Informatie

11.5: O-gebonden eiwitglycosylering vindt volledig plaats in de Golgi - Biologie


O-gebonden glycoproteïnen beginnen hun glycosylering met de werking van het Golgi-specifieke enzym, GalNAc-transferase, dat een N-acetylgalactosamine hecht aan de hydroxylgroep van een serine of threonine. De bepaling van welk residu aan glycosylaat lijkt te worden gestuurd door secundaire en tertiaire structuur, zoals eerder vermeld, en komt vaak voor in dichte clusters van glycosylering. Ondanks dat het vrij kleine toevoegingen zijn (meestal <5 residuen), kunnen de gecombineerde oligosacharideketens die aan een O-gebonden glycoproteïne zijn gehecht, meer dan 50% van de massa van een glycoproteïne bijdragen. Twee van de bekendere O-gebonden glycoproteïnen zijn mucine, een bestanddeel van speeksel, en ZP3, een bestanddeel van de zona pellucida (die eicellen beschermt). Deze twee voorbeelden illustreren ook een belangrijke eigenschap van glycoproteïnen en glycolipiden in het algemeen: de suikers zijn zeer hydrofiel en houden watermoleculen vast, waardoor het volume van het eiwit enorm wordt vergroot.

Interessant is dat deze beschermende, doordrenkte schaal delen van de eiwitkern kan maskeren. In het geval van het celadhesiemolecuul, NCAM, dat in bepaalde ontwikkelingsstadia en locaties een sterk gepolysialyleerd glyco-eiwit is en in andere niet-geglycosyleerd, kan het naakte eiwit worden herkend als een hechtend substraat, terwijl het geglycosyleerde eiwit kan worden herkend als een weerzinwekkend substraat naar andere cellen. Zelfs in sterk geglycosyleerde eiwitten fungeren de suikerresten echter vaak als herkenningsplaatsen voor andere cellen. Zo is de zona pellucida erg belangrijk als fysieke barrière die de eicel beschermt, maar geglycosyleerd ZP3 werkt ook als spermareceptor.


N- en O-Glycosyleringsroutes in de polyfyletische groep van microalgen

De term microalg verwijst naar verschillende eencellige en fotosynthetische organismen die een polyfyletische groep vertegenwoordigen. Het verzamelt talrijke soorten, die gevonden kunnen worden in cyanobacteriën (d.w.z. Arthrospira) evenals in verschillende eukaryote groepen, zoals Chlorofyten (d.w.z. Chlamydomonas of Chlorella) en Heterokonts (d.w.z. diatomeeën). Deze fylogenetische diversiteit resulteert in een buitengewone verscheidenheid aan metabole routes, die grote mogelijkheden bieden voor de productie van natuurlijke verbindingen zoals pigmenten of lipiden die de steeds groeiende interesse van industriëlen voor deze organismen sinds het midden van de vorige eeuw kunnen verklaren. Meer recentelijk hebben verschillende soorten bijzondere aandacht gekregen als biofabrieken voor de productie van recombinante eiwitten. Microalgen zijn inderdaad gemakkelijk te kweken, veilig en goedkoop, waardoor ze aantrekkelijke alternatieven zijn als heterologe expressiesystemen. In dit laatste toepassingsgebied moet rekening worden gehouden met de glycosyleringscapaciteit van deze organismen, aangezien deze post-translationele modificatie van eiwitten hun structurele en biologische kenmerken beïnvloedt. Hoewel deze mechanismen goed bekend zijn bij verschillende eukaryoten zoals zoogdieren, planten of insecten, zijn er slechts enkele onderzoeken uitgevoerd naar de eiwitglycosylering in microalgen. De laatste tijd zijn er aanzienlijke vorderingen gemaakt, vooral op het gebied van eiwitten N-glycosylering, terwijl O-glycosylering blijft slecht bekend. Deze review is bedoeld om de recente gegevens samen te vatten om de state-of-the-art kennis in glycosyleringsverwerking in microalgen te beoordelen.


UARK Celbiologie Examen 3

- Het dolicholfosfaat bevindt zich op het cytosolische vlak van het ER tijdens de stappen van het bouwen van de kernoligosaccharide-eenheid en wordt vervolgens door een specifiek flippase-enzym naar het lumen van het ER gespiegeld.

Zodra een eiwit het organel bereikt waar het functioneert, moet er een mechanisme zijn om te voorkomen dat het weggaat.

Concentreert, in tegenstelling tot RME, het ingenomen materiaal niet.

Primair mechanisme voor specifieke internalisatie van de meeste macromoleculen door eukaryote cellen.

Betoogde dat 20 aminozuren in veel verschillende rangschikkingen het enorme aantal verschillende moleculen zouden kunnen produceren die in cellen worden waargenomen.

