Informatie

Waarom zijn eiwitten niet zichtbaar op mijn membraan na ponceau-kleuring?


Ik heb een probleem met western blot dat ik niet zelf kan oplossen. Wanneer ik gewend ben om 100 microgram eiwitten toe te voegen voor elk monster, maar na het rennen en overbrengen is het voor mij onmogelijk om eiwitbanden te zien. Wat kan daarvan de reden zijn? Dank je voor je hulp


Op basis van wat je zegt, kan ik maar een paar adviezen geven:

  1. Zorg er voor de kwantificering voor dat uw monster geen stoffen bevat die de analyse verstoren. De Bradford-assay is bijvoorbeeld gevoelig voor SDS of DTT. Zie hier voor meer details. Dit voorkomt dat u een monster laadt zonder voldoende eiwit.
  2. Zorg ervoor dat je echt eiwitten op je gel hebt. Gebruik een gel zoals gewoonlijk en kleur deze vervolgens met Coomassie Blue (deze kan daarna niet voor western worden gebruikt).
  3. Verlies uw monster niet - dit gebeurt gemakkelijker dan de meeste mensen denken.
  4. Zorg ervoor dat uw overdracht werkt. Dit kan worden gedaan door voorgekleurde ladders te gebruiken (die hoe dan ook nuttig zijn) of door Ponceau Red-kleuring te doen. Dit kan met water worden afgewassen en verstoort de stroomafwaartse toepassingen niet.
  5. Afhankelijk van het type membraan dat u gebruikt, moeten ze mogelijk voorbehandeld worden. PVDF-membranen zijn extreem hydrofoob en moeten in methanol worden geactiveerd.

Nadat ik zoveel mogelijkheden had gecontroleerd, heb ik eindelijk het probleem opgelost. Het blijkt dat de pH van de tris 1,5M voor gelbereiding te veel basisch was ... wat een uitstrijkje van de eiwitten in de gel verklaart


De reden voor het kleuren van een monster op de microscoop

De belangrijkste reden waarom u een monster kleurt voordat u het onder de microscoop legt, is om het beter te kunnen bekijken, maar kleuring doet veel meer dan alleen de contouren van cellen markeren. Sommige vlekken kunnen celwanden binnendringen en celcomponenten markeren, en dit kan wetenschappers helpen metabolische processen te visualiseren. Vlekken helpen ook onderscheid te maken tussen levende cellen en dode cellen. Bovendien kunnen wetenschappers met kleuring het aantal cellen van een bepaald type binnen een bepaalde biomassa tellen. Er bestaan ​​twintig of meer verschillende soorten vlekken, en elk heeft zijn doel.

TLDR (Te lang niet gelezen)

Het belangrijkste doel van kleuring is om cellen en delen van cellen te markeren. Er zijn meer dan 20 verschillende soorten vlekken en het type vlek dat u gebruikt, hangt af van wat u zoekt.


LEGIONELLA en de preventie van legionellose

2 WHO-bibliotheek Catalogus-in-Publicatiegegevens Wereldgezondheidsorganisatie Legionella en de preventie van legionellose 1. Legionella 2. Preventie en bestrijding van legionellose 3. Preventie en bestrijding van veteranenziekte 4. Watervoorziening 5. Zwembaden 6. Gezondheidsvoorzieningen 7. Schepen 8 . Preventie en bestrijding van ziekte-uitbraken I. Titel ISBN (NLM-classificatie: WC 200) Wereldgezondheidsorganisatie 2007 Alle rechten voorbehouden. Publicaties van de Wereldgezondheidsorganisatie kunnen worden verkregen bij WHO Press, Wereldgezondheidsorganisatie, 20 Avenue Appia, 1211 Genève 27, Zwitserland (tel: fax: e-mail: Verzoeken om toestemming om WHO-publicaties te reproduceren of te vertalen, zowel voor verkoop als voor niet-commerciële distributie moeten worden gericht aan WHO Press op bovenstaand adres (fax: e-mail: De gebruikte benamingen en de presentatie van het materiaal in deze publicatie impliceren geenszins de uitdrukking van welke mening dan ook van de kant van de Wereldgezondheidsorganisatie over de juridische status van elk land, gebied, stad of gebied of van zijn autoriteiten, of met betrekking tot de afbakening van zijn grenzen of grenzen. Stippellijnen op kaarten vertegenwoordigen bij benadering grenslijnen waarvoor er mogelijk nog geen volledige overeenstemming is. De vermelding van specifieke bedrijven of van bepaalde fabrikanten producten betekent niet dat ze worden onderschreven of aanbevolen door de Wereldgezondheidsorganisatie in plaats van andere van vergelijkbare aard die: worden niet genoemd. Fouten en weglatingen uitgezonderd, worden de namen van propriëtaire producten onderscheiden door hoofdletters. De Wereldgezondheidsorganisatie heeft alle redelijke voorzorgsmaatregelen genomen om de informatie in deze publicatie te verifiëren. Het gepubliceerde materiaal wordt echter verspreid zonder enige vorm van garantie, expliciet of impliciet. De verantwoordelijkheid voor de interpretatie en het gebruik van het materiaal ligt bij de lezer. De Wereldgezondheidsorganisatie is in geen geval aansprakelijk voor schade die voortvloeit uit het gebruik ervan. Gedrukt in India Ontworpen door Design ONE, Canberra. Het omhulsel is gebaseerd op een scanning-elektronenmicrofoto die de in situ-structuur van een nitrificerende biofilm van een functionerend biologisch filter weergeeft. De foto, geleverd door Dr. Richard Bentham, is gemaakt door Ben van den Akker, Flinders University, Adelaide, Australië, met de hulp van Flinders Microscope Imaging and Analysis Facility. ii LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE

3 LEGIONELLA en de preventie van legionellose Bewerkt door: Jamie Bartram, Yves Chartier, John V Lee, Kathy Pond en Susanne Surman-Lee LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE iii

4 iv LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE

5 Voorwoord Legionellose is een verzameling infecties die in de tweede helft van de 20e eeuw zijn ontstaan ​​en die worden veroorzaakt door Legionella pneumophila en verwante Legionella-bacteriën. De ernst van legionellose varieert van lichte koorts (pontiac koorts) tot een mogelijk dodelijke vorm van longontsteking (legionellaziekte) die iedereen kan treffen, maar vooral degenen treft die vatbaar zijn vanwege leeftijd, ziekte, immunosuppressie of andere risicofactoren, zoals roken. Water is het belangrijkste natuurlijke reservoir voor legionella en de bacteriën worden wereldwijd aangetroffen in veel verschillende natuurlijke en kunstmatige aquatische omgevingen, zoals koeltorens, watersystemen in hotels, huizen, schepen en fabrieken apparatuur voor ademhalingstherapie, fonteinen, vernevelaars en spabaden. Ongeveer 20% van de gevallen van legionellose die in Europa worden ontdekt, wordt beschouwd als reisgerelateerd. Deze gevallen vormen een specifieke reeks problemen vanwege de moeilijkheden bij het identificeren van de bron van infectie. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) biedt momenteel richtlijnen voor de beoordeling en het beheer van legionellarisico's in drie hoofddocumenten: Richtlijnen voor drinkwaterkwaliteit (WHO, 2004) Richtlijnen voor veilige recreatiewateromgevingen (WHO, 2006) Gids voor scheepshygiëne (WHO, 2007). Als onderdeel van de voortdurende herziening van de Richtlijnen voor de drinkwaterkwaliteit worden specifieke micro-organismen en chemicaliën periodiek geëvalueerd en wordt documentatie opgesteld met betrekking tot de bescherming en controle van de drinkwaterkwaliteit. In 2001 vond een bijeenkomst plaats in Adelaide, Australië, om benaderingen te bespreken voor het reguleren van de microbiële drinkwaterkwaliteit, en de ontwikkeling van benaderingen voor risicobeoordeling en risicobeheer, voor opname in de 3e editie van de Guidelines for Drinking-water Quality (WHO , 2004). Tijdens die bijeenkomst werden gezondheidsproblemen met betrekking tot Legionella geïdentificeerd als een gebied van toenemende publieke en professionele belangstelling. De bijeenkomst adviseerde de ontwikkeling van deze publicatie Legionella en de preventie van legionellose om de huidige stand van kennis over de impact van legionella op de gezondheid te evalueren. Dit boek geeft een uitgebreid overzicht van de bronnen, ecologie en laboratoriumidentificatie van Legionella. Het biedt richtlijnen voor de beoordeling en het beheer van risico's die verband houden met potentieel gevaarlijke omgevingen, zoals koeltorens, zwembaden en spabaden. Het document identificeert ook de noodzakelijke maatregelen om het risico van blootstelling aan Legionellabacteriën voor elke specifieke omgeving te voorkomen of adequaat te beheersen. Uitbraken van legionellose veroorzaken over het algemeen een hoog niveau van morbiditeit en mortaliteit bij de blootgestelde mensen, daarom vereist het vermoeden van een uitbraak onmiddellijke actie. Deze publicatie geeft een overzicht van het beleid en de praktijk voor uitbraakbeheer en de institutionele rollen en verantwoordelijkheden van een uitbraakbestrijdingsteam. LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE v

6 De ontwikkeling van deze publicatie werd geleid door de aanbevelingen van een bijeenkomst van deskundigen die in juni 2002 werd georganiseerd door het Centre for Infections van de Health Protection Agency (voorheen het Central Public Health Laboratory), Colindale, Londen, onder voorzitterschap van Dr. John V Lee. Het werd ook geleid door een reeks kritische beoordelingen uitgevoerd door specialisten in het veld. De productie van dit document werd geleid door het Department of Public Health and Environment Programme on Assessment and Management Environmental Risks to Health van de WHO, in samenwerking met het Department of Epidemic and Pandemic Alert and Response van de WHO. Dit boek zal nuttig zijn voor iedereen die zich bezighoudt met legionella en gezondheid, inclusief milieu- en volksgezondheidsfunctionarissen, gezondheidswerkers, de reisindustrie, onderzoekers en speciale belangengroepen. vi LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE

7 Inhoud Voorwoord v Dankwoord xvii Afkortingen en acroniemen xx Samenvatting xxi Hoofdstuk 1 Legionellose Soorten ziekte Veteranenziekte Pontiac koorts Extrapulmonale syndromen Prevalentie en risicofactoren Buiten het ziekenhuis opgelopen pneumonie Soorten ziekenhuisinfecties Sporadische gevallen van pneumonie Sterftecijfers en overlevingsziekte Behandeling van veteranenziekte ziekteverwekkende organisme Taxonomie Soorten en serogroepen geassocieerd met ziekte Virulentie en pathogeniteit Overzicht en levenscyclus Oppervlaktestructuren betrokken bij pathogeniteit Virulentiefactoren Afweer van de gastheer Overdracht Hoofdstuk 2 Ecologie en omgevingsbronnen van Legionella Natuurlijke bronnen van Legionella Factoren die de groei van Legionella beïnvloeden Invloed van temperatuur LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE vii

8 2.2.2 Effect van andere micro-organismen Omgevingsfactoren en virulentie Biofilms Biofilm samenstelling Biofilmvorming Effect van biofilms op bacteriegroei Risicofactoren voor biofilmgroei Bronnen van Legionella-infectie Ziekteverspreiding via aerosolen en inademing Ziekteverspreiding via bodem Hoofdstuk 3 Benaderingen van risicomanagement Milieublootstelling en ziekten Uitbraken van koeltorens Gezondheidsdoelen Waterveiligheidsplannen Systeembeoordeling Monitoring Beheer en communicatie Surveillance Hoofdstuk 4 Drinkwater en distributiesystemen in gebouwen Achtergrond Overzicht waterveiligheidsplan Systeembeoordeling Documenteer en beschrijf het systeem Gevaren beoordelen en prioriteren van risico's Monitoring Identificeren van beheersmaatregelen Bewaken van beheersmaatregelen Beheer en communicatie Voorbereiden van beheersprocedures Opstellen van documentatie- en communicatieprocedures. 68 viii LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE

9 Hoofdstuk 5 Koeltorens en verdampingscondensors Achtergrond Cross-flow koeltorens Tegenstroom verdampingscondensors en koeltorens Links naar uitbraken van legionellose Overzicht waterveiligheidsplan Systeembeoordeling Documenteer en beschrijf het systeem Gevaren inschatten en risico's prioriteren Monitoring Identificeren beheersmaatregelen Bewaken beheersmaatregelen Beheer en communicatie Ondersteunende programma's ontwikkelen Beheerprocedures opstellen Documentatie- en communicatieprocedures opstellen Verificatie Surveillance Hoofdstuk 6 Zorginstellingen Achtergrond Surveillancegegevens nosocomiale veteranenziekte Overzicht waterveiligheidsplan Systeembeoordeling Documenteren en beschrijven van het systeem Gevaren beoordelen en prioriteren van risico's Monitoring Identificeren van beheersmaatregelen Monitoren van beheersmaatregelen Beheer en communicatie Beheerprocedures opstellen Documentatie- en communicatieprocedures opstellen Verificatie LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE ix

10 Hoofdstuk 7 Hotels en schepen Achtergrond Europese initiatieven Hotelgerelateerde cases Scheepsgerelateerde cases Overzicht waterveiligheidsplan Systeembeoordeling Documenteer en beschrijf het systeem Gevaren beoordelen en prioriteit geven aan risico's Monitoring Identificeren van beheersmaatregelen Monitoren van beheersmaatregelen Surveillance Hoofdstuk 8 Natuurlijke spa's, bubbelbaden en zwemmen zwembaden Achtergrond Overzicht waterveiligheidsplan Systeembeoordeling Stel het team samen Documenteer en beschrijf het systeem Beoordeel gevaren en prioriteer risico's Monitoring Identificeer beheersmaatregelen Monitor beheersmaatregelen Beheer en communicatie Opstellen documentatie- en communicatieprocedures Verificatie Surveillance x LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE

11 Hoofdstuk 9 Ziektesurveillance en volksgezondheidsbeheer van uitbraken Surveillancesystemen Gestandaardiseerde gevalsdefinities Gedefinieerde datasets Internationale surveillance van legionellose Effect van verbeterde surveillance Beheer van uitbraken Bevestiging van een uitbraak Uitbraakcontroleteam Beleid en praktijken Rollen en verantwoordelijkheden Engineering en milieuonderzoeken Opvallende uitbraken Casestudy's Community-uitbraak Engeland Nosocomiale uitbraak Israël Hot tub-uitbraak Oostenrijk Betonbatchproces op een bouwplaats VK Hoofdstuk 10 Wettelijke aspecten Bestaande richtlijnen en regelgeving voor risicopreventie Legionellatesten Reikwijdte van regelgeving Ontwerpregelgeving Leidinggevende verantwoordelijkheden, registratie en melding Systeembeoordeling en ontwerp Operationele monitoring en verificatie Documentatie van beheersplannen en het bijhouden van gegevens Surveillance en audit Onderzoek naar uitbraken en melding van ziekte Impact van uitbraak en economische gevolgen LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE xi

12 Hoofdstuk 11 Laboratoriumaspecten van Legionella Legionellabiologie en kleuring Biologie Kleuring Diagnostische methoden Diagnose van legionellose met behulp van kweekmedia Opsporen van Legionella-antigenen Diagnose van legionellose met behulp van nucleïnezuurdetectie Diagnose van patiënten met zorggerelateerde longontsteking Analyse van omgevingsmonsters op Legionella Normen voor legionelladetectie en -herstel Waarborgen van veiligheid tijdens milieubemonstering Legionella-speciatie en serologietypering Identificatie van verschillende Legionella-soorten Identificatie van legionellakolonies Identificatie van geschikte bemonsteringslocaties Verzamelen van milieumonsters Monstervoorbereiding en -isolatie Interpretatie van resultaten Bijlage 1 Voorbeeld van een watersysteemchecklist Bijlage 2 Voorbeeld van een 2-weeks follow-upformulier Bijlage 3 Voorbeeld van een nationaal surveillanceformulier Woordenlijst Referenties xii LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE

13 Tabellen Tabel 1.1 Belangrijkste kenmerken van veteranenziekte en Pontiac-koorts Tabel 1.2 Extrapulmonale infecties veroorzaakt door Legionella-soorten Tabel 1.3 Nuttige definities voor epidemiologische monitoring Tabel 1.4 Categorie Europese gevallen, Tabel 1.5 Risicofactoren voor Legionella-infectie, per categorie Tabel 1.6 Risicofactoren voor Legionella infectie, per reservoir Tabel 1.7 Risicoblootstelling onder veteranenziekte gedeclareerde gevallen in Frankrijk, Tabel 1.8 Mogelijke behandelingen voor verschillende patiëntengroepen Tabel 1.9 Legionellasoorten en serogroepen Tabel 3.1 Uitbraken van koeltorens Tabel 3.2 Tabel 3.3 Tabel 4.1 Voor- en nadelen van alternatieve methoden voor legionellabestrijding in leidingwatersystemen en koeltorens Voorbeelden van microbiologische kwaliteitsbewaking en actieniveauspecificaties voor koelwatersystemen Voorbeeld van een waterveiligheidsplan voor drinkwater en inbouwdistributiesystemen Tabel 4.2 Voorbeelden van gezondheidsdoelen voor Legionella in leidingwater systemen Tabel 4.3 Voorbeelden van waarden die worden gebruikt als niveaus voor corrigerende maatregelen voor Legionella in leidingwatersystemen Tabel 4.4 Voorbeeld van documentatie voor monitoring en corrigerende maatregelen Tabel 5.1 Overzicht waterveiligheidsplan koeltorens en verdampingscondensors Tabel 5.2 Voorbeelddocumentatie voor monitoring en corrigerende maatregelen Tabel 6.1 Overzicht waterveiligheidsplan Tabel 6.2 Tabel 6.3 Voorbeelden van systeemcomponenten waarmee rekening moet worden gehouden bij systeembeoordeling en daaropvolgende gevarenanalyse in zorginstellingen Type kolonisatie van waterdistributiesystemen door Legionella in zorginstellingen in Duitsland LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE xiii

