Informatie

Ontbrekende cellen van immunopanning


Waarom heb ik geen cellen meer in mijn positieve panning-plaat na het overbrengen van de negatieve panning-plaat tijdens immunopanning? Ik probeer retinale ganglioncellen van postnatale ratten te zuiveren en gebruik een Thy1.1-antilichaam dat is geoogst uit een supernatant van een hybridomacellijn in de positieve panning-plaat.

Na overdracht van de celsuspensie van de negatieve naar de positieve panning-plaat zijn er geen cellen in het pre-trypsinisatie-supernatant, niets plakt aan de panning-plaat en geen cellen in het post-trypsinization-supernatant, dus ik heb geen idee waar ze zouden kunnen hebben weg. Het controleren van de negatieve panningplaten laat echter zien dat er veel cellen aan die platen vastzitten, dus kunnen mijn RGC's op een bepaald moment tijdens de overdracht verloren zijn gegaan en wanneer?

Bij voorbaat hartelijk dank voor uw hulp.


Immunopanning vergt in mijn ervaring ontzettend veel optimalisatie, maar het is het waard als het werkt. Ik zou, als je de middelen hebt, van plan zijn om ratten te verlossen alleen voor analyse-optimalisatie voordat je zelfs maar begint te proberen echte gegevens eruit te krijgen (ervan uitgaande dat je een gestage stroom primaire cellen plant).

Dat gezegd hebbende, er zijn enkele heel eenvoudige controles die u eerst kunt proberen. Probeer een ruwe celtelling te krijgen van wat je op je negatieve plaat hebt gedaan (afhankelijk van je voorbereidende stappen kan dat een beetje lastig zijn), en tel dan de cellen opnieuw terwijl je de celsuspensie overbrengt naar de positieve platen. Als je geen cellen meer over hebt, of je hebt heel weinig cellen over, dan verlies je misschien al je populatie op je negatieve plaat.

Als je cellen in suspensie hebt, zou ik je positieve plaat in twijfel trekken. Maak je ze zelf of koop je ze gecoat? Welke rattensoort gebruik je? Misschien moet u uw antilichaamconcentratie op de plaat titreren. Er zijn echt heel veel stappen in immunopanning die kunnen worden geoptimaliseerd.


Ontbrekende cellen van immunopanning - Biologie

Het onvermogen om astrocyten te zuiveren en te kweken, heeft lang onderzoek naar hun functie belemmerd. Terwijl voorlopercellen van astrocyten kunnen worden gekweekt uit neonatale hersenen, was het niet mogelijk om rijpe astrocyten uit postnatale hersenen te kweken. Hier rapporteren we een nieuwe methode om astrocyten prospectief te zuiveren door immunopanning. Deze astrocyten ondergaan apoptose in kweek, maar vasculaire cellen en HBEGF bevorderen hun overleving in serumvrije kweek. We ontdekten dat sommige zich ontwikkelende astrocyten normaal gesproken in vivo apoptose ondergaan en dat de overgrote meerderheid van de astrocyten in contact komt met bloedvaten, wat suggereert dat astrocyten worden gematcht met bloedvaten door te strijden om vasculaire trofische factoren zoals HBEGF. Vergeleken met traditionele astrocytenculturen, lijken de genprofielen van de gekweekte gezuiverde postnatale astrocyten veel meer op die van in vivo astrocyten. Hoewel deze astrocyten de vorming en functie van synapsen sterk bevorderen, scheiden ze geen glutamaat af als reactie op stimulatie.

Hoogtepunten

► Een nieuwe methode ontwikkeld om astrocyten van ratten- en muizenhersenen te zuiveren en te kweken ► Geïdentificeerde groeifactoren, vasculaire cellen zoals nodig voor overleving van astrocyten in vitro ► Hypothese dat astrocyten overeenkomen met bloedvaten ► Aangetoond dat ons kweeksysteem een ​​betere representatie is van de in vivo astrocyten


Inhoud

Het concept van het morfogenetisch veld, fundamenteel in het begin van de twintigste eeuw voor de studie van embryologische ontwikkeling, werd voor het eerst geïntroduceerd in 1910 door Alexander G. Gurwitsch. [6] Experimentele ondersteuning werd geboden door de experimenten van Ross Granville Harrison waarbij fragmenten van een newt-embryo op verschillende locaties werden getransplanteerd. [7]

Harrison was in staat om "velden" van cellen te identificeren die organen produceren zoals ledematen, staart en kieuwen en om aan te tonen dat deze velden zouden kunnen worden gefragmenteerd of dat er ongedifferentieerde cellen zouden kunnen worden toegevoegd en dat er nog steeds een volledig normale uiteindelijke structuur zou ontstaan. Men ging er dus van uit dat het het "veld" van cellen was, in plaats van individuele cellen, die een patroon kregen voor de daaropvolgende ontwikkeling van bepaalde organen. Het veldconcept werd verder ontwikkeld door Harrisons vriend Hans Spemann, en vervolgens door Paul Weiss en anderen. [3] Het concept was vergelijkbaar met de betekenis van de term entelechie van vitalisten als Hans Adolf Eduard Driesch (1867-1941).