- Bevat 10 nucleotideparen per beurt en gaat 0,34 nm per nucleotidepaar vooruit.

In grote lijnen neemt de grootte van het genoom toe met de complexiteit van het organisme.

- Deze lussen van chromatine bevatten actieve DNA-gebieden (gebieden die worden getranscribeerd)

-Eiwit van 20.000 Dalton duurt slechts een paar minuten om te equilibreren tussen het cytoplasma en de kern.

2- porie transporteert eiwit en importine naar de kern

3- RAN-GTP bindt aan importine en geeft het eiwit vrij

4- RAN-GRP-importinecomplex terug naar cytoplasma getransporteerd

rRNA: structureel RNA-molecuul voor ribosoom

Niet getranscribeerd. Zij zijn het controlegebied.

Sigma-factor bindt aan de -10 en -30 dozen op het promotorgebied

Het blootgestelde enkelstrengs DNA dient als sjabloon voor de synthese van RNA met gebruikmaking van binnenkomende ribonucleotidetrifosfaten (NTP's) als substraten.

RNA-synthese is langwerpig in de richting van 5' naar 3'.

Pol II: Transcribeert voor mRNA

Promotor bestaat uit twee delen:
De kernpromotor is de minimale set van DNA-sequenties die voldoende is om de nauwkeurige initiatie van transcriptie van RNA-polymerase te sturen.

Initiator (Inr) sequentie rond de startplaats van transcriptie. OP de +1-site

TATA-box bevindt zich ongeveer 25 tot 30 nucleotiden stroomopwaarts van de startplaats.

TFIIB-herkenningselement (BRE) dat zich direct stroomopwaarts van de TATA-box bevindt.

Stroomafwaarts promotorelement (DPE) bevindt zich ongeveer 30 nucleotiden stroomafwaarts van de startplaats.

-DPE-gestuurde promotors die de DPE en Inr hebben, maar
ontbreken de TATA-box of de BRE.

De meeste promotors hebben extra stroomopwaartse promotors om de transcriptie te verhogen

Gebruikt volledig stroomafwaartse promotors.

De eerste is TFIID
- Bindt aan de TATA-box
- Snelheidsbeperkende stap


Referenties

Rothman, J.E. Het Golgi-apparaat: twee organellen in tandem. Wetenschap 213, 1212–1219 (1981).

Pelham, H.R. Recycling van eiwitten tussen het endoplasmatisch reticulum en het Golgi-complex. Curr. Opin. cel bioik. 3, 585– 591 (1991).

Munro, S. & Pelham, H.R. Een C-terminaal signaal voorkomt secretie van luminale ER-eiwitten. Cel 48, 899– 907 (1987).

Nilsson, T., Jackson, M. & Peterson, P.A. Korte cytoplasmatische sequenties dienen als retentiesignalen voor transmembraaneiwitten in het endoplasmatisch reticulum. Cel 58, 707–718 (1989).

Jackson, M.R., Nilsson, T. & Peterson, P.A. Identificatie van een consensusmotief voor retentie van transmembraaneiwitten in het endoplasmatisch reticulum. EMBO J. 9, 3153–3162 ( 1990).

Schindler, R., Itin, C., Zerial, M., Lottspeich, F. & Hauri, H.P. ERGIC-53, een membraaneiwit van het ER-Golgi-tussencompartiment, draagt ​​een ER-retentiemotief. EUR. J. Cell Biol. 61, 1–9 (1993 ).

Sohn, K. et al. Een belangrijk transmembraaneiwit van van Golgi afgeleide COPI-gecoate blaasjes die betrokken zijn bij coatomeerbinding. J. Cell Biol. 135, 1239–1248 (1996).

Rojo, M. et al. Betrokkenheid van het transmembraaneiwit p23 bij biosynthetisch eiwittransport. J. Cell Biol. 139, 1119– 1135 (1997).

Dominguez, M. et al. gp25L/emp24/p24-eiwitfamilieleden van de cis-Golgi-netwerk bindt zowel COPI- als II-coatomeer. J. Cell Biol. 140, 751–765 (1998).

Cosson, P. & Letourneur, F. Coatomer-interactie met retentiemotieven van di-lysine endoplasmatisch reticulum. Wetenschap 263 , 1629–1631 (1994).

Letourneur, F. et al. Coatomeer is essentieel voor het ophalen van met dilysine gemerkte eiwitten naar het endoplasmatisch reticulum. Cel 79, 1199 –1207 (1994).

Bremser, M. et al. Koppeling van vachtassemblage en vesicle budding aan verpakking van vermeende vrachtreceptoren. Cel 96, 495 –506 (1999).