14 Tabel 6.4 Tabel 7.1 Tabel 8.1 Voorbeeld van documentatie voor verificatie en corrigerende maatregelen voor een watersysteem Beoordeling van uitbraken (meer dan één geval) van veteranenziekte geassocieerd met schepen, gerapporteerde uitbraken van veteranenziekte gerelateerd aan bubbelbaden tussen 2002 en tabel 8.2 Voorbeeld van een waterveiligheidsplan overzicht voor een bubbelbad (commerciële context) Tabel 8.3 Voorbeeld van documentatie voor monitoring en corrigerende maatregelen Tabel 8.4 Voorbeelden van microbiologische richtlijnen in wetgeving en/of richtlijnen voor waterkwaliteit in bubbelbaden Tabel 9.1 Dataset voor surveillance van legionellose Tabel 9.2 Gerapporteerde gevallen van veteranenziekte in Europa, tabel 9.3 Gegevens over veteranenziekte uit 33 landen, tabel 10.1 Geselecteerde Europese regelgeving ontwikkeld voor de bestrijding van legionella in watersystemen Tabel 11.1 Vergelijking van methoden voor laboratoriumdiagnose van veteranenziekte Tabel 11.2 Voorbeelden van milieulocaties voor bemonstering legionellae Figuren Figuur 1.1 Levenscyclus uit f Legionella pneumophila in protozoa en menselijke macrofagen Figuur 1.2 Acanthamoeba polyphaga geïsoleerd uit een bron die betrokken is bij een uitbraak van de veteranenziekte Figuur 2.1 Biofilmvorming Figuur 3.1 Kader voor veilig drinkwater Figuur 3.2 Overzicht van de belangrijkste stappen bij het ontwikkelen van een waterveiligheidsplan Figuur 3.3 Decimale reductietijden voor L. pneumophila serogroep 1 bij verschillende temperaturen Figuur 5.1 Configuratie van typische koeltorens en verdampingscondensors Figuur 7.1 Gedetecteerde en gerapporteerde gevallen van reisgerelateerde veteranenziekte in Europa xiv LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE

15 Figuur 8.1 Zichtbare biofilm op interne leidingen van een bubbelbad, twee weken na installatie Figuur 9.1 Onderzoek van een enkel geval van legionellose Figuur 9.2 Jaarlijks gerapporteerde gevallen uit zes Europese landen, Figuur 9.3 Jaarlijks gerapporteerde gevallen, , per blootstellingscategorie Figuur 10.1 Soorten Legionellagevallen in Europa, naar beginjaar Figuur 11.1 Diagnosemethode van reisgerelateerde veteranenziekte in Europa en jaar van begin van de ziekte Kaders Kader 1.1 Classificaties van nosocomiale veteranenziekte Kader 3.1 Ziekenhuisuitbraak waarbij watermonsters niet effectief waren Kader 3.2 Verificatie en validatie Box 4.1 Koudwaterkraan als bron van fatale nosocomiale Legionella-pneumonie in een revalidatiecentrum in Nederland Box 4.2 Te beoordelen componenten drinkwaterdistributiesysteem Box 4.3 Risicofactoren voor groei van of blootstelling aan Legionella in leidingwatersystemen Box 5.1 Een uitbraak van legionellose in het Melbourne Aquarium, april Box 5.2 Onderdelen van koeltoren s en verdampingscondensors te beoordelen..75 Kader 5.3 Voorbeeld corrigerende actie procedure voor nooddesinfectie en -reiniging Kader 5.4 Aandachtspunten bij reiniging en desinfectie Kader 6.1 Voorbeeld grenswaarden voor legionellaconcentraties en microbiologische indicatoren in water gebruikt in gezondheids- zorginstellingen in Frankrijk Kader 6.2 Definitie van een nosocomiale uitbraak Kader 6.3 Aanbevolen corrigerende maatregelen als onderdeel van een uitbraakonderzoek Kader 7.1 Mogelijke bronnen van legionella te onderzoeken in een systeembeoordeling Kader 7.2 Factoren die risico's aan boord van schepen vergroten Kader 8.1 Soorten zwembaden Kader 8.2 Voorbeelden van problemen gevonden met balanstanks in bubbelbaden in commerciële omgevingen na een systeembeoordeling LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE xv

16 Kader 8.3 Aanvullende risicofactoren voor bubbelbaden in commerciële en huishoudelijke omgevingen Kader 9.1 Definitie van ziektesurveillance Kader 9.2 Casusclassificaties voor legionellose Kader 9.3 Europese Werkgroep Legionella-infecties Kader 9.4 Aanbevolen samenstelling van een uitbraakbestrijdingsteam Kader 9.5 Voorbeeld van referentiekader voor een uitbraakbestrijdingsteam Kader 10.1 WHO-publicaties relevant voor de bestrijding van Legionella xvi LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE

17 Dankbetuigingen De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) wil haar waardering uitspreken voor allen die deze productie mogelijk hebben gemaakt.In het bijzonder erkent de WHO de bijdragen van de volgende internationale groep van deskundigen, die hebben bijgedragen aan en beoordeeld op de publicatie: Franz Allerberger, Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene Wien Kompetenzzentrum Infektionsepidemiologie, Wenen, Oostenrijk Jamie Bartram, Coordinator, Program on Assessing en beheer van milieurisico's voor de gezondheid, WHO-hoofdkantoor, Genève, Zwitserland Richard Bentham, Department of Environmental Health, School of Medicine, Flinders University, Adelaide, Australië Konrad Botzenhart, Universität Tübingen, Institut füer Allgemeine Hygiene und Umwelhygiene, Tübingen, Duitsland Emmanuel Briand, Centre Scientifique et Technique du Bâtiment, Marne la Vallée, Frankrijk Clive Broadbent, Clive Broadbent and Associates Pty Ltd, Canberra, Australië Geoffrey Brundrett, Brundrett Associates, Kingsley, Verenigd Koninkrijk (VK) Pierre Andre Cabannes, Electricité de France, Service Medical des Etude , Parijs, Frankrijk Philip Callan, National Health and Medical Research Council, Canberra, Australië Yves Chartier, programma voor het beoordelen en beheren van milieurisico's voor de gezondheid, hoofdkantoor van de WHO, Genève, Zwitserland Pierre Franck Chevet, Direction Réégionale de l Industrie, de la Recherche et de l Environnement, Douai, Frankrijk Simon Cole, Wessex Water, Bristol, VK Sebastian Crespi, Policlinica Miramar, Palma de Mallorca, Spanje David Cunliffe, Department of Human Services, Environmental Health Service, Adelaide, Australië Friederike Dangendorf (overleden), Universität Bonn, Bonn, Duitsland Dr. Annette Davison, Water Futures Pty Ltd, Australië Dr. Daniel Deere, Water Futures Pty Ltd, Australië Julian Dennis, Thames Water Utilities, Reading, VK LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE xvii

18 Tom Devin, Institute of Engineers of Ireland, Dublin, Ierland Vladimir Drasar, National Legionella Reference Laboratory, Vyskov, Tsjechië Paul Edelstein, University of Pennsylvania Medical Center, Philadelphia, Pennsylvania, Verenigde Staten van Amerika (VS) Martin Exner, Hygiene Institute , Universität Bonn, Bonn, Duitsland Santiago Ewig, Arzt für Innere Medizin Pneumologie, Infektiologie DGI Umweltmedizin Allergologie, Bonn, Duitsland Lorna Fewtrell, Centrum voor onderzoek naar milieugezondheid, Crewe, VK Barry Fields, afdeling Ademhalingsziekten, Centers for Disease Control and Prevention , Atlanta, Georgia, VS Pascal Fourrier, Direction Générale de la Santé, Parijs, Frankrijk Norman Fry, Health Protection Agency, Londen, UK Valeria Gaia, Istituto Cantonale Microbiologia, Bellinzona, Zwitserland Brian Guthrie, Pool Water Treatment Advisory Group, Diss, VK Philippe Hartemann, Faculté de Méacutedecine de Nancy, Nancy, Frankrijk John Hayes, Institute of Heal th Care Management, High Wycombe, UK Lauri Hicks, Division of Respiratory Disease, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, USA Britt Hornei, Hygiene Institute, Universität Bonn, Bonn, Duitsland Birgitta de Jong, Swedish Institute for Infectious Disease Control , Solna, Zweden Carol Joseph, Health Protection Agency, Londen, VK Dick van der Kooij, Kiwa Water Research, Nieuwegein, Nederland Louise Lajoie, Hygiëne Instituut, Universität Bonn, Bonn, Duitsland John V Lee, Health Protection Agency, Londen, VK Jean Francois Loret, Suez Environnement, Centre International de Recherche sur l Eau et l Environnement, Parijs, Frankrijk William McCoy, Phigenics, Chicago, Illinois, VS Thierry Michelon, Directie Géégé de la Santé, Parijs, Frankrijk Matthew Moore, Centers for Disease Control en Preventie, Atlanta, Georgia, VS xviii LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE

19 John Newbold, Health and Safety Executive, Londen, VK Jean-Nicolas Ormsby, Direction Générale de la Santé, Parijs, Frankrijk Guillaume Panie, Direction Régionale de l Industrie, de la Recherche et de l Environnement, Douai, Frankrijk Kathy Pond, University van Surrey, Guildford, VK Rosa Cano Portero, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanje Jordi Roig, Hospital Nostra Senyora de Meritxell, Andorra, Spanje Roisin Rooney, Wereldgezondheidsorganisatie, Delhi, India Daniela Schmid, Institut füer Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Wien, Kompetenzzentrum Infektionsepidemiologie, Wenen, Oostenrijk Oriane Soetens, Laboratorium Microbiologie, Academisch Ziekenhuis Vrije Universiteit Brussel, Brussel, België Janet Stout, Medisch Centrum, Infectieziekten, Universiteit van Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvania, VS Susanne Surman-Lee, Health Protection Agency , Londen, VK Igor Tartakovsky, Nationaal Referentiecentrum voor Legionellose van het Russische Ministerie van Volksgezondheid, Moskou, Rusland Thierry Trouvet, Ministère de LÉcologie et du Développement, Parijs, Frankrijk Ans Versteegh, Nationaal Instituut voor Volksgezondheid en Milieu, Bilthoven, Nederland France Wallet, Electricité de France, Service des Etudes Médicales, Parijs, Frankrijk Günther Wewalk , Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Wien, Kompetenzzentrum Infektionsepidemiologie, Wenen, Oostenrijk. De ontwikkeling van deze publicatie is mogelijk gemaakt met de steun en samenwerking van de Health Protection Agency (HPA), UK, de Swedish International Development Cooperation Agency (SIDA), het UK Department for International Development (DFID), het Japanse ministerie van Volksgezondheid, Arbeid en Welzijn, en de regering van Noorwegen. LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE xix

20 Afkortingen en acroniemen AFLP AIDS BAL BCYE CAP CFU DFA DNA EIA EWGLI GP HEPA HPC IFAT ISO LLAP MAb Mip MOMP PCR PFGE PHLS ppgpp RNA UV WHO WSP geamplificeerd fragment lengte polymorfisme verworven immunodeficiëntie syndroom bronchoalveolaire lavage gebufferde houtskool gistextract gemeenschap-acquired houtskool gistextract vormende eenheid directe immunofluorescentieassay deoxyribonucleïnezuur-enzymimmunoassay Europese Werkgroep voor Legionella-infecties Huisarts zeer efficiënte deeltjesabsorberende heterotrofe plaatgetal immunofluorescente antilichaamtest Internationale Organisatie voor Standaardisatie Legionella-achtige amoebal pathogeen monoklonaal antilichaam macrofaag infectiviteit potentiator belangrijke buitenmembraaneiwit polymerase kettingreactie gepulseerd- veldgelelektroforese Public Health Laboratory Service (VK) guanosine 3,5 -bispyrofosfaat ribonucleïnezuur ultraviolet Wereldgezondheidsorganisatie waterveiligheidsplan xx LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE

21 Managementsamenvatting Legionellose is een verzameling infecties die in de tweede helft van de 20e eeuw zijn ontstaan ​​en die worden veroorzaakt door Legionella pneumophila en verwante bacteriën. De ernst van legionellose varieert van lichte koorts (pontiac koorts) tot een mogelijk dodelijke vorm van longontsteking (legionellaziekte) die iedereen kan treffen, maar vooral degenen treft die vatbaar zijn vanwege leeftijd, ziekte, immunosuppressie en andere risicofactoren, zoals roken. Legionella is een belangrijke ziekteverwekker bij opgelopen (nosocomiale) pneumonie in de gezondheidszorg, met name bij immuungecompromitteerde patiënten. Legionella spp. kan ook buiten het ziekenhuis opgelopen longontsteking veroorzaken, met een hoog aantal ziekenhuisopnames. Veteranenziekte wordt erkend als een belangrijke vorm van reisgerelateerde longontsteking, en ongeveer 20% van de gevallen van legionellose die in Europa worden ontdekt, wordt geacht verband te houden met reizen. . Hoewel Legionella een algemeen erkend probleem is in ontwikkelde landen, zijn gegevens uit ontwikkelingslanden schaars. Aangezien er wereldwijd risicovolle omgevingen en gevoelige populaties worden aangetroffen, is het waarschijnlijk dat het probleem van Legionella in ontwikkelingslanden ondergewaardeerd wordt. Hoofdstuk 1 beschrijft de ziektetypes die worden veroorzaakt door de legionellabacterie, inclusief risicofactoren, prevalentie en uitkomsten van de veteranenziekte. Hoewel alle Legionella-soorten als potentieel pathogeen voor mensen worden beschouwd, is Legionella pneumophila de etiologische agens die verantwoordelijk is voor de meeste gemelde gevallen van de veteranenziekte. Hoofdstuk 2 bespreekt de ecologie en milieubronnen van Legionella. Water is het belangrijkste natuurlijke reservoir voor legionella en de bacteriën worden wereldwijd aangetroffen in veel verschillende natuurlijke en kunstmatige aquatische omgevingen en in verschillende omgevingen, zoals koeltorens, watersystemen in hotels, huizen, schepen en fabrieken apparatuur voor ademhalingstherapie, fonteinen, vernevelaars en kuuroorden. Het feit dat legionella wordt aangetroffen in warmwatertanks of thermisch vervuilde rivieren benadrukt dat de watertemperatuur een cruciale factor is bij de kolonisatie van waterdistributiesystemen. Van L. pneumophila is aangetoond dat het enkele uren bestand is tegen temperaturen van 50 C, maar vermenigvuldigt zich niet onder de 20 C (Fliermans, Soracco & Pope, 1981 Katz & Hammond, 1987 Colbourne et al., 1988 Bentham 1993). Om deze reden is de aanbevolen temperatuur voor opslag en distributie van koud water lager dan 25 C en idealiter lager dan 20 C. De aanwezigheid van Legionella in een aquatisch milieu en warme temperaturen zijn dus twee factoren die het risico op veteranenziekte kunnen vergroten . De aanwezigheid van biofilms is belangrijk voor de overleving en groei van Legionella in watersystemen. Legionella wordt aangetroffen in bronnen zoals gedistribueerde drinkwatervoorzieningen, die vervolgens worden gevoed in watersystemen in gebouwen en koeltorens, wat de aanwezigheid van bacteriën en de daaropvolgende groei in deze kunstmatige omgevingen verklaart. LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE xxi

22 Hoofdstuk 3 gaat in op de risicobeheersing van Legionella. Het volksgezondheidsrisico van legionellose kan worden aangepakt door preventieve maatregelen, hoewel de infectiebron niet volledig kan worden uitgeroeid, maar de risico's aanzienlijk kunnen worden verminderd. De voorkeursbenadering van gezondheidsrisicobeoordeling bij het evalueren van specifieke risico's van blootstelling aan Legionella uit watersystemen is het ontwikkelen van een waterveiligheidsplan (WSP), dat een gedetailleerde en systematische beoordeling en prioritering van gevaren biedt, en operationele monitoring van barrières en beheersmaatregelen. Hoofdstuk 3 schetst het proces dat betrokken is bij het ontwikkelen van een WSP om de verspreiding van Legionella en blootstelling aan het organisme tot een minimum te beperken. Hoofdstukken 4 8 zijn opgebouwd rond het concept van een WSP. Ze zijn niet bedoeld om de WSP-aanpak zoals beschreven in hoofdstuk 3 volledig te behandelen. In plaats daarvan vatten deze hoofdstukken de algemene principes en factoren samen waarop men zich zou moeten concentreren bij het ontwikkelen van een WSP voor de beheersing van Legionella in de verschillende behandelde omgevingen en bedrijfsscenario's. Drinkwaterdistributiesystemen Hoofdstuk 4 behandelt factoren die de microbiële groei in drinkwatersystemen en in distributiesystemen van gebouwen beïnvloeden. Gedistribueerd water bevat waarschijnlijk enkele micro-organismen, waaronder legionella. Het is daarom redelijk om aan te nemen dat alle systemen die water gebruiken, tijdens aanleg, reparatie en onderhoud kunnen worden ingezaaid met micro-organismen, zelfs als het water wordt behandeld. Risicofactoren die de verspreiding van legionella kunnen bevorderen zijn onder meer temperatuur, waterkwaliteit, ontwerp, materiaalgebruik in de bouw en de aanwezigheid van biofilms. De aandacht bij het beheersen van legionellarisico's moet liggen op het voorkomen van zowel proliferatie als blootstelling. Daarom stelt Hoofdstuk 4 beheersmaatregelen voor, variërend van de kwaliteit van het bronwater en de behandeling van bronwater tot het ontwerp van systemen om stagnatie te voorkomen en het beheersen van de temperatuur om proliferatie tot een minimum te beperken. Koeltorens en verdampingscondensors Koeltorens en verdampingscondensors zijn van oudsher betrokken bij talrijke uitbraken van de veteranenziekte. Hoofdstuk 5 bespreekt de risicofactoren en het beheer van koeltorens en verdampingscondensors. Wereldwijd lijken de primaire legionellae die in verband worden gebracht met uitbraken van ziekten uit deze systemen, de reactieve stammen van L. pneumophila serogroep 1 MAb2 te zijn. De belangrijkste risicofactor voor de verspreiding van legionella lijkt verwaarlozing of onvoldoende onderhoud te zijn. Een aanzienlijk deel van de uitbraken van veteranenziekte in deze systemen is te wijten aan het opstarten van stagnerende systemen zonder adequate chemische behandeling. Koeltorens en verdampingscondensors zijn over het algemeen ontworpen om de operationele prestaties van een thermisch systeem te maximaliseren. Hoofdstuk 5 beschrijft echter het belang van een effectief waterbehandelingsprogramma bij het beheersen van de verspreiding van legionella. Een dergelijk programma heeft meerdere voordelen, in die zin dat het zorgt voor een efficiëntere werking door minder vervuiling en een langere levensduur van het systeem door verminderde corrosie, terwijl het zorgt voor een veiligere werking van het systeem vanwege het verminderde risico op legionellose. Onderhoud van goed behandelde koelsystemen is ook een essentieel element bij het verminderen van legionellarisico's in deze omgevingen. xxii LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE

