Informatie

11.10: Antisense RNA - Biologie


Messenger-RNA (mRNA) is enkelstrengs. De sequentie van nucleotiden wordt "sense" genoemd omdat het resulteert in een genproduct (eiwit). Normaal gesproken worden de ongepaarde nucleotiden "gelezen" door RNA-anticodons over te dragen naarmate het ribosoom verder gaat naar vertalen de boodschap.

Echter, RNA kan vormen duplexen net zoals DNA dat doet. Het enige dat nodig is, is een tweede RNA-streng waarvan de sequentie van basen complementair is aan de eerste streng.

Voorbeeld

5´ C A U G 3´ mRNA
3´ G U A C 5´ Antisense RNA

De tweede streng heet de antisense streng omdat de sequentie van nucleotiden het complement is van de boodschapzin.

Wanneer mRNA een duplex vormt met een complementaire antisense RNA-sequentie, wordt translatie geblokkeerd. Dit kan gebeuren omdat het ribosoom geen toegang kan krijgen tot de nucleotiden in het mRNA of omdat het duplex-RNA snel wordt afgebroken door ribonucleasen in de cel. Met recombinant-DNA-methoden kunnen synthetische genen (DNA) die coderen voor antisense-RNA-moleculen in het organisme worden geïntroduceerd.

Voorbeelden

De Flavr Savr tomaat

De meeste tomaten die naar de markt moeten worden verscheept, worden geoogst voordat ze rijp zijn. Anders zorgt het door de tomaat gesynthetiseerde ethyleen ervoor dat ze rijpen en bederven voordat ze de klant bereiken. Er zijn transgene tomaten geconstrueerd die in hun genoom een ​​kunstmatig gen (DNA) dragen dat wordt getranscribeerd in een antisense-RNA dat complementair is aan het mRNA voor een enzym dat betrokken is bij de productie van ethyleen. Deze tomaten maken slechts 10% van de normale hoeveelheid van het enzym.

Het doel van dit werk was om supermarkttomaten te voorzien van iets dat meer lijkt op het uiterlijk en de smaak van tomaten die rijp zijn geoogst. Deze tomaten raakten echter vaak beschadigd tijdens transport en verwerking en zijn van de markt gehaald.

Transgene tabak

Fig.11.9.3 tabaksbloem

Bloem van een tabaksplant die een transgen draagt ​​waarvan het transcript antisense is voor een van de mRNA's die nodig zijn voor normale bloempigmentatie.

Transgene bloem

Bloem van een andere transgene plant waarvan de normale pigmentatie niet is veranderd.

Transgene planten maken

Er zijn verschillende methoden om genen in planten te introduceren, waaronder:

  • plantencellen infecteren met plasmidevectoren die het gewenste gen dragen
  • schieten microscopisch kleine korrels die het gen bevatten rechtstreeks in de cel

In tegenstelling tot dieren is er geen echt onderscheid tussen somatische cellen en kiembaancellen. Somatische weefsels van planten, bijv. wortelcellen gekweekt in kweek,

  • kan in het laboratorium worden getransformeerd met het gewenste gen
  • uitgegroeid tot volwassen planten met bloemen.

Als alles goed gaat, wordt het transgen opgenomen in het stuifmeel en de eieren en doorgegeven aan de volgende generatie.

In dit opzicht is het gemakkelijker om transgene planten te produceren dan transgene dieren.

Antisense RNA komt ook van nature voor

Bevatten cellen genen die van nature worden vertaald in antisense RNA-moleculen die in staat zijn de translatie van andere genen in de cel te blokkeren? Het antwoord is ja, en deze lijken een andere methode van genexpressie reguleren. Bij zowel muizen als mensen is het gen voor de insuline-achtige groeifactor 2-receptor (Igf2r) dat van de vader wordt geërfd, synthetiseert een antisense-RNA dat de synthese van het mRNA voor Igf2r lijkt te blokkeren. Een overgeërfd verschil in de expressie van een gen, afhankelijk van of het van de moeder of de vader is geërfd, wordt genomisch of ouderlijk genoemd. inprenting.

RNA-interferentie (RNAi)

Bij het testen van de effecten van antisense RNA moet men gebruik maken van: gevoel RNA van hetzelfde coderende gebied als a controle. Verrassenderwijs blijken preparaten van sense-RNA vaak een even effectieve remmer te zijn als antisense-RNA.