Cosson, P., Demolliere, C., Hennecke, S., Duden, R. & Letourneur, F. δ- en ζ-COP, twee coatomeersubeenheden die homoloog zijn aan clathrine-geassocieerde eiwitten, zijn betrokken bij het ophalen van ER. EMBO J. 15, 1792–1798 (1996).

Sandvig, K. et al. Retrograde transport van endocytosed Shiga-toxine naar het endoplasmatisch reticulum. Natuur 358, 510– 512 (1992).

Johannes, L., Tenza, D., Antony, C. & Goud, B. Retrograde transport van KDEL-dragend B-fragment van Shiga-toxine. J. Biol. Chem. 272, 19554–19561 (1997).

Mallard, F. et al. Directe route van vroege / recycling-endosomen naar het Golgi-apparaat onthuld door de studie van shiga-toxine B-fragmenttransport. J. Cell Biol. 143, 973–990 (1998).

Majoel, ik. et al. KDEL-receptor (Erd2p)-gemedieerd retrograde transport van het choleratoxine A-subeenheid van het Golgi omvat COPI, p23 en het COOH-uiteinde van Erd2p. J. Cell Biol. 143, 601– 612 (1998).

Jackson, M.E. et al. Het KDEL-ophaalsysteem wordt uitgebuit door: Pseudomonas exotoxine A, maar niet door Shiga-achtig toxine-1, tijdens retrograde transport van het Golgi-complex naar het endoplasmatisch reticulum. J. Cel Wetenschap. 112, 467–475 (1999).

Johannes, L. & Goud, B. Surfen op een retrograde golf: hoe bereikt Shiga-toxine het endoplasmatisch reticulum? Trends Cell Biol. 8, 158–162 ( 1998).

Miesenbock, G. & Rothman, J.E. Het vermogen om ontsnapte ER-eiwitten op te halen, strekt zich uit tot de trans-de meeste cisterna van de Golgi-stapel. J. Cell Biol. 129, 309 –319 (1995).

Lanoix, J. et al. GTP-hydrolyse door arf-1 bemiddelt sortering en concentratie van Golgi-ingezeten enzymen in functionele COPI-blaasjes. EMBO J. 18, 4949–4960 ( 1999).

Rabouille, C. et al. In kaart brengen van de verdeling van Golgi-enzymen die betrokken zijn bij de constructie van complexe oligosachariden. J. Cel Wetenschap. 108, 1617–1627 (1995).

Rottger, S. et al. Lokalisatie van drie humane polypeptide GalNAc-transferasen in HeLa-cellen suggereert initiatie van O-gekoppelde glycosylering door het hele Golgi-apparaat. J. Cel Wetenschap. 111, 45– 60 (1998).

Johnston, P.A., Stieber, A. & Gonatas, N.K. Een hypothese over het verkeer van MG160, een mediaal Golgi sialoglycoproteïne, van de trans-Golgi-netwerk naar de Golgi-reservoirs. J. Cel Wetenschap. 107, 529– 537 (1994).

Storrie, B. et al. Recycling van Golgi-residente glycosyltransferasen door het ER onthult een nieuwe route en biedt een verklaring voor door nocodazol geïnduceerde Golgi-verstrooiing. J. Cell Biol. 143, 1505 –1521 (1998).

Kuge, O. et al. Sar1 bevordert het ontluiken van blaasjes uit het endoplasmatisch reticulum, maar niet uit de Golgi-compartimenten. J. Cell Biol. 125, 51–65 (1994).

Aridor, M., Bannykh, S.I., Rowe, T. & Balch, W.E. Sequentiële koppeling tussen COPII- en COPI-vesikelcoatings in endoplasmatisch reticulum naar Golgi-transport. J. Cell Biol. 131, 875– 893 (1995).

Cole, N. B., Ellenberg, J., Song, J., DiEuliis, D. & Lippincott-Schwartz, J. Retrograde transport van Golgi-gelokaliseerde eiwitten naar de ER. J. Cell Biol. 140, 1 –15 (1998).

Shima, D.T., Cabrera-Poch, N., Pepperkok, R. & Warren, G. Een geordende overervingsstrategie voor het Golgi-apparaat: visualisatie van mitotische demontage onthult een rol voor de mitotische spil. J. Cell Biol. 141, 955–966 (1998).

Pepperkok, R., Lowe, M., Burke, B. & Kreis, T.E. Drie verschillende stappen in het transport van vesiculair stomatitisvirus-glycoproteïne van het ER naar het celoppervlak in vivo met differentiële gevoeligheden voor GTPγS. J. Cel Wetenschap. 111, 1877– 1888 (1998).

Peperkok, R. et al. β-COPI's essentieel voor biosynthetisch membraantransport van het endoplasmatisch reticulum naar het Golgi-complex in vivo. Cel 74, 71–82 ( 1993).

