Informatie

Splitsing van RNA door restrictie-enzymen?


Zes restrictie-enzymen die zijn besproken in Sequentiespecifieke splitsing van RNA door Type II restrictie-enzymen (Murray et al.) hebben het vermogen om RNA-strengen te detecteren en te knippen met de herkenningssequentie van dat enzym.

Zoals u weet, zijn restrictie-enzymen afkomstig van een systeem dat door sommige bacteriën wordt gedragen en dat een restrictie-modificatiesysteem wordt genoemd.

Met dit feit in gedachten tijdens het lezen van het artikel hierboven, vroeg ik me af hoe de bacteriën die een van deze zes systemen dragen hun eigen RNA beschermen tegen restrictie. Methyleren de overeenkomstige methyltranferase in elk systeem zowel DNA als RNA? Zou dit de genexpressiesnelheid niet enorm opofferen, aangezien de methyltranferase zeker niet kan methyleren? alle de RNA-sequenties die worden geproduceerd?

Misschien heb ik de krant op de een of andere manier verkeerd begrepen. Zou het kunnen dat deze restrictie-enzymen alleen in sommige omstandigheden buiten de cel dit unieke vermogen hebben?


Dit artikel vond dat deze enzymen RNA:DNA heteroduplexen herkennen. Het is onwaarschijnlijk dat dergelijke duplexen worden aangetroffen in vivo. Ze zijn aanwezig wanneer DNA wordt geprimed voor replicatie, maar deze duplexen zijn relatief kort en hebben dus minder kans om willekeurig een herkenningssequentie te bevatten. Bovendien, als de herkenningssequentie in de primer wordt gevonden, zal het gDNA specifiek worden gemethyleerd om het te beschermen tegen afbraak. RNA:DNA-duplexen worden ook gevonden tijdens transcriptie, maar ze zijn ook kort en het gDNA zou gemethyleerd zijn. Bovendien wordt de transcriptiebel waar de heteroduplex zich vormt, beschermd door RNA-polymerase, dat vervolgens het transcript van het gDNA verdringt wanneer het het langwerpige complex verlaat.

Het is ook belangrijk op te merken dat dit artikel ontdekte dat deze enzymen RNA:DNA niet zo goed splitsen als DNA:DNA-duplexen en dat deze resultaten optraden onder experimentele omstandigheden met relatief hoge concentraties van enzym en substraat. De lagere katalytische efficiëntie is waarschijnlijk te wijten aan een lagere bindingsaffiniteit, die kan worden veroorzaakt door:

  • aanwezigheid van uracil in RNA (dit werd expliciet vermeld in het artikel)
  • 2'-OH met een sterische barrière
  • helixvorm (RNA heeft de neiging een A-vormige helix aan te nemen)

Wat betreft de reden waarom ze RNA-DNA-heteroduplexen niet herkennen (die bijvoorbeeld aanwezig zijn tijdens transcriptie), vermoed ik dat de methylering die bacterieel genomisch dsDNA beschermt (zie de DNA-modificerende enzymsectie van deze Columbia University-lezing voor meer info) ook beschermt RNA-DNA-hybriden, omdat het genomische DNA nog steeds gemethyleerd zou zijn.

Merk op dat de meeste enzymen die in het artikel voorkomen, door New England Biolabs worden vermeld als gevoelig voor methylering (bijvoorbeeld: AvaII, BanI, HinfI, TaqI).

@canadiner en @user137 geven een groot aantal redenen waarom deze restrictie-enzymen ds/ssRNA niet kunnen splitsen in de commentaren op het antwoord van canadiner (andere helixvorm, verschillende interactiesterkten tussen strengen).


Translocatie-gekoppelde DNA-splitsing door de Type ISP-restrictie-modificatie-enzymen

De productie van endonucleolytische dubbelstrengs DNA-breuken vereist afzonderlijke strengsplitsingsgebeurtenissen. Hoewel katalytische mechanismen voor eenvoudige, dimere endonucleasen bekend zijn, zijn er veel complexe nucleasemachines die slecht worden begrepen. Hier hebben we de enkele polypeptide Type ISP restrictie-modificatie (RM) enzymen bestudeerd, die willekeurig DNA splitsen tussen verre doelwitplaatsen wanneer twee enzymen botsen na convergente ATP-gestuurde translocatie. We rapporteren de 2,7-Å resolutie röntgenkristalstructuur van een Type ISP-enzym-DNA-complex, waaruit blijkt dat zowel het helicase-achtige ATPase als het nuclease stroomopwaarts van de richting van translocatie zijn gelokaliseerd, een waarneming die inconsistent is met eenvoudige dimerisatie van het nuclease-domein. Met behulp van enkelvoudige moleculen en biochemische technieken demonstreren we dat elke ATPase zijn DNA-eiwitcomplex hermodelleert en langs DNA verplaatst zonder het in een lus te plaatsen, wat leidt tot een botsingscomplex waarin de nucleasedomeinen distaal zijn. Sequentiebepaling van de producten van enkele splitsingsgebeurtenissen suggereert een eerder onbeschreven endonucleasemodel, waarbij meerdere, stochastische streng-nicking-gebeurtenissen combineren om DNA-splitsing te produceren.


Inhoud

Ribonuclease H is een familie van endonuclease-enzymen met een gedeelde substraatspecificiteit voor de RNA-streng van RNA-DNA-duplexen. Per definitie splitsen RNasen H RNA-skelet-fosfodiesterbindingen om een ​​3'-hydroxyl- en een 5'-fosfaatgroep achter te laten. [7] RNasen H zijn voorgesteld als leden van een evolutionair verwante superfamilie die andere nucleasen en nucleïnezuurverwerkingsenzymen omvat, zoals retrovirale integrasen, DNA-transposasen, Holliday-junctie-resolvasen, Piwi- en Argonaute-eiwitten, verschillende exonucleasen en het spliceosomale eiwit Prp8. [8] [9]

RNasen H kunnen grofweg worden onderverdeeld in twee subtypen, H1 en H2, die om historische redenen Arabische cijfers krijgen in eukaryoten en Romeinse cijfers in prokaryoten. dus de Escherichia coli RNase HI is een homoloog van de Homo sapiens RNase H1. [2] [7] In E coli en vele andere prokaryoten, de rnhA gen codeert voor HI en de rnhB gen codeert voor HII. Een derde verwante klasse, HIII genaamd, komt voor in een paar bacteriën en archaea is nauw verwant aan prokaryotische HII-enzymen. [4]