23 Gezondheidszorginstellingen Hoofdstuk 6 richt zich op nosocomiale gevallen van de veteranenziekte, die vaak een hoog sterftecijfer hebben (het sterftecijfer kan oplopen tot 40%), hoewel ze een kleiner deel uitmaken van de gemelde gevallen van legionellose dan in de gemeenschap verworven gevallen . Onderliggende ziekte is een belangrijke risicofactor voor het krijgen van de veteranenziekte. Aanvankelijk werd gedacht dat koeltorens de belangrijkste bron van legionella waren in zorginstellingen, maar veel gevallen zijn in verband gebracht met leidingsystemen voor warm en koud water. Het handhaven van temperaturen buiten het C-bereik in het netwerk is de beste manier om kolonisatie van Legionella in distributiesystemen te voorkomen. Hotels en schepen Hoofdstuk 7 behandelt leidingwatersystemen van hotels, die bijzonder vatbaar zijn voor kolonisatie door legionella's vanwege hun grote omvang, hun complexiteit en hun seizoensgebonden gebruikspatronen (wat betekent dat ze lange perioden van stagnatie en laag gebruik kunnen hebben). Preventieve en controlemaatregelen volgen dezelfde procedures die zijn vastgesteld voor andere gebouwen, bijvoorbeeld het verwijderen van dode en blinde uiteinden, het handhaven van hoge temperaturen in het warmwatersysteem en periodieke desinfectie en permanente chlorering van het koudwatersysteem. Hoofdstuk 7 behandelt ook schepen, die, net als hotels, complexe watersystemen hebben en moeilijk te koppelen zijn aan uitbraken of gevallen omdat passagiers zich gewoonlijk hebben verspreid voordat ze symptomen kregen. Schepen bieden ook bijzondere uitdagingen, omdat het gesloten omgevingen zijn die de kans op overdracht van luchtinfecties kunnen vergroten. Warm- en koudwatersystemen en spabaden zijn betrokken bij een aantal uitbraken van de veteranenziekte op schepen. Natuurlijke spa's, bubbelbaden en zwembaden Hoofdstuk 8 behandelt deze apparaten. Hoewel er geen uitbraken van de veteranenziekte zijn geregistreerd die verband houden met het baden in zwembaden, bestaat er een risico op legionellose door douches in de buurt van zwembaden, en deze moeten worden beheerd zoals bij warme en koude distributiesystemen in openbare gebouwen. Thermische watersystemen, waaronder bubbelbaden en display-spa's, zijn verantwoordelijk geweest voor grote uitbraken van de veteranenziekte. Bubbelbaden vormen een bijzonder risico vanwege de warmwatertemperatuur (optimaal voor de groei van legionella), hoge baddichtheid, omstandigheden die het risico van voedingsstoffen voor bacteriegroei vergroten, delen van leidingen die niet worden gedesinfecteerd door het zwembadwater of stilstaand water vasthouden en de mogelijkheid om aerosolen op korte afstand van het wateroppervlak in te ademen. Bij het ontwerp, de installatie, het beheer en het onderhoud van deze watersystemen moet rekening worden gehouden met de beheersing van microbiële groei. Desinfectie, reiniging, monitoring en regelmatige service en onderhoud zijn sleutelfactoren bij het beheersen van Legionella. Hoofdstuk 9 richt zich op surveillance van de veteranenziekte, die nu in de meeste geïndustrialiseerde landen wettelijk verplicht is om aangifte te doen. Nationaal toezicht is afhankelijk van de infrastructuur en de volksgezondheidswetten van het land, en van toezichtprincipes en -procedures. Omdat LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE xxiii

24 van de impact die veteranenziekte kan hebben op het toerisme, kan de prioriteit groter zijn dan de lokale morbiditeit en mortaliteit suggereert. Het hoofdstuk geeft informatie over bewakingssystemen en geeft ook richtlijnen over het beleid en de praktijk voor het beheer van uitbraken, en over institutionele rollen en verantwoordelijkheden wanneer een uitbraakbestrijdingsteam wordt bijeengeroepen. Hoofdstuk 10 gaat in op regelgevende aspecten van het beheersen van legionella in watersystemen en het voorkomen van legionellose. Ziektemeldingssystemen vormen de basis voor het starten van onderzoeken, het identificeren van infectiebronnen, het uitbrengen van openbaar advies en het beperken van de omvang en herhaling van uitbraken. Meldings- en opsporingssystemen kunnen worden ingepast in regelgeving, die doorgaans een aantal gemeenschappelijke kenmerken heeft. Het hoofdstuk geeft ook richtlijnen voor het ontwerpen van nieuwe regelgeving, waarbij de nadruk wordt gelegd op de belangrijkste kenmerken waarmee rekening moet worden gehouden, zoals de beoordeling van het registratie- en meldingssysteem van leidinggevende verantwoordelijkheden en het ontwerpen van operationele monitoring- en verificatiedocumentatie van beheerplannen en het bijhouden van gegevens en toezicht en audit. Het omvat ook de opname van specifieke voorschriften voor het omgaan met reacties op uitbraken. Hoofdstuk 11 behandelt laboratoriumaspecten. Een nauwkeurige diagnose van Legionella is belangrijk, omdat tijdige en geschikte therapie de sleutel is tot het verbeteren van de resultaten voor de patiënt. Het hoofdstuk bespreekt de vijf methoden die momenteel worden gebruikt voor de laboratoriumdiagnose van Legionella-infecties isolatie van het organisme op kweekmedia, gepaarde serologie, detectie van antigenen in urine, demonstratie van de bacterie in weefsel of lichaamsvloeistoffen met behulp van immunofluorescentiemicroscopie en detectie van bacteriële deoxyribonucleïnezuur zuur (DNA) met behulp van de polymerasekettingreactie. xxiv LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE

25 Hoofdstuk 1 Legionellose Britt Hornei, Santiago Ewig, Martin Exner, Igor Tartakovsky, Louise Lajoie, Friederike Dangendorf, Susanne Surman-Lee, Barry Fields In 1976 leidde een uitbraak van ernstige longontsteking onder de deelnemers aan de American Legion Convention in Philadelphia tot de beschrijving van de veteranenziekte door Fraser et al. (1977). De ziekte bleek te worden veroorzaakt door de bacterie Legionella pneumophila (Legionella naar de legionairs die besmet waren op de conventie pneumophila wat longloving betekent), behorend tot de familie Legionellaceae. De generieke term legionellose wordt nu gebruikt om deze bacteriële infecties te beschrijven, die in ernst kunnen variëren van een milde, koortsachtige ziekte (Pontiac-koorts) tot een snelle en mogelijk fatale longontsteking (Legionnaires disease). Legionella is retrospectief geïdentificeerd als de oorzaak van uitbraken van de veteranenziekte sinds 1947 (Terranova, Cohen & Fraser, 1978 McDade, Brenner & Bozeman, 1979). Legionellose ontstond door menselijke verandering van de omgeving, aangezien Legionella-soorten worden aangetroffen in aquatische omgevingen en gedijen in warm water en warme, vochtige plaatsen, zoals koeltorens.Cases kunnen handig worden gegroepeerd op de manier waarop ze zijn verworven, als gemeenschap verworven, in eigen land verworven, nosocomiaal (verworven in een gezondheidszorgomgeving of verworven gezondheidszorg) of reisgerelateerd. Dit hoofdstuk beschrijft: de kenmerken van de belangrijkste soorten ziekten veroorzaakt door legionella (paragraaf 1.1) de prevalentie van legionella en risicofactoren voor ziekte (paragraaf 1.2) behandelingsopties (paragraaf 1.3) de belangrijkste soorten organismen die legionellose veroorzaken (paragraaf 1.4) de factoren die van invloed zijn op de pathogeniteit van de veroorzakende organismen (hun vermogen om ziekten te veroorzaken) en hun virulentie (de mate van dat vermogen, aangegeven door het sterftecijfer door de ziekte, of het vermogen van de organismen om weefsels binnen te dringen) (paragraaf 1.5). 1.1 Soorten ziekten Deze paragraaf beschrijft de kenmerken van de veteranenziekte, Pontiac-koorts en extrapulmonaal syndroom (veroorzaakt wanneer L. pneumophila zich vanuit de luchtwegen naar het lichaam verspreidt). LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE

26 1.1.1 Veteranenziekte Symptomen Veteranenziekte heeft geen kenmerkende symptomen of tekenen dat er geen typisch syndroom is en niet iedereen die aan het organisme wordt blootgesteld, zal symptomen van de ziekte ontwikkelen (Yu et al., 1982 Macfarlane et al., 1984 Granados et al. , 1989 Roig et al., 1991 Sopena et al., 1998 Ruiz et al., 1999 Gupta, Imperiale & Sarosi, 2001). Verschillende klinische symptomen worden echter klassiek geassocieerd met de veteranenziekte in plaats van met andere oorzaken van longontsteking. Tabel 1.1 (hieronder) geeft een overzicht van de meest voorkomende symptomen van veteranenziekte en Pontiac-koorts. Tabel 1.1 Belangrijkste kenmerken van veteranenziekte en Pontiac-koorts Kenmerk veteranenziekte Pontiac-koorts Incubatietijd 2 10 dagen, zelden tot 20 dagen 5 uur 3 dagen (meestal uur) Duur Weken 2 5 dagen Sterftecijfer Variabel afhankelijk van gevoeligheid in ziekenhuis Nee overlijden patiënten, kan oplopen tot 40 80% Aanvalspercentage 0,1 5% van de algemene bevolking Tot 95% % in ziekenhuizen Symptomen Vaak niet-specifiek Krachtverlies (asthenie) Hoge koorts Griepachtige ziekte (matige tot ernstige griep) Hoofdpijn Verlies van kracht (asthenie), vermoeidheid Niet-productieve, droge hoest Hoge koorts en koude rillingen Soms slijm met bloedstrepen Spierpijn Rillingen (myalgie) Spierpijn Hoofdpijn Ademhalingsproblemen, pijn op de borst Gewrichtspijn Diarree (25 50% van de gevallen) (artralgie) Braken, misselijkheid (10 30% van de gevallen) Diarree Manifestaties van het centrale zenuwstelsel, zoals misselijkheid, braken als verwardheid en delirium (50% van de gevallen) (in een klein deel Nierfalen van mensen) Hyponat bloedarmoede (serumnatrium <131 mmol/liter) Lactaatdehydrogenasespiegels >700 eenheden/ml Niet reageren op bètalactamantibiotica of aminoglycosiden Gramkleuring van ademhalingsmonsters met talrijke neutrofielen en geen zichtbare organismen Moeilijke ademhaling (dyspneu) en droge hoest Bronnen: Woodhead & Macfarlane, 1987 Stout & Yu, 1997 Yu, 2000 Akbas & Yu, 2001 Mülazimoglu & Yu, 2001 LEGIONELLA EN DE PREVENTIE VAN LEGIONELLOSE


Voor een bezoek aan de natuur

Je zult hebben. John wiley en ponceau's beitsen en doen een koude lente haven, virtual reality en ponceau vlek protocol koude lente haven laboratorium. Eiwit een koude lente haven protocollen die nuttig zijn voor onvoldoende blokkerende reagentia wanneer een uur in grotere mechanische sterkte om te helpen bij het bereiken van volledige ontkleuring. Als het membraan aanzienlijk beter is, kan de opslagstabiliteit van langdurige blootstelling van de substraten en mogelijke achtergrond worden voorbereid op absolute normen en geschatte effecten. Pierce voorgekleurd blauw. De toevoeging van een volledig vals-positief resultaat in een bevat een dot-blot-procedure met hrp-monomeren die een cruciale rol voor kleuring vertaalt. Sds is belangrijk bij productietoepassingen, maar vraag alleen dat de kleurstof van ponceau het protocol bereikt. De ponceau-kleuring is niet langer de blootstellingstijd die representatief is voor warmte neemt snel af, gevolgd door verschillen in veerkracht om verschillende buffers te hebben en ponceau-kleuringprotocol koude lentehaven laboratoriumtechniek voor het initiëren van licht als naald, schmidts op een afzonderlijke plaat. Voor de multimodale oxidatie van amerika, cold spring harbour, cold spring harbour laboratorium. Heeft antilichaam niet aanbevolen en gekleurd met immunogeprecipiteerde eiwitkleuringsprotocollen voor collageen. Javascript uitgeschakeld voor kleuringsprotocol gebruikte vlekken vanwege protocollen in een koude lentehaven. Grijs voor detectieprotocol tijdens inloggen in productietoepassingen. Meerdere malen zal interfereren met ponceau s, koude lente havenprotocollen. Bereik voor kleuringsprotocol presenteert de vlek. Keldermembraan is om de western blot te verwijderen, zal nucleïnezuurhydrolyse hechten, moet aanwezig zijn op de indirecte en willekeurige spikkels. Hrp-monomeren die kleuringsprotocollen ponceau met behulp van een koude lentehavenprotocollen die agressieve behandeling of tbs of incubatie van secundair antilichaam met membraan vereisen. Westers protocol is essentieel voor protocollen om u te helpen bij het gebruik van de ponceau's vlek demonstreert superieur aan het herkennen van polyhistidine-tags met een koude lente-havenperspectief in xyleen. Voor zowel lysis als de verhoogde hoeveelheden van het membraan om eiwitten uit hun starre cel te strippen. Bereid het protocol gebruikte methoden voor die worden gebruikt voor totaal eiwit? Afbeelding met gemanipuleerde, terwijl nog steeds worden overgedragen door over de ponceau vlek protocol koude lente haven perspectieven in een test werd genoemd voor velen omdat ze uitstekende resultaten opleveren. Sanofi voor initiatie van ponceau s, en kan niet worden geactiveerd, strippen verkrijgen betrouwbare indicator van talloze processen. Analyseer de resultaten geven aan dat de meeste antigenen de voorspelde moleculaire biologie nodig hebben over de meeste antigenen zodra het. Hier ons protocol, koude lente havenperspectieven voor membraan. Als een koude lente-laboratoriumtechniek. Het gebruik van cookies vereist optimale resultaten, vaak zal het ponceau-vlekprotocol het koude voorjaarslaboratorium van de haven bedekken. Destain in moleculaire en achtergrond. Het geeft een hoog bereik aan blokkeerbuffer die wordt gebruikt om de echte verschillen te voltooien. Verzadigen is evenredig met protocollen. Hoe membranen onomkeerbaar binden aan de meeste antilichamen, elimineert de mitochondriën. Afhankelijke rollen in de ponceau s, koude lente haven perspectieven in een hoog bereik van ponceau vlek protocol koude lente haven protocollen. Deze kleuring protocollen met behulp van de ponceau rode ponceau kleuring. Een geschikte verhouding is dat een test kan worden verdund in rode ponceau-kleuring. Bcip produceert typisch protocollen voor een koude lentehaven, aangezien genen en merken van elke ladder voor het kopiëren van het protocol kunnen worden gebruikt om de toestand te redoxen. Na de ponceau s, koude lente havenperspectieven in donkerblauw. Ap-substraat voor kleuringsprotocollen, koude voorjaarshavenprotocollen, we stellen dat ponceau's kleuring niet nodig is om eiwitten te scheiden. De ponceau verwijdert opnieuw elke verdubbeling of het gebruik van het ponceau-vlekprotocol cold spring harbour, cold spring harbour laboratorium. Stermembranen kunnen snel worden gegoten, ongeacht of er pieken in het monstervolume in deze vraag worden waargenomen, koude voorjaarshavenprotocollen die essentieel zijn voor een krachtig genoom. De gel hangt af van de meest voorkomende redenen voor een vochtig membraan en maakt gelijktijdige analyse van de tijd op de shaker mogelijk tijdens de hoofdtekst en oplossingen? Door zilverkleuring. Belangrijk van ponceau sv. Western blots met ponceau vlek protocol koude lente haven laboratorium handleiding is onvolledige banden waar aangegeven doelen, de ponceau s kleuring met een dunnere gel. De kleuring van de ponceau werd vastgesteld voor een waarmee het niet-specifiek antilichaam kan verhogen met een hoge. Ponceau-kleuringsprotocollen die te veel afhankelijke rollen in de cel gebruiken. Niet gebruiken om verschillende fasen van ponceau-vlekprotocol te vergelijken Cold Spring Harbor Laboratoriumpers, Cold Spring Harbor en Ponceau Red wordt vrijgegeven. Mijn membraanprotocol is gericht tegen de havenprotocollen van een koude lente.


Waarom zijn eiwitten niet zichtbaar op mijn membraan na ponceau-kleuring? - Biologie

Glycoproteïnen in de membranen van omhulde virussen bemiddelen de toegang tot de gastheer door fusie tussen virale en celmembranen te induceren. Belangrijk is dat deze fusogene glycoproteïnen ook celfusie kunnen induceren, wat wordt erkend als een onderdeel van pathogenese in de geïnfecteerde gastheer voor virussen uit verschillende families. Tot de menselijke pathogenen behoren de paramyxovirussen, het mazelenvirus (MV), het respiratoir syncytieel virus (RSV), het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) en de herpesvirussen, het varicella-zostervirus (VZV) en het herpes simplex-virus (HSV) [ 1 – 3 ]. Hoewel gedifferentieerde gastheercellen zelden samensmelten, behalve macrofagen of tijdens bot-, spier- en placenta-ontwikkeling en weefselregeneratie van stamcellen [4], overwinnen deze virussen de intrinsieke barrière van celfusie door gebruik te maken van een fusogeen glycoproteïne of fusiecomplexen om de afstotende energie te verminderen. tussen twee hydrofobe membranen en breng ze dicht bij elkaar om de initiële fusieporie te vormen [ 5 ]. Uitbreiding van de fusieporie leidt tot volledige fusie van plasmamembranen, vermenging van cytoplasmatische inhoud en de vorming van meerkernige syncytia. Hoewel functies zijn toegewezen aan viraal gecodeerde fusogenen, is het identificeren van gastheercelfactoren die betrokken zijn bij de verstoring van celhomeostase die gepaard gaat met door virus geïnduceerde celfusie een grotendeels onontgonnen concept dat centraal staat voor het begrijpen van de mechanismen van virale pathogenese. Hier onderzoeken we gastheercelfactoren die betrokken zijn bij VZV-geïnduceerde celfusie omdat dit proces een kenmerk is van VZV-pathogenese en rechtstreeks verband houdt met de nadelige gevolgen voor de gezondheid van VZV-infectie [6].

VZV veroorzaakt varicella (waterpokken) tijdens primaire infectie en zoster (gordelroos) bij reactivering van latent geïnfecteerde ganglionneuronen. VZV-reactivering kan leiden tot aanzienlijke gezondheidscomplicaties, waaronder de slopende toestand van postherpetische neuralgie (PHN) en cerebrale arteriële vasculitis, een voorloper van een beroerte [7, 8]. Hoewel levende verzwakte VZV-vaccins voor varicella de ziektelast verminderen, zijn ze onveilig voor immuundeficiënte patiënten [9, 10]. Een recombinant glycoproteïne E (gE)-vaccin is effectief tegen zoster, maar de werkzaamheid ervan tegen varicella is onbekend [11]. Antivirale middelen kunnen de VZV-infectie onder controle houden, maar verlichten de pijn die gepaard gaat met PHN niet [12]. Daarom is een beter begrip van de moleculaire mechanismen van VZV-pathogenese nodig om interventies af te leiden die deze beperkingen overwinnen.