Scheel, J., Pepperkok, R., Lowe, M., Griffiths, G. & Kreis, T.E. Dissociatie van coatomeer van membranen is vereist voor door brefeldine A geïnduceerde overdracht van Golgi-enzymen naar het endoplasmatisch reticulum. J. Cell Biol. 137, 319– 333 (1997).

Schweizer, A., Ericsson, M., Bachi, T., Griffiths, G. & Hauri, H.P. Karakterisering van een nieuw 63 kDa membraaneiwit. Gevolgen voor de organisatie van de ER-naar-Golgi-route. J. Cel Wetenschap. 104, 671–683 (1993).

Dascher, C. & Balch, W.E. Dominante remmende mutanten van ARF1 blokkeren endoplasmatisch reticulum naar Golgi-transport en veroorzaken demontage van het Golgi-apparaat. J. Biol. Chem. 269, 1437–1448 (1994).

Lord, J. M. & Roberts, L. M. Toxine entry: retrograde transport door de secretoire route. J. Cell Biol. 140, 733–736 (1998).

Sandvig, K. & van Deurs, B. Endocytose en intracellulair transport van ricine: recente ontdekkingen. FEBS Lett. 452, 67–70 (1999).

Sandvig, K. et al. Retrograde transport van het Golgi-complex naar het ER van zowel Shiga-toxine als het niet-toxische Shiga B-fragment wordt gereguleerd door boterzuur en cAMP. J. Cell Biol. 126, 53– 64 (1994).

Nakamura, N. et al. karakterisering van a cis-Golgi-matrixeiwit, GM130. J. Cell Biol. 131, 1715– 1726 (1995).

Martinez, O. et al. Het kleine GTP-bindende eiwit rab6 functioneert bij intra-Golgi-transport. J. Cell Biol. 127, 1575– 1588 (1994).

Martinez, O. et al. GTP-gebonden vormen van rab6 induceren de herverdeling van Golgi-eiwitten in het endoplasmatisch reticulum. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 94, 1828–1833 ( 1997).

Simonsen, A. et al. EEA1 koppelt de PI (3) K-functie aan Rab5-regulatie van endosoomfusie. Natuur 394, 494– 498 (1998).

Gaynor, E.C., te Heesen, S., Graham, T.R., Aebi, M. & Emr, S.D. Signaalgemedieerde terugwinning van een membraaneiwit van het Golgi naar het ER in gist. J. Cell Biol. 127, 653–665 (1994).

Teal, S. B., Hsu, V.W., Peters, P.J., Klausner, R.D. & Donaldson, J.G. Een activerende mutatie in ARF1 stabiliseert de binding van coatomeer aan Golgi-membranen. J. Biol. Chem. 269, 3135–3138 ( 1994).

Sata, M., Moss, J. & Vaughan, M. Structurele basis voor het remmende effect van brefeldin A op guanine-nucleotide-uitwisselingseiwitten voor ADP-ribosyleringsfactoren. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 96, 2752– 2757 (1999).

Lippincott-Schwartz, J. Membraancycli tussen het ER- en Golgi-apparaat en zijn rol in biosynthetisch transport. subcel. Biochem. 21, 95– 119 (1993).

Kartenbeck, J., Stukenbrok, H. & Helenius, A. Endocytose van aapvirus 40 in het endoplasmatisch reticulum. J. Cell Biol. 109, 2721– 2729 (1989).

Tang, B.L., Wong, S.H., Qi, X.L., Low, S.H. & Hong, W. Moleculaire klonering, karakterisering, subcellulaire lokalisatie en dynamiek van p23, de KDEL-receptor van zoogdieren. J. Cell Biol. 120, 325–328 ( 1993).

Schweizer, A., Fransen, J.A., Bachi, T., Ginsel, L. & Hauri, H.P. Identificatie, door een monoklonaal antilichaam, van een 53-kD-eiwit geassocieerd met een tubulo-vesiculair compartiment aan de cis-zijde van het Golgi-apparaat. J. Cell Biol. 107, 1643–1653 (1988).

Kreis, T.E. Micro-geïnjecteerde antilichamen tegen het cytoplasmatische domein van vesiculair stomatitisvirus-glycoproteïne blokkeren het transport naar het celoppervlak. EMBO J. 5, 931–941 ( 1986).

Palmer, D.J., Helms, J.B., Beckers, C.J., Orci, L. & Rothman, J.E. Binding van coatomeer aan Golgi-membranen vereist ADP-ribosyleringsfactor. J. Biol. Chem. 268, 12083–12089 (1993).

Wit, J. et al. Rab6 coördineert een nieuwe Golgi naar ER retrograde transportroute in levende cellen. J. Cell Biol. (in de pers).