De structuur van RNase H bestaat gewoonlijk uit een 5-strengs -sheet omgeven door een verdeling van α-helices. [10] Alle RNasen H hebben een actieve plaats die is gecentreerd op een geconserveerd sequentiemotief dat bestaat uit aspartaat- en glutamaatresiduen, vaak het DEDD-motief genoemd. Deze residuen interageren met katalytisch benodigde magnesiumionen. [7] [5]

RNasen H2 zijn groter dan H1 en hebben meestal extra helices. De domeinorganisatie van de enzymen varieert. Sommige prokaryotische en de meeste eukaryote leden van de H1-groep hebben een extra klein domein aan het N-uiteinde dat bekend staat als het "hybride bindende domein", dat de binding aan RNA: DNA-hybride duplexen vergemakkelijkt en soms een verhoogde processiviteit verleent . [2] [7] [11] Terwijl alle leden van de H1-groep en de prokaryotische leden van de H2-groep functioneren als monomeren, zijn eukaryote H2-enzymen obligate heterotrimeren. [2] [7] Prokaryotische HIII-enzymen zijn leden van de bredere H2-groep en delen de meeste structurele kenmerken met H2, met de toevoeging van een N-terminaal TATA-box-bindend domein. [7] Retrovirale RNase H-domeinen die voorkomen in reverse transcriptase-eiwitten met meerdere domeinen hebben structuren die sterk lijken op de H1-groep. [5]

RNasen H1 zijn uitgebreid bestudeerd om de relaties tussen structuur en enzymatische activiteit te onderzoeken. Ze worden ook gebruikt, vooral de E coli homoloog, als modelsystemen om eiwitvouwing te bestuderen. [12] [13] [14] Binnen de H1-groep is een verband geïdentificeerd tussen hogere substraatbindende affiniteit en de aanwezigheid van structurele elementen bestaande uit een helix en flexibele lus die zorgen voor een groter en meer basissubstraatbindend oppervlak. De C-helix heeft een verspreide taxonomische verdeling en is aanwezig in de E coli en menselijke RNase H1-homologen en afwezig in het HIV-RNase H-domein, maar er bestaan ​​wel voorbeelden van retrovirale domeinen met C-helices. [15] [16]

Ribonuclease H-enzymen splitsen de fosfodiesterbindingen van RNA in een dubbelstrengs RNA:DNA-hybride, waarbij een 3'-hydroxyl- en een 5'-fosfaatgroep aan beide uiteinden van de snijplaats achterblijven met een katalysemechanisme met twee metaalionen, waarbij twee tweewaardige kationen, zoals Mg2+ en Mn2+, nemen direct deel aan de katalytische functie. [17] Afhankelijk van de verschillen in hun aminozuursequenties, worden deze RNases H ingedeeld in type 1 en type 2 RNases H. [18] [19] Type 1 RNases H hebben prokaryote en eukaryote RNases H1 en retrovirale RNase H. Type 2 RNases H hebben prokaryote en eukaryote RNases H2 en bacteriële RNase H3. Deze RNasen H bestaan ​​in een monomere vorm, met uitzondering van de eukaryote RNasen H2, die in een heterotrimere vorm voorkomen. [20] [21] RNase H1 en H2 hebben verschillende substraatvoorkeuren en verschillende maar overlappende functies in de cel. In prokaryoten en lagere eukaryoten is geen van beide enzym essentieel, terwijl wordt aangenomen dat beide essentieel zijn in hogere eukaryoten. [2] De gecombineerde activiteit van zowel H1- als H2-enzymen wordt geassocieerd met het behoud van de genoomstabiliteit als gevolg van de afbraak door enzymen van de RNA-component van R-lussen. [22] [23]

Ribonuclease H1 Bewerken

Ribonuclease H1-enzymen hebben ten minste vier ribonucleotide-bevattende basenparen in een substraat nodig en kunnen geen enkele ribonucleotide verwijderen van een streng die anders is samengesteld uit deoxyribonucleotiden. Om deze reden wordt het onwaarschijnlijk geacht dat RNase H1-enzymen betrokken zijn bij de verwerking van RNA-primers van Okazaki-fragmenten tijdens DNA-replicatie. [2] RNase H1 is niet essentieel in eencellige organismen waar het is onderzocht in E coli, RNase H1 knockouts verlenen een temperatuurgevoelig fenotype, [7] en in S. cerevisiaeproduceren ze defecten in de stressrespons. [24]

In veel eukaryoten, waaronder zoogdieren, bevatten RNase H1-genen een mitochondriale targetingsequentie, wat leidt tot expressie van isovormen met en zonder het aanwezige MTS. Als gevolg hiervan is RNase H1 gelokaliseerd in zowel de mitochondriën als de kern. In knock-out muismodellen zijn RNase H1-null-mutanten dodelijk tijdens de embryogenese als gevolg van defecten in het repliceren van mitochondriaal DNA. [2] [25] [26] De defecten in mitochondriale DNA-replicatie veroorzaakt door verlies van RNase H1 zijn waarschijnlijk te wijten aan defecten in de verwerking van de R-lus. [23]

Ribonuclease H2 Bewerken

In prokaryoten is RNase H2 enzymatisch actief als een monomeer eiwit. In eukaryoten is het een obligaat heterotrimeer bestaande uit een katalytische subeenheid A en structurele subeenheden B en C. Hoewel de A-subeenheid nauw homoloog is aan het prokaryotische RNase H2, hebben de B- en C-subeenheden geen duidelijke homologen in prokaryoten en zijn ze slecht geconserveerd bij het sequentieniveau zelfs onder eukaryoten. [27] [28] De B-subeenheid bemiddelt eiwit-eiwitinteracties tussen het H2-complex en PCNA, dat H2 lokaliseert naar replicatiefoci. [29]

Zowel prokaryotische als eukaryote H2-enzymen kunnen enkele ribonucleotiden in een streng splitsen. [2] ze hebben echter iets andere splitsingspatronen en substraatvoorkeuren: prokaryotische enzymen hebben een lagere processiviteit en hydrolyseren opeenvolgende ribonucleotiden efficiënter dan ribonucleotiden met een 5'-deoxyribonucleotide, terwijl eukaryote enzymen meer processief zijn en beide typen substraat met vergelijkbare efficiëntie hydrolyseren. [2] [30] De substraatspecificiteit van RNase H2 geeft het een rol bij het herstel van ribonucleotide-excisie, het verwijderen van verkeerd opgenomen ribonucleotiden uit DNA, naast de verwerking van de R-lus. [31] [32] [29] Hoewel zowel H1 als H2 aanwezig zijn in de celkern van zoogdieren, is H2 daar de dominante bron van RNase H-activiteit en is het belangrijk voor het handhaven van de stabiliteit van het genoom. [29]