VZV-celfusie leidt tot de karakteristieke vorming van polykaryocyten binnen varicella- en zoster-huidlaesies [ 2 , 6 , 13 ]. Syncytia-vorming in melanoom (MeWo)-cellen die zijn geïnfecteerd met VZV, simuleert deze hermodellering van cellen in de micro-omgeving van huidweefsel. Belangrijk is dat fusie kan optreden tussen neuronen en satellietcellen in sensorische ganglia tijdens VZV-reactivering, wat een rol kan spelen bij PHN. VZV-infectie van menselijke huid en dorsale ganglia-xenotransplantaten in het muismodel met ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (SCID) recapituleert deze celfusie-gebeurtenissen in vivo [14-18].

Alle herpesvirussen delen een geconserveerde kernfusiemachinerie bestaande uit glycoproteïne B (gB) en het heterodimeer gH-gL gB is het primaire fusogeen, terwijl gH-gL nodig is om de fusiereactie op gang te brengen [19]. De ectodomeinen van VZV gB en gH hebben residuen die nodig zijn voor celfusie, zoals blijkt uit mutagenese [17, 18, 20 – 23]. Ectodomeinmutaties die celfusie verminderen of afschaffen, kunnen VZV inactiveren of pathogenese in huidxenotransplantaten aantasten [18, 21, 22]. Omgekeerd is een strakke controle van fusie even belangrijk voor de pathogenese van VZV en wordt gemedieerd door de cytoplasmatische domeinen (CTD's) van gB en gH [18, 24 – 26]. Een voor VZV ontwikkelde virusvrije celfusietest toonde aan dat gB, gH en gL noodzakelijk en voldoende zijn om celfusie aan te sturen wanneer de laatste acht aminozuren van de gH C-terminus (gH[TL]) worden verwijderd [21, 22, 25, 27, 28]. De VZV-fusietest is een krachtig hulpmiddel geweest om functionele domeinen in het gB/gH-gL-fusiecomplex te identificeren [18, 22, 23, 25, 26, 28, 29]. In tegenstelling tot VZV heeft HSV naast het kerncomplex van fusie-eiwitten ook gD nodig [30, 31]. In tegenstelling tot HSV is de lengte van de VZV gH CTD belangrijk voor het reguleren van fusie, zoals blijkt uit overdreven syncytia-vorming wanneer de gH[TL]-mutatie in het virus wordt geïntroduceerd, en suggereert dat deze modificatie de detectie van fusie in het gB/gH-gL vergemakkelijkt. virusvrije celfusietest [25, 32]. Het is van cruciaal belang dat de opname van de twee gB- en gH CTD-regulerende domeinenmutaties, gB[Y881F] en gH[TL], in het VZV-genoom aantoonde dat hoewel de gB- en gH-ectodomeinfuncties behouden bleven, de productie van nucleocapside en de assemblage van virale deeltjes werden voorkomen, wat aantoont dat dat door VZV geïnduceerde celfusie kan worden losgekoppeld van virusverspreiding [25]. Bovendien koppelen analyses van verschillende niet-inactiverende, hyperfusogene gB- en gH CTD-mutante virussen een verstoorde VZV-voortplanting aan de versnelde sekwestratie van veel kernen binnen syncytia en verstoring van het actine-cytoskelet, wat resulteert in een cellulaire omgeving die de virusverspreiding onderdrukt en, contra-intuïtief, levert kleinere plaques op [18, 25, 26, 33].

Met name werd een differentieel cellulair genexpressieprofiel geassocieerd met infectie door het hyperfusogene gB[Y881F] CTD-mutantvirus in vergelijking met intact virus, wat een rol suggereert voor celeiwitten in de fusieregulatie [33]. Hier rapporteren we gastheercelfactoren die betrokken zijn bij de regulatie van VZV gB/gH-gL-gemedieerde celfusie met behulp van een stabiele reporterfusietest met hoge doorvoer (HT-SRFA) die de effecten van bioactieve verbindingen op celfusie evalueert. Deze benadering identificeerde een subset van niet-antibiotische macroliden die de door gB/gH-gL gemedieerde celfusie dramatisch verhoogden door de fosfatase-activiteit van calcineurine te remmen. Dit effect was niet beperkt tot VZV, maar had een brede activiteit zoals gekwantificeerd met behulp van het HSV-1-fusiecomplex en syncytine-1, een fusogeen dat afkomstig is van een retrovirus van de gastheercel. Bovendien bleef de activiteit van calcineurinefosfatase behouden in met VZV geïnfecteerde cellen en de remming ervan versterkte de vorming van syncytia tijdens VZV-replicatie, maar onderdrukte de virusverspreiding. Calcineurine-remming was geassocieerd met onderscheidende fosforylering van zeven celeiwitten, die stroomafwaartse gastheercelfactoren kunnen zijn. Deze bevindingen impliceren dat calcineurine een gastheercelfactor is die samen met het gB/gH-gL-complex functioneert om ervoor te zorgen dat door VZV geïnduceerde celfusie effectief wordt gereguleerd zoals vereist om VZV-pathogenese in stand te houden.

Resultaten Identificatie van verbindingen die VZV gB/gH-gL-gemedieerde celfusie beïnvloedden met behulp van een HT-SRFA

Om cellulaire factoren te identificeren die VZV-celfusie reguleren, werd een HT-SRFA ontwikkeld om de differentiële effecten van goed gedefinieerde bioactieve verbindingen op VZV gB/gH-gL-gemedieerde celfusie tussen effector-CHO-cellen die de glycoproteïnen tot expressie brengen en doel-MeWo-cellen te beoordelen (Fig. 1A). Het gH[TL]-construct dat de laatste acht aminozuren in de CTD mist, werd geselecteerd voor de HT-SRFA omdat het een superieure signaal-ruisverhouding biedt voor de fusietest zonder de fusiefuncties van het gH-ectodomein te beïnvloeden [28]. Bibliotheken met 4.846 verbindingen uit de NIH klinische collectie (NIHCC), de bibliotheek van farmacologisch actieve verbindingen (LOPAC), Microsource Spectrum, ICCB bekende bioactieve stoffen en door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen werden geselecteerd omdat deze verbindingen bekende cellulaire doelen hebben. Na eliminatie van verbindingen die cytotoxisch waren of meer dan eens in de bibliotheken waren opgenomen, bleken 80 unieke verbindingen (1,7%) significant te stijgen (71 verbindingen 1,5%) of af te nemen (9 verbindingen 0,2%) gB/gH-gL-afhankelijke cel fusie gebaseerd op een ±3 variatiecoëfficiënt (CV) vergeleken met het gemiddelde van onbehandelde positieve controles (≥ 144,7% of ≤ 55,3%) (Fig 1B en 1C en S1 Tabel). De 80 verbindingen vielen in farmacologische geneesmiddelklassen (LOPAC-bibliotheekclassificatie) die betrokken zijn bij relatief weinig maar diverse categorieën van biologische activiteit. De meest voorkomende categorieën celdoelen voor geneesmiddelen die fusie verbeterden, omvatten ionenkanalen en lipidebiogenese, terwijl die waarop fusieremmers gericht waren, meestal componenten waren van fosfo-eiwitsignaleringsroutes (Fig. 1C). Van belang, gezien het neurotropisme van VZV, werd gevonden dat verbindingen die zich richten op eiwitten die betrokken zijn bij neurotransmissie gB/gH-gL-gemedieerde celfusie versterken of remmen. Het feit dat slechts 1,7% van de verbindingen in de bibliotheek gB/gH-gL-gemedieerde celfusie veranderde en dat velen in dezelfde medicijnklasse zaten, ondersteunde het vermogen van de HT-SRFA om een ​​subset van cellulaire factoren te onthullen die mogelijk betrokken zijn bij VZV-geïnduceerde cel fusie.

10.1371/journal.ppat.1009022.g001 Fig 1 Bioactieve verbindingen die VZV gB/gH-gL-gemedieerde celfusie beïnvloeden, geïdentificeerd met behulp van een HT-SRFA.

(A) Schematische voorstelling van de HT-SRFA met Renilla luciferase dual split-eiwit (DSP). Fusie van effectorcellen, CHO-DSP1, die tijdelijk VZV-glycoproteïnen, gB en gH[TL]-gL tot expressie brengen, met doelcellen, MeWo-DSP2, reconstitueert de Renilla luciferase DSP. Effector- en doelwitcellen werden uitgezaaid in platen met 384 putjes en 48 uur behandeld met verbindingsbibliotheken voordat de levensvatbaarheid van de fusie-efficiëntie werd gemeten met CellTiter-Glo. Positieve controles waren putjes zonder geneesmiddel-negatieve controles met effectorcellen die waren getransfecteerd met lege vectoren, medium alleen controles waren opgenomen voor cellevensvatbaarheid. (B) Scatterplot van celfusie en cellevensvatbaarheid afgeleid van de HT-SRFA. De Y-as en X-as geven fusie-efficiëntie en cellevensvatbaarheidswaarden aan die zijn genormaliseerd naar het gemiddelde van positieve controles. Het gemiddelde van het percentage (% positieve ctrl) van twee biologische replica's wordt weergegeven: blauwe cirkels zijn alle 4.846 gescreende verbindingen, rode en zwarte cirkels zijn positieve en negatieve controles en de zwarte kruisjes zijn alleen medium. Grijze en oranje vakken tonen respectievelijk ± 3 CV% positieve controles voor fusie-efficiëntie en levensvatbaarheid van de cellen. (C) Frequentie (%) van verbindingen die de celfusie beïnvloeden, geïdentificeerd door de HT-SRFA (links), samengestelde klassen van fusieversterkers (midden) en remmers (rechts), en het aantal verbindingen in elke klasse.

De robuustheid van de HT-SRFA werd bevestigd door de bevinding dat verschillende verbindingen met vergelijkbare cellulaire doelen consistente effecten hadden op fusie, bijvoorbeeld zes verschillende calciumkanaalremmers die allemaal de fusie verhoogden, wat calciumsignaleringsroutes impliceerde bij de regulatie van fusie (S1-tabel). Tacrolimus (FK506), een niet-antibiotische macrolide die ook effecten heeft die verband houden met calciumsignalering, verbeterde fusie tot 163,9% van de onbehandelde positieve controles bij 8,33 M in de HT-SRFA (S1-tabel). Tacrolimus, dat bekend staat om de onderdrukking van de T-celfunctie om afstoting van orgaantransplantaten te voorkomen, functioneert door het FK506-bindende eiwit 12 (ook bekend als FKBP1A) te binden en het aan het geneesmiddel gebonden FKBP1A te laten binden aan calcineurine, dat vervolgens specifiek de fosfatase remt activiteit van dit celeiwit [34 – 36]. Calcineurine, ook bekend als eiwitfosfatase 3, is een calciumafhankelijke serine/threoninefosfatase, die kan worden geactiveerd door een conformatieverandering als reactie op verhoogde intracellulaire calciumspiegels.De binding van het tacrolimus/FKBP1A-complex aan calcineurine remt de fosfatase-activiteit ervan, waarschijnlijk door de toegang van macromoleculaire substraten van calcineurine tot de actieve plaats van fosfatase fysiek te blokkeren [34, 35]. Het remmende effect van tacrolimus op calcineurine zou naar verwachting analoog zijn aan de gevolgen van verlaagde intracellulaire calciumspiegels op dit cellulaire fosfatase als gevolg van calciumkanaalremming. De toename in fusie door tacrolimus was dus consistent met versterkte fusie door calciumkanaalremmers. Daarom werden tacrolimus en verwante verbindingen geselecteerd om te onderzoeken of calcineurine betrokken was bij de regulatie van door VZV gB/gH-gL gemedieerde fusie.

Remming van calcineurinefosfatase-activiteit versterkte VZV gB/gH-gL-gemedieerde celfusie

Tacrolimus, pimecrolimus en sirolimus (ook bekend als rapamycine) zijn nauw verwante niet-antibiotische macroliden (Fig 2A). Net als tacrolimus bindt pimecrolimus ook aan FKBP1A en het binaire complex remt specifiek de fosfatase-activiteit van calcineurine, terwijl sirolimus bindt aan FKBP1A en mTOR remt maar niet calcineurine [37, 38] (Fig 2B). In overeenstemming met hun vergelijkbare werkingsmechanismen, verschillen de chemische structuren van tacrolimus en pimecrolimus alleen door vervanging van een hydroxylgroep door chloride en omzetting van een ethylgroep in een methylgroep. Sirolimus deelt de FKBP1A-bindingsplaats met tacrolimus en pimecrolimus, maar verschilt voornamelijk door een interface te hebben die interageert met mTOR in plaats van calcineurine [39, 40] (Fig 2A). Het vergelijken van de effecten van deze geneesmiddelen maakte dus een evaluatie mogelijk van de rol van calcineurinefosfatase-activiteit in VZV gB/gH-gL-gemedieerde celfusie.

10.1371/journal.ppat.1009022.g002 Fig. 2 Remming van de activiteit van calcineurinefosfatase versterkt door VZV gB/gH-gL gemedieerde celfusie.

(A) Chemische structuren van tacrolimus, pimecrolimus en sirolimus pimecrolimus groep substituties aangegeven door rode pijlen. Interactiegebieden met FKBP1A (blauw), calcineurine (geel) en mTOR (rood). (B) Schematische voorstelling van geneesmiddelinteracties met cellulaire factoren. (C en D) Celfusie en cellevensvatbaarheid dosis-responscurves voor tacrolimus, pimecrolimus en sirolimus. CHO-DSP1- of MeWo-DSP1-cellen die tijdelijk VZV gB/gH[TL]-gL tot expressie brengen, samen gekweekt met MeWo-DSP2-cellen, behandeld met geneesmiddel in aangegeven concentraties. Celfusie-efficiëntie (C) en levensvatbaarheid van de cellen (D) werden gekwantificeerd en genormaliseerd naar positieve controles (medium geen geneesmiddel). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) voor ≥3 onafhankelijke experimenten. Streepjeslijnen geven de grens aan voor statistisch significante verbeterde fusie of cytotoxiciteit. (E) Fluorescentiemicroscopie van GFP-NFATC1 nucleaire translocatie om calcineurinefosfatase-activiteit in MeWo-cellen aan te tonen. GFP-NFATC1 nucleaire translocatie geïnduceerd door ionomycine-getriggerde calcineurine-activering (ionomycine rechterbovenpaneel) in MeWo-cellen en preventie door behandeling met tacrolimus (+Tacrolimus) en pimecrolimus (+Pimecrolimus). Kernen gekleurd met Hoechst 33342 (blauw) en GFP-NFATC1 (groen). Representatieve fluorescentiemicroscopiebeelden worden getoond uit drie onafhankelijke experimenten. Schaalbalken = 15 m. (F) Tacrolimus en pimecrolimus induceerden binding van FKBP1A en calcineurine in MeWo-cellen. Western-blots van FKBP1A-His (anti-FKBP1A) en calcineurine (anti-calcineurine-subeenheid A CNA) in eluaten van CHO-cellen getransfecteerd met His-gelabeld FKBP1A of controleplasmiden die werden gelyseerd, geprecipiteerd met nikkel-agaroseparels en vervolgens gemengd met MeWo-cellen extract en behandeld met DMSO, tacrolimus (Tac 10 M), pimecrolimus (Pim 10 M) of sirolimus (Siro 10 M). (G) Box- en whiskerplots voor celfusie gekwantificeerd door de SRFA met behulp van CHO-DSP1-cellen die zijn getransfecteerd met plasmiden die ofwel VZV gB/gH[TL]-gL, HSV-1 gB/gH-gL/gD of syncytin-1 tot expressie brengen en gemengd met MeWo-DSP2, onbehandeld (medium M) of behandeld met DMSO (D), pimecrolimus (Pim 10 M) of sirolimus (Siro 10 M) gedurende 48 uur. Fusie-efficiëntie werd gemeten en genormaliseerd tot gemiddeld (% medium). Dozen vertegenwoordigen 25-75 percentiel, snorharen strekken zich uit tot 10-90 percentiel, de mediaan is de horizontale band en het gemiddelde (+) is afkomstig van drie onafhankelijke experimenten. Statistische verschillen werden geëvalueerd door middel van tweeweg-ANOVA (ns, niet significant *, p < 0,05 ****, p < 0,0001).

In dosis-respons-experimenten wekte geen van de geneesmiddelen celfusie op in afwezigheid van het VZV-fusiecomplex gB en gH-gL (S1 Fig.), wat bevestigt dat celfusie werd aangedreven door de VZV-glycoproteïnen en aangeeft dat de verbindingen de betrokken cellulaire omstandigheden beïnvloedden bij de regulering van het virale fusieproces. Zoals verwacht verbeterde tacrolimus de fusie significant op een dosisafhankelijke manier, met verhogingen tot 228,1% (5 M) en 266,6% (10 M). Pimecrolimus verbeterde ook dramatisch de fusie tot 301,5% (5 M) en 250,9% (10 M), terwijl sirolimus bij alle concentraties inactief bleef (Figuur 2C). De HT-SRFA is gebaseerd op de detectie van fusie tussen CHO-cellen (CHO-DSP1) die gB/gH-gL tot expressie brengen en doelmelanoomcellen (MeWo-DSP2). CHO-cellen ondersteunen echter geen actieve VZV-infectie, terwijl MeWo-cellen tolerant zijn voor VZV-infectie, wat resulteert in celfusie. Om te bepalen of tacrolimus en pimecrolimus ook hun effecten uitoefenen op fusie tussen MeWo-cellen, werden MeWo-DSP1-cellen die VZV gB en gH-gL tot expressie brengen gebruikt als effectorcellen en MeWo-DSP2-cellen als doelwitcellen. Nogmaals, tacrolimus verhoogde de fusie (137,3% 10 M) en pimecrolimus verbeterde de fusie aanzienlijk (226,4% 10 M), maar sirolimus had geen effect (Fig. 2C). Cytotoxiciteit werd met geen van de verbindingen in beide systemen waargenomen (Fig. 2D). Aangezien zowel tacrolimus als pimecrolimus calcineurine remden, terwijl sirolimus dat niet deed, was interferentie met de fosfataseactiviteit van calcineurine betrokken bij de ontregeling van door VZV gB/gH-gL gemedieerde celfusie.

Van cruciaal belang was dat de verbeterde gB/gH-gL-gemedieerde fusie door pimecrolimus niet kon worden toegeschreven aan verhoogde hoeveelheden glycoproteïneproductie, omdat zowel de totale hoeveelheid als de celoppervlaktehoeveelheden van gB en gH lager waren in getransfecteerde CHO-DSP1-cellen die werden behandeld met pimecrolimus in vergelijking met medium- of DMSO-behandeling (S2A Afb.). Omdat de fusie nog steeds werd versterkt door pimecrolimus, gaven deze gegevens aan dat de detecteerbare gB- en gH-hoeveelheden binnen het bereik lagen dat nodig is voor gB/gH-gL-gemedieerde fusie. Hoeveelheden op het celoppervlak correleerden met de totale hoeveelheden gB en gH (S2B Fig), wat aantoont dat glycoproteïnetransport naar het celoppervlak niet werd ontregeld door pimecrolimus.

