeted mutation or a gene knockout. (a) Copies of a cloned gene are altered in vitro to produce the targeting vector. The gene shown here has been inactivated by insertion (more. )

Figure 13-22

Producing a knockout mouse carrying the targeted mutation. (a) Embryonic stem (ES) cells (green at far left) are isolated from an agouti mouse strain and altered to carry a targeted mutation in one chromosome. The ES cells are then inserted into young (more. )

MESSAGE

Fungal, plant, and animal genes can be cloned and manipulated in bacteria and reintroduced into the eukaryote cell, where they generally integrate into chromosomal DNA.

The technology for mammalian gene knockouts is similar to that for gene replacement. In gene therapy, a mutant allele is replaced by a wild type, the gene replacement providing a cure for the mutant condition.

In overleg met de uitgever is dit boek toegankelijk via de zoekfunctie, maar kan niet worden doorgebladerd.


Bekijk de video: cellen - osmose (December 2021).