Sommige prokaryoten bezitten een extra gen van het H2-type dat RNase HIII wordt genoemd in de nomenclatuur met Romeinse cijfers die voor de prokaryotische genen wordt gebruikt. HIII-eiwitten zijn nauwer verwant aan de H2-groep door sequentie-identiteit en structurele overeenkomst, maar hebben substraatvoorkeuren die meer op H1 lijken. [7] [33] In tegenstelling tot HI en HII, die beide wijdverspreid zijn onder prokaryoten, wordt HIII gevonden in slechts een paar organismen met een verspreide taxonomische distributie. Het komt iets vaker voor in archaea en wordt zelden of nooit gevonden in hetzelfde prokaryotische genoom als HI. [34]

De actieve plaats van bijna alle RNasen H bevat vier negatief geladen aminozuurresiduen, bekend als het DEDD-motief, vaak is ook een histidine aanwezig, bijvoorbeeld in HIV-1, de mens of E. coli. [2] [7]

De geladen residuen binden twee metaalionen die nodig zijn voor katalyse onder fysiologische omstandigheden. Dit zijn magnesiumionen, maar mangaan ondersteunt meestal ook enzymatische activiteit [2] [7] terwijl calcium of een hoge concentratie Mg2+ de activiteit remt. [11] [35] [36]

Op basis van experimenteel bewijs en computersimulaties activeert het enzym een ​​watermolecuul gebonden aan een van de metaalionen met het geconserveerde histidine. [35] [37] De overgangstoestand is associatief van aard [38] en vormt een tussenproduct met geprotoneerde fosfaat en gedeprotoneerde alkoxide vertrekkende groep. [37] De vertrekkende groep wordt geprotoneerd via het glutamaat dat een verhoogde pKa heeft en waarschijnlijk wordt geprotoneerd. Het mechanisme is vergelijkbaar met RNase T en de RuvC-subeenheid in het Cas9-enzym, die beide ook een histidine- en een twee-metaalionmechanisme gebruiken.

Het mechanisme van het vrijkomen van het gesplitste product is nog steeds niet opgelost. Experimenteel bewijs van in de tijd opgeloste kristallografie en soortgelijke nucleasen wijst op een rol van een derde ion in de reactie die naar de actieve plaats wordt gerekruteerd. [39] [40]

Het menselijk genoom bevat vier genen die coderen voor RNase H:

    , een voorbeeld van het H1-subtype (monomeer), de katalytische subeenheid van het trimere H2-complex , een structurele subeenheid van het trimere H2-complex , een structurele subeenheid van het trimere H2-complex

Bovendien komt genetisch materiaal van retrovirale oorsprong vaak voor in het genoom, wat de integratie van de genomen van menselijke endogene retrovirussen weerspiegelt. Dergelijke integratiegebeurtenissen resulteren in de aanwezigheid van genen die coderen voor retroviraal reverse transcriptase, dat een RNase H-domein omvat. Een voorbeeld is ERVK6. [41] Long terminal repeat (LTR) en non-long terminal repeat (non-LTR) retrotransposons komen ook veel voor in het genoom en bevatten vaak hun eigen RNase H-domeinen, met een complexe evolutionaire geschiedenis. [42] [43] [44]

Rol bij ziekte

In kleine onderzoeken zijn mutaties in humaan RNase H1 in verband gebracht met chronische progressieve externe oftalmoplegie, een veelvoorkomend kenmerk van mitochondriale ziekte. [26]

Mutaties in een van de drie RNase H2-subeenheden zijn algemeen bekend als oorzaken van een zeldzame genetische aandoening die bekend staat als Aicardi-Goutières-syndroom (AGS), [3] die zich op jonge leeftijd manifesteert als neurologische en dermatologische symptomen. [46] De symptomen van AGS lijken sterk op die van congenitale virale infectie en zijn geassocieerd met ongepaste opregulatie van type I interferon. AGS kan ook worden veroorzaakt door mutaties in andere genen: TREX1, SAMHD1, ADAR en MDA5/IFIH1, die allemaal betrokken zijn bij de verwerking van nucleïnezuur. [47] Karakterisering van de mutatieverdeling in een AGS-patiëntenpopulatie vond 5% van alle AGS-mutaties in RNASEH2A, 36% in 2B en 12% in 2C. [48] ​​Mutaties in 2B zijn in verband gebracht met een iets mildere neurologische stoornis [49] en met een afwezigheid van interferon-geïnduceerde gen-upregulatie die kan worden gedetecteerd bij patiënten met andere AGS-geassocieerde genotypen. [47]

Twee groepen virussen gebruiken reverse transcriptie als onderdeel van hun levenscyclus: retrovirussen, die coderen voor hun genomen in enkelstrengs RNA en repliceren via een dubbelstrengs DNA-tussenproduct en dsDNA-RT-virussen, die hun dubbelstrengs DNA-genomen repliceren via een RNA "pregenoom" tussenproduct. Pathogene voorbeelden omvatten respectievelijk humaan immunodeficiëntievirus en hepatitis B-virus. Beide coderen voor grote multifunctionele reverse transcriptase (RT) eiwitten die RNase H-domeinen bevatten. [51] [52]

Retrovirale RT-eiwitten van HIV-1 en muizenleukemievirus zijn de best bestudeerde leden van de familie. [53] [54] Retrovirale RT is verantwoordelijk voor het omzetten van het enkelstrengs RNA-genoom van het virus in dubbelstrengs DNA. Dit proces vereist drie stappen: ten eerste produceert RNA-afhankelijke DNA-polymerase-activiteit minus-strengs-DNA uit de plus-strengs RNA-matrijs, waardoor een RNA:DNA-hybride tussenproduct wordt gegenereerd, ten tweede wordt de RNA-streng vernietigd en ten derde, DNA-afhankelijke DNA-polymerase-activiteit synthetiseert plus-strengs DNA en genereert dubbelstrengs DNA als het eindproduct. De tweede stap van dit proces wordt uitgevoerd door een RNase H-domein dat zich aan de C-terminus van het RT-eiwit bevindt. [5] [6] [55] [56]

RNase H voert drie soorten splitsingsacties uit: niet-specifieke afbraak van het plus-streng RNA-genoom, specifieke verwijdering van de minus-streng tRNA-primer en verwijdering van de plus-streng purine-rijke polypurine tract (PPT)-primer. [57] RNase H speelt een rol bij de priming van de plus-streng, maar niet bij de conventionele methode om een ​​nieuwe primersequentie te synthetiseren. In plaats daarvan creëert RNase H een "primer" van de PPT die resistent is tegen RNase H-splitsing. Door alle basen behalve de PPT te verwijderen, wordt de PPT gebruikt als een markering voor het einde van het U3-gebied van zijn lange terminale herhaling. [56]