Juist N- en O- glycosylering van recombinante eiwitten is belangrijk voor hun biologische functie. Hoewel de N- de glycaanverwerkingsroute van verschillende expressiegastheren is in het verleden met succes gemodificeerd, er is relatief weinig aandacht besteed aan het genereren van aangepaste O-gebonden glycanen. Planten zijn aantrekkelijke gastheren voor de engineering van O- glycosyleringsstappen, omdat ze geen endogene glycosyltransferasen bevatten die ser/thr-glycosylering van het zoogdiertype uitvoeren en de productie van gedefinieerde O-glycanen. Hier hebben we mucine-type geproduceerd: O-GalNAc en kern 1 O-gekoppelde glycaanstructuren op recombinant humaan erytropoëtine gefuseerd aan een IgG zware keten fragment (EPO-Fc) door tijdelijke expressie in Nicotiana benthamiana planten. Verder, voor het genereren van gesialyleerde kern 1-structuren constructen die coderen voor humaan polypeptide:N-acetylgalactosaminyltransferase 2, Drosophila melanogaster kern 1 β1,3-galactosyltransferase, menselijk α2,3-sialyltransferase en Mus musculus α2,6-sialyltransferase werd tijdelijk mede tot expressie gebracht in N. benthamiana samen met EPO-Fc en de machines voor sialylering van N-glycanen. De vorming van aanzienlijke hoeveelheden mono- en gedesialyleerd O-gekoppelde glycanen werden bevestigd door vloeistofchromatografie-elektrospray-ionisatie-massaspectrometrie. Analyse van de drie EPO-glycopeptiden die dragen N-glycanen onthulden de aanwezigheid van biantennaire structuren met terminale siaalzuurresiduen. Onze gegevens tonen aan dat: N. benthamiana fabrieken zijn vatbaar voor engineering van de O- glycosyleringsroute en kan een goed gedefinieerd menselijk type produceren O- en N-gekoppelde glycanen op recombinante therapieën.

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​(aan RS) van het federale ministerie van Transport, Innovatie en Technologie (bmvit) en het Oostenrijkse wetenschapsfonds (FWF) TRP 242-B20 (aan RS), door het PhD-programma "BioToP-Biomoleculaire technologie of Proteins” van het Oostenrijkse Wetenschapsfonds (FWF) Project W1224-B09 (aan LN), en door een subsidie ​​van het Oostenrijkse onderzoeksbevorderingsbureau (FFG) Laura Bassi Centres of Expertise-project 822757 (aan HS).


CYCLIC AMP/EIWIT KINASE A-GEMEDIEERDE CONTROLE VAN GOLGI-FUNCTIE

De cAMP/PKA-route is een geconserveerde signaleringsroute die ruimtelijk en tijdelijk wordt gecontroleerd om een ​​strakke specificiteit te bereiken. Het is algemeen bekend dat componenten van deze route aanwezig zijn op de Golgi (Cheng en Farquhar 1976 Nigg et al. 1985). A-kinase-verankeringseiwitten (AKAP's) binden aan de regulerende subeenheden van het tetramere PKA-holo-enzym en rekruteren PKA naar een specifiek intracellulair compartiment, waaronder het Golgi (Shanks et al. 2002 Li et al. 2003). PKA wordt vervolgens geactiveerd na cAMP-binding, wat leidt tot dissociatie van de katalytische en regulerende subeenheden. De Golgi dient als een belangrijk platform voor PKA-signalering. Een bepaalde populatie van het PKA-holo-enzym is geconcentreerd in het Golgi-complex (Martin et al. 1999). Na stimulatie van adenylaatcyclase dissociëren de dimere katalytische subeenheden van het Golgi en hopen ze zich op in de kern, terwijl de regulerende subeenheden geassocieerd blijven met het Golgi-complex (Nigg et al. 1985). Het is daarom mogelijk dat de Golgi kan functioneren als een relais voor het integreren van signaalgebeurtenissen die afkomstig zijn van het plasmamembraan, zoals G-eiwit-gekoppelde receptoractivering, met transcriptionele regulatie in de kern.