Waarom? Het lijkt erop dat de preparaten van sense-RNA vaak besmet zijn met hybriden: sense- en antisense-strengen die een dubbele helix van dubbelstrengs RNA vormen (dsRNA). Dubbelstrengs RNA dat overeenkomt met een bepaald gen is een krachtige onderdrukker van dat gen. In feite hangt het onderdrukkende effect van antisense-RNA waarschijnlijk ook af van zijn vermogen om dsRNA te vormen (met behulp van het overeenkomstige mRNA als sjabloon).

Het vermogen van dsRNA om de expressie van een gen dat overeenkomt met zijn eigen sequentie te onderdrukken, wordt genoemd: RNA-interferentie (RNAi). Het wordt ook wel post-transcriptionele genuitschakeling of PTGS.

Mechanisme van RNAi

De enige RNA-moleculen die normaal in het cytoplasma van een cel worden aangetroffen, zijn moleculen van enkelstrengs RNA. Als de cel moleculen vindt van dubbelstrengs RNA (dsRNA), gebruikt het een enzym genaamd Dicer om ze in fragmenten te knippen die ~ 21 basenparen bevatten (~ 2 windingen van een dubbele helix). De twee strengen van elk fragment scheiden zich dan - waardoor de vrijkomt antisense streng. Met behulp van een eiwit bindt het aan a complementaire zinsvolgorde op een molecuul van mRNA. Als de basenparing exact is, wordt het mRNA vernietigd. Vanwege hun werking worden deze fragmenten van RNA "klein (of kort) interfererend RNA" genoemd (siRNA). Het complex van siRNA en eiwit wordt de "RNA-lverwekt safzweren Cingewikkeld" (RISC).

SiRNA's kunnen ook interfereren met transcriptie

Er is groeiend bewijs dat siRNA's ook de transcriptie van genen kunnen remmen

  • misschien door te binden aan complementaire sequenties op DNA of
  • misschien door te binden aan het ontluikende RNA-transcript terwijl het wordt gevormd.

In splijtingsgist is het siRNA tenminste gecomplexeerd met één molecuul van elk van drie verschillende eiwitten. Het hele complex heet de RITS complexe ("RNA-lgeïnduceerde initiatie van transcriptioneel gen sverzwakken")

Hoe deze siRNA's - gesynthetiseerd in het cytosol - toegang krijgen tot het DNA in de kern is onbekend.

Synthetische siRNA-moleculen die binden aan genpromotors kunnen — in het laboratorium — de transcriptie van dat gen onderdrukken. De repressie wordt gemedieerd door methylering van het DNA in de promotor en, misschien, methylering van histonen in de buurt.

Er is een rijststam (LGC-1) die abnormaal lage niveaus van eiwitten produceert, genaamd glutelins. Het blijkt dat van verschillende gluteline-genen die in rijst worden gevonden

  • twee sterk op elkaar lijkende gluteline-genen bevinden zich rug aan rug op hetzelfde chromosoom.
  • In LGC-1 is een deletie opgetreden tussen de twee genen waardoor het signaal wordt verwijderd dat normaal gesproken de transcriptie zou stoppen na het eerste gen.
  • Dus RNA-polymerase II transcribeert direct voorbij het eerste gen en verder in het tweede.
  • Het resultaat is een boodschapper-RNA met bijna identieke sequenties die in tegengestelde richtingen lopen.
  • Hierdoor vouwt het mRNA zich op tot een molecuul van dubbelstrengs RNA (dsRNA).
  • Een Dicer-achtig enzym snijdt het dsRNA in kleine interfererende RNA's (siRNA's) die verdere transcriptie van die genen en andere gluteline-genen onderdrukken.

Waarom RNAi?

Er is gevonden dat RNAi werkt in zulke uiteenlopende organismen als planten, schimmels en dieren zoals: Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, en zelfs muizen en de zebravissen. Zo'n universele celrespons moet een belangrijke functie hebben. Wat kan het zijn?

Enkele mogelijkheden:

  • Sommige virussen van zowel planten als dieren hebben een genoom van dsRNA. En veel andere virussen van zowel planten als dieren hebben een RNA-genoom dat in de gastheercel kortstondig wordt omgezet in dsRNA. Dus RNAi kan een wapen zijn om infecties door deze virussen tegen te gaan door hun mRNA's te vernietigen en zo de synthese van essentiële virale eiwitten te blokkeren.
  • Transposons kunnen worden getranscribeerd in RNA-moleculen met gebieden die dubbelstrengs zijn. RNAi zou deze dan kunnen vernietigen.
  • RNA-interferentie kan het onverwachte dividend zijn van een ander basisproces voor het beheersen van genexpressie.