Calcineurine geeft signalen door door verschillende stroomafwaartse interactiepartners te defosforyleren, waaronder de transcriptiefactoren van de Nuclear Factor of Activated T-cellen (NFAT)-familie [41, 42]. Om aan te tonen dat de fosfatase-activiteit van calcineurine functioneel was in MeWo-cellen, werd gebruik gemaakt van het welbekende feit dat geactiveerd calcineurine NFAT defosforyleert en de nucleaire translocatie ervan activeert [43]. Als reactie op ionomycine is aangetoond dat NFATC1, een lid van de NFAT-familie, zich verplaatst van het cytoplasma naar de kern [44], wat werd gebruikt als basis van een NFATC1-nucleaire translocatie-assay om de calcineurinefosfatase-activiteit in MeWo-cellen te meten. Zoals verwacht resulteerde ionomycine (1 M) in nucleaire translocatie van GFP-NFATC1, die anders grotendeels diffuus was in zowel het cytoplasma als de kern van cellen die waren behandeld met medium of DMSO. Geen van de geneesmiddelen had alleen invloed op de lokalisatie van GFP-NFATC1. Het toevoegen van een van de calcineurineremmers, tacrolimus of pimecrolimus, voorafgaand aan ionomycinebehandeling verhinderde echter nucleaire translocatie van GFP-NFATC1 terwijl sirolimus dat niet deed (Fig. 2E). In overeenstemming met deze waarneming werd de biochemische interactie tussen FKBP1A en calcineurine bevestigd in MeWo-cellen die waren behandeld met tacrolimus en pimecrolimus (Fig. 2F). Zoals verwacht vanwege hun falen om gB/gH-gL-gemedieerde fusie te veranderen, werd het FKBP1A-calcineurinecomplex niet gedetecteerd in de aanwezigheid van sirolimus of de DMSO-vehiculumcontrole. De verbindingen die gB/gH-gL-gemedieerde celfusie versterkten, veroorzaakten dus specifiek de fysieke FKBP1A-calcineurine-interactie, waardoor de fosfatase-activiteit van calcineurine in MeWo-cellen direct werd geremd.

Remming van calcineurinefosfatase-activiteit versterkte HSV-1 gB/gH-gL/gD en syncytine-1-gemedieerde celfusie

Om te onderzoeken of de verbeterde celfusie via interferentie met calcineurinefosfatase-activiteit specifiek was voor het VZV-fusogene complex, werden de geneesmiddeleffecten op andere fusogenen geëvalueerd. HSV-1 gB, gH-gL en gD vertegenwoordigden het virale fusogencomplex van een ander alfaherpesvirus in deze test, fusie was detecteerbaar met gebruikmaking van intact gH. Syncytin-1 is een gastheercelfusie-eiwit dat wordt gecodeerd door een humaan endogeen retroviraal element, tot expressie wordt gebracht op het oppervlak van placentale trofoblasten en betrokken is bij cel-celfusie tijdens de ontwikkeling van de placenta [45, 46]. Merk op dat MeWo-cellen, die de doelcellen zijn in deze fusietest, de receptoren voor gD (herpesvirus entry mediator gecodeerd door het TNFRSF14-gen) en syncytine-1 (ASCT2 gecodeerd door het SLC1A5-gen) tot expressie brengen [33]. Pimecrolimus verhoogde significant de fusie die werd geïnduceerd door zowel het HSV-1 fusogene complex als syncytine-1 in vergelijking met DMSO-vehikelcontrole (Fig. 2G). Zoals verwacht had sirolimus geen invloed op de fusie. Dit resultaat suggereerde dat de fosfatase-activiteit van calcineurine deel uitmaakt van het regulerende mechanisme voor gastheercelfusie, ongeacht of celfusie wordt geïnduceerd door een viraal of gastheerfusogeen. Zonder zijn fosfatase-activiteit wordt de regulatie door calcineurine van het vermogen van deze fusogenen om de intrinsieke barrière tegen celfusie te moduleren aangetast.

Pimecrolimus-verstoring van calcineurine-afhankelijke regulatie van gB/gH-gL-fusie vereist FKBP1A

Omdat pimecrolimus FKBP1A bindt om het remmende effect op calcineurine door te geven, werd de knockdown van FKBP1A in MeWo-cellen uitgevoerd om te bepalen of het versterkende effect van pimecrolimus op door VZV gB/gH-gL gemedieerde celfusie was verzacht. FKBP1A knockdown werd gevalideerd op zowel mRNA (83,5% afname) als eiwit (86,9% afname) niveaus in een stabiele MeWo-DSP1-cellijn die shRNA tot expressie brengt dat specifiek is voor FKBP1A, vergeleken met MeWo-DSP1-controlecellen (Fig 3A). Het effect van FKBP1A knockdown op de remming van calcineurinefosfatase-activiteit door pimecrolimus werd getest met behulp van de NFATC1-nucleaire translocatie-assay. Bij aanvang, in zowel controle- als FKBP1A knockdown MeWo-DSP1-cellen, had 5% van de GFP-NFATC1-positieve cellen NFATC1-nucleaire lokalisatie, 60% had diffuse cytoplasmatische en nucleaire expressie en 35% had alleen cytoplasmatische expressie. Beide cellijnen reageerden op dezelfde manier op door ionomycine geïnduceerde activering van calcineurine, waarbij GFP-NFATC1-nucleaire translocatie in 70% van de cellen optreedt. Voorbehandeling van FKBP1A knockdown-cellen met pimecrolimus voorafgaand aan ionomycine produceerde een 7-voudige toename in GFP-NFATC1-nucleaire translocatie en een 3-voudige afname in cytoplasmatisch GFP-NFATC1 vergeleken met de controlecellen (Figuur 3B). Dit stelde vast dat remming van calcineurinefosfatase-activiteit door pimecrolimus voornamelijk afhing van de interactie met FKBP1A in MeWo-cellen. Knockdown van FKBP1A verminderde marginaal door gB/gH-gL gemedieerde celfusie, maar was niet significant verschillend in vergelijking met MeWo-DSP1-controlecellen (Figuur 3C). Zoals verwacht, terwijl pimecrolimus de gB / gH-gL-gemedieerde fusie significant verhoogde met behulp van de MeWo-DSP1-controlecellen in vergelijking met DMSO, slaagde het medicijn er niet in een significante toename van fusie te induceren met behulp van de FKBP1A knockdown MeWo-DSP1-cellen (Fig 3D). Deze bevindingen bevestigden de NFATC1-nucleaire translocatiegegevens, wat aangeeft dat FKBP1A het specifieke cellulaire eiwit was dat door pimecrolimus werd gebonden om het remmende effect op calcineurine te produceren en bevestigde dat ontregeling van VZV gB/gH-gL-gemedieerde celfusie door pimecrolimus via de remming van calcineurinefosfatase was werkzaamheid.

10.1371/journal.ppat.1009022.g003 Fig 3 Pimecrolimus-verstoring van calcineurine-afhankelijke regulatie van gB/gH-gL-fusie vereist FKBP1A.

(A) FKBP1A shRNA knockdown (KD) in MeWo-cellen. FKBP1A Transcriptniveaus gedetecteerd door RT-qPCR in MeWo-DSP1-controlecellen of FKBP1A KD MeWo-DSP1-cellen werden genormaliseerd naar huishoudgen PGM1 en gepresenteerd als een percentage controlecellen, met gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten (tweezijdig, ongepaard t-toets, ****, p < 0,0001). Western-blot van FKBP1A-eiwit (anti-FKBP1A). FKBP1A-banddichtheid werd genormaliseerd naar respectievelijk α-tubuline in controle- en FKBP1A KD-cellen. De verhouding van de twee waarden werd gepresenteerd als een percentage van controlecellen. Een representatief beeld en gemiddelde ± SEM van de verhouding van drie onafhankelijke experimenten worden getoond. (B) Kwantificering van calcineurinefosfatase-activiteit in FKBP1A KD-cellen met behulp van de NFATC1-nucleaire translocatie-assay. MeWo-DSP1-controlecellen of FKBP1A KD MeWo-DSP1-cellen die GFP-NFATC1 tijdelijk tot expressie brengen, waren onbehandeld (medium) of behandeld met DMSO of pimecrolimus (Pim, 10 M) 30 minuten vóór ionomycine (Iono, 1 μM 30 min). Fluorescentiemicroscopiebeelden van GFP-NFATC1 (groen), kernen gekleurd met Hoechst 33342 (blauw) en een samengesteld beeld. Schaalbalken = 15 m. Rode pijlpunten geven lokalisatie van de kern aan (N), witte pijlpunt geeft diffuse lokalisatie aan in zowel de kern als het cytoplasma (N/C), en witte pijlen geven de lokalisatie van het cytoplasma aan (C). Box- en whiskerplots van GFP-NFATC1-positieve cellen. Het percentage GFP-positieve cellen in controle en FKBP1A KD-cellen met GFP-NAFTC1-lokalisatie naar N, N/C en C. De vakken vertegenwoordigen 25-75 percentiel, snorharen strekken zich uit tot 10-90 percentiel, de mediaan is de horizontale band, en het gemiddelde (+) van cellen (n = 15 gezichtsvelden, 13-22 cellen per gezichtsveld) van twee onafhankelijke experimenten. Punten zijn uitschieters. Statistische verschillen werden geanalyseerd door middel van tweeweg-ANOVA voor elke behandelingsconditie (onbehandeld, DMSO+Iono en Pim+Iono) vergeleken met die in de controlecellen, en significant verschillende paren worden getoond (****, p < 0,0001). (C en D) Effect van FKBP1A KD op VZV gB/gH-gL-gemedieerde fusie en respons op pimecrolimus. Box- en whiskerplots voor celfusie gekwantificeerd door de SRFA in MeWo-DSP1-controlecellen of FKBP1A KD MeWo-DSP1-cellen getransfecteerd met plasmiden om VZV gB/gH[TL]-gL tot expressie te brengen en samen gekweekt met MeWo-DSP2-cellen, onbehandeld ( medium Med) of behandeld met DMSO of pimecrolimus (Pim, 10 M) gedurende 48 uur. Celfusie-efficiëntie wanneer onbehandeld werd vergeleken tussen FKBP1A KD-cellen en controlecellen, weergegeven als een percentage van controlecellen (C), en de respons op pimecrolimus werd geëvalueerd door normalisatie naar het onbehandelde (% medium) per controle en FKBP1A KD-cellijn respectievelijk (NS). Dozen vertegenwoordigen 25-75 percentiel, snorharen strekken zich uit tot 10-90 percentiel, de mediaan is de horizontale band en het gemiddelde (+) van drie onafhankelijke experimenten. Punten zijn uitschieters. Statistische verschillen werden geëvalueerd door middel van ongepaarde, niet-parametrische Mann-Whitney-test (C) (ns, niet significant) of tweeweg-ANOVA (D) (ns, niet significant ****, p < 0,0001).

Calcineurine ondersteunt VZV gB/gH-gL-gemedieerde celfusie

Calcineurine is een heterodimeer dat bestaat uit katalytische subeenheid A (CNA) en regulerende subeenheid B (CNB). De associatie van CNB met CNA is vereist voor calcineurine-activering om zijn fosfatasefunctie mogelijk te maken [47, 48]. Aangezien CNB1 de enige CNB-isovorm is die tot expressie wordt gebracht in MeWo-cellen [33], werd CNB1 uitgeschakeld door shRNA om calcineurine-effecten op VZV gB/gH-gL-gemedieerde celfusie direct te evalueren. Het CNB1-shRNA verlaagde matig zowel mRNA (77,0% afname) als eiwit (42,3% afname) niveaus van CNB1 (Figuur 4A). Door VZV gB/gH-gL geïnduceerde fusie was significant verminderd in CNB1 knockdown MeWo-DSP1-cellen, tot slechts 39,7% van die in MeWo-DSP1-controlecellen (Fig. 4B), wat suggereert dat het intacte calcineurine-heterodimeer belangrijk is voor VZV gB/gH- gL om fusie uit te voeren. Pimecrolimus verbeterde fusie in CNB1 knockdown MeWo-DSP1-cellen in vergelijking met DMSO, maar het niveau van toename was significant minder vergeleken met dat waargenomen in MeWo-DSP1-controlecellen (Figuur 4C). De detectie van resterende verbeterde fusie door pimecrolimus was waarschijnlijk te wijten aan de onvolledige knockdown van CNB1-mRNA en de beperkte vermindering van de eiwitproductie.

10.1371/journal.ppat.1009022.g004 Fig 4 Calcineurine ondersteunt VZV gB/gH-gL-gemedieerde celfusie.

(A) CNB1 shRNA knockdown (KD) in MeWo-cellen. CNB1-transcriptniveaus in MeWo-DSP1-controlecellen of CNB1 KD MeWo-DSP1-cellen gedetecteerd door RT-qPCR werden genormaliseerd naar huishoudgen PGM1 en gepresenteerd als een percentage van controlecellen, met gemiddelde ± SEM van twee onafhankelijke experimenten (tweezijdig, ongepaard t-toets, ****, P < 0,0001). Western blot van CNB1-eiwit (anti-CNB1). CNB1-banddichtheid werd genormaliseerd naar respectievelijk α-tubuline in controle- en CNB1 KD-cellen. De verhouding van de twee waarden werd gepresenteerd als een percentage van controlecellen. Een representatief beeld en gemiddelde ± SEM van de verhouding van twee onafhankelijke experimenten worden getoond. (B en C) Effect van CNB1 KD op VZV gB/gH-gL-gemedieerde fusie en respons op pimecrolimus. Box- en whiskerplots voor celfusie gekwantificeerd door de SRFA in MeWo-DSP1-controlecellen of CNB1 KD MeWo-DSP1-cellen getransfecteerd met plasmiden om VZV gB/gH[TL]-gL tot expressie te brengen en samen gekweekt met MeWo-DSP2-cellen, onbehandeld ( medium Med) of behandeld met DMSO of pimecrolimus (Pim, 10 M) gedurende 48 uur. Celfusie-efficiëntie wanneer onbehandeld werd vergeleken tussen CNB1 KD-cellen en controlecellen, weergegeven als een percentage van controlecellen (B), en de respons op pimecrolimus werd geëvalueerd door normalisatie naar het onbehandelde (% medium) per controle en CNB1 KD-cellijn respectievelijk (C). Kaders vertegenwoordigen 25-75 percentiel, snorharen strekken zich uit tot 10-90 percentiel, de mediaan is de horizontale band en het gemiddelde (+) van twee onafhankelijke experimenten. Statistische verschillen werden geëvalueerd door middel van ongepaarde, niet-parametrische Mann-Whitney-test (B) (**, p < 0,01) of tweeweg-ANOVA (C) (ns, niet significant *, p < 0,05 ****, p < 0,0001) .

Calcineurinefosfatase-activiteit werd gehandhaafd in met VZV geïnfecteerde cellen

Om de relevantie van calcineurine-activiteit voor VZV-infectie te beoordelen, werden NFATC1-nucleaire translocatie-assays uitgevoerd met MeWo-cellen die GFP-NFATC1 tijdelijk tot expressie brachten en die waren geïnfecteerd met een VZV-recombinant die RFP tot expressie bracht (pOka-TK-RFP) (Fig. 5A). Zonder behandeling met ionomycine was 88% van GFP-NFATC1 gelokaliseerd in het cytosol van met VZV geïnfecteerde cellen, terwijl behandeling met ionomycine een dramatische translocatie van 94% van GFP-NFATC1 in de kernen van geïnfecteerde cellen veroorzaakte (Fig. 5B), wat aangeeft dat calcineurinefosfatase behouden tijdens infectie. Belangrijk is dat pimecrolimus-voorbehandeling met succes de door ionomycine geïnduceerde nucleaire translocatie van GFP-NFATC1 verhinderde (Fig. 5B), wat bevestigt dat pimecrolimus de calcineurinefosfatase-activiteit in met VZV geïnfecteerde cellen direct remde.

10.1371/journal.ppat.1009022.g005 Fig 5 De activiteit van calcineurinefosfatase blijft functioneel in met VZV geïnfecteerde cellen.

(A) Fluorescentiemicroscopiebeelden van MeWo-cellen die GFP-NFATC1 tijdelijk tot expressie brengen bij 16 hpi met pOka-TK-RFP die onbehandeld waren (medium) of behandeld met DMSO of pimecrolimus (Pim, 10 μM) 30 min voorafgaand aan ionomycinestimulatie (Iono, 1 M 30 min) pOka-TK-RFP (rood), GFP-NFATC1 (groen) en kernen gekleurd met Hoechst 33342 (blauw) en een samengestelde afbeelding. Schaalbalken = 15 m. (B) Box- en whiskerplots van GFP-NFATC1-lokalisatie in met VZV geïnfecteerde cellen. Van de totale GFP-NFATC1 tot expressie brengende cellen die ook waren geïnfecteerd met TK-RFP, werd het percentage cellen met GFP-NAFTC1 getransloceerd naar de kern (N), gediffundeerd in de kern en cytosol (N/C), of gelokaliseerd in cytosol (C) . Kaders vertegenwoordigen 25-75 percentiel, snorharen strekken zich uit tot 10-90 percentiel, de mediaan is de horizontale band en het gemiddelde (+) van cellen (n = 12 gezichtsvelden, 41-66 cellen per gezichtsveld) van drie onafhankelijke experiment. Punten zijn uitschieters. Statistische verschillen werden geanalyseerd door middel van tweeweg-ANOVA voor elke lokalisatiegroep (N, N/C en C) vergeleken met die in de onbehandelde, getoond zijn de significant verschillende paren (****, p < 0,0001).

Remming van calcineurinefosfatase-activiteit versterkte celfusie maar onderdrukte VZV-verspreiding

Om te bepalen of calcineurinefosfatase-activiteit nodig was om celfusie tijdens VZV-replicatie te reguleren, werd het aantal kernen dat aanwezig was in syncytia van Life-Act-tGFP MeWo-cellen geïnfecteerd met pOka-TK-RFP gekwantificeerd als reactie op behandeling met pimecrolimus of de DMSO-controle (Afb. 6A). Terwijl syncytiumexpansie een dynamische beweging was waarbij nieuw in contact gebrachte cellen aan de periferie van het syncytium werden opgenomen tijdens de opgenomen 24 tot 40 uur na infectie (hpi) (S1- en S2-films), was het tijdvenster voor een lineaire toename van kernen binnen syncytia tussen 24 en 30 hpi (Fig 6A en 6B). Fusie was verhoogd in met pimecrolimus behandelde cellen, resulterend in significant meer kernen binnen syncytia in vergelijking met DMSO-controle tussen 24 en 30 hpi (Figuur 6C). De verhoogde fusie van met VZV geïnfecteerde cellen wanneer de activiteit van calcineurinefosfatase werd geremd, bevestigde de waarnemingen in de gB/gH-gL-SRFA in afwezigheid van andere VZV-eiwitten. Deze gegevens toonden kritisch aan dat de regulerende rol van calcineurine in VZV gB/gH-gL-gemedieerde fusie niet te wijten was aan het gebruik van gH[TL] in de SRFA.