Bovendien is PKA direct betrokken bij het beheersen van meerdere aspecten van Golgi-handel en morfologie (Fig.਄). Een verhoging van het niveau van intracellulair cAMP induceert herverdeling van Arf1 van het cytosol naar het Golgi (Martin et al. 2000). Recombinante katalytische PKA-subeenheden of cAMP stimuleren de binding van Arf1 aan geïsoleerde Golgi-membranen en deze in vitro membraanrekrutering van Arf1 wordt voorkomen door specifieke PKA-remmers (Martin et al. 2000). Deze resultaten suggereren dat PKA een regulator kan zijn van COP-I-specifieke mensenhandel op het Golgi. Een ander doelwit van PKA is de KDEL-receptor (KDEL-R) (Fig.਄). PKA-afhankelijke fosforylering aan zijn carboxy-terminale staart is vereist voor retrograde transport van de KDEL-receptor van de Golgi naar de ER (Cabrera et al. 2003). De KDEL-receptor is een transmembraaneiwit dat wordt geactiveerd door binding aan KDEL-motiefbevattende eiwitten op het Golgi, dat dimerisatie, COP-I-complexrekrutering en retrograde mensenhandel naar het ER induceert (Pelham 1991). Dit proces is belangrijk voor het recyclen van ER-inwonende eiwitten die continu ontsnappen naar Golgi-compartimenten (Pelham 1991). De signaaladapter Cbl lokaliseert naar het Golgi in een moleculair complex dat ook geactiveerd Src-kinase bevat (Bard en Baron 1997). Een recent onderzoek toont nu aan dat binding van de KDEL-receptor aan ER-chaperones Golgi-gelokaliseerde Src-kinasen activeert, die op hun beurt de Golgi-trafficulatie en secretoire capaciteit opwaarts reguleert (Pulvirenti et al. 2008) (Fig.਄). De GTPase dynamin 2 (Dyn2) wordt gefosforyleerd door Src wanneer een hoge lading secretoire lading door de TGN gaat (Weller et al. 2010). Activering van Src leidt tot blaasvorming van Golgi cisternae, die afhankelijk is van Dyn2 (Weller et al. 2010). Dyn2 is daarom een ​​belangrijke Src-effector die de Golgi-functie en morfologie reguleert tijdens actieve secretie.

Controle van de Golgi-functie door PKA en Src-familiekinase. Een bepaalde subpopulatie van PKA-holo-enzym is gelokaliseerd op het Golgi, waar het kan worden geactiveerd door toename van intracellulair cAMP. Geactiveerde PKA fosforyleert de Arf1- en KDEL-receptor, wat belangrijk is voor retrograde recycling van ER-eiwitten uit de cis-Golgi. KDEL-receptor in complex met ER-chaperones activeert Golgi-gelokaliseerde Src-familiekinasen (Src), die op hun beurt het intra-Golgi-verkeer opwaarts reguleren. Bovendien induceert activering van Src veranderingen in de Golgi-structuur en induceert blaasjesvorming tijdens secretie. PKA is ook betrokken bij het reguleren van de Golgi-structuur, maar de specifieke doelen in dit mechanisme zijn onbekend.

PKA is ook betrokken bij een ander aspect van anterograde transport. In hepatocyten is PKA-activiteit vereist voor efficiënt transport van apicale eiwitten en lipiden (Zegers en Hoekstra 1997 Wojtal et al. 2006). Verplaatsing van PKA-RIIα van het Golgi-apparaat remt het anterograde transport van MDR1 P-glycoproteïne en van glycosfingolipiden van het Golgi naar apicale canaliculaire membranen (Wojtal et al. 2006). PKA-RIIα verdringing van het Golgi maakt echter geen einde aan andere aspecten van cAMP-gemedieerde apicale plasmamembraanbiogenese in hepatocyten en het is mogelijk dat aanvullende cAMP-effectoren een rol kunnen spelen bij canaliculaire ontwikkeling (Wojtal et al. 2006). Bovendien is proteïnekinase A-activiteit vereist voor constitutief transport van het TGN naar het plasmamembraan in niet-gepolariseerde cellen, en een toename in cAMP-synthese versnelt de snelheid van anterograde verkeer (Muniz et al. 1996 Muniz et al. 1997).

Ten slotte zijn de Golgi-morfologie en biogenese afhankelijk van PKA-activiteit. Uitputting van PKA-regulerende subeenheden met behulp van RNAi of remming van PKA met specifieke geneesmiddelen induceert fragmentatie van de Golgi (Bejarano et al. 2006). Omgekeerd veroorzaakt stimulatie met cAMP fusie en condensatie van individuele Golgi-cisternae tot compactere structuren (Mavillard et al. 2010). Als gevolg hiervan neemt de passage van secretoire eiwitten door de Golgi-stapels toe en neemt de efficiëntie van de glycanverwerking enigszins af (Mavillard et al. 2010). Deze waarnemingen geven aan dat residente PKA-activiteit op het Golgi betrokken is bij het reguleren van de structuur en functie van Golgi als reactie op extracellulaire signalen.