In de jaren dertig onthulde het werk van genetici, met name Thomas Hunt Morgan, echter het belang van chromosomen en genen voor het beheersen van de ontwikkeling, en de opkomst van de nieuwe synthese in de evolutionaire biologie verminderde het waargenomen belang van de veldhypothese. Morgan was een bijzonder harde criticus van velden omdat het gen en het veld werden gezien als concurrenten voor erkenning als de basiseenheid van ontogenie. [3] Met de ontdekking en het in kaart brengen van master-controlegenen, zoals de homeobox-genen, leek de superioriteit van genen verzekerd. Maar aan het eind van de twintigste eeuw werd het veldconcept 'herontdekt' als een nuttig onderdeel van de ontwikkelingsbiologie. Er werd bijvoorbeeld gevonden dat verschillende mutaties dezelfde misvormingen konden veroorzaken, wat suggereert dat de mutaties een complex van structuren als een eenheid aantasten, een eenheid die zou kunnen overeenkomen met het veld van de vroege 20e-eeuwse embryologie.

Scott Gilbert stelde voor dat het morfogenetische veld een middenweg is tussen genen en evolutie. [3] Dat wil zeggen, genen werken in op velden, die vervolgens inwerken op het zich ontwikkelende organisme. [3] Jessica Bolker beschreef morfogenetische velden niet alleen als beginnende structuren of organen, maar als dynamische entiteiten met hun eigen gelokaliseerde ontwikkelingsprocessen, die centraal staan ​​in het opkomende gebied van de evolutionaire ontwikkelingsbiologie ("evo-devo"). [8] In 2005 noemden Sean B. Carroll en collega's morfogenetische velden alleen als een concept dat door vroege embryologen werd voorgesteld om de bevinding te verklaren dat een voorpootknop kan worden getransplanteerd en nog steeds aanleiding geeft tot een voorpoot. Ze definiëren "veld" eenvoudig als "een discrete regio" in een embryo. [9]


Sharon, D., Tilgner, H., Grubert, F. & Snyder, M. Een lang gelezen overzicht van één molecuul van het menselijke transcriptoom. nat. Biotechnologie. 31, 1009–1014 (2013).

Au, K.F. et al. Karakterisering van het menselijke ESC-transcriptoom door hybride sequencing. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 110, E4821-E4830 (2013).

Oikonomopoulos, S., Wang, YC, Djambazian, H., Badescu, D. & Ragoussis, J. Benchmarking van de Oxford Nanopore MinION-sequencing voor kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van cDNA-populaties. Wetenschap. vertegenwoordiger 6, 31602 (2016).

Tilgner, H., Grubert, F., Sharon, D. & Snyder, MP Het definiëren van een persoonlijk, allel-specifiek en single-molecuul long-read transcriptoom. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 111, 9869–9874 (2014).

Koren, S. et al. Hybride foutcorrectie en de novo assemblage van single-molecule sequencing leest. nat. Biotechnologie. 30, 693–700 (2012).

Tilgner, H. et al. Uitgebreide transcriptoomanalyse met behulp van synthetische long-read sequencing onthult moleculaire co-associatie van splitsingsgebeurtenissen op afstand. nat. Biotechnologie. 33, 736–742 (2015).

Tilgner, H. et al. Microfluïdische isovorm-sequencing toont wijdverbreide splicing-coördinatie in het menselijke transcriptoom. Genoom onderzoek. 28, 231–242 (2018).

Bolisetty, MT, Rajadinakaran, G. & Graveley, BR Bepaling van exon-connectiviteit in complexe mRNA's door nanopore-sequencing. Genoom Biol. 16, 204 (2015).

Roy, C.K., Olson, S., Graveley, BR, Zamore, P.D. & Moore, MJ Beoordeling van RNA-sequentieconnectiviteit over lange afstand via DNA-DNA-ligatie met RNA-matrijs. eLife 4, e03700 (2015).

Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S.R. & Südhof, T.C. Cartografie van alternatieve splicing van neurexine in kaart gebracht door single-molecule long-read mRNA-sequencing. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 111, E1291-E1299 (2014).

Schreiner, D. et al. Gerichte combinatorische alternatieve splicing genereert hersenregiospecifieke repertoires van neurexines. neuron 84, 386–398 (2014).

Karlsson, K. & Linnarsson, S. Eencellige mRNA-isovormdiversiteit in de muizenhersenen. BMC Genomics 18, 126 (2017).

Byrne, A. et al. Nanopore langgelezen RNAseq onthult wijdverbreide transcriptionele variatie tussen de oppervlaktereceptoren van individuele B-cellen. nat. gemeenschappelijk 8, 16027 (2017).

Song, Y. et al. Eencellige alternatieve splitsingsanalyse met expeditie onthult splitsingsdynamiek tijdens neurondifferentiatie. Mol. Cel 67, 148–161 (2017).

Shalek, AK et al. Eencellige transcriptomics onthult bimodaliteit in expressie en splitsing in immuuncellen. Natuur 498, 236–240 (2013).

Zeisel, A. et al. Celtypen in de muiscortex en hippocampus onthuld door eencellige RNA-seq. Wetenschap 347, 1138–1142 (2015).

Lake, BB et al. Neuronale subtypes en diversiteit onthuld door single-nucleus RNA-sequencing van het menselijk brein. Wetenschap 352, 1586–1590 (2016).

Zheng, G.X.Y. et al. Massaal parallelle digitale transcriptionele profilering van afzonderlijke cellen. nat. gemeenschappelijk 8, 14049 (2017).

Darmanis, S. et al. Een overzicht van de transcriptoomdiversiteit van de menselijke hersenen op het niveau van een enkele cel. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 112, 7285–7290 (2015).

Jaitin, DA et al. Massaal parallelle eencellige RNA-seq voor markervrije ontbinding van weefsels in celtypen. Wetenschap 343, 776–779 (2014).

Pollen, AA et al. Eencellige mRNA-sequencing met lage dekking onthult cellulaire heterogeniteit en geactiveerde signaalroutes in de zich ontwikkelende hersenschors. nat. Biotechnologie. 32, 1053–1058 (2014).