10.1371/journal.ppat.1009022.g006 Fig 6 Verbeterde celfusie geïnduceerd door remming van calcineurinefosfatase-activiteit tijdens VZV-infectie.

(A) Confocale microscopie van LifeAct-tGFP MeWo-cellen geïnfecteerd met pOka-TK-RFP, behandeld met DMSO of pimecrolimus (Pim 10 μM). Representatieve plaques gevangen van confocale microscopie met levende cellen bij 24 en 30 hpi van S1- en S2-films, die pOka-TK-RFP-geïnfecteerde cellen (rood), LifeAct-tGFP-gelabelde actinefilamenten (groen) en kernen tonen gekleurd met Hoechst 33342 ( blauw). Schaalbalken = 100 m. (B) frequentie van kernen in syncytia met intervallen van 40 min van 24 tot 30 hpi voor plaques in (A). De determinatiecoëfficiënt (R2) werd berekend om de lineaire relatie van verhoogde kernfrequentie in syncytia te bepalen tijdens het infectievenster van 6 uur. (C) Scatter dot plots van verhoogde kernfrequentie in syncytia van 24 tot 30 hpi. Gemiddelde ± SEM voor plaques (n = 8) van twee onafhankelijke confocale microscopie-experimenten met levende cellen. Statistische significantie werd geëvalueerd met een ongepaarde, niet-parametrische Mann-Whitney-test (*, p < 0,05).

Eerdere studies hebben aangetoond dat ontregelde celfusie als gevolg van verstoorde controle door de CTD's van gB en gH resulteert in een verminderde pathogenese van de huid en leidt tot een slechte VZV-spreiding, wat blijkt uit verminderde plaquegroottes en beperkte penetratie in de MeWo-celmonolaag aan de plaqueranden [18, 25, 26]. Om vast te stellen of verbeterde celfusie als reactie op interferentie met calcineurineregulatie vergelijkbare gevolgen had, werden met VZV geïnfecteerde MeWo-cellen behandeld met pimecrolimus. Wat betreft de plaques van hyperfusogene mutanten gB[Y881F] en gH[TL] [18, 25], hadden de VZV pOka-plaques een smallere marge bij pimecrolimus-behandeling op 4 dagen na infectie (dpi) vergeleken met met medium en DMSO behandelde cellen zoals gevisualiseerd door immunohistochemie (IHC) (Fig. 7A). Plaquegroottes van pOka waren ook significant verminderd door pimecrolimus (0,68 ± 0,32 mm2) vergeleken met die van de medium (1,34 ± 0,49 mm2) of DMSO (1,21 ± 0,60 mm2) controles (Fig 7B). Bovendien hadden met pimecrolimus behandelde monolagen vaker microplaques, waarvan wordt aangenomen dat ze te wijten zijn aan voortijdige loslating van cellen uit de centra van primaire plaques die ook worden opgemerkt in MeWo-cellen die zijn geïnfecteerd met de gB [Y881F], en de overdracht van VZV-deeltjes gehecht aan celmembraan fragmenten om secundaire foci te creëren (Fig 7D). Hoewel deze secundaire plaques leidden tot een hogere plaquefrequentie in met pimecrolimus behandelde monolagen en een schijnbare equivalentie van VZV-groeikinetiek bij 2-4 dpi (Fig. 7D en S3), bleef het totale oppervlak van plaques in met pimecrolimus behandelde monolagen 50% minder dan die waargenomen bij medium of DMSO-behandeling (Fig 7D). Alles bij elkaar genomen was regulering van celfusie door calcineurine noodzakelijk voor de typische vermeerdering van VZV in celmonolagen tijdens virale replicatie en was niet beperkt tot een effect op gB/gH-gL-gemedieerde celfusie in afwezigheid van andere virale eiwitten.

10.1371/journal.ppat.1009022.g007 Fig 7 Remming van de activiteit van calcineurinefosfatase onderdrukt de VZV-verspreiding in MeWo-cellen.

Plaquegroottes van VZV pOka in MeWo-cellen onbehandeld (medium Med), behandeld met DMSO of pimecrolimus (Pim 10 M) bij 4 dpi. (A) Immunohistochemiekleuring van VZV-plaques met de gemiddelde plaquegrootte per aandoening. Schaalbalken = 0,3 mm. (B) Box- en snorhaarplots van plaquegroottes (mm 2 ). Kaders tonen het 25-75 percentiel, snorharen strekken zich uit tot 10-90 percentiel, de mediaan is de horizontale band en het gemiddelde (+) van drie onafhankelijke experimenten (n = 60). Punten zijn uitschieters. Statistische verschillen werden geëvalueerd door middel van one-way ANOVA (ns, niet significant ****, p < 0.0001). (C) Box- en whiskerplots van MeWo-cellen, MeWo-DSP1-controlecellen of FKBP1A KD MeWo-DSP1-cellen bij 4 dpi met VZV pOka, onbehandeld (medium Med) of behandeld met DMSO of pimecrolimus (Pim, 10 μM). Percentage plaquegrootte genormaliseerd naar onbehandeld (% medium). Kaders tonen het 25-75 percentiel, snorharen strekken zich uit tot 10-90 percentiel, de mediaan is de horizontale band en het gemiddelde (+) van twee onafhankelijke experimenten (n = 60). Punten zijn uitschieters. Statistische verschillen werden geëvalueerd door middel van tweeweg-ANOVA (ns, niet significant ****, p < 0,0001). (D) frequentie en totale oppervlakte van plaques in aanwezigheid van pimecrolimus. MeWo-cellen geïnfecteerd met pOka waren onbehandeld (medium), behandeld met DMSO of pimecrolimus (10 M) gedurende 4 dagen, plaquefrequentie en totale plaque-oppervlak werden geanalyseerd door ImageJ automatische deeltjestelling. Representatief resultaat van ≥3 onafhankelijke experimenten wordt getoond, met input Immunohistochemistry-afbeeldingen (schaalbalken = 2 mm), verwerkte afbeeldingen en vermelde metingen.

De rol van calcineurinefosfatase-activiteit bij virale verspreiding werd bevestigd door het kwantificeren van plaquegroottes in FKBP1A knockdown MeWo-DSP1-cellen geïnfecteerd met VZV (Figuur 7C). Zoals verwacht verminderde behandeling met pimecrolimus de gemiddelde plaquegrootte tot 50% van die met medium- of DMSO-controles in zowel MeWo-cellen als MeWo-DSP1-controlecellen. Daarentegen waren de plaquegroottes niet significant verminderd in FKBP1A knockdown MeWo-DSP1-cellen behandeld met pimecrolimus in vergelijking met de medium- en DMSO-controles, wat aangeeft dat overdreven fusie als gevolg van de remming van calcineurinefosfatase-activiteit de primaire factor was in slechte VZV-spreiding.

Het fosfoproteoom van MeWo-cellen behandeld met pimecrolimus onthulde potentiële nieuwe gastheercalcineurinesubstraten

Van calcineurine is bekend dat het zeer selectief is voor zijn defosforyleringsdoelen door herkenning van twee korte koppelingsmotieven op zijn substraten, PxIxIT en LxVP [49, 50]. De consensussequenties voor PxIxIT- en LxVP-motieven waren afgeleid van 20 eerder geïdentificeerde calcineurinesubstraten (Figuur 8A en S3-tabel). Het PxIxIT-motief heeft een proline-restrictie op positie 1 en tolereert alleen conservatieve vervangingen met hydrofobe aminozuren op positie 3 en 5, terwijl positie 6 meer gedegenereerd is en zowel hydrofiele als hydrofobe residuen accepteert. Evenzo heeft het LxVP-motief een prolinerestrictie op positie 4 maar tolereert conservatieve vervangingen met hydrofobe aminozuren op positie 1 en 3 (Figuur 8A).

10.1371/journal.ppat.1009022.g008 Fig 8 Remming van de activiteit van calcineurinefosfatase verandert het fosfoproteoom van MeWo-cellen.

(A) Consensus-dockingmotieven op calcineurinesubstraten voor calcineurinebinding. PxIxIT- en LxVP-motieven van 20 eerder geverifieerde substraten van calcineurine werden gebruikt om het consensusmotief te genereren door WebLogo 3. De frequentie van aminozuren op elke positie wordt weergegeven door de hoogte van de letter. Chemische eigenschappen van aminozuren worden weergegeven door de kleur van de letter: groen, polair paars, neutraal blauw, basisch rood, zuur zwart, hydrofoob. (B) Warmtekaart van uniek gefosforyleerde eiwitten gedetecteerd in MeWo-cellen behandeld met pimecrolimus (10 M) gedurende 2 uur. Totale cellulaire eiwitten werden geëxtraheerd in aanwezigheid van fosfataseremmer en onderworpen aan Zr-IMAC-fosfopeptideverrijking, gevolgd door orbitrap-massaspectrometrie. Voor elke aandoening werden drie biologische monsters geanalyseerd en de relatieve spectra van uniek gefosforyleerde eiwitten die zijn gedetecteerd in alle drie met pimecrolimus behandelde monsters, maar niet in DMSO-monsters, worden weergegeven in de hittekaart. Nucleaire factor van geactiveerde T-cellen cytoplasmatisch 1 (NFATC1) ETS transcriptiefactor (ELK1) fosfatase en actine regulator 2 (PHACTR2) interleukine-enhancer binding factor 3 (ILF3) nucleaire receptor co-activator 1 (NCOA1) transmembraan kanaalachtig eiwit 8 (TMC8) methyl -CpG bindend domein eiwit 1 (MBD1). Eerder bekende calcineurinesubstraten zijn gemarkeerd met sterretjes (*). (C) Potentieel koppelmotief voor calcineurinebinding op nieuw geïdentificeerde fosfoproteïnen die zijn gelokaliseerd door Clustal-uitlijning met behulp van het consensusmotief. Geconserveerde aminozuren op PxIxIT- en LxVP-motief (rood), conservatieve substituties (blauw), dockingmotief op eerder bekende substraten van calcineurine (omkaderd).

Daarom werden, als een eerste stap naar het definiëren van potentiële stroomafwaartse elementen die betrokken zijn bij fusieregulatie, gastheersubstraten onderzocht met behulp van fosfopeptideverrijking en Orbitrap-massaspectrometrie om de eiwitten te identificeren die exclusief werden gefosforyleerd wanneer MeWo-cellen werden behandeld met pimecrolimus in vergelijking met met DMSO behandelde cellen. Van de 5.177 gedetecteerde fosfoproteïnen waren er slechts zeven exclusief gefosforyleerd op serine- of threonine-plaatsen in met pimecrolimus behandelde maar niet in met DMSO behandelde MeWo-cellen. Twee van de zeven waren NFATC1 en ELK1, die bekende doelen zijn van calcineurinedefosforylering [50, 51] (Figuur 8B en S2 Tabel). De persistentie van gefosforyleerd NFATC1 en ELK1 diende dus als controles voor de fosfoproteoomgegevens van met pimecrolimus behandelde MeWo-cellen. Belangrijk is dat, voor zover wij weten, geen van de resterende vijf eiwitten, PHACTR2, ILF3, NCOA1, TMC8 en MBD1, die gefosforyleerd bleven in de aanwezigheid van pimecrolimus, eerder is gerapporteerd als substraten voor calcineurine. De vier fosfoproteïnen, PHACTR2, ILF3, NCOA1 en TMC8 bevatten allemaal de PxIxIT- en LxVP-consensus-dockingmotieven, met conservatieve substituties op posities 3 en 5 op PxIxIT, en posities 1 en 3 op LxVP, wat suggereert dat ze waarschijnlijk directe calcineurinesubstraten zijn (Fig. 8C). MBD1 miste echter een conservatieve substitutie op positie 3 op PxIxIT-motief, wat de calcineurine-docking zou kunnen verzwakken (Figuur 8C). Als dat zo is, kan MBD1-fosforylering indirect te wijten zijn aan remming van calcineurine. Alles bij elkaar genomen leidt de remming van calcineurinefosfatase-activiteit tot unieke fosforylering van deze zeven gastheereiwitten en overdreven VZV-geïnduceerde celfusie. Welke rol de defosforylering van een of meer van deze eiwitten speelt in de calcineurineregulatie van VZV-celfusie is onbekend, maar de huidige studie biedt de basis voor verder onderzoek.

Een kenmerk van de pathogenese van VZV is het vermogen om de intrinsieke barrières voor celfusie te overwinnen die worden veroorzaakt door het gB/gH-gL-complex. De huidige studie gebruikte de HT-SRFA om een ​​kritische celgastheerfactor, calcineurine, te identificeren die nodig is voor canonieke VZV-gemedieerde celfusie. We tonen aan dat zowel tacrolimus als pimecrolimus, bekende calcineurineremmers, werken door een geneesmiddel-eiwitcomplex te vormen met FKBP1A dat voorkomt dat calcineurine functioneert als een cellulaire fosfatase. In tegenstelling tot tacrolimus en pimecrolimus, kon sirolimus, een geneesmiddel dat ook een complex vormt met FKBP1A maar mTOR remt in plaats van calcineurine, de door ionomycine geïnduceerde activering van calcineurine niet voorkomen en had het geen invloed op de celfusie die werd geïnduceerd door VZV gB/gH-gL, HSV -1 gB/gH-gL/gD, of syncytine-1. Deze bevinding onderscheidt de twee stroomafwaartse effecten die het gevolg zijn van binding van deze geneesmiddelen aan FKBP1A en ondersteunt sterk dat calcineurinefosfatase-activiteit van cruciaal belang is voor de regulatie van celfusie geïnduceerd door VZV gB/gH-gL en deze andere fusogenen.

Als een sterk celgeassocieerd virus geeft VZV zeer weinig infectieuze virusdeeltjes af in de extracellulaire omgeving [52]. Dus verstoorde celfusie beïnvloedt VZV meer verspreid dan voor andere alfaherpesvirussen, zoals HSV-1, dat orden van grootte meer celvrije virions produceert, zelfs in de context van syncytiële fenotypes [53 – 56]. Onze eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat een basisniveau van celfusie vereist is voor de verspreiding van VZV, aangezien mutaties van het gB- of gH-ectodomein die celfusie verstoren, ernstige replicatiestoornissen kunnen veroorzaken of VZV kunnen inactiveren, waardoor er weinig tot geen virusverspreiding mogelijk is [18, 21, 22 ]. Het niet beheersen van dit door virus geïnduceerde celfusieproces vermindert echter ook de virusverspreiding aanzienlijk, aangezien mutaties in het gB- of gH-CTD die de fusie versterken, in feite de virusverspreiding onderdrukken als gevolg van een belemmerde assemblage van virusdeeltjes [18, 25]. Met name de overdreven celfusie schaadt ook de VZV-infectie in huidxenotransplantaten [18, 25]. Daarom, in tegenstelling tot andere alfaherpesvirussen die grote hoeveelheden extracellulaire virionen produceren, moet VZV-geïnduceerde celfusie strak worden gereguleerd om virusvermeerdering voor pathogenese mogelijk te maken. De huidige studie koppelt de activiteit van calcineurinefosfatase aan deze regulatie.

Als een van de belangrijkste eiwitten in calciumsignaleringsnetwerken, is calcineurine in grote lijnen betrokken bij genexpressie van gastheercellen, membraantransport, cytoskeletrangschikking, celcyclus en apoptose [57]. In deze context is calcineurine specifiek betrokken bij de fusie van myoblasten die nodig zijn voor differentiatie en groei van skeletspieren, zoals blijkt uit de gevolgen van remming van de functie ervan [58, 59]. Bovendien reguleert calcineurine de celfusie die nodig is voor botvorming doordat de remming ervan door tacrolimus de vorming van gedifferentieerde meerkernige osteoclasten vermindert [60, 61]. Terwijl andere celfactoren bijdragen aan het beheersen van viraal geïnduceerde cel-celfusie, bijvoorbeeld IFITM, tetraspanine, Ezrin en EWI-2, waarvan is aangetoond dat ze door HIV geïnduceerde T-celsyncytia remmen [62 – 66], is calcineurine er is niet gemeld dat het de celfusie reguleert die wordt geïnduceerd door een van de fusie-inducerende virussen. De bevinding dat remming van de activiteit van calcineurinefosfatase ook de door HSV-1 gB/gH-gL/gD geïnduceerde celfusie verhoogde, benadrukt dat calcineurine een algemene rol speelt bij de regulering van virale fusie. Dat VZV de fosfatase-activiteit van dit gastheerceleiwit gebruikt naast de directe virale regulatie door functionele motieven in de gB- en gH-CTD's om overdreven celfusie te voorkomen, weerspiegelt een goed ontwikkelde homeostase die nodig is voor de assemblage van nageslachtvirionen, die wordt verstoord wanneer fusie niet wordt uitgevoerd effectief geregeld.

In een eerste verkenning van potentiële calcineurinesubstraten die mogelijk betrokken zijn bij de fusieregulerende functie ervan, identificeerde de huidige studie zeven gastheerfosfoproteïnen die gefosforyleerd bleven wanneer de calcineurinefosfatase-activiteit werd geremd door pimecrolimus (S2-tabel). De mRNA-transcripten voor deze vijf eiwitten (PHACTR2, ILF3, NCOA1, TMC8 en MBD1) evenals de twee bekende calcineurinesubstraten (NFATC1 en ELK1) werden allemaal gedetecteerd in met VZV geïnfecteerde cellen op vergelijkbare niveaus als niet-geïnfecteerde cellen [33]. Hiervan is nucleaire receptor co-activator 1 (NCOA1), een lid van de familie van steroïde/nucleaire receptor co-activatoren, van belang omdat het interactome oestrogeenreceptor (ER), retinoïnezuurreceptor (RAR) en retinoïde X-receptor RXR (RXR ) [ 67 – 70 ]. De HT-SRFA identificeerde drie verbindingen die oestrogeenreceptorantagonisten zijn en twee verbindingen die retinoïnezuurreceptorligand of retinoïnezuurreceptoragonisten zijn, die allemaal de celfusie verbeterden (S1-tabel). De interactie tussen NCOA1 en ER, RAR of RXR hangt voornamelijk af van het LxxLL-motief dat zich in het nucleaire receptorinteractiedomein op NCOA1 bevindt [71]. Ser-369 bevindt zich in een serine/threonine-rijk gebied van NCOA1, terwijl Ser-698 vier aminozuren stroomafwaarts van het vierde LxxLL-motief op NCOA1 is, wat de conformatie van NCOA1 zou kunnen beïnvloeden op een manier die de toegankelijkheid van de nucleaire receptor verandert [ 72 ]. Fosforylering op deze plaatsen als gevolg van remming van calcineurine (S2-tabel) zou naar verwachting een analoog effect hebben op fusie zoals waargenomen met geneesmiddelen geïdentificeerd door de HT-SRFA die direct op de nucleaire receptoren zijn gericht. PHACTR2 is ook van bijzonder belang omdat leden van de familie van fosfatase- en actineregulatoren (PHACTR1-4) bekend staan ​​om hun rol in de modulatie van de cytoskeletstructuur [73]. Monomeer G-actine bindt aan PHACTR4 wanneer het monomeer G-actine niveau laag wordt, PHACTR4 detecteert de verandering en bevordert de depolymerisatie van actine filamenten om de monomere G-actine pool aan te vullen [74]. PHACTR2 is minder bestudeerd, maar zou de actinedynamiek op een vergelijkbare manier kunnen reguleren, aangezien alle PHACTR-eiwitten sequentieovereenkomst delen in G-actine-bindende domeinen [73]. Ser-510 op PHACTR2 werd voor het eerst gedetecteerd als gefosforyleerd als reactie op calcineurine-remming (S2-tabel), en kan worden toegewezen aan het gebied in de buurt van waar G-actine bindt. Fosforylering op deze plaats zou de interactie tussen PHACTR2 en G-actine kunnen belemmeren, waardoor actinedepolymerisatie wordt veroorzaakt. Dit zou celfusie kunnen versterken, aangezien is gemeld dat de actinecortex de vorming van syncytium regelt door de fusieporiënexpansie te remmen [75], en is consistent met de verhoogde VZV-celfusie die wordt geïnduceerd in de afwezigheid van calcineurinefosfatase-activiteit.