Omdat RNase H-activiteit vereist is voor virale proliferatie, wordt dit domein beschouwd als een geneesmiddeldoelwit voor de ontwikkeling van antiretrovirale geneesmiddelen die worden gebruikt bij de behandeling van HIV/AIDS en andere aandoeningen veroorzaakt door retrovirussen. Er zijn remmers van retroviraal RNase H van verschillende chemotypen geïdentificeerd, waarvan vele een werkingsmechanisme hebben dat is gebaseerd op chelatie van de kationen op de actieve plaats. [58] Reverse-transcriptaseremmers die specifiek de polymerasefunctie van RT remmen, worden wijdverbreid klinisch gebruikt, maar geen remmers van de RNase H-functie. Het is de enige enzymatische functie die wordt gecodeerd door HIV en die nog niet het doelwit is van geneesmiddelen in klinisch gebruik. [55] [59]

RNasen H zijn wijd verspreid en komen voor in alle domeinen van het leven. De familie behoort tot een grotere superfamilie van nuclease-enzymen [8] [9] en wordt als evolutionair oud beschouwd. [60] In prokaryotische genomen zijn vaak meerdere RNase H-genen aanwezig, maar er is weinig correlatie tussen het voorkomen van HI-, HII- en HIII-genen en algemene fylogenetische relaties, wat suggereert dat horizontale genoverdracht een rol kan hebben gespeeld bij het vaststellen van de distributie van deze enzymen. RNase HI en HIII komen zelden of nooit voor in hetzelfde prokaryotische genoom. Wanneer het genoom van een organisme meer dan één RNase H-gen bevat, hebben ze soms significante verschillen in activiteitsniveau. Er is gesuggereerd dat deze waarnemingen een evolutionair patroon weerspiegelen dat functionele redundantie tussen RNase H-genen minimaliseert. [7] [34] RNase HIII, dat uniek is voor prokaryoten, heeft een verspreide taxonomische distributie en wordt gevonden in zowel bacteriën als archaea. [34] Er wordt aangenomen dat het vrij vroeg van HII is afgeweken. [61]

Het evolutionaire traject van RNase H2 in eukaryoten, vooral het mechanisme waardoor eukaryote homologen obligate heterotrimeren werden, is onduidelijk dat de B- en C-subeenheden geen duidelijke homologen hebben in prokaryoten. [2] [28]

Omdat RNase H specifiek alleen het RNA in dubbelstrengs RNA:DNA-hybriden afbreekt, wordt het vaak gebruikt als laboratoriumreagens in de moleculaire biologie. Gezuiverde bereidingen van E coli RNase HI en HII zijn in de handel verkrijgbaar. RNase HI wordt vaak gebruikt om de RNA-matrijs te vernietigen na synthese van complementair DNA (cDNA) van de eerste streng door middel van reverse transcriptie. Het kan ook worden gebruikt om specifieke RNA-sequenties te splitsen in de aanwezigheid van korte complementaire DNA-segmenten. [62] Voor detectie kunnen zeer gevoelige technieken zoals oppervlakteplasmonresonantie worden gebruikt. [63] [64] RNase HII kan worden gebruikt om de RNA-primercomponent van een Okazaki-fragment af te breken of om enkelstrengige inkepingen te introduceren op posities die een ribonucleotide bevatten. [62] Een variant van hot-start PCR, bekend als RNase H-afhankelijke PCR of rhPCR, is beschreven met behulp van een thermostabiel RNase HII van de hyperthermofiele archaeon Pyrococcus abyssi. [65] Merk op dat het ribonucleaseremmer-eiwit dat gewoonlijk als reagens wordt gebruikt, niet effectief is in het remmen van de activiteit van HI of HII. [62]

Ribonucleasen H werden voor het eerst ontdekt in het laboratorium van Peter Hausen toen onderzoekers in 1969 RNA:DNA hybride endonuclease-activiteit in de kalfthymus vonden en het de naam "ribonuclease" gaven. H" om zijn aan te duiden hybride specificiteit. [27] [66] [67] RNase H-activiteit werd vervolgens ontdekt in E coli [68] en in een monster van oncovirussen met RNA-genomen tijdens vroege studies van virale reverse transcriptie. [69] [70] Later werd duidelijk dat kalfsthymusextract meer dan één eiwit met RNase H-activiteit bevatte [71] en dat E coli bevatte twee RNase H-genen. [72] [73] Oorspronkelijk werd het enzym dat nu bekend staat als RNase H2 in eukaryoten H1 genoemd en vice versa, maar de namen van de eukaryote enzymen werden veranderd om overeen te komen met die in E coli om vergelijkende analyse te vergemakkelijken, wat de moderne nomenclatuur oplevert waarin de prokaryotische enzymen worden aangeduid met Romeinse cijfers en de eukaryote enzymen met Arabische cijfers. [2] [27] [74] [75] Het prokaryotische RNase HIII, gerapporteerd in 1999, was het laatste RNase H-subtype dat werd geïdentificeerd. [74]

Het karakteriseren van eukaryotisch RNase H2 was historisch gezien een uitdaging, deels vanwege de lage abundantie. [2] Zorgvuldige pogingen om het enzym te zuiveren suggereerden dat, in tegenstelling tot de E coli RNase H2, het eukaryote enzym had meerdere subeenheden. [76] De S. cerevisiae homoloog van de E coli eiwit (dat wil zeggen, de H2A-subeenheid) was gemakkelijk te identificeren door bio-informatica toen het gistgenoom werd gesequenced, [77] maar het overeenkomstige eiwit bleek geen enzymatische activiteit te hebben in isolatie. [2] [24] Uiteindelijk werden de B- en C-subeenheden van gist geïsoleerd door gezamenlijke zuivering en bleken ze nodig te zijn voor enzymatische activiteit. [78] De gist-B- en C-subeenheden hebben echter een zeer lage sequentie-identiteit met hun homologen in andere organismen, en de overeenkomstige menselijke eiwitten werden pas definitief geïdentificeerd nadat mutaties in alle drie het Aicardi-Goutières-syndroom veroorzaakten. [2] [3]


GEBRUIKER klonen

GEBRUIKERSvriendelijke DNA-engineering en klonering is ontwikkeld als een restrictie-enzym- en ligase-onafhankelijke DNA-assemblagemethode (1-3). De methode is gebaseerd op het genereren van overlappende PCR-producten die geschikt zijn voor naadloze en directionele assemblage van aangepaste DNA-moleculen. PCR-inleidingen zijn ontworpen om 5´-overlappende sequenties te hebben die een enkel deoxyuridine (dU) residu bevatten dat is opgenomen in plaats van deoxythymidine (dT) op een afstand van 6-10 nt van het 5´-uiteinde. De gegenereerde PCR-fragmenten worden geflankeerd door sequentieoverlappingen en hebben een enkel dU-residu per DNA-streng. De PCR-fragmenten worden dan behandeld met USER/Thermolabile USER II Enzym, dat specifiek de dU-bevattende strengen inkerft en 3´ enkelstrengige uitbreidingen genereert die geschikt zijn voor directionele assemblage van PCR-fragmenten. NEB verkoopt USER- en Thermolabiele USER II-enzymen voor ligase- en restrictie-enzymonafhankelijke kloneringsreacties.