Conclusies en perspectieven

MUC16 is niet alleen de voorloper van de meest gebruikte biomarker voor terugkerende eierstokkanker CA125, maar blijkt ook een actieve rol te spelen bij tumorigenese en metastase van eierstok-, pancreas- en borstkanker, enz. Bovendien beginnen we pas de biologische basisprocessen en functies van MUC16 zoals splitsing, identificatie van CA125-epitoop op MUC16, mechanistische betrokkenheid van MUC16-Cter bij tumorigenese en metastase, enz. Een grondig en volledig begrip van dit complexe eiwit in termen van mechanisme van splitsing, generatie van circulerend CA125, nucleaire translocatie en daaropvolgende genregulatie, identificatie van eiwitpartners die zijn functies mediëren, effecten van posttranslationele modificaties op zijn functies en stabiliteit, promotorkarakterisering en regulatie van zijn expressie, identificatie van splitsingsvarianten (indien aanwezig) en hun context van splicing, enz. zou nodig zijn om het volledige potentieel van MUC16 te realiseren in termen van dis diagnostiek en therapie te vergemakkelijken.


11.5: O-gebonden eiwitglycosylering vindt volledig plaats in de Golgi - Biologie

De biologische studie van O-gekoppelde glycosylering is bijzonder problematisch, omdat chemische hulpmiddelen om deze modificatie te beheersen ontbreken. Een remmer van het UDP-GlcNAc 4-epimerase dat UDP-GalNAc synthetiseert, de donor die de O-gekoppelde glycosylering, zou een krachtig reagens zijn voor reversibele remming O-gebonden glycosylering. We hebben een bibliotheek met 1338 leden gesynthetiseerd van uridine-analogen die zijn gericht op het epimerase op grond van substraatmimicry. Screening van de bibliotheek identificeerde een remmer met een Kl waarde van 11 uM. Testen met verwante enzymen bevestigden de specificiteit van de verbinding voor het UDP-GlcNAc 4-epimerase. Remmers van een belangrijke stap van O-gekoppelde glycaanbiosynthese kan worden ontdekt vanuit een gericht bibliotheekscherm. Nakomelingen daarvan kunnen krachtige hulpmiddelen zijn om te controleren O-gebonden glycosylering in cellen.

Huidig ​​adres: Afdeling Geneeskunde, Afdeling Infectieziekten en Geografische Geneeskunde, Stanford University Medical Center, Stanford, Californië 94305.


Abstract

Mucine-type O- glycosylering wordt geïnitieerd door een familie van polypeptide GalNAc-transferasen (GalNAc-T's) die type II transmembraaneiwitten zijn die Golgi-luminale katalytische en lectinedomeinen bevatten die zijn verbonden door een flexibele linker. Verschillende GalNAc-T's, waaronder GalNAc-T4, vertonen zowel op lange als op korte afstand eerdere glycosyleringsspecificiteit, die wordt bepaald door respectievelijk hun lectine- en katalytische domeinen. Hoewel het mechanisme van de lectine-domein-afhankelijke glycosylering bekend is, is de moleculaire basis voor de katalytisch-domein-afhankelijke glycosylering van glycopeptiden onduidelijk. Hierin rapporteren we de kristalstructuur van GalNAc-T4 gebonden aan het diglycopeptide GAT * GAGAGAGT * TPGPG (met twee α-GalNAc geglycosyleerde Thr (T *), het PXP-motief en een "naakte" Thr-acceptorplaats) die het katalytische domein ervan beschrijft glycopeptide GalNAc bindingsplaats. Kinetische studies van wildtype en GalNAc-bindingsplaatsmutante enzymen tonen aan dat de lectinedomein GalNAc-bindingsactiviteit domineert over de katalytische domein GalNAc-bindingsactiviteit en dat deze activiteiten onafhankelijk kunnen worden geëlimineerd. Verrassenderwijs werd gevonden dat een flexibele lus die uit het lectinedomein steekt essentieel is voor de optimale activiteit van het katalytische domein. Dit werk biedt de eerste structurele basis voor de glycosyleringsvoorkeuren op korte afstand van een GalNAc-T.


Discussie en conclusies

Er zijn drie mogelijke configuraties van een AGR voorgesteld om gerichte in vitro glycosylering van mAbs. Alle drie de ontwerpen zijn gebaseerd op een opeenvolgende toepassing van enzymen die verschillende stadia van glycosylering katalyseren. Er zijn voldoende hoge conversieniveaus in elk reactorcompartiment vereist om het hele proces op het gewenste product te richten en alternatieve routes die tot ongewenste terminale soorten leiden te elimineren. Gedetailleerde wiskundige modellen van massatransport en enzymatische reacties werden ontwikkeld voor de drie reactortypes om te bevestigen dat ze in staat zijn om de gewenste conversieniveaus van de oorspronkelijke mens te bereiken.5 glycaan in de uiteindelijke bi-antennaire volledig gegalactosyleerde structuur Man3GlcNAc4Gal2.