RNAi als hulpmiddel

De ontdekking van RNAi voegt in ieder geval een veelbelovend hulpmiddel toe aan de gereedschapskist van moleculair biologen. De introductie van dsRNA dat overeenkomt met een bepaald gen zal de celeigen expressie van dat gen uitschakelen. (Voeden) C. elegans Aan E coli het maken van het dsRNA zal zelfs voldoende zijn.)

Heroïsch voorbeeld

In het nummer van 24 maart 2005 van Natuur, Sonnichsen et al meldden dat ze dsRNA's hebben geïnjecteerd die overeenkomen met 20.326 genen van C. elegans (98% van het totaal!) en het effect van elk op de embryonale ontwikkeling hebben gevolgd vanaf de voltooiing van meiose (na bevruchting) tot de tweede mitotische deling die de 4- celembryo.

Ze ontdekten dat minstens 661 verschillende genen in deze periode een proces veranderden:

  • ongeveer de helft van hen betrokken bij celdeling en
  • de helft in het algemene celmetabolisme.

(Nog duizend genen produceerden fenotypische effecten die in latere stadia van ontwikkeling werden waargenomen.)

Omdat RNAi op een bepaald tijdstip in bepaalde weefsels kan worden gedaan, biedt het vaak een voordeel ten opzichte van conventionele "knock-outs" van genen, waarbij het ontbrekende gen in de kiembaan wordt gedragen en waarvan de afwezigheid het embryo kan doden voordat het kan worden bestudeerd.

Een ander voorbeeld: genen screenen op hun effect op de gevoeligheid voor geneesmiddelen

  • Verdeel uw cellen in duizenden putjes en voeg - uit een "bibliotheek" van duizenden siRNA's die het hele genoom vertegenwoordigen - siRNA-moleculen toe die de expressie van één gen naar elk putje richten
  • Voeg het medicijn toe aan alle putjes
  • Kijk welke putjes cellen hebben die reageren

Enkele andere veelbelovende toepassingen van RNAi

In zoogdiercellen

In zoogdiercellen vermindert het introduceren van dsRNA-fragmenten slechts tijdelijk de genexpressie. Zoogdiercellen kunnen echter worden geïnfecteerd met a DNA-vector dat codeert voor een RNA-molecuul van 50-80 nucleotiden dat een "klein haarspeld-RNA" wordt genoemd (shRNA) die een sequentie bevat die overeenkomt met het gen dat men wil onderdrukken. Terwijl het shRNA wordt gesynthetiseerd, zet dicer het om in een typisch siRNA-molecuul. Omdat de cel continu shRNA kan synthetiseren, is de interferentie langdurig. Met vectoren die geïntegreerd worden in het gastheergenoom, kan RNAi zelfs worden doorgegeven aan de nakomelingen.

in planten

Het nummer van 19 juni 2003 van Natuur gerapporteerd over koffieplanten die zijn ontworpen om een ​​transgen tot expressie te brengen dat siRNA maakt dat - door RNAi - interfereert met de expressie van een gen dat nodig is om cafeïne. Dus misschien zal "cafeïnevrije" koffie op een dag niet langer de chemische verwijdering van cafeïne uit koffiebonen vereisen.

Monsanto ontwikkelt een transgene maïs (maïs) die een dsRNA tot expressie brengt dat overeenkomt met de sequentie van een essentieel gen in de westelijke maïswortelworm, een verwoestende plaag voor het gewas. Na opname van dit dsRNA, verwerken de eigen cellen van het insect het tot een siRNA dat het mRNA van het gen voor vernietiging richt en de worm binnen een paar dagen doodt.

Amplificatie van RNAi

In C. elegans, planten, en neurospora, heeft de introductie van enkele moleculen dsRNA een krachtig en langdurig effect. In planten verspreidt de genuitschakeling zich naar aangrenzende cellen (via plasmodesmata) en zelfs naar andere delen van de plant (via het floëem). RNAi in een cel kan doorgaan na mitose in het nageslacht van die cel. Triggeren van RNAi in C. elegans kan zelfs via de kiembaan in zijn nakomelingen terechtkomen.

Een dergelijke versterking van een initieel triggersignaal suggereert een katalytisch effect. Het blijkt dat deze organismen RNA-afhankelijke RNA-polymerasen (RdRP's) hebben die het mRNA gebruiken waarop het initiële antisense-siRNA is gericht als een sjabloon voor de synthese van meer siRNA's. Synthese van deze "secundaire" siRNA's vindt zelfs plaats in aangrenzende gebieden van het mRNA. Dus niet alleen kunnen deze secundaire siRNA's zich richten op aanvullende gebieden van het oorspronkelijke mRNA, maar ze zijn mogelijk in staat om mRNA's van andere genen die dezelfde nucleotidensequentie dragen, tot zwijgen te brengen.