Discussie

De hier gepresenteerde gegevens geven aan dat de stroomopwaartse ATPase van een type ISP-enzym zijn stroomafwaartse MTase-TRD-doelwitcomplex hermodelleert om doelafgifte mogelijk te maken (Fig. 6). Na binding van ATP, zou type ISP-domeinbeweging en de daaruit voortvloeiende herschikkingen in de ATPase-DNA-interacties, inclusief die waarbij de -haarspeldlus betrokken is, het DNA in een stroomopwaartse richting trekken, wat leidt tot beweging stroomafwaarts van het volledige enzym zonder dat daarvoor DNA-lusvorming. Dit model verschilt nogal van dat van de klassieke Type I RM-enzymen. We stellen voor dat de koppelaar een sleutelrol zal spelen bij het overbrengen van conformationele spanning tijdens initiatie. De omgedraaide base die wordt gezien in de actieve plaats van MTase zou ook fungeren als een 'canchor' om afgifte van het doelwit te voorkomen. doorgegeven door het DNA en/of koppelaar.

Model voor lusonafhankelijke DNA-translocatie en uitgebreide nucleolytische DNA-verwerking. (1) Het pre-initiatiecomplex. Het nuclease bevindt zich in een inactieve conformatie. (2) De ATPase-cyclus maakt de MTase-TRD-greep op het DNA losser. (3) dsDNA-translocatie stroomafwaarts van het doelwit (rood). (4) Convergentie van twee enzymen brengt de nucleasen aanvankelijk ongeveer 75 bp uit elkaar. (5) Voorbeeld van stochastische 𠇍NA shredding” door een botsingscomplex. Getallen zijn de volgorde van de nicking-gebeurtenissen.

Hermodellering van de MTase-TRD moet verlies van doelinteracties met zich meebrengen. Het opnieuw gemodelleerde MTase-TRD kan echter geassocieerd blijven met het DNA om als een glijdende klem te werken, waardoor de procesiviteit wordt verbeterd. Als alternatief kan de klem volledig worden geopend, waardoor de koppelaar-MTase-TRD-eenheden volledig van het DNA kunnen zwaaien. Deze beweging kan helpen bij het verklaren van de

30 bp dichtste benadering van de nucleasedomeinen (Fig. 5c,d).

De type ISP-remodelleringsactiviteit is enigszins vergelijkbaar met de rol van de ATPase-subeenheid van de Type III RM-enzymen. 12 Hoewel die enzymen echter een uitbarsting van ATPase-activiteit gebruiken om de MTase-doelwitinteracties te verbreken, wordt de daaropvolgende bidirectionele beweging langs het DNA thermisch aangedreven zonder dat ATP-hydrolyse nodig is. Daarentegen blijven de Type ISP-enzymen ATP consumeren tijdens unidirectionele translocatie. 18 Het valt nog te bezien of de Type III-enzymen ook naar hun verwante MTase-subeenheden bewegen, waarbij ze van het doelwit worden geduwd zoals in het Type ISP-schema (Fig. 6), of in de tegenovergestelde richting van de “pull& #x0201d de MTase-subeenheden van het doelwit.

De Type ISP-structuur biedt ook een eenvoudig, enkelvoudig polypeptideraamwerk om andere hermodelleringsprocessen te begrijpen die actieve verstoring van eiwit-nucleïnezuurcomplexen door een ATPase-motor kunnen inhouden, zoals de DExH/D RNA-helicase, 38 SF1 DNA-helicase PcrA, 39, 40 de Swi2/Snf2-familie ATPase Mot1, 15,17 of nucleosoomremodellers. 15,16 De bovenstaande structurele vergelijking suggereert dat de ATPase-cyclus die wordt voorgesteld voor bonafide helicasen, waarbij domeinsluiting en opening van N- en C-kernen betrokken zijn bij ATP-binding en hydrolyse 26,27,29,30 is geconserveerd in dsDNA-translocerende ATPasen. Op zijn beurt zou de Type ISP ATPase daarom een ​​equivalent inchworm-mechanisme gebruiken voor zowel hermodellering als translocatie. Interessant is dat de haarspeldlus van het type ISP uniek is voor Type ISP ATPasen (aanvullende figuur 7), wat wijst op variatie in de translocatiemechanismen tussen SF2 ATPasen ondanks behoud van canonieke motieven en algemene structuren.

De brede afstand van de geproduceerde DNA-strengbreuken (Figuur 5) is consistent met de stroomopwaartse locaties van de nucleasedomeinen zoals voorspeld in een frontaal botsingscomplex (aanvullende figuur 10a). Aangezien de nucleasen niet direct kunnen interageren, is activering bij botsing hoogstwaarschijnlijk te wijten aan conformationele spanning van de ATPasen die via de koppelaars worden overgedragen. Desalniettemin moeten aanvullende hermodellering en verplaatsing van het botsingscomplex nodig zijn om het DNA verder te verwerken om een ​​dsDNA-breuk te produceren. We stellen een 𠇍NA Shredder”-model voor waarin cumulatieve nicking-gebeurtenissen uiteindelijk resulteren in een dsDNA-breuk (Fig. 6). Dit staat in contrast met de precieze DNA-splitsing geproduceerd door twee dicht bij elkaar gelegen nucleasen zoals gesuggereerd voor Type I- en III-enzymen (aanvullende figuur 1) en waargenomen in een groot aantal andere, eenvoudigere nucleasen.