Fededa, JP et al. Een polair mechanisme coördineert verschillende regio's van alternatieve splicing binnen een enkel gen. Mol. Cel 19, 393–404 (2005).

Fagnani, M. et al. Functionele coördinatie van alternatieve splicing in het centrale zenuwstelsel van zoogdieren. Genoom Biol. 8, R108 (2007).

Mecklenburg, N. et al. Groei- en differentiatiefactor 10 (Gdf10) is betrokken bij de ontwikkeling van gliacellen van Bergmann onder Shh-regulatie. Glia 62, 1713–1723 (2014).

Koirala, S. & Corfas, G. Identificatie van nieuwe gliale genen door eencellige transcriptionele profilering van Bergmann-gliacellen uit het cerebellum van de muis. PLoS One 5, e9198 (2010).

Lein, ES et al. Genoombrede atlas van genexpressie in de hersenen van volwassen muizen. Natuur 445, 168–176 (2007).

Butts, T., Green, MJ & Wingate, RJT Ontwikkeling van het cerebellum: eenvoudige stappen om een ​​'breintje' te maken. Ontwikkeling 141, 4031–4041 (2014).

Jain, M. et al. Nanopore-sequencing en assemblage van een menselijk genoom met ultralange uitlezingen. nat. Biotechnologie. 36, 338–345 (2018).

Waterston, R.H. et al. Initiële sequencing en vergelijkende analyse van het muizengenoom. Natuur 420, 520–562 (2002).

Dobin, A. et al. STAR: ultrasnelle universele RNA-seq aligner. Bio-informatica 29, 15–21 (2013).

Tilgner, H. et al. Nauwkeurige identificatie en analyse van menselijke mRNA-isovormen met behulp van diepe lange leessequencing. G3 3, 387–397 (2013).

Harrow, J. et al. GENCODE: de referentie annotatie van het menselijk genoom voor The ENCODE Project. Genoom onderzoek. 22, 1760–1774 (2012).

Mcmanus et al. Globale analyse van trans-splicing in Drosophila. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 107, 12975–12979 (2010).

Karolchik, D. et al. De UCSC Genome Browser-database: update 2014. Nucleïnezuren Res. 42, D764-D770 (2014).

O'Leary, N.A. et al. Referentiesequentie (RefSeq) database bij NCBI: huidige status, taxonomische uitbreiding en functionele annotatie. Nucleïnezuren Res. 44, D733-D745 (2016).

Zhang, Y. et al. Zuivering en karakterisering van voorlopercellen en volwassen menselijke astrocyten onthult transcriptionele en functionele verschillen met muis. neuron 89, 37–53 (2016).

Ge, K. et al. Mechanisme voor eliminatie van een tumorsuppressor: afwijkende splicing van een hersenspecifiek exon veroorzaakt functieverlies van Bin1 bij melanoom. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 96, 9689–9694 (1999).

Fugier, C. et al. Verkeerd gereguleerde alternatieve splitsing van BIN1 wordt geassocieerd met veranderingen in de T-tubuli en spierzwakte bij myotone dystrofie. nat. Med. 17, 720–725 (2011).

Karni, R. et al. Het gen dat codeert voor de splitsingsfactor SF2/ASF is een proto-oncogen. nat. structuur Mol. Biol. 14, 185–193 (2007).

Anvar, SY et al. MRNA-sequencing van volledige lengte onthult een wijdverbreide koppeling tussen transcriptie-initiatie en mRNA-verwerking. Genoom Biol. 19, 46 (2018).

Vaquero-Garcia, J. et al. Een nieuwe kijk op de complexiteit en regulatie van transcriptoom door de lens van lokale splicingvariaties. eLife 5, e11752 (2016).

Li, Y.I. et al. Annotatievrije kwantificering van RNA-splitsing met LeafCutter. nat. Genet. 50, 151–158 (2018).

Sharma, K. et al. Door celtype en hersengebied opgelost muizenhersenproteoom. nat. neurosci. 18, 1819–1831 (2015).

Kang, H. M. et al. Multiplexed droplet single-cell RNA-sequencing met behulp van natuurlijke genetische variatie. nat. Biotechnologie. 36, 89–94 (2018).

Picelli, S. et al. Full-length RNA-seq van enkele cellen met behulp van Smart-seq2. nat. Protoc. 9, 171–181 (2014).

Satija, R., Farrell, JA, Gennert, D., Schier, AF & Regev, A. Ruimtelijke reconstructie van genexpressiegegevens van een enkele cel. nat. Biotechnologie. 33, 495–502 (2015).

Wu, TD & Watanabe, C.K. GMAP: een genomisch mapping- en uitlijnprogramma voor mRNA- en EST-sequenties. Bio-informatica 21, 1859–1875 (2005).

Benjamini, Y. & Hochberg, Y. Het controleren van het percentage valse ontdekkingen: een praktische en krachtige benadering van meervoudig testen. J.R. Stat. soc. B 57, 289–300 (1995).


3. Conclusies

De kennis van de structurele, moleculaire en functionele biologie van bot is essentieel voor een beter begrip van dit weefsel als een meercellige eenheid en een dynamische structuur die ook als endocrien weefsel kan fungeren, een functie die nog steeds slecht wordt begrepen. In vitro en in vivo studies hebben aangetoond dat botcellen reageren op verschillende factoren en moleculen, wat bijdraagt ​​aan een beter begrip van de plasticiteit van botcellen. Bovendien zijn botmatrixintegrines-afhankelijke botcelinteracties essentieel voor botvorming en -resorptie. Studies hebben het belang van het lacunocanaliculaire systeem en de pericellulaire vloeistof onderzocht, waardoor osteocyten als mechanosensoren werken voor de aanpassing van bot aan mechanische krachten. Hormonen, cytokinen en factoren die de activiteit van botcellen reguleren, zoals sclerostine, ephrinB2 en semafoor, hebben onder normale en pathologische omstandigheden een belangrijke rol gespeeld in de bothistofysiologie. Een dergelijk dieper begrip van de dynamische aard van botweefsel zal dus zeker helpen om nieuwe therapeutische benaderingen van botziekten te beheersen.