Dit fenomeen, genaamd "transitieve RNAi",

  • kan de interpretatie van experimenten met genonderdrukking bemoeilijken, aangezien de expressie van andere genen kan worden onderdrukt naast het doelgen;
  • werpt een waarschuwingsvlag op voor het gebruik van RNAi om afzonderlijke genen bij therapie bij de mens te onderdrukken (hoewel RdRP's en amplificatie niet zijn waargenomen in zoogdiercellen).

RNAi in therapie bij mensen

Omdat het doelwit zo specifiek is, heeft de mogelijkheid om RNAi te gebruiken om de expressie van een enkel gen te stoppen, grote opwinding gewekt dat er een nieuwe klasse van therapeutische middelen op komst is. Er zijn veel klinische onderzoeken aan de gang om het gebruik van siRNA-moleculen bij de behandeling van een breed scala aan ziekten te onderzoeken. Tot op heden zijn de meest veelbelovende resultaten het gebruik van RNAi geweest om een ​​erfelijke ziekte aan te pakken waarbij de lever een gemuteerde vorm van transthyretine uitscheidt, wat leidt tot de accumulatie van amyloïde-afzettingen in neuronen en elders.

MicroRNA's (miRNA's)

In C. elegans, succesvolle ontwikkeling door zijn larvale stadia en naar de volwassene vereist de aanwezigheid van ten minste twee "microRNA's" ("miRNA's") - enkelstrengs RNA-moleculen die ongeveer 22 nucleotiden bevatten en dus ongeveer even groot zijn als siRNA's.

deze kleine enkelstrengs transcripten worden gegenereerd door de splitsing van grotere voorlopers met behulp van de C. elegans versie van Dicer.

Ze handelen door ofwel te vernietigen of remmende vertaling van verschillende boodschapper-RNA's in de worm (meestal door binding aan een gebied met een complementaire sequentie in het 3'-niet-vertaalde gebied [3'-UTR] van het mRNA).

De microRNA's (miRNA's) in C. elegans (die eerst "kleine temporale RNA's" werden genoemd) blijken vertegenwoordigers te zijn van een grote klasse RNA's die worden gecodeerd door de eigen genen.

  • Het initiële product van gentranscriptie is een groot molecuul genaamd pri-miRNA.
  • Terwijl nog steeds in de kern een enzym genaamd Drosher knipt het pri-miRNA in een kortere molecule (~ 70 nucleotiden) genaamd pre-miRNA.
  • Het pre-miRNA wordt geëxporteerd naar het cytosol waar het wordt gesplitst (door Dicer bij dieren) in het miRNA.

MicroRNA's

  • komen voor in alle dieren (mensen genereren zo'n 1000 miRNA's) en planten, maar niet in schimmels.
  • bevatten 19-25 nucleotiden;
  • zijn gecodeerd in het genoom
    • sommige door op zichzelf staande genen (die kunnen coderen voor verschillende miRNA's)
    • sommige door delen van een intron van het gen waarvan ze het mRNA zullen reguleren.
  • kan worden uitgedrukt in
    • alleen bepaalde celtypen en
    • alleen op bepaalde momenten in de differentiatie van een bepaald celtype.

Hoewel direct bewijs van de functie van veel van deze nieuw ontdekte genproducten nog moet worden ontdekt, reguleren ze genexpressie door het reguleren van boodschapper-RNA (mRNA), ofwel

  • het mRNA vernietigen wanneer de sequenties exact overeenkomen (de gebruikelijke situatie in planten) of
  • haar onderdrukken vertaling wanneer de sequenties slechts een gedeeltelijke overeenkomst zijn. In dit laatste geval zijn waarschijnlijk meerdere miRNA's nodig om gelijktijdig in de 3'-UTR te binden.

MicroRNA's hebben twee eigenschappen die hiervoor bij uitstek geschikt zijn:

  • Omdat ze zo klein zijn, kunnen ze snel worden getranscribeerd vanuit hun genen.
  • Ze hoeven niet te worden vertaald in een eiwitproduct om te kunnen werken (in tegenstelling tot bijvoorbeeld transcriptiefactoren).