Het botsingscomplex zou aanvankelijk resulteren in de vorming van een of twee strengbreuken. De locatie van deze initiële splitsing zal willekeurig zijn, gedicteerd door de voorgaande stochastische translocatiegebeurtenissen. Herschikkingen van het complex als gevolg van interdomein plasticiteit samen met de sequentievoorkeur van de nuclease (aanvullende figuur 13c), kunnen resulteren in gevarieerde splitsingsloci en dus een reeks initiële afstanden. Het waargenomen minimum van 30 bp zou een botsingscomplex kunnen weerspiegelen waarbij beide koppelaar-MTase-TRD-eenheden van het DNA zijn geslingerd, waardoor de dichtste benadering van twee helicase-nuclease-eenheden mogelijk is die nog steeds stress-activering mogelijk maakt. Voortdurende ATPase-activiteit kan vervolgens het botsingscomplex hermodelleren, wat leidt tot verdere stroomopwaartse en stroomafwaartse bewegingen en nicking-gebeurtenissen, waardoor schade aan de verbinding wordt veroorzaakt die culmineert in een dsDNA-breuk (Fig. 6). De verhogingen van de mediaan- en scheefheidswaarden (Fig. 5) zijn dus te wijten aan de langere incubatietijden waarin botsingscomplexe beweging leidt tot verdere splitsingsgebeurtenissen op andere locaties. Met name de mobiliteit na een botsing kan ook verantwoordelijk zijn voor splitsing verder stroomopwaarts dan � en voor zeldzame 5′ overhangen (Fig. 5b), waar vermoedelijk het botsingscomplex één streng insnijdt en onmiddellijk in een 3′ richting beweegt voordat het de tegenoverliggende streng.

Het laden van meerdere translocatie-enzymen op het DNA dat een mogelijk gevolg is van het vrijkomen van het doelwit, zou kunnen resulteren in een opeenhoping van enzymen aan beide zijden van het primaire botsingscomplex. Als deze enzymen zouden worden geactiveerd, zouden ze een tijdsafhankelijke toename van de 3′-3′ splitsingsafstand kunnen veroorzaken. Mobiliteit na een botsing kan echter gemakkelijker breukgebeurtenissen stroomopwaarts van � en de 5′ overhangen verklaren. Toch kunnen kop-staartbotsingen een aanvullende rol spelen bij de DNA-verwerking. We hebben een alternatief model buiten beschouwing gelaten waarbij strengbreuken door meerdere, afzonderlijke botsingsgebeurtenissen op willekeurige locaties de wijd uit elkaar geplaatste overhangen genereren, aangezien dit 5′ overhangen met gelijke frequentie zou genereren en geen tijdsafhankelijke toename in afstand zou laten zien.

We speculeren dat, afhankelijk van de cellulaire gastheer, gebroken DNA met variabele 3′-overhangen geproduceerd door Type ISP-enzymen geen substraat zou zijn voor de overeenkomstige dsDNA-breukherstel-enzymen (RecBCD of AddAB), die een voorkeur hebben voor stompe uiteinden. 41,42,43 Bijgevolg, zelfs als het vreemde DNA de regulerende sequenties zou hebben die nodig zijn voor homologe recombinatie, zouden ze die herstelroute niet binnengaan. dsDNA-breukvorming door meerdere nicking-gebeurtenissen zou bovendien eenvoudige religatie van de DNA-uiteinden voorkomen. Waar de cel ook codeert voor een CRISPR-Cas-systeem, kunnen de kleine DNA-fragmenten die worden gegenereerd tijdens splitsing door Type ISP-enzymen (of tijdens verwerking na splitsing door klassieke Type I-enzymen 44 ) zich voeden met de spacer-acquisitieroute (adaptatie), zoals gesuggereerd voor de DNA-fragmenten gegenereerd door RecBCD. 45

Samenvattend, de duidelijke nucleolytische activiteit van de Type ISP-enzymen contrasteert met de mechanismen die worden gebruikt door dimere nucleasen en illustreert verder nog een andere strategie die is geëvolueerd naar resistentie in de eeuwige wapenwedloop tussen bacteriofaag en gastheer. 2


Transcriptie van bacteriofaag φX174 in vitro: Analyse met restrictie-enzymen

de drie fagen φX174 promotoren (PEEN', PEEN en PG) gedefinieerd en ten opzichte van elkaar in kaart gebracht door Axelrod (1976) zijn in kaart gebracht op het bacteriofaaggenoom. RNA-ketens werden specifiek geïnitieerd in vitro bij elke promotor met oligonucleotide-primers, puls-gelabeld met (α-32P)-gelabelde ribonucleosidetrifosfaten, opgejaagd in moleculen van volledige lengte met een overmaat aan niet-gelabelde ribonucleosidetrifosfaten, en gezuiverd op polyacrylamidegels. De geïsoleerde RNA-soorten werden gehybridiseerd met een reeks gezuiverde, niet-gelabelde DNA-fragmenten die waren gegenereerd door splitsing van φX174 RFI † DNA met restrictie-endonucleasen van Hemophilus influenzae (endonuclease R) of H. aegyptius (endonuclease Z). De 32 P-gelabelde RNA-sequenties (ongeveer 100 tot 400 basen) afkomstig van promotoren A′, A of G hybridiseerden bij voorkeur met DNA-fragmenten R-4, R-8 en R-6B/Z-3, respectievelijk. De DNA-fragmenten zijn eerder uitgelijnd met de genetische kaart van bacteriofaag door onafhankelijke methoden in andere laboratoria (Chen et al., 1973 Hutchison et al., 1973 Lee en Sinsheimer, 1974a, Lee en Sinsheimer, 1974b Borrias et al., 1976). Vergelijking van de bovenstaande hybridisatieresultaten met die fragmentkaart laat zien dat promotoren A′, A en G nabij de start van cistrons liggen A, B en NS.

Gebruikte afkorting: RFI, het dubbelstrengs gesloten circulaire supercoiled replicatieve vorm DNA van φX174.


Restrictie Enzymsplitsing: &lsquosingle-site&rsquo enzymen en &lsquomulti-site&rsquo enzymen

Restriction enzymes are proteins used to fragment and clone DNA, but their biological function is to protect bacteria and archaea against viral infections. All bind to double-stranded (ds) DNA at specific sequences of base pairs (the &lsquorecognition sequence&rsquo) and cleave the DNA strands. Given their catalytic similarities, we might expect all restriction enzymes to be similar to each other, but they are in fact extremely diverse, and vary widely in amino acid sequence, three-dimensional structure, subunit composition, and modes of action. Restriction enzymes of identical specificity (&lsquoisoschizomers&rsquo) are sometimes similar, and represent diverged versions of the same ancestral protein, but those of different specificity are often unique, and display no more similarity to one another than to unrelated proteins chosen at random. It seems likely that restriction enzymes arose independently many times during microbial evolution and under varied circumstances.