Onderzoek naar de afhankelijkheid van verblijftijden die nodig zijn om 95% conversie te bereiken en de bijbehorende reactorlengtes van de stroomsnelheid, karakteristieke afmetingen van enzymdragers (microcapillaire/pelletradii en porieradius voor poreuze pellets) en NSD-overmaat maakt de bepaling mogelijk van praktisch haalbare AGR parameters op voorwaarde dat enzymkinetische gegevens bekend zijn. Merk op dat deze gegevens eiwitspecifiek zijn, zodat kinetische karakterisering zou moeten worden uitgevoerd voor alle enzym-substraatparen voordat AGR-optimalisatie wordt uitgevoerd. Daarom moeten de gepresenteerde kwantitatieve resultaten die zijn verkregen met specifieke literatuurwaarden alleen worden gebruikt als richtlijn voor het begrijpen van de effecten van regelbare parameters op de optimale AGR-configuratie en niet als een kant-en-klare oplossing. In dit opzicht moet ook worden opgemerkt dat dit werk geen rekening houdt met de afhankelijkheid van kinetische parameters van pH en temperatuur vanwege het gebrek aan relevante informatie. Als dergelijke afhankelijkheden beschikbaar zouden zijn, zouden de implicaties voor een optimaal AGR-ontwerp grotendeels afhangen van de vraag of een bepaald reactortype het mogelijk maakt om de pH en temperatuur lokaal te regelen binnen elk van de reactorcompartimenten of alleen globaal voor de hele reactor.

In dit werk houden we geen rekening met enige degradatie (thermisch of chemisch) van NSD's of enzymen die leidt tot hun verlies van activiteit vanwege het ontbreken van relevante experimentele indicaties over de omvang van deze effecten. Met deze factoren moet echter rekening worden gehouden bij het ontwerpen van een praktische AGR-implementatie. Hoewel er geen kwantitatieve analyse is uitgevoerd, is het kwalitatief duidelijk dat, aangezien NSD-degradatie zou leiden tot hun verlies langs de reactor, een verstandige tegenmaatregel zou zijn om hun inlaatconcentraties te verhogen, zodat ze het laatste AGR-compartiment in voldoende hoeveelheden bereiken om aanvaardbare algemene reactietijden te garanderen . Omgekeerd zou verlies van enzymactiviteit zich vertalen in een beperkte bruikbare levensduur van de reactor, terwijl een AGR een doelproduct kan opleveren dat aan specifieke CQA's voldoet. Zodra de actieve enzymconcentraties onder een bepaalde drempel komen die de vereiste conversieniveaus garanderen, is het mogelijk dat de reactor (of sommige van zijn modules) niet langer voldoende zijn en moet worden vervangen. Als alternatief kan een andere operationele strategie worden gebruikt die geschikt is voor lagere enzymbeladingen (bijvoorbeeld met langere verblijftijden).

Bij het ontwerpen van een real-life systeem moet ook rekening worden gehouden met de vereiste doorvoer en economische aspecten. De voordelen van het gebruik van hogere enzym- en/of NSD-concentraties zijn inderdaad duidelijk uit de gepresenteerde resultaten, maar hun kosten kunnen onbetaalbaar blijken, bijv. andere reactortypes overwogen. Omgekeerd, als een hoge doorvoer moet worden bereikt, zou een kortere kolom met een lagere drukval wenselijk zijn, waardoor het gepakte bed met poreuze pellets de voorkeur verdient. Enzym- en NSD-afbraaksnelheden in vergelijking met de vereiste verblijftijden zouden ook een belangrijke factor zijn in de economische haalbaarheid van verschillende reactorontwerpen.

Bovendien moet een praktische reactorimplementatie in overeenstemming met het QbD-paradigma een veiligheidsmarge bieden om rekening te houden met mogelijke onzekerheden in de concentraties van mAbs, NSD's en enzymen, evenals in andere ontwerp- en procesparameters. Dit, samen met andere veronderstellingen die zijn gemaakt bij de constructie van de hierin gerapporteerde modellen, zullen in onze toekomstige bijdragen nader worden onderzocht.

Hoewel hierin slechts vier enzymatische modules werden beschouwd, kunnen het ontwerpconcept en de principes die ten grondslag liggen aan de modellen en de benadering van reactoroptimalisatie eenvoudig worden uitgebreid tot een willekeurig aantal reactormodules die individuele enzymatische stappen implementeren. Deze ontwerpbenadering kan bijvoorbeeld worden aangepast aan de hermodellering van mAb's met heterogene glycanen die zijn afgeleid van op zoogdiercellen gebaseerde expressiesystemen 13 om goed gedefinieerde glycovormen te verkrijgen voor karakterisering of binnen een productieomgeving. Bovendien is de reikwijdte van de gepresenteerde modellerings- en optimalisatiebenadering niet beperkt tot mAbs of het glycosyleringsproces en kan het toepassingen vinden voor enzymatisch reactieontwerp in andere gebieden van biochemische engineering.


Bekijk de video: Van DNA naar eiwit - 3D (Januari- 2022).