MicroRNA's reguleren (onderdrukken) expressie van genen ook bij zoogdieren. Genoomanalyse heeft duizenden menselijke genen aan het licht gebracht waarvan de transcripten (mRNA's) bevatten sequenties waaraan een of meer van onze miRNA's kunnen binden. Waarschijnlijk kan elk miRNA aan wel 200 verschillende mRNA-doelen binden, terwijl elk mRNA bindingsplaatsen heeft voor meerdere miRNA's. Een dergelijk systeem biedt veel mogelijkheden voor gecoördineerde mRNA-translatie.

Een studie gerapporteerd in Natuur (Lim, et al., 433: 769, 17 Feb 2005) gebruikte DNA-chipanalyse om aan te tonen dat wanneer een bepaald miRNA tot expressie werd gebracht in HeLa-cellen,

  • een miRNA dat normaal tot expressie wordt gebracht in de hersenen, onderdrukte de mRNA-productie door 174 verschillende genen, terwijl
  • een miRNA dat normaal tot expressie wordt gebracht in hart- en skeletspieren onderdrukte mRNA-productie door 96 genen - op 8 na allemaal anders dan die onderdrukt door het miRNA in de hersenen.

Naarmate het werk op dit gebied snel vordert, begint het patroon te ontstaan ​​dat:

  • Veel genen - vooral die die betrokken zijn bij dergelijke huishoudelijke activiteiten (bijvoorbeeld cellulaire ademhaling) die alle cellen gemeen hebben - hebben geen 3'-UTR's die kunnen worden geblokkeerd door een van de miRNA's die in het genoom worden gecodeerd.
  • De genen die tot expressie moeten komen in een bepaald type gedifferentieerde cel en/of op een bepaald moment in het leven van die cel
    • brengen geen van de miRNA-genen tot expressie die hun expressie zouden kunnen blokkeren, maar
    • brengen miRNA-genen tot expressie die de expressie van andere genen blokkeren voor gespecialiseerde functies die op dat moment niet geschikt zouden zijn in die cel.
  • In plaats van eenvoudige schakelaars te zijn die genexpressie in- of uitschakelen, lijken miRNA's een subtieler effect uit te oefenen - het verhogen of verlagen van het niveau van genexpressie (zoals eiwittranscriptiefactoren doen).

Dus onderdrukking van genexpressie door miRNA's lijkt een mechanisme te zijn om gereguleerde en gecoördineerde genexpressie te verzekeren, aangezien cellen langs bepaalde paden differentiëren. Wanneer bijvoorbeeld zygote-genen in de blastula van de zebravis beginnen te worden ingeschakeld, codeert een van hen voor een miRNA dat de vernietiging van de maternale mRNA's veroorzaakt die tot dan toe de oorzaak waren.

Dus miRNA's kunnen een even belangrijke rol spelen als transcriptiefactoren bij het reguleren en coördineren van de expressie van meerdere genen in een bepaald type cel op bepaalde tijden.

Therapeutische miRNA's?

Het gemak waarmee miRNA's in cellen kunnen worden geïntroduceerd en hun wijdverbreide effecten op genexpressie hebben de hoop gewekt dat ze nuttig kunnen zijn bij het beheersen van genetische aandoeningen, bijvoorbeeld kanker.

Tot op heden zijn sommige laboratoriumonderzoeken veelbelovend geweest.

  • Een miRNA dat de expressie van G . blokkeert1 en S-fase cyclinen - en zo de celcyclus op zijn weg stoppen - beschermen muizen tegen leverkanker.
  • een miRNA dat genen remt die nodig zijn voor metastase, onderdrukt de metastase van behandelde menselijke borstkankercellen.

Samenvatting

Naast eiwittranscriptiefactoren gebruiken eukaryoten klein RNA moleculen om genexpressie te reguleren - bijna altijd door het te onderdrukken - zo wordt het fenomeen genoemd RNA-uitschakeling.

Er zijn twee bronnen van kleine RNA-moleculen:

  • kleine interfererende RNA's (siRNAs)
    • Plantencellen maken deze van het dubbelstrengs RNA (dsRNA) van binnendringende virussen.
    • Wetenschappers en farmaceutische bedrijven maken deze als middelen om de expressie van specifieke genen uit te schakelen (RNA-interferentie of RNAi genoemd).
  • micro-RNA's (miRNAs)
    • Deze zijn gecodeerd in het genoom van alle planten en dieren.
  • Zowel siRNA's als miRNA's worden op dezelfde manier verwerkt in het cytosol van de cel.
    • Beide worden gegenereerd door Dicer.
    • Beide zijn opgenomen in een RNA-lverwekt safzweren Cingewikkeld (RISC).
      • Als de nucleotidesequentie van het kleine RNA exact overeenkomt met die van het mRNA, wordt het mRNA geknipt en vernietigd.
      • Als er slechts een gedeeltelijke overeenkomst is (meestal in zijn 3'-UTR), wordt translatie (d.w.z. eiwitsynthese) onderdrukt. Beide activiteiten vinden plaats in het cytosol - misschien in P-lichamen.
      • Voor sommige kleine RNA's gaat het RISC-complex echter de kern binnen en schakelt de transcriptie van het/de corresponderende gen(en) uit door
        • binding aan de afgewikkelde DNA-sequentie (of misschien het RNA-transcript terwijl het wordt gevormd)
        • het omzetten van euchromatine in heterochromatie
        • methylering van lysine-9 histon H3 in de nucleosomen rond het (de) gen(en)