Fasescheiding als een ontbrekend mechanisme voor de interpretatie van ziektemutaties

Het is onduidelijk hoe ziektemutaties intrinsiek ongeordende eiwitregio's (IDR's) beïnvloeden, die een stabiele gevouwen structuur missen. Hoewel deze mutaties veel voorkomen bij ziekten, worden ze vaak verwaarloosd of geannoteerd als varianten van onbekende betekenis. Biomoleculaire fasescheiding, een fysiek proces dat vaak wordt gemedieerd door IDR's, heeft steeds meer waardering gekregen voor rollen in cellulaire organisatie en regulatie. We vinden dat autismespectrumstoornis (ASS) en kanker-geassocieerde eiwitten zijn verrijkt voor voorspelde neigingen tot fasescheiding, wat suggereert dat IDR-mutaties fasescheiding in belangrijke cellulaire processen verstoren. Meer in het algemeen veronderstellen we dat combinaties van IDR-mutaties met een klein effect de fasescheiding verstoren, wat mogelijk bijdraagt ​​aan "ontbrekende erfelijkheid" bij gevoeligheid voor complexe ziekten.

trefwoorden: Fasescheiding autisme spectrum stoornis biomoleculaire condensaten kanker intrinsieke stoornis intrinsiek ongeordende eiwitregio's neurologische ontwikkeling.


Geninteracties herstellen van eencellige gegevens met behulp van gegevensverspreiding

Eencellige RNA-sequencingtechnologieën lijden aan vele bronnen van technische ruis, waaronder onderbemonstering van mRNA-moleculen, vaak "drop-out" genoemd, die belangrijke gen-gen-relaties ernstig kan verdoezelen. Om dit aan te pakken, hebben we MAGIC (Markov-affiniteitsgebaseerde grafiekimputatie van cellen) ontwikkeld, een methode die informatie over vergelijkbare cellen deelt, via gegevensdiffusie, om de celtellingsmatrix ongedaan te maken en ontbrekende transcripten in te vullen. We valideren MAGIC op verschillende biologische systemen en vinden het effectief bij het herstellen van gen-genrelaties en aanvullende structuren. Toegepast op de epitheliale naar mesenchymale overgang, onthult MAGIC een fenotypisch continuüm, waarbij de meeste cellen zich in tussenliggende staten bevinden die stamachtige handtekeningen vertonen, en bekende en voorheen niet-gekarakteriseerde regulerende interacties afleiden, wat aantoont dat onze aanpak met succes regulerende relaties kan ontdekken zonder verstoringen .

trefwoorden: EMT imputatie spruitstuk leren regulerende netwerken eencellige RNA-sequencing.


Experimentele methodes

Alle reagentia worden gekocht bij Sigma (St. Louis, MO), tenzij anders vermeld.

Subplate neuron zuivering en cultuur

Om de opbrengst en efficiëntie te verhogen, hebben we onze bestaande immunopanning-methode (DeFreitas et al., 2001) aangepast om Magnetic-activated Cell Separation (MACS) te gebruiken. Alle MACS-materialen en -reagentia zijn gekocht bij Miltenyi Biotech (Auburn, CA) en omvatten: de MACS Neural Tissue Dissociation-kit, MACS-multistand, OctoMACS-scheidingsmagneet, scheidingskolommen, 30 µm pre-separatiefilters en ratten-antimuis IgG1 microkralen. Monoklonaal muis-anti-p75 NTR-antilichaam, 192, (Chandler et al., 1984) is het genereuze geschenk van Dr. Eric Shooter (Stanford University, CA). Hersenen van embryonale dag 17 (fokdag = E0) Long Evans-ratten (Simonsen) worden op ijs ontleed in Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) (Gibco). Meninges worden verwijderd en dorsolaterale caudale neocortex wordt verteerd volgens het MACS Neural Tissue Dissociation Kit-protocol. Gedissocieerde cellen worden gedurende 5 minuten bij 400 g gecentrifugeerd door een 15%/60% Percoll (Pharmacia Biotech) stapgradiënt en cellen worden verzameld bij het 15%/60% Percoll-grensvlak. Na een herstel van 45 minuten in HBSS met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C, wordt celscheiding gedaan met behulp van het MACS-protocol voor zuivering van positief gelabelde cellen. Het tellen van de cellen wordt gedaan met behulp van een Hausser BrightLine hemacytometer volgens hun instructies. Het aantal startcellen ligt meestal tussen 1𠄴 × 108 cellen, afhankelijk van het aantal geoogste embryo's. Cellen worden geresuspendeerd in een concentratie van 1 - 108 cellen/ml met 40 - 5 g/ml anti-p75 NTR monoklonaal, 192, in MACS-buffer (HBSS met 1% runderserumalbumine (BSA) en 1% FBS ) en worden gedurende 15 minuten bij 4C geïncubeerd. Na 5 minuten centrifugeren en weggooien van het supernatant, worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in MACS-buffer bij een concentratie van 2,5 10 108 cellen/ml waaraan 250 L/ml microkralen is toegevoegd voorafgaand aan incubatie bij 4°C gedurende 30 minuten. Maximaal 2 x 108 cellen (1 ml van de celsuspensie) worden door een MACS-filter en in elke MACS-kolom geleid en met MACS-buffer gewassen. De negatieve elutie bevat ongebonden corticale plaatcellen, terwijl de kolom de gebonden, positief gelabelde subplaatneuronen bevat. Resulterende cellen worden gewassen en gekweekt bij 37°C in Neurobasaal medium (Gibco) met B-27-additieven (Gibco) en penicilline/streptomycine op weefselkweekplastic (platen met 12 of 96 putjes) bekleed met 1 mg/ml poly-L- ornithine en 15 mg/ml fibronectine (Becton Dickinson) in CMF-PBS.