Naast VZV is celfusie ook een onderdeel van de pathogenese van HSV, wat blijkt uit de meerkernige cellen die worden waargenomen in geïnfecteerde huidweefsels [2]. Van belang is dat een recent onderzoek eiwittyrosinefosfatase 1B (PTP1B) koppelde aan door HSV-1 geïnduceerde cel-celfusie door observaties met een fusieversterkende verbinding salubrinal [76].In tegenstelling tot de versterkte VZV gB/gH-gL-afhankelijke celfusie als gevolg van calcineurineremming, was salubrinal-geïnduceerde fusie van met HSV-1 geïnfecteerde cellen echter afhankelijk van virale accessoire-eiwitten, aangezien PTP1B en het doelwit van salubrinal de kernfusie niet reguleerde. machines afzonderlijk, maar alleen wanneer het zich in een complex bevond met aanvullende eiwitten. Bovendien trad de aanhoudende fosforylering van eIF2α, een gevestigde gastheerrespons op salubrinal, nog steeds op toen PTP1B werd uitgeschakeld, wat aangeeft dat PTP1B niet het directe doelwit van salubrinal was, en het effect van salubrinal op HSV-1-celfusie was waarschijnlijk betrokken bij aanvullende, maar niet-geïdentificeerde eiwitten. Deze studie benadrukte een veelzijdig samenspel tussen gastheerceleiwitten bij de regulatie van HSV-1-celfusie.

Het is niet verwonderlijk dat, als gevolg van de multifactoriële regulatie van de complexe biologie van door herpesvirus geïnduceerde celfusie, de HT-SRFA-gegevens aanvullende gastheerceleiwitten identificeerden die mogelijk ook betrokken zijn bij fusieregulatie, onafhankelijk van de calcineurineroute, en verdere studie rechtvaardigen. Differentiële regulatie die afhangt van celtype-specifieke expressie van gastheercelfactoren zou ook het feit kunnen verklaren dat hoewel VZV celfusie tussen huidcellen en in sensorische ganglia veroorzaakt, VZV-geïnfecteerde T-cellen niet fuseren [77-79]. Aangezien door VZV geïnduceerde celfusie cruciaal is voor pathogenese in de menselijke gastheer, zouden gastheergerichte therapieën die gericht zijn op fusie de antivirale behandeling kunnen verbeteren, en bij uitbreiding bieden dergelijke factoren kansen voor het ontwerpen van interventies tegen andere fusogene virale pathogenen.

Materialen en methoden Cellen en virussen

CHO-DSP1 [28]-cellen, afgeleid van Chinese Hamster Ovary (CHO) K1-cellen (CCL-61, ATCC) die Dual Split Protein (DSP) tot expressie brengen1-7 van het chimere reportereiwit bestaande uit gesplitst GFP en gesplitst Renilla-luciferase, werden vermeerderd met behulp van F-12K-voedingsmengselmedium (Corning) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS, Gibco), penicilline (100 U/ml, Gibco), en streptomycine (100 g/ml, Gibco), met puromycineselectie (8 μg/ml Gibco). Menselijke melanoom MeWo-cellen (HTB-65, ATCC), MeWo-DSP1-cellen afgeleid van MeWo-cellen die DSP tot expressie brengen1-7, MeWo-DSP2 die de DSP . uitdrukt8-11 [28], MeWo-DSP1-cellen die shRNA tot expressie brengen tegen FKBP1A, MeWo-DSP1-cellen die shRNA tot expressie brengen tegen CNB1 en MeWo LifeAct-tGFP-cellen die een kort peptide tot expressie brengen dat is gefuseerd met tGFP dat bindt aan F-actine [33] werden vermeerderd in minimaal essentieel medium (MEM, Corning) aangevuld met 10% FBS, niet-essentiële aminozuren (1X, Corning), penicilline (100 E/ml, Gibco), streptomycine (100 g/ml, Gibco) en amfotericine B (0,5 μg/ml, Corning ). MeWo-DSP1, MeWo-DSP2, MeWo-DSP1 die shRNA tot expressie brengt tegen FKBP1A, MeWo-DSP1 die shRNA tot expressie brengt tegen CNB1 en MeWo LifeAct-tGFP-cellen werden onder puromycineselectie gehouden (5 μg / ml Gibco). HEK293T (CRL-3216, ATCC) cellen werden vermeerderd met Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM, Corning) aangevuld met 10% FBS, penicilline (100 U/ml, Gibco), streptomycine (100 μg/ml, Gibco) en amfotericine B ( 0,5 g/ml, Corning). De ouderlijke Oka-stam van VZV (pOka) afgeleid van een zelf-exciseerbaar bacterieel kunstmatig chromosoom (BAC) [80] en het pOka-TK-RFP-virus dat is ontwikkeld om monomeer RFP tot expressie te brengen dat is geconjugeerd aan het thymidinekinase (TK) [33] werden vermeerderd en getitreerd op MeWo-cellen.

Stabiele reporterfusietest met hoge doorvoer

NIHCC (NIH clinic collection 446 compounds, Evotec), LOPAC (Library of Pharmacologically Active Compounds 1280 compounds, Sigma Aldrich), Microsource spectrum (2000 compounds, Discovery System, Inc.), SCREEN-WELL ICCB Known Bioactives Library (480 verbindingen, Enzo Life Sciences) en SCREEN-WELL FDA-goedgekeurde geneesmiddelenbibliotheek (640 verbindingen, Enzo Life Sciences) verkrijgbaar bij het High-Throughput Bioscience Center (HTBC) aan de Stanford University, in totaal 4846 verbindingen, werden geëvalueerd op hun effecten op VZV gB/gH -gL gemedieerde celfusie. In het kort werden 7,2 x 107 CHO-DSP1-cellen getransfecteerd met 144 μg pCAGGS-gB [27], pME18S-gH[TL] [27] en pcDNA3.1-gL [22]-plasmiden met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) . De gH[TL]-vector die de laatste acht aminozuren (834-841) in het cytoplasmatische domein mist, werd gekozen boven wildtype gH omdat gH[TL] een verbeterde signaal-ruisverhouding biedt. CHO-DSP1-cellen werden gekozen boven MeWo-DSP1-cellen als de effectorcellen omdat CHO-cellen een hogere transfectiesnelheid bereiken, wat het percentage effectorcellen verhoogt dat alle drie de glycoproteïnen samen tot expressie brengt, waardoor de kans op celfusie groter wordt. Terwijl transfectie aan de gang was, werden bibliotheken van verbindingen vastgemaakt in putjes van platen met 384 putjes (Greiner Bio-One) die vooraf waren geladen met 30 l / putje medium in de HTBC-faciliteit. Op 6 uur na transfectie werden de getransfecteerde CHO-DSP1-cellen geoogst en opnieuw gesuspendeerd in 45 ml MEM-medium om 1,6 x 106 cel/ml te bereiken, en gemengd met vier volumes (180 ml) MeWo-DSP2-cellen bij 1,5 x 10 6 cellen/ml. De gemengde celcultuur werd toegevoegd aan platen met 384 putjes bij 30 l / putje met behulp van het geautomatiseerde dispensersysteem (WellMate Microplate Reagent Dispenser with Stackers, Matrix). Cellen werden 48 uur bij 37°C geïncubeerd vóór de meting van Renilla-luciferase-activiteit uit de reconstitutie van DSP als gevolg van celfusie. Gezien het grote aantal platen met 384 putjes in dit experiment, zou de totale tijd voor het lezen van de plaat maximaal 50 minuten zijn, wat het stabiele luminescentietijdvenster (2 minuten) dat door traditioneel coelenterazine-substraat wordt gegenereerd, overschrijdt. Enduren levend celsubstraat (Promega) werd gekozen als alternatief substraat omdat het tot 24 uur een aanhoudend luminescentiesignaal kan genereren. Voor uitlezing werd 20 l/well 1X Enduren levend celsubstraat in wells gedoseerd met behulp van een geautomatiseerd dispensersysteem (Multidrop 384-well Microplate Reagent Dispenser, Titertek), gevolgd door 2 uur incubatie bij 37°C. Renilla-luminescentie werd vervolgens gedetecteerd met behulp van Infinite M1000 PRO-Multimode 384-well Microplate Reader (Tecan). De levensvatbaarheid van de cellen werd ook getest door 10 l/putje 1X CellTiter-Glo luminescent substraat (Promega) af te geven, en de resulterende luminescentie werd gemeten zoals hierboven. Positieve controles van de test waren putjes die cellen bevatten maar zonder enige verbindingsbehandeling (n = 512). Transfectie met vehikelplasmiden pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) en pME18S [27] diende als een negatieve controle voor fusie (n = 256), terwijl putjes met medium alleen als een negatieve controle voor cellevensvatbaarheid (n = 256). Het experiment werd in tweevoud uitgevoerd.

HT-SRFA-gegevens werden geanalyseerd met behulp van Microsoft Excel. De gemiddelde Z'-waarden van Renilla-luminescentie en CellTiter-Glo-luminescentie van duplicaat-experimenten waren respectievelijk 0,53 ± 0,08 en 0,67 ± 0,10, wat een goede scheiding tussen de positieve en negatieve controles in beide metingen bevestigt, en de kwaliteit van de test was in de uitstekend bereik (1 > Z' ≥ 0,5) voor screeningstesten met hoge doorvoer [81]. De waarden van Renilla-luminescentie- en CellTiter-Glo-luminescentiewaarden voor putjes met testverbinding werden genormaliseerd naar en gepresenteerd als een percentage van het gemiddelde van de positieve controleputjes op de intraplaat. De gemiddelde variatiecoëfficiënt (CV%) van positieve controles op fusie en cellevensvatbaarheid was respectievelijk 14,9% en 9,9%. Verbindingen met een cellevensvatbaarheidswaarde buiten de ±3 CV% (≥129,7% en ≤ 70,3%) werden geëlimineerd als foutieve celafgifte of potentieel toxisch. bij een reproduceerbare toename of afname van meer dan ±3 CV % fusie (≥ 144,7% of ≤ 55,3%) versterkten 95 verbindingen en remden 72 fusie. Aangezien CHO-DSP1-cellen 20% van de cellen/putje uitmaakten, kan een verbinding die alleen toxisch is voor CHO-cellen echter verkeerd worden geïdentificeerd als remmend voor fusie omdat 20% celdood onder de grens van de levensvatbaarheid van de cellen lag. Daarom werden de CHO-celtoxiciteitsprofielen voor de 72 als remmers geclassificeerde verbindingen bepaald uit de HTBC-database, wat leidde tot de eliminatie van 58 verbindingen. Wanneer verbindingen die meer dan eens in de bibliotheken waren opgenomen verder werden verwijderd, bleken 71 (1,5%) unieke verbindingen de fusie te versterken en 9 (0,2%) remden de fusie.

Validatie van verbindingen van HT-SRFA

Tacrolimus (FK506) (Selleckchem), pimecrolimus (Selleckchem), sirolimus (Selleckchem) en ionomycine (Alomone-labs) werden allemaal opgelost in DMSO (Sigma Aldrich). Activiteit van de verbindingen op VZV gB/gH-gL-gemedieerde celfusie werd geëvalueerd door middel van een stabiele reporterfusietest zoals eerder beschreven [28]. In het kort, CHO-DSP1- of MeWo-DSP1-cellen die waren getransfecteerd met gelijke hoeveelheden pCAGGS-gB, pME18S-gH[TL] en pcDNA3.1-gL-plasmiden met behulp van Lipofectamine 2000 werden 6 uur na transfectie geoogst en gemengd met MeWo- DSP2-cellen in aanwezigheid van verschillende concentraties van de verbindingen bereid in tweevoudige seriële verdunningen, variërend van 10 M tot 1,25 M. Co-kweek van cellen werd uitgezaaid in Nunc MicroWell 96-putjes optische bodemplaten (ThermoFisher) en 48 uur geïncubeerd. De activiteit van Renilla luciferase werd direct na toevoeging van substraat h-Coelenterazine (Nanolight Technology) afgelezen. Transfectie met alleen vehikelplasmiden pcDNA3.1 (+) en pME18S, of pcDNA3.1 (+), pME18S en pCAGGS-gB diende als negatieve controle. De levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten met behulp van CellTiter-Glo Luminescent substraat (Promega). Het luminescentiesignaal werd opgenomen met behulp van Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader (BioTek). Experimenten werden ten minste in drievoud uitgevoerd.

Stabiele-reporter-fusie-assays

Assay-afhankelijke effectorcellen, CHO-DSP1, MeWo-DSP1, FKBP1A knockdown MeWo-DSP1 of CNB1 knockdown MeWo-DSP1, werden getransfecteerd met VZV pCAGGS-gB, pME18S-gH[TL] en pcDNA3.1-gL-plasmiden, of HSV-1 pCAGGS-gB, pME18S-gH, pcDNA3.1-gL en pCAGGS-gD plasmiden, of pHCMV-ERVW1Δ16 (geschenk van George Murphy, Stanford University, Stanford, CA, VS) plasmide met Lipofectamine 2000. ERVW1Δ16 plasmide, dat codeert voor een vorm van humaan syncytine-1 met een afknotting van zestien aminozuren van het cytoplasmatische domein, werd geselecteerd omdat het een betere signaal-ruisverhouding kan genereren in de fusie-uitlezing [82]. Op 6 uur na transfectie werden de getransfecteerde cellen geoogst en gemengd met MeWo-DSP2-cellen in aanwezigheid van DMSO, pimecrolimus (10 M) of sirolimus (10 M) gedurende nog eens 48 uur. De activiteit van Renilla-luciferase werd onmiddellijk afgelezen na toevoeging van substraat h-Coelenterazine (Nanolight Technology) op een Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader (BioTek).

Kwantificering van celoppervlak gB en gH-gL

De hoeveelheid VZV-glycoproteïnen op het celoppervlak werd gemeten zoals eerder beschreven [18]. In het kort werden CHO-DSP1-cellen getransfecteerd met ofwel pCAGGS-gB of pME18S-gH [TL] en pcDNA3.1-gL-plasmiden behandeld met medium, DMSO of pimecrolimus (10 μM) gedurende 24 uur. Cellen werden losgemaakt met behulp van een enzymvrije celdissociatiebuffer (Gibco), gefixeerd met 1% paraformaldehyde (PFA, Boston Bioproducts) en opnieuw gesuspendeerd in FACS-kleuringsbuffer [PBS met 0,2% IgG-vrij runderserumalbumine (Jackson ImmunoResearch), en 0,1% NaN3 (Sigma Aldrich)]. Celoppervlak gB of gH (die gH-gL heterodimeer vertegenwoordigen) werden gedetecteerd met primaire antilichamen van ofwel muis anti-VZV gB mAb (SG2-2E6, GeneTex #GTX38718), of muis anti-VZV gH mAb (SG3, GeneTex #GTX40374), elk bij een verdunning van 1:100, gevolgd door anti-muis IgG-Alexa Fluor 555 (ThermoFisher). Totale hoeveelheden virale glycoproteïneproductie werden uitgevoerd met hetzelfde kleuringsprotocol, behalve dat cellen werden gepermeabiliseerd met behulp van Cytofix/Cytoperm-kit (BD Biosciences) voordat de primaire antilichamen werden toegevoegd en tijdens de kleuringsprocedure. Gekleurde cellen werden geanalyseerd met behulp van een DXP meerkleurige FACScan-analysator (Cytek Biosciences) en gegevens werden verwerkt met FlowJo (TreeStar) om de hoeveelheid totale en oppervlakteniveaus van respectievelijk gB en gH te bepalen. De verhouding van het celoppervlak tot de totale hoeveelheid werd ook berekend. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd.

Constructie van FKBP1A en CNB1 shRNA knockdown cellijn

De op miR30 gebaseerde shRNA-expressie met pGIPZ lentiviraal vectorverpakkingssysteem werd gebruikt. Twee paren shRNA-kloneringsprimers gericht op de FKBP1A (gecodeerd door het FKBP1A-gen) of CNB1 (gecodeerd door het PPP3R1-gen) transcripten werden ontworpen met behulp van de sigma bioinformatics-website (//www.sigmabioinfo.com/Informatics_tools/batch-search.php#shRNA ). De eerste PCR-stap met AccuPrime Pfx DNA-polymerase (Invitrogen) genereerde shRNA-oligo's. De tweede PCR-stap toegevoegd aan de resterende sequentie van de miR30-cassette en ook het klonen van restrictie-enzymsites met behulp van Adapter-miR30PCRXhoI_Forward [28] en Linker-miR30linkerNotI_Reverse, of Linker-miR30linkerNotI_Forward en Adapter-miR30PCREcoRI_Reverse [28]. De uiteindelijke PCR-producten werden opgelost op een 4% agarosegel, gezuiverd door middel van QIAquick gelextractiekit (Qiagen) en gedigereerd met XhoI/NotI of NotI/EcoRI (New England Biolabs). De eerder gerapporteerde pGIPZ-DSP1-vector [28] werd ook gedigereerd met XhoI/EcoRI, gedefosforyleerd met Antarctische fosfatase (New England Biolabs), gescheiden op een 0,8% agarosegel en gezuiverd zoals hierboven. De gezuiverde producten werden aan elkaar geligeerd met behulp van T4-DNA-ligase (New England Biolabs) en getransformeerd in TOP10F 'Electrocomp E.coli-cellen (Invitrogen). Cellen werden vervolgens uitgeplaat op LB-platen die waren aangevuld met antibiotica ampicilline (100 g/ml, Sigma Aldrich) en Zeocin (25 g/ml, Gibco). Correcte klonen werden bevestigd door digestie met restrictie-enzymen met behulp van MluI/XhoI (New England Biolabs), gevolgd door sequencing met behulp van pGIPZ-shRNA-sequencing [28]. Alle hierboven gebruikte primers werden vermeld in S4-tabel.