Afgezien van hun gebruik als laboratorium - en misschien therapeutische - hulpmiddelen, zijn kleine RNA's duidelijk essentieel voor de organismen die ze maken.

Een paar voorbeelden:

  • Planten en dieren gebruiken ze om zich te verdedigen tegen virussen.
    • Voorbeeld: Wanneer menselijke cellen worden geïnfecteerd door het hepatitis C-virus (HCV), produceren ze miRNA's die interfereren met de genexpressie door dit RNA-virus en dus met zijn vermogen om te repliceren.
  • Sommige herpesvirussen gebruiken ze om hun gastheercel lang genoeg in leven te houden om virale replicatie te voltooien (door de immuunrespons van de gastheer tegen de geïnfecteerde cel af te zwakken en vroegtijdige dood door apoptose te voorkomen).
  • Van de 46 miRNA's die tot expressie worden gebracht in het Drosophila-embryo, is aangetoond dat 25 essentieel zijn voor een normale ontwikkeling.
  • Correcte embryonale ontwikkeling bij andere dieren (bijv. C. elegans, zebravissen, muizen) heeft ze ook nodig.
  • Ze beschermen tegen het gevaar van mutaties veroorzaakt door transposons die zich in het genoom verplaatsen.
  • Ze zijn ook nodig om de grootte van de pool van ten minste sommige soorten stamcellen te reguleren.
  • Transgene muizen met een enkel miRNA-gen uitgeschakeld ontwikkelen ernstige immunodeficiëntie die dendritische cellen, helper-T-cellen en B-cellen aantast.
  • Verminderde of geen expressie van bepaalde miRNA's zijn kenmerkend voor verschillende kankers bij mensen.

11.10: Antisense RNA - Biologie

RNA-antisense-zuivering gevolgd door DNA-sequencing is een methode om de genomische DNA-doelplaatsen van een bepaald lncRNA in kaart te brengen. We hebben RAP ontworpen om specifieke zuivering van chromatine geassocieerd met een doel-lncRNA mogelijk te maken, het in kaart brengen van de geassocieerde DNA-doellocaties met hoge resolutie te bereiken na sequencing van het gevangen DNA, en elk lncRNA robuust vast te leggen met minimale optimalisatie.
RAP is ontwikkeld door Jesse Engreitz met hulp van Patrick McDonel, Alex Shishkin, Klara Sirokman en Christine Surka.

RNA Antisense Zuivering-RNA

RNA Antisense Purification gevolgd door RNA-sequencing is een methode om de RNA-interacties die optreden met een specifiek lncRNA (of andere RNA-soorten) in kaart te brengen. Met behulp van verschillende verknopingsmethoden kan deze benadering worden gebruikt om lncRNA-RNA-interacties te identificeren die plaatsvinden via eiwittussenproducten of door directe RNA-RNA-hybridisatie.

RNA Antisense Zuivering-Massaspectrometrie

[download RAP-MS-protocol]
RNA-antisense-zuivering met massaspectrometrie (RAP-MS) is een methode om een ​​lncRNA-complex in vivo te zuiveren en de direct interagerende eiwitten te identificeren door kwantitatieve massaspectrometrie. RAP-MS maakt gebruik van UV-verknoping om covalente koppelingen te creëren tussen direct interagerend RNA en eiwit en zuivert lncRNA's in denaturerende omstandigheden om niet-covalente interacties te verstoren.