Immunopanning met behulp van antilichamen tegen p75 NTR levert culturen van subplaatneuronen op die zijn verrijkt tot ongeveer 90% zuiverheid op basis van bromodeoxyuridine (BrdU) geboortedatum en immunofenotypering (DeFreitas et al., 2001). Om te bevestigen dat MACS-gezuiverde subplaatneuronen equivalente culturen produceren, analyseerden we MACS-gezuiverde culturen met behulp van vergelijkbare methoden. Subplaatneuronen werden geïdentificeerd aan de hand van hun vroege geboortedata (embryonale dag, E10.5�.5 (Bayer en Altman, 1990)) in vergelijking met corticale neuronen in de bovenste laag die op latere data worden gegenereerd (E13.5 & x02013 P0.5 ). BrdU (50 mg/kg) werd aan het moederdier toegediend met een enkele intraperitoneale injectie op E12.5. Kwantificering van BrdU-positieve cellen werd uitgevoerd met behulp van de FITC BrdU Flow-kit (BD Pharmingen) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden subplaat- en corticale neuronen geïsoleerd zoals hierboven beschreven uit tijdzwangere moederdieren die BrdU-injecties kregen op E12.5. De cellen werden gefixeerd met paraformaldehyde, gepermeabiliseerd met saponine en behandeld met DNase om BrdU bloot te leggen voorafgaand aan kleuring met FITC-geconjugeerd anti-BrdU-antilichaam. Gekleurde cellen werden gewassen en opnieuw gesuspendeerd in kleurbuffer voor analyse door middel van flowcytometrie. Flowcytometrie werd uitgevoerd op een LSRII en gekwantificeerd met behulp van FACSDiva-software (BD). Gegevens werden geanalyseerd met behulp van FlowJo-software (TreeStar). Een enkele puls van BrdU bij E12.5 labelt 26+/�% (N=3) van MACS-gezuiverde subplaatneuronen, wat vergelijkbaar is met die gerapporteerd in de oorspronkelijke beschrijving met behulp van immunopanning (33%) (DeFreitas et al. , 2001). BrdU op E12.5 labelt ook een vergelijkbaar aantal corticale neuronen (13+/𢄢%, N=3 vs. 10%) (DeFreitas et al., 2001). Immunofenotypering MACS-gezuiverde subplaatneuronculturen laten een vergelijkbare verrijking zien voor cellen die reageren met antilichamen tegen het neuronspecifieke intermediaire filament Tau als die gerapporteerd voor immunopanning (88+/𢄣%, N=3 vs. 90%) (DeFreitas et al. ., 2001). MACS-gezuiverde subplaat-neuronculturen bevatten relatief weinig cellen die reageren met antilichamen tegen Nestin, een marker verrijkt in voorlopercellen, vergeleken met corticale culturen (7+/𢄣% vs. 33%).

Serumvrije celcultuur, zuurstof-glucose-deprivatie en overlevingstesten

Subplaat- en corticale plaatneuronen werden gekweekt in schalen met 96 putjes bekleed met poly-L-ornithine en fibronectine in Neurobasaal medium dat B-27-additieven bevatte met rhBDNF (Peprotech) en forskoline. Op DIV1 wordt forskoline verwijderd en worden de antimitotische middelen uridine en fluoro-deoxy-uridine (FDU) toegevoegd om de groei van niet-neuronale cellen te remmen. Op DIV4 wordt het neurobasale medium gewijzigd om BDNF, uridine en FDU te verwijderen. Op DIV7 worden cellen die zuurstof-glucose deprivatie ondergaan, overgebracht naar Neurobasal media zonder glucose en B27-additief zonder antioxidanten. Cellen worden in een luchtdichte kamer onder 95% stikstof/5% CO . geplaatst2 bij 37°C gedurende 7 uur. Aan het einde van de zuurstof-glucose-deprivatieperiode wordt het glucosebevattende Neurobasal-medium vervangen en worden de cellen teruggebracht naar de incubator. 24 uur later wordt de overleving gemeten met behulp van de Live/Dead Assay (Molecular Probes) in combinatie met de Lactate Dehydrogenase (LDH) Assay (Roche). Elk experiment wordt in tweevoud uitgevoerd en ten minste drie keer herhaald en de resultaten worden gerapporteerd als gemiddelde ± SEM.