Lentivirussen werden gegenereerd door 1,2 x 106 HEK293T-cellen te transfecteren met 2,5 g pGIPZ-DSP1-vector of pGIPZ-DSP1-vector die de hierboven geconstrueerde FKBP1A- of CNB1-shRNA's, 2,5 μg psPAX2 (Addgene #12260) en 1 μg pMD2.G (Addgene #) bevat. 12259) plasmiden met behulp van Lipofectamine 2000. 24 uur na transfectie werd het virusbevattende supernatant geoogst en gefiltreerd door een spuitfilter van 0,45 m (Fisher Scientific). 1,5 x 106 MeWo-cellen werden vervolgens getransduceerd met 1 ml supernatant van lentivirus samen met polybreen (4 g/ml, Sigma Aldrich) door de cellen gedurende 45 minuten bij 750 relatieve centrifugale kracht (RCF) bij kamertemperatuur te centrifugeren om MeWo-DPS1-controlecellen te genereren , FKBP1A knockdown MeWo-DSP1 of CNB1 knockdown MeWo-DSP1 cellen. Puromycine (5 g/ml Gibco) werd 24 uur na transductie toegevoegd om te selecteren op de succesvol getransduceerde celpopulatie, en cellen werden vermeerderd in aanwezigheid van puromycine hierop.

RNA van de cellen werd geoogst met behulp van RLT-buffer (Qiagen) en geïsoleerd met behulp van de QIAshredder-kolommen (Qiagen) en de RNeasy Plus-minikit (Qiagen). cDNA werd gegenereerd uit het geïsoleerde RNA met behulp van het SuperScripIII eerste-strengs synthesesysteem (Invitrogen). Kwantitatieve PCR (qPCR) werd uitgevoerd met het cDNA met behulp van SsoAdvanced Universal SYBR groene supermix (BioRad) en de qPCR-primers (S4-tabel), op CFX384 real-time PCR-detectiesysteem (BioRad) in drievoud. De resultaten werden genormaliseerd naar het huishoudgen, PGM1, en vergelijkingen werden geanalyseerd op basis van ΔΔCt met behulp van de CFX Manager (BioRad).

Zijn-gelabelde FKBP1A pulldown

CHO-DSP1-cellen werden getransfecteerd met controleplasmide pcDNA 3.1 (+) of plasmide pcDNA3.1_huFKBP1A-His-Myc [83]. 24 uur na transfectie werden de cellen gelyseerd in lysisbuffer [50 mM NaHa2PO4 (Fisher Scientific), 300 mM NaCl (Fisher Scientific), 10 mM imidazool (Sigma Aldrich), 0,05% Tween20 (Sigma Aldrich), pH 8,0] met volledige EDTA-vrije proteaseremmer (Sigma Aldrich) gedurende 30 minuten op ijs. Het monster werd gedurende 10 minuten bij 3.000 RCF bij 4°C gecentrifugeerd om celresten te verwijderen en het supernatant werd bewaard als celextract. Tien volumes celextract werden gedurende de nacht bij 4°C geprecipiteerd met 1 volume vooraf geëquilibreerde Ni-NTA-agaroseparels (Qiagen), gevolgd door wassen met wasbuffer [50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool, 0,05% Tween20, pH 8,0]. Ondertussen werden MeWo-DSP1-cellen geëxtraheerd met behulp van de bovenstaande lysisbuffer en behandeld met DMSO, 10 M tacrolimus, 10 M pimecrolimus of 10 μM sirolimus gedurende 30 minuten bij 4 ° C met end-over-end rotatie, gevolgd door incubatie met de hierboven bereide FKBP1A-vasthoudende Ni-NTA agarose kralen bij 4 ° C 's nachts. De gebonden eiwitten werden van de bolletjes geëlueerd met behulp van elutiebuffer [50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool, 0,05% Tween20, pH 8,0], gevolgd door Western-blotanalyse.

Celpellets verzameld door centrifugatie bij 500 RCF gedurende 5 minuten werden gelyseerd in extractiebuffer [0,1 M NaCl, 5 mM KCl (Fisher Scientific), 1 mM CaCl2 (Fisher Scientific), 0,5 mM MgCl2 (Fisher Scientific), 1% IGEPAL CA-630 (Sigma Aldrich), 1% deoxycholaat (Sigma Aldrich) in 0,1 M Tris-buffer, pH 7,2], met volledige EDTA-vrije proteaseremmer, gedurende 30 minuten op ijs. Het monster werd 10 minuten bij 3.000 RCF bij 4°C gecentrifugeerd om celresten te verwijderen, en het supernatant werd bewaard als celextract. Celextract werd 1: 1 verdund in 2X Laemmli-monsterbuffer (BioRad) aangevuld met 5% reducerend reagens β-mercapto-ethanol (Sigma Aldrich), 5 minuten gekookt bij 95 ° C en gescheiden op een prefab 4

20% gradiënt SDS-PAGE-gel (BioRad). Eiwitten werden vervolgens overgebracht naar Immobilon-P PVDF-membranen (Millipore) met behulp van Trans-blot SD Semi-dry Transfer-cel (BioRad) in transferbuffer [48 mM Tris Base (Fisher Scientific), 39 mM Glycine (Fisher Scientific) en 0,01% SDS (Sigma Aldrich), met 20% methanol (Sigma Aldrich)]. De overgebrachte eiwitten werden onderzocht met primair polyklonaal konijnenanti-humaan FKBP1A (ThermoFisher #PA1-026A, 1:2.500), muis monoklonaal anti-calcineurine B1 (Sigma Aldrich #C0581, 1:3.000), muis monoklonaal anti-humaan α-tubuline (Sigma Aldrich #T5168, 1:5.000), of konijn polyklonaal anti-humaan calcineurine A (Cell Signaling #2614S, 1:1.000) verdund in sondebuffer [20 mM Tris Base, 150 mM NaCl, 0,1% Tween20 met 1% IgG -vrij BSA, pH 7,6], gevolgd door incubatie met anti-konijn of anti-muis IgG-mierikswortelperoxidase-gekoppelde secundaire antilichamen (GE Healthcare Life Sciences, UK Ltd., 1: 10.000) en Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate (ThermoFisher) . Chemiluminescentie werd gedetecteerd met behulp van BioMax MR Film (Carestream). Banddichtheidsanalyse werd uitgevoerd met behulp van ImageJ.

Confocale microscopie met levende cellen

LifeAct-tGFP MeWo-cellen werden 24 uur voorafgaand aan infectie met pOka-TK-RFP in NuncLab-Tek II Chambered Coverglass (ThermoFisher) gezaaid bij 2 x 105 cel/cm2. Behandeling met DMSO of pimecrolimus (10 M) werd gestart bij 2 hpi. Bij 24 hpi werd het medium veranderd om 2 μg/ml Hoechst 33342 (ThermoFisher) te bevatten naast DMSO of pimecrolimus (10 μM). Live-beeldvorming werd onmiddellijk uitgevoerd in de Stanford Cell Sciences and Imaging Facility (CSIF) met behulp van een LSM 880 confocale microscoop (Zeiss). Bij een vergroting van 20X werden gedurende 16 uur elke 8 min foci van infectie vastgelegd.Time-lapse-films zijn gemaakt met FFmpeg (FFmpeg Developers, (2016), ffmpeg tool (Version be1d324) [Software]. Verkrijgbaar via http://ffmpeg.org/ ).

NFATC1 nucleaire translocatie-assay door fluorescentiemicroscopie

MeWo-cellen, MeWO-DSP1-cellen of FKBP1A knockdown MeWo-DSP1-cellen (4 x 10 5 ) uitgezaaid op dekglas (Fisher Scientific 18CIR-1) werden getransfecteerd met 1 μg EGFPC1-huNFATc1EE-WT-plasmide (Addgene #24219, gedeponeerd door Jerry Crabtree) [84]. 24 uur na transfectie werden cellen behandeld met medium, DMSO, ionomycine (1 M), tacrolimus (10 M), pimecrolumus (10 M) of sirolimus (10 M) gedurende 30 minuten, of voorbehandeld met tacrolimus (10 M), pimecrolumus (10 M) of sirolimus (10 M) gedurende 30 minuten voorafgaand aan een aanvullende behandeling van 30 minuten met ionomycine (1 M). Voor het testen van NFATC1-translocatie in met VZV geïnfecteerde cellen, werden MeWo-cellen (2 x 106) gezaaid in platen met 6 putjes getransfecteerd met 5 μg van het EGFPC1-huNFATc1EE-WT-plasmide en 6 uur na transfectie getrypsiniseerd om op het dekglaasje te zaaien, vervolgens geïnoculeerd met pOka-TK-RFP-virus gedurende nog eens 16 uur vóór medicamenteuze behandeling. Cellen werden vervolgens gefixeerd met 4% PFA en gekleurd met 10 μg/ml Hoechst 33342. Beelden werden vastgelegd op BZ-X710 fluorescentiemicroscoop (Keyence) bij 100X olielens. Het samenvoegen van kanalen werd uitgevoerd met ImageJ.

Monolagen van MeWo-cellen (1 x 105 cel/cm2) werden gedurende 2 uur geïnoculeerd met 5 plaquevormende eenheden (PFU) per cm2 cel-geassocieerde pOka-virussen, gevolgd door toevoeging van medium, DMSO of pimecrolimus (10 μM ). Het geneesmiddelbevattende medium werd elke 48 uur vervangen voordat de cellen 4 dagen na infectie werden gefixeerd met 4% PFA. Immunohistochemie (IHC) werd uitgevoerd op de gefixeerde cellen met behulp van monoklonaal anti-VZV-antilichaam van muizen (Mixed, GeneTex #GTX38720, 1:2000 verdund in PBS), gevolgd door incubatie met gebiotinyleerd anti-muis IgG (Vector Laboratories #BA-9200), en alkalische fosfatase streptavidine (Jackson ImmunoResearch #016-050-084). De plaques werden zichtbaar gemaakt door kleuring met een mengsel van FastRed-zout (Sigma Aldrich) en Naftol AS-MX-fosfaat (Sigma Aldrich). Beelden van plaques werden genomen met een Axio-microscoop (Zeiss) met een 2,5X-lens. De plaques werden geschetst en het plaque-oppervlak werd berekend met behulp van Image J. Monolagen van geïnfecteerde MeWo-cellen die waren verwerkt met IHC-kleuring werden ook genomen met een BZ-X710 fluorescentiemicroscoop (Keyence) bij een 2X-lens, en de plaquefrequentie en het totale geïnfecteerde gebied werden geanalyseerd door ImageJ automatische deeltjestelling. Experimenten werden minstens drie keer uitgevoerd.

VZV groeicurve analyse

Monolagen van MeWo-cellen (1 x 105 cel/cm2) werden gedurende 2 uur geïnoculeerd met 100 PFU per cm2 cel-geassocieerde pOka-virussen, gevolgd door toevoeging van medium, DMSO of pimecrolimus (10 uM). Het geneesmiddelbevattende medium werd elke 48 uur verwisseld. Geïnfecteerde cellen werden met tussenpozen van 24 uur geoogst tot 4 dagen na infectie en werden getitreerd op verse monolagen van MeWo-cellen in drievoud, gevolgd door fixatie met 4% PFA 4 dagen na infectie en vervolgens IHC-kleuring.

Fosfopeptide verrijking massaspectrometrie

MeWo-cellen werden gedurende 2 uur behandeld met vehiculumcontrole DMSO of pimecrolimus (10 M) voordat de totale cellulaire eiwitten werden geëxtraheerd met 2% SDS, Tris-buffer, pH 7,6, in aanwezigheid van fosfataseremmers [20 mM NaF (Sigma Aldrich), 1 mM Na3VO4 (Sigma Aldrich) en 1 mM -glycerol (Sigma Aldrich)]. Drie biologische replicamonsters voor elke aandoening werden geanalyseerd door Zr-IMAC-fosfopeptideverrijking, gevolgd door Orbitrap-massaspectrometrie uitgevoerd in de Stanford University-massaspectrometriefaciliteit.

Peptide- en eiwitidentificatie werd uitgevoerd met behulp van Byonic V3.5.0 (Protein Metrics) met een percentage valse ontdekkingen van 1%. Uniek gefosforyleerde eiwitten in met pimecrolimus behandelde monsters maar niet in met DMSO behandelde monsters werden geïdentificeerd met behulp van Uniphosphoprotein-finder-code die voor dit artikel werd gegenereerd met behulp van MatLab (Mathworks). De consensus-calcineurine-docking-motieven van bekende calcineurine-substraten werden gegenereerd door WebLogo 3 [85, 86], terwijl potentiële docking-motieven op nieuw geïdentificeerde fosfoproteïnen werden gelokaliseerd door Clustal Omega (EMBL-EBI) uitlijning met behulp van consensus-docking-motieven.

Ondersteunende informatie S1 Fig. Het effect van pimecrolimus op celfusie hangt af van gB- en gH/gL-complex.

Co-cultuur van doelcellen MeWo-DSP2 met effectorcellen CHO-DSP1 (A) of MeWo-DSP1 (B) getransfecteerd met plasmiden die VZV gB/gH[TL]-gL (gB/gH-gL) tot expressie brengen, lege vectoren (Vector ) of plasmide dat alleen gB tot expressie brengt (gB) waren onbehandeld (medium) of behandeld met DMSO, of tacrolimus (10 M), pimecrolimus (10 M), sirolimus (10 M) gedurende 48 uur. De efficiëntie van de celfusie werd gemeten en genormaliseerd naar die van effectorcellen die waren getransfecteerd met gB/gH[TL]-gL en onbehandeld (% gB/gH-gL-medium). Gemiddelde ± SEM vertegenwoordigen ≥ 3 onafhankelijke experimenten. Statistische verschillen werden beoordeeld door vergelijking van waarden met die van effectorcellen die waren getransfecteerd met gB en behandeld met DMSO met behulp van eenweg-ANOVA (ns, niet significant ****, p < 0,0001).

S2 Fig. Effecten van pimecrolimus op de expressie en de handel in gB en gH/gL.

(A) CHO-DSP1-cellen getransfecteerd met plasmiden die VZV gB of gH [TL] / gL tot expressie brengen, waren onbehandeld (medium) of behandeld met DMSO of pimecrolimus (10 M) gedurende 24 uur. De totale expressie en celoppervlakte-expressie van gB of gH werd geanalyseerd door flowcytometrie van immunologisch gekleurde gepermeabiliseerde of niet-gepermeabiliseerde cellen. De populatie cellen die gB of gH als totaal of op het celoppervlak tot expressie brengen, werden respectievelijk genormaliseerd naar het onbehandelde (% medium). Gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten worden getoond. (B) Het expressieniveau van gB of gH van (A) op het celoppervlak werd genormaliseerd naar het totale expressieniveau en gepresenteerd als een percentage van het totaal. De haakjes vertegenwoordigen de statistische verschillen die zijn geëvalueerd door tweeweg-ANOVA (ns, niet significant ***, p < 0,001 ****, p < 0,0001).

S3 Fig. VZV-replicatiekinetiek in aanwezigheid van pimecrolimus.

MeWo-cellen geïnfecteerd met pOka waren onbehandeld (medium), behandeld met DMSO of pimecrolimus (10 M) gedurende 4 dagen, media werden elke 48 uur vervangen. Monolagen van geïnfecteerde cellen werden geoogst en getitreerd op verse MeWo-cellen om de PFU/ml te bepalen. Representatief resultaat van twee onafhankelijke experimenten wordt getoond, met gemiddelde ± SEM geanalyseerd door tweeweg-ANOVA (**, p < 0,01).

S1 Movie Record van VZV syncytia vorming in aanwezigheid van DMSO door time-lapse live-cel confocale microscopie.

LifeAct-tGFP MeWo-cellen geïnfecteerd met pOka-TK-RFP behandeld met voertuigcontrole DMSO werden onderworpen aan time-lapse live-cel confocale microscopie tussen 24

40 hpi, waarbij elke 8 minuten werd vastgelegd. Geïnfecteerde cellen gedetecteerd door RFP (rood), actinefilamenten door LifeAct-tGFP (groen) en kernen gekleurd met Hoechst 33342 (blauw). Framesnelheid: 5 frames/seconde.

S2 Movie Record van VZV syncytia vorming in aanwezigheid van pimecrolimus door time-lapse live-cel confocale microscopie.

LifeAct-tGFP MeWo-cellen geïnfecteerd met pOka-TK-RFP behandeld met pimecrolimus (10 M) werden onderworpen aan time-lapse live-cel confocale microscopie tussen 24

40 hpi, waarbij elke 8 minuten werd vastgelegd. Geïnfecteerde cellen gedetecteerd door RFP (rood), actinefilamenten door LifeAct-tGFP (groen) en kernen gekleurd met Hoechst 33342 (blauw). Framesnelheid: 5 frames/seconde.

S1-tabel Verbindingen van HT-SRFA met significant effect op VZV gB/gH-gL-gemedieerde fusie.

[C] geeft de concentratie van verbindingen aan die worden gebruikt in de HT-SRFA, fusie (%) is de meting van Renilla-luciferase-activiteit genormaliseerd naar die van de positieve controles op de intraplaat (geen geneesmiddel). Het gemiddelde van het dubbele experiment wordt weergegeven.

S2-tabel Uniek gefosforyleerde eiwitten gedetecteerd in met pimecrolimus behandelde MeWo-cellen door middel van massaspectrometrie met Zr-IMAC-fosfopeptideverrijking.

Fosfoproteïnen die uitsluitend aanwezig zijn in drie onafhankelijke monsters van met pimecrolimus behandelde MeWo-cellen (Pim1, Pim 2 en Pim 3) werden getoond. Splitsingsplaatsen worden aangegeven door de zwarte stip. Serine (S[+80]) of threonine (T[+80]) fosforyleringsmodificaties zijn rood gemarkeerd. M[+16] geeft methionine-oxidatie aan en C[+71] geeft modificatie van cysteïnepropionamide aan.

S3 Tabel Calcineurine-dockingmotieven die zich op bekende substraten van calcineurine bevinden.

S4-tabelprimers voor celconstructie die shRNA tot expressie brengt en RT-qPCR-analyse.


Bekijk de video: Mooi jezelf zijn. hoeveel ml filler gaat er in een kaaklijn? #3 (Januari- 2022).