RNAtag-volgorde

[download RNAtag Seq-protocol] [RNAtag Seq-gegevens]
RNAtag-Seq is een methode voor het genereren van een enkele RNA-Seq-bibliotheek uit een groot aantal onafhankelijk van een barcode voorziene RNA-monsters. Deze methode biedt zeer reproduceerbare, strengspecifieke, kwantitatieve sequencing die de volledige lengtes van transcripten in verschillende soorten dekt. Deze aanpak verhoogt de doorvoer aanzienlijk en verlaagt de kosten per monster van de RNA-Seq-bibliotheekconstructie.
Split-Pool-herkenning van interacties door tag-extensie (DNA)

Split-Pool Recognition of Interactions by Tag Extension (SPRITE) is een methode om genoombrede hogere-orde-interacties tussen DNA-moleculen in kaart te brengen.


Achtergrond

High-throughput-sequencing van DNA-fragmenten wordt gebruikt in een reeks kwantitatieve tests. Een gemeenschappelijk kenmerk van deze testen is dat ze grote hoeveelheden DNA-fragmenten sequensen die bijvoorbeeld het repertoire van RNA-moleculen van een biologisch systeem weerspiegelen (RNA-Seq [1, 2]) of de DNA- of RNA-interactiegebieden van nucleotide-bindende moleculen ( ChIP-Seq [3], HITS-CLIP [4]). Meestal worden deze uitlezingen toegewezen aan een klasse op basis van hun toewijzing aan een gemeenschappelijk gebied van het doelgenoom, waarbij elke klasse een doeltranscript vertegenwoordigt, in het geval van RNA-Seq, of een bindingsgebied, in het geval van ChIP-Seq . Een belangrijke samenvattende statistiek is het aantal reads in een klasse voor RNA-Seq, dit: lees telling bleek (tot een goede benadering) lineair gerelateerd te zijn aan de abundantie van het doeltranscript [2]. Interesse ligt in het vergelijken van leestellingen tussen verschillende biologische omstandigheden. In het eenvoudigste geval gebeurt de vergelijking apart, klasse voor klasse. We zullen de term gebruiken gen synoniem voor klasse, hoewel een klasse ook kan verwijzen naar bijvoorbeeld een transcriptiefactorbindingsplaats of zelfs een streepjescode [5].

We willen statistische tests gebruiken om te beslissen of, voor een bepaald gen, een waargenomen verschil in gelezen tellingen significant is, dat wil zeggen of het groter is dan wat zou worden verwacht, alleen vanwege natuurlijke willekeurige variatie.

Als reads onafhankelijk zouden worden bemonsterd uit een populatie met bepaalde, vaste fracties van genen, zouden de read-tellingen een multinomiale verdeling volgen, die kan worden benaderd door de Poisson-verdeling.

Daarom is de Poisson-verdeling gebruikt om te testen op differentiële expressie [6, 7]. De Poisson-verdeling heeft een enkele parameter, die op unieke wijze wordt bepaald door zijn gemiddelde variantie en alle andere eigenschappen volgen daaruit in het bijzonder, de variantie is gelijk aan het gemiddelde. Er is echter opgemerkt [1, 8] dat de aanname van de Poisson-verdeling te restrictief is: het voorspelt kleinere variaties dan wat in de gegevens wordt gezien. Daarom controleert de resulterende statistische test geen type I-fout (de kans op valse ontdekkingen) zoals geadverteerd. We laten voorbeelden hiervan later zien, in de discussie.

Om dit zogenaamde overdispersieprobleem aan te pakken, is voorgesteld om telgegevens te modelleren met negatieve binomiale (NB) distributies [9], en deze benadering wordt gebruikt in de edgeR pakket voor analyse van SAGE en RNA-Seq [8, 10]. De NB-verdeling heeft parameters die uniek worden bepaald door middel van μ en variantie σ 2 . Het aantal replica's in datasets van belang is echter vaak te klein om beide parameters, gemiddelde en variantie, voor elk gen betrouwbaar te schatten. Voor edgeR, namen Robinson en Smyth aan [11] dat gemiddelde en variantie gerelateerd zijn door: σ 2 = μ + αμ 2 , met een enkele evenredigheidsconstante α dat is gedurende het hele experiment hetzelfde en kan uit de gegevens worden geschat. Daarom hoeft voor elk gen slechts één parameter te worden geschat, waardoor deze kan worden toegepast op experimenten met kleine aantallen replica's.

In dit artikel breiden we dit model uit door meer algemene, gegevensgestuurde relaties van variantie en gemiddelde toe te staan, een effectief algoritme te bieden om het model aan te passen aan gegevens, en te laten zien dat het betere passingen biedt (Sectie Model). Als gevolg hiervan kan een meer evenwichtige selectie van differentieel tot expressie gebrachte genen over het dynamische bereik van de gegevens worden verkregen (paragraaf Testen op differentiële expressie). We demonstreren de methode door deze toe te passen op vier datasets (paragraaf Toepassingen) en bespreek hoe het zich verhoudt tot alternatieve benaderingen (Sectie conclusies).