Immunocytochemie

Neuronale kweken groeien in platen met 96 putjes en worden gefixeerd door een 95% methanol/5% azijnzuuroplossing toe te passen en gedurende 15 minuten bij 𶀤C te incuberen. Culturen die zijn uitgeplaat op Nunc LabTek II-systeemkamerglaasjes voor synaptische en neurietkleuring, worden gefixeerd door een 4% paraformaldehyde/4% sucrose PBS-oplossing aan te brengen en gedurende 12 minuten bij 4 ° C te incuberen, gevolgd door toepassing van 100% methanol bij � voor 10 minuten. Ze worden gewassen met 0,1 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), vervolgens blootgesteld aan blokkerende oplossing (PBS met 10% foetaal runderserum, 10% gelatine en 0,1% Triton X-100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Het primaire antilichaam wordt verdund in een blokkerende oplossing en gedurende één uur aangebracht in de volgende verdunningen: muis-anti-Nestin op 1:100 (Abcam), konijn-anti-Tau op 1:200 (Sigma), muis-anti-GFAP op 1:200 ( Sigma), muis anti-PSD-95 op 1:200 (Affinity Bioreagents), konijn anti-GluR2 op 1:100 (Epitomics), konijn anti-MAP2 op 1:200 (Millipore), en muis anti-gefosforyleerde neurofilamenten, SMI 31 om 1:200 (Covance). Na primaire incubatie incuberen we onze culturen met Alexa-488 Goat anti-Mouse (Invitrogen) en Alexa-555 Goat anti-Rabbit (Invitrogen) in een concentratie van 1:200 in serumbevattende PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur bedekt met aluminiumfolie . Tegengekleurde kernen worden gevisualiseerd met TOPRO-3 (Molecular Probes). Elke kweek wordt ondergedompeld in 100 µl Vectashield-montagemedium (Vector Laboratories) voorafgaand aan fluorescerende beeldvorming op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop van Nikon of een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop van Zeiss Axio Imager. Het tellen van cellen op basis van morfologische kleuring wordt uitgevoerd met Metamorph v. 7.0 op een pc.

MRNA-isolatie en Affymetrix-microarray-analyse

Immunopanning werd uitgevoerd zoals beschreven (DeFreitas et al., 2001) om drie onafhankelijke replica's te produceren voor isolatie en analyse van mRNA. Ongebonden cellen na immunopanning met anti-p75 NTR-antilichaam vertegenwoordigen een gemengde populatie die ongeveer 30% neuronen bevat op basis van expressie van intermediaire filamenten (DeFreitas et al., 2001). Om een ​​pure neuronale populatie te produceren voor vergelijking met p75 NTR immunogezuiverde subplaatneuronen, werden corticale neuronen binnen de ongebonden celpopulatie geïsoleerd door een daaropvolgende immunopanningstap met behulp van een antilichaam tegen het axonale glycoproteïne TAG-1 (3.1C12, Developmental Studies Hybridoma Bank), die wordt uitgedrukt door een subset van neocorticale projectie-neuronen (Furley et al., 1990). Opbrengsten van een zuivere neuronale populatie werden bevestigd door expressie van het intermediaire filament en neuronale marker Tau. Meerdere immunopanning-preparaten werden samengevoegd om ten minste 5 miljoen cellen te produceren. Individuele celpreparaten werden bij � in RNAlater (Ambion) ingevroren en samengevoegd (N=3� monsters per replicaat) om drie onafhankelijke biologische replica's te produceren. Cellen werden ontdooid in Trizol (Invitrogen, Carlsbad CA) en RNA werd geïsoleerd met behulp van RNeasy Mini-kolommen (Qiagen, Germantown MD). RNA, ten minste 5 g per replicaat, werd geamplificeerd met één ronde van cDNA-synthese en in vitro transcriptie om biotine-gelabeld cRNA te produceren volgens de protocollen van de fabrikant (Affymetrix, Santa Clara CA). De RNA-kwaliteit werd beoordeeld op een Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) voor en na amplificatie en fragmentatie. Hybridisatie van het gelabelde cRNA met de Rat Genome U34A-array, wassen en scannen van de chip werden uitgevoerd aan de Universiteit van Californië, aan San Francisco gelieerde J. David Gladstone Genomics Core volgens de protocollen van de fabrikant (Affymetrix).

Microarray-gegevensanalyse

Afbeeldingen van probehybridisatie-intensiteit op de gescande chips werden gekwantificeerd en geschaald door Affymetrix Microarray Suite 5.0-software, met behulp van standaardinstellingen volgens de protocollen van de fabrikant. De software gebruikt genormaliseerde intensiteiten van de 11 probeparen per sequentie om een ​​detectiebetrouwbaarheidsscore (aanwezig, afwezig of marginaal) en een signaalintensiteitswaarde te rapporteren die het expressieniveau vertegenwoordigt. Gegevens werden vervolgens geanalyseerd in Microsoft Excel om de vouwverandering van genexpressie tussen celtypen te berekenen.

Agonist/antagonist excitotoxiciteit

Subplate en corticale plaatneuronen werden gekweekt zoals beschreven in de vorige sectie. Op DIV7 worden cellen overgebracht naar neurobasale media die een reeks concentraties van verschillende agonisten bevatten, waaronder l-glutamaatzuur (glutamaat, Sigma) van 0 tot 80'000b5M, NMDA (Tocris) van 0 tot 1000'000b5M, of (RS)-AMPA (Tocris) van 0 tot 1000µM. Antagonisten die worden gebruikt om cellen 10 minuten voor te behandelen voorafgaand aan experimenten, zijn onder meer NBQX (Tocris) bij 30'000b5M, DL-AP5 (Tocris) bij 200'000b5M, <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text ":"LY341495","term_id":"1257705759","term_text":"LY341495">> LY341495 (Tocris) bij 200nM en β-NAAG (Sigma) bij 100µM. De mGluR-groep II-agonist DCG-IV (Tocris) wordt ook gebruikt in combinatie met AMPA-experimenten bij 100'000b5M om cellen voor te behandelen. De afgifte van glutamaatblaasjes wordt geblokkeerd door de cellen gedurende 3 uur te incuberen in 30 nM tetanustoxine (EMD Biosciences) voordat de glutamaatagonist wordt aangebracht. Cellen worden gedurende één uur bij 37°C met de agonisten geïncubeerd. Aan het einde van de incubatie wordt het glucosebevattende Neurobasal-medium vervangen en worden de cellen teruggevoerd naar de incubator. 24 uur later wordt de overleving gemeten zoals hieronder beschreven.