Accompanying this diversity are subtle differences in the ways that restriction enzymes behave. In one comparison, seven enzymes that cleave the sequence GGCGCC at four different positions were examined, and five distinct reaction pathways were discerned (1). Perhaps the most important mechanistic difference when using restriction enzymes as molecular biology reagents concerns the number of recognition sites a restriction enzyme must bind to in order to cleave. Most restriction enzymes act as simple monomers (one protein chain, e.g. MspI (NEB #R0106) (2)) or homodimers (two identical protein chains, e.g. BamHI (NEB #R3136)), which bind and cleave one recognition site at a time. These enzymes cut substrates with one site as efficiently as they cut substrates with several sites. Others are more complex, and undergo allosteric activation, or form &lsquotransient&rsquo dimers (e.g. FokI (NEB #R0109) (3-5)), tetramers (e.g. NgoMIV (NEB #R0564) (6)), or even larger assemblages (e.g. BcgI (NEB #R0545) (7,8)), and these cut only when bound to two, and sometimes more (9), sites at once. In some cases, this &lsquomulti-site&rsquo, behavior might be an adaptation against accidental cleavage of the bacterium&rsquos own DNA. Structurally, it likely stems from the subunit organizations of the enzymes and how their recognition and catalytic domains fit together (8). Irrespective of the why and how, the need to bind to more than one site in order to cleave can make substrates with only one site difficult to cut in vitro.

Restriction enzymes that bind several sites in order to cleave exhibit several characteristics:

    Cleavage kinetics. Substrates with single sites are cleaved slowly and in some cases incompletely because enzymes must interact with (&lsquobridge&rsquo) two or more DNA molecules at once. The probability of doing so declines precipitously at low DNA concentrations. Adding more enzyme to try to improve cleavage in this situation can do the opposite and make matters even worse, because increasing enzyme concentration in effect reduces the relative substrate concentration (refer to #2 below). If the contacts between the subunits are fragile, as they are thought to be for transient dimers such as FokI (NEB #R0109) (10), then enzymes bridging sites in trans, in different molecules, can be unstable and ineffective. In contrast, when multiple sites are present in the same DNA molecule, the local concentration of sites is higher, and enzymes bridging sites in cis are more stable, both of which lead to faster, more complete, cleavage. Multi-site enzymes vary in the degree to which they are affected by these and related factors. Some, such as BspMI/BfuAI (NEB #R0502) (11) and NmeAIII (NEB #R0711) barely cleave 1-site substrates at all. Others (e.g. SacII (NEB #R0157) cut partially, and yet others (e.g. PluTI (NEB #R0713)) can cleave to near-completion.

Given the diversity of restriction enzymes, many exceptions occur, but single-site and multi-site enzymes partition fairly well into two distinguishable groups based on positions of cleavage.

    Single-site enzymes. The majority of restriction enzymes that cleave within or very close to their recognition sequence are active at single-sites. These enzymes are classified as &lsquoType IIP&rsquo if their sequences are palindromic (symmetric), and &lsquoType IIT&rsquo if their sequences are asymmetric and two different catalytic sites are used to cleave the DNA strands. They cleave to completion DNA substrates with only one site as efficiently as they cleave substrates with several sites. Their cleavage ability is not inhibited at high enzyme concentration due to site-saturation, and is not enhanced by the addition of specific oligos.

Type IIT enzymes AciI (NEB #R0551) and EarI (NEB #R0528) are possible exceptions to this generalization, as too are several Type IIP enzymes. These enzymes cleave 1-site substrates slowly, and in some cases, incompletely cleavage is inhibited at high enzyme concentrations due to site-saturation and cleavage can be enhanced by the addition of specific oligos. These Type IIP enzyme exceptions include: AluI (NEB #R0137) BsaWI (NEB #R0567) (25) BsrFI/Cfr10I (NEB #R0562) (14,19,20) Ecl18kI (12,18) EcoRII (9,17,19,20) HpaII (NEB #R0171) (19,20) NaeI (NEB #R0190) (13,24,26,27) NarI/Mly113I (NEB #R0191) (1,19,20,24,28) NgoMIV ((NEB #R0564) 6) PluTI/BbeI (NEB #R0713) (1) RsrII (NEB #R0501) SacII/Cfr42I (NEB #R0157) (19,29) Sau3AI (NEB #R0169) (19,20) SfiI (NEB #R0123) (16,30-35) SgrAI (NEB #R0603) (19,20,36-38) SmlI and XmaI/Cfr9I (NEB #R0180) (19,24), all of which act to one degree or another as multi-site enzymes.

RECOMMENDATIONS

If you are using an enzyme that may require more than one recognition site on the substrate to cleave optimally, we suggest two possible optimization methods: 1) Titrate the units of enzyme used in the reaction to determine the optimal enzyme to substrate ratio. As a starting point, we recommend using 1-2 &mul of restriction enzyme (at the supplied units/&mul) per microgram of substrate and performing 2-fold serial dilutions of the enzyme, keeping the DNA concentration constant. 2) If that is not possible, add duplex oligonucleotides that contain the recognition site. The oligos provide the additional recognition site needed to activate substrate-bound, but dormant enzyme monomers. Addition of duplex DNA containing a recognition site can compete for binding and reduce the effective enzyme concentration. To use oligos effectively, the stoichiometry of the reaction needs to be established beforehand by performing a series of titrations and identifying the optimum range for the concentration of oligos. We recommend keeping the enzyme concentration constant at 2-4 fold above the optimum established in step 1, above, while performing 2-fold serial dilutions of the oligo. As a starting point, we recommend a ratio of 4:1 (oligo sites:substrate sites) and performing a 2-fold serial dilution of the oligo, keeping the enzyme and substrate concentrations constant.


These authors contributed equally: Heng Zhang, Zhuang Li, Renjian Xiao.

Voorkeuren

Department of Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette, IN, USA

Heng Zhang, Zhuang Li, Renjian Xiao & Leifu Chang

Purdue University Center for Cancer Research, Purdue University, West Lafayette, IN, USA

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

Bijdragen

H.Z., R.X. and Z.L. prepared samples. Z.L., H.Z. and L.C. collected and processed cryo-EM data. H.Z. and R.X. performed biochemical analysis. Z.L., H.Z. and L.C. prepared figures. All authors analyzed the data. H.Z., Z.L. and L.C. prepared the manuscript with input from R.X.

Corresponderende auteurs


Restriction Enzyme Digestion

Read about Type II restriction enzymes and the distinguishing properties of the four principle subtypes.

High throughput sequencing methods have revolutionized genomic analysis by producing millions of sequence reads from an organism’s DNA at an ever decreasing cost.

Brochures

Selectiehulpmiddelen

Troubleshooting Guides

Usage Guidelines

Dit product valt onder een of meer patenten, handelsmerken en/of copyrights die eigendom zijn van of beheerd worden door New England Biolabs, Inc (NEB).

Hoewel NEB haar producten voor verschillende toepassingen ontwikkelt en valideert, kan het voor het gebruik van dit product van de koper zijn dat hij voor bepaalde toepassingen aanvullende intellectuele eigendomsrechten van derden moet verkrijgen.