Wijdverbreide activering van antisense-transcriptie van het gastheergenoom tijdens herpes simplex-virus 1-infectie

Achtergrond: Herpesvirussen kunnen een breed scala aan diersoorten infecteren. Herpes simplex-virus 1 (HSV-1) is een van de acht herpesvirussen die mensen kunnen infecteren en komt wereldwijd voor. Herpesvirussen hebben meerdere manieren ontwikkeld om de geïnfecteerde cellen aan hun behoeften aan te passen, maar kennis over deze transcriptionele en post-transcriptionele modificaties is schaars.

Resultaten: Hier laten we zien dat HSV-1 de expressie van ongeveer 1000 antisense-transcripten van het genoom van de menselijke gastheercel induceert. Een subset hiervan wordt ook geactiveerd door het nauw verwante varicella zoster-virus. Antisense-transcripten ontstaan ​​ofwel bij genpromoters of in het genlichaam, en ze vertonen een verschillende gevoeligheid voor de remming van vroege en onmiddellijke vroege virale genexpressie. Overexpressie van de belangrijkste virale transcriptiefactor ICP4 is voldoende om een ​​subset van antisense transcripten aan te zetten. Histonmarkeringen rond transcriptiestartplaatsen van HSV-1-geïnduceerde en constitutief getranscribeerde antisense-transcripten lijken sterk op elkaar, wat aangeeft dat de genetische loci al klaar zijn om deze nieuwe RNA's te transcriberen. Bovendien legt een antisense-transcript dat overlapt met het BBC3-gen (ook bekend als PUMA) deze krachtige inductor van apoptose in cis transcriptioneel tot zwijgen.

conclusies: We laten voor het eerst zien dat een virus wijdverbreide antisense-transcriptie van het gastheercelgenoom induceert. We leveren bewijs dat HSV-1 dit gebruikt om een ​​sterke inductor van apoptose te downreguleren. Onze bevindingen openen nieuwe perspectieven op globale en specifieke veranderingen van gastheerceltranscriptie door virussen.

trefwoorden: Antisense BBC3 Herpes ICP4 NFKB transcriptievirus lncRNA.

Belangenconflict verklaring

Toestemming voor publicatie
Concurrerende belangen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.

Opmerking van de uitgever

Springer Nature blijft neutraal met betrekking tot jurisdictieclaims in gepubliceerde kaarten en institutionele voorkeuren.

Figuren

Karakterisering van antisense transcripten. een…

Karakterisering van antisense transcripten. een Overzicht van RNA-sequencinggegevens die in dit onderzoek zijn gebruikt.…

Validatie van antisense transcripten. een…

Validatie van antisense transcripten. een Nanostring nCounter-assays: controles. RNA werd geïsoleerd uit...

Antisense-expressie met behulp van fosfonazijnzuur ...

Antisense-expressie met behulp van fosfonazijnzuur (PAA) en knock-outvirussen. een Vereenvoudigde fylogenetische boom…

Antisense-transcriptpromoters zijn al ...

Antisense-transcriptpromoters zijn al klaar voor transcriptie. een Antisense transcript inductie op...

Bewijs voor remming van het gevoel...

Bewijs voor remming van zintranscriptie door BBC3as. een FISH met één molecuul. HSV-1-geïnfecteerde cellen...


Lioliou E, Romilly C, Romby P, Fechter P. RNA-gemedieerde regulatie in bacteriën: van natuurlijke tot kunstmatige systemen. Nat Biotechnologie. 201027:222-35.

Wagner E, Flardh K. Antisense RNA's overal? Trends Genet. 200218:223-6.

Khorkova O, Myers A, Hsiao J, Wahlestedt C. Natuurlijke antisense transcripten. Hum Mol Gen. 201423:54-63.

Hindley J. Fractionering van 32P-gelabelde ribonucleïnezuren op polyacrylamidegels en hun karakterisering door vingerafdrukken. J Mol Biol. 196730: 125-36.

Vanhée-Brossollet C, Vaquero C. Zijn natuurlijke antisense-transcripten zinvol in eukaryoten? Gen. 1998211:1–9.

Lybecker M, Bilusic I, Raghavan R. Pervasieve transcriptie: het detecteren van functionele RNA's in bacteriën. Transcriptie. 20145:e944039.

Numata K, Okada Y, Saito R, Kiyosawa H, Kanai A, Tomita M. Vergelijkende analyse van