Kwantificering van celdood in vitro

Digitale beelden van levende (cysteïne-AM) of dode (ethidium) gekleurde cellen in platen met 96 putjes worden verkregen met een Nikon fluorescentiemicroscoop. Per putje worden drie afzonderlijke beelden verkregen. Levende cellen en dode cellen worden geïdentificeerd met behulp van morfometrie en intensiteitsdrempels, samen met de Count Nuclei-toepassing van Metamorph-software. Het totale aantal cellen wordt afgeleid van de som van levende en dode cellen, en het percentage levend wordt uitgedrukt als een fractie van het totaal (Live/(Live + Dead)). Achtergrondceldood wordt bepaald in controleplaten en afgetrokken van experimentele platen. Om de resultaten verder te verifiëren, worden kweeksupernatanten van dezelfde platen geoogst en geanalyseerd op lactaatdehydrogenase (LDH)-activiteit met een in de handel verkrijgbare testkit (Roche). De totale cellulaire LDH-activiteit van levende cellen wordt bepaald door de cellen gedurende 30 minuten in te vriezen in een temperatuur van 30 °C, gevolgd door ze te ontdooien in een incubator van 37 °C en de resulterende supernatanten te verzamelen. LDH-activiteiten worden bepaald door colorimetrie volgens de instructies van de LDH-assaykit. Percentage levend van LDH-activiteit werd als volgt berekend: LDH-percentage levend = 1 − waarbij Dood de LDH-activiteit is van kweeksupernatanten voorafgaand aan bevriezing en Levend de cellulaire LDH-activiteit is die resulteert uit supernatanten na bevriezen-ontdooien. Voor alle gegevens vertonen LDH-resultaten dezelfde trend als Live/Dead-resultaten en worden daarom niet gerapporteerd.

Immunoblotting en densitometrie

5ubplate en corticale plaatneuronen werden gekweekt zoals beschreven. Op DIV7 werden eiwitten geëxtraheerd en geoogst met een geschikt volume cellysisbuffer (1X PBS, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,2% SDS, 1X complete mini-proteasecocktail [Roche]). Extracten werden 20 minuten bij 4°C bij 19.000 g afgedraaid en het supernatant dat de eiwitten bevatte werd verzameld. Het eiwitgehalte werd geschat met een BCA-eiwittestkit (Pierce, Rockford, IL) met behulp van een op BSA gebaseerde standaardcurve. Gelijke hoeveelheden eiwit werden gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht naar een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan met behulp van snelle semi-droge immunoblottechnieken (Biorad, Hercules, CA). PVDF-blots (Bio Rad) werden geblokkeerd met 5% magere melk in 1X TBS met 0,05% Tween 20 (TBST) gedurende één uur bij kamertemperatuur, daarna 3 keer gewassen gedurende 10 minuten elk in TBST. Blots werden vervolgens geïncubeerd in TBST met 5% runderserumalbumine (BSA) met geschikte verdunning van primair antilichaam gedurende de nacht bij 4°C, inclusief konijn anti-GluR1 (Upstate, product #07-660) bij 1:1000, muis anti-GluR2 (Chemicon, product #MAB397) op 1:1000, muis anti-NR1 (BD Biosciences, product #556308) op 1:1000, konijn anti-NR2A monoklonaal (Upstate, product #05-901) op 1:500, muis anti -NR2B (BD Biosciences, product #610416) op 1:1000, en konijn anti-mGluR2/3 (Chemicon, product #AB1553) op 1:2000. Na 3 keer wassen 10 minuten in TBST werden blots gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met HRP-geconjugeerd secundair antilichaam, waaronder 0,1 µg/ml Geit-anti-konijn IgG (CalBioChem, San Diego, CA) en 0,1 µg/ml Geiten-anti-muis (CalBioChem), dienovereenkomstig. Blots werden gevisualiseerd met behulp van het SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific) en vastgelegd op autoradiografische films (GE Healthcare, Buckinghamshire, VK). Voor het laden van controles werden alle blots geïncubeerd met anti-&#-actine (Sigma) bij 0,2 &#g/ml overnacht bij 4°C, gevolgd door incubatie met HRP-geconjugeerde geit-anti-muis zoals hierboven beschreven. Films werden gedigitaliseerd met een Epson Perfection 4490 Photo-scanner en optische banddichtheid (OD) werd gemeten met ImageJ-versie 1.40g (NIH, VS). Voor elk monster hebben we de verhouding van eiwit tot β-actinewaarden berekend, en deze getallen werden gebruikt om de gemiddelde ± SEM te berekenen. Deze waarden werden gepresenteerd als willekeurige OD-controlewaarden en, indien van toepassing, de OD-verhouding.

Statistieken

De resultaten zijn samengevat door gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde (SEM) en grafisch weergegeven door een histogram met één toestand of door curven die het percentage levend boven de geneesmiddelconcentratie aangeven. Om de effecten van meerdere concentraties van glutamaatagonisten of -antagonisten te bepalen, werd variantieanalyse (ANOVA) uitgevoerd waarbij rekening werd gehouden met de afzonderlijke effecten van geneesmiddelconcentratie en celtype met behulp van Bonferroni-correctie voor meerdere vergelijkingen. Wanneer er een significant verschil bestond tussen celtypen, werden de effecten bij specifieke geneesmiddelconcentraties beoordeeld met behulp van een tweezijdige Student's T-test.