Neem voor meer informatie over commerciële rechten contact op met het Global Business Development-team van NEB via [email protected]

Dit product is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden. Dit product is niet bedoeld voor therapeutische of diagnostische doeleinden bij mensen of dieren.

Videos

What is a Type II Restriction Enzyme?

Type II restriction enzymes are most commonly used for molecular biology applications, as they recognize stereotypical sequences and produce a predictable cleavage pattern. Learn more about how Type II REs work.

What is a Type I Restriction Enzyme?

Type I restriction enzymes are a group of endonucleases that recognize a bipartite sequence, but do not produce a predictable cleavage pattern. Learn more about how Type I REs work.

What is a Type III Restriction Enzyme?

Type III restriction enzymes are a group of endonucleases that recognize a non-pallindromic sequence, comprising two inversely oriented sites. Learn more about these poorly understood enzymes.

Cloning With Restriction Enzymes

Restriction enzymes are an integral part of the cloning workflow, for generating compatible ends on fragments and vectors. This animation discusses three guidelines for determining which restriction enzymes to use in your cloning experiment.

Standaardprotocol voor restrictie-enzymdigesten

Laat een van de restrictie-enzymexperts van NEB u helpen uw techniek te verbeteren en veelvoorkomende fouten bij het instellen van de spijsvertering te voorkomen.

Waarom snijdt mijn restrictie-enzym het DNA niet af?

Krijgt u niet het decolleté dat u verwachtte? Laat een NEB-wetenschapper u helpen bij het oplossen van uw reactie.

Beperking Enzym Digest Probleem: Te veel DNA-banden

Vind je onverwachte banden in je spijsverteringsreactie? Hier zijn enkele tips om u te helpen de oorzaak te achterhalen.

What is Restriction Enzyme Star Activity?

Learn what Star Activity is, why it is detrimental to accurate restriction enzyme digestion, and how NEB's HF enzymes are engineered to avoid it.

Verminder steractiviteit met hifi-restrictie-enzymen

NEB heeft HF®-enzymen ontwikkeld om steractiviteit te elimineren. Lees hoe en wat dit betekent voor uw samenvattingen.

NEB ® Restriction Enzyme Double Digest Protocol

Double digestions can save you time, and this video can offer tips for how to achieve the best results, no matter which of NEB's restriction enzymes you're using.

Restrictie Enzyme Digest-protocol: dicht bij het DNA-einde snijden

Wanneer u dicht bij het uiteinde van een DNA-molecuul knipt, moet u ervoor zorgen dat u weet hoeveel basen u aan de uiteinden van uw PCR-primers moet toevoegen.

Beperking Enzymverteringsprobleem: DNA-uitstrijkje op agarosegel

Lees meer over de oorzaak van dit veelvoorkomende probleem en hoe de enzymen van NEB QC worden uitgevoerd om DNA-smering te voorkomen.

Restriction Enzymes in Isothermal Amplification

Isothermal amplification generates many copies of a target sequence in a short period of time, at a constant temperature. Learn more about isothermal amplification.

Restriction Enzymes in Optical Mapping

Optical mapping is a method that allows production of restriction maps of whole chromosomes or genomes. Learn more about optical mapping.


Dicer-like enzymes with sequence cleavage preferences

Researchers keep discovering new functions of small RNAs. For instance, they can be used as a defense mechanism against viruses or self-replicating genome invaders. These tiny pieces of RNA are often produced by a cleavage of long precursors by so called Dicer proteins. To their surprise, researchers from the University of Bern have found that some Dicers acquired a unique and as yet unknown feature that allow them to cleave the RNA precursors in a very specific way, resulting in small RNAs that work much more efficiently.

In the human cell as in society: It is all about information. Genes are read, information molecules (called messenger RNAs or short mRNA) are produced and proteins are synthesized according to the instructions. And there are a whole lot more of these messenger substances, the cellular apparatus is a huge information hub, a meticulously regulated business. And as if all these information exchanges were not complicated enough: in the past years RNA-related research has uncovered more and more evidence that regulation works on a higher level too. The information management itself is highly dynamic – information substances are being held back, they are changed, at times even shredded right away.

In eukaryotes especially, the shredded information molecules, called small RNAs (sRNAs), have critical roles in development, gene expression, and genome stability. They are produced by a range of different proteins. One of the best known is called Dicer and cuts them from long double-stranded RNA templates. Up to now, Dicer was thought to be a bit of a lumberjack when it comes to tearing down RNA – just hacking it into short fragments of roughly equal size, paying no special attention to the form and content of the fragments. The proteins have never been shown to have sequence cleavage preferences, but recently a research group from the Institute of Cell Biology of the University of Bern headed by Mariusz Nowacki has found Dicer-like enzymes with truly surprising qualities. The research could lead to new insights into the regulation of cellular communication and might open up as yet uncharted opportunities for future protein engineering.

The research group, which is part of the NCCR "RNA and disease," has found that in the microorganism Paramecium, which uses small RNAs to guide the elimination of invading transposable DNA elements, some Dicer-like proteins are cutting up RNA with much greater diligence than expected. As published in Cel, Cristina Hoehener, Iris Hug, and Mariusz Nowacki report that their Dicer-like enzymes have strict size and pronounced sequence preferences. These preferences result in the production of sRNAs precisely matching the ends of their target DNA elements, which leads the researchers to propose an as yet unknown biological role for these newly characterized enzymes and their cleavage products.

Small RNAs repair the DNA

They think that these Dicer-like proteins facilitate the elimination of unwanted DNA elements by accumulating precisely at their ends. These accumulations then trigger the elimination of the "highlighted" parts of the DNA from the genetic material. Transposons are alien parts of the genome, infiltrated into the DNA, with the ability to jump from one part of the DNA to another. This makes them especially dangerous as they can trigger all kinds of unwanted genetic effects. So an organism has every reason to get rid of these DNA segments quickly and efficiently.

Especially intriguing for the researchers is the level of precision with which these Dicer enzymes do their job. In contrast to restriction enzymes that cut only when they recognize very specific sequences, the Paramecium Dicer proteins function somewhat sloppily—Nowacki calls it a "relaxed preference." The researchers believe that a too strict preference would not be appropriate here: for the DNA repair to be effective it is important that a lot of sRNA fragments can assemble at the right segment. If Dicer would be too picky, it would not be able to produce suitable snippets for all the dangerous foreign DNA. "Fuzziness is not necessarily a bad thing," says Nowacki. Over the course of the evolution many biological processes have evened out between precision and chance—one of the reasons why cells can react with surprisingly tailor-made solutions to all kinds of different threats.


Bekijk de video: From DNA to protein - 3D (December 2021).