Hoe cellen functioneren: ontbrekend doel voor calciumsignalering geïdentificeerd

Een internationale studie onder leiding van neurowetenschappelijke onderzoekers van de Ohio State University beschrijft een van de ontbrekende triggers die calcium in cellen regelt, een proces dat belangrijk is voor spiercontractie, zenuwceltransmissie, insulineafgifte en andere essentiële functies.

Het onderzoek wordt op 22 april online geplaatst in het tijdschrift Natuur.

The researchers believe the findings will enhance the understanding of how calcium signals are regulated in cells and shed light on new ways to treat many diseases, including cardiovascular diseases, immune diseases, metabolic diseases, cancer, and brain disorders.

The study found that molecular structures called two-pore channels (TPCs) cause the release of calcium when stimulated by a substance called NAADP.

The researchers also show that TPCs are located in the membranes of cell components called lysosomes and endosomes. These are mobile structures within cells that were not previously thought to be sites of calcium release.

Furthermore, the discharge of calcium from these structures can prompt much larger releases from stores located on the large and elaborate membrane network called the endoplasmic reticulum.

"Our study discovered one of the missing targets for calcium signaling," says Michael Xi Zhu, associate professor of neuroscience and a researcher with Ohio State's Center for Molecular Neurobiology. "It also nails down that NAADP receptors are located on lysosomes and endosomes, which should change people's views of calcium signaling.

"It's as if we now understand that cells have not only a primary battery for calcium but other batteries in different places."

Researchers have known for some time that NAADP, or nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate, stimulates calcium release inside cells, but there was controversy about how this happened and where this calcium source was located.

Zhu, working with colleagues at the University of Edinburgh, the University of Oxford and UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School in New Jersey, used gene sequence information to discover first that TPC proteins should have the properties of a calcium channel.

The investigators tested their hypothesis in a series of experiments that involved boosting TPC levels &ndash specifically, TPC2 &ndash in a line of laboratory cells. They found that higher TPC2 levels corresponded to higher calcium levels in cells exposed to NAADP.

They used fluorescent antibody labeling to show that the TPC proteins are localized in the membranes of lysosomes and endosomes, which are two types of vesicles in cells. Lysosomes contain enzymes that digest materials and kill bacteria, while endosomes contain materials taken up from the external environment and internalized.

Finally, the researchers found that these NAADP-sensitive stores of calcium are tightly coupled to the larger calcium stores on the endoplasmic reticulum.

This work was supported by grants from the U.K. Wellcome Trust, British Heart Foundation, U.S. National Institutes of Health and American Heart Association.

Verhaalbron:

Materialen geleverd door Ohio State University Medical Center. Opmerking: inhoud kan worden bewerkt voor stijl en lengte.


How Cells Work

Many genetic diseases occur because a person is missing the gene for a single enzyme. Here are some of the more common problems caused by missing genes:

  • Lactose intolerance - The inability to digest lactose (the sugar in milk) is caused by a missing lactase gene. Without this gene, no lactase is produced by intestinal cells.
  • Albinism - In albinos, the gene for the enzyme tyrosinase is missing. This enzyme is necessary for the production of melanin, the pigment that leads to sun tans, hair color and eye color. Without tyrosinase, there is no melanin.
  • Cystic fibrosis - In cystic fibrosis, the gene that manufactures the protein called cystic fibrosis transmembrane conductance regulator is damaged. Volgens Encyclopedia Britannica: The defect (or mutation) found in the gene on chromosome 7 of persons with cystic fibrosis causes the production of a protein that lacks the amino acid phenylalanine. This flawed protein somehow distorts the movement of salt and water across the membranes that line the lungs and gut, resulting in dehydration of the mucus that normally coats these surfaces. The thick, sticky mucus accumulates in the lungs, plugging the bronchi and making breathing difficult. This results in chronic respiratory infections, often with Staphylococcus aureus or Pseudomonas aeruginosa. Chronic cough, recurrent pneumonia, and the progressive loss of lung function are the major manifestations of lung disease, which is the most common cause of death of persons with cystic fibrosis.

Other genetic diseases include Tay-Sachs disease (damage to the gene for the enzyme hexosaminidase A leads to an accumulation of a chemical in the brain that destroys it), sickle cell anemia (improper coding of the gene that produces hemoglobin), hemophilia (lack of a gene for a blood-clotting factor) and muscular dystrophy (caused by a defective gene on the X chromosome). There are something like 60,000 genes in the human genome, and over 5,000 of them, if damaged or missing, are known to lead to genetic diseases. It is amazing that damage to just one enzyme can lead, in many cases, to life-threatening or disfiguring problems.


Daughter Cells and Cancer

Mitotic cell division is strictly regulated by cells to ensure that any errors are corrected and that cells divide properly with the correct number of chromosomes. Should mistakes occur in cell error checking systems, the resulting daughter cells may divide unevenly. While normal cells produce two daughter cells by mitotic division, cancer cells are distinguished for their ability to produce more than two daughter cells.

Three or more daughter cells may develop from dividing cancer cells and these cells are produced at a faster rate than normal cells. Due to the irregular division of cancer cells, daughter cells may also end up with too many or not enough chromosomes. Cancer cells often develop as a result of mutations in genes that control normal cell growth or that function to suppress cancer cell formation. These cells grow uncontrollably, exhausting the nutrients in the surrounding area. Some cancer cells even travel to other locations in the body via the circulatory system or lymphatic system.


Bekijk de video: Protein Purification Animation - his tag protein purification (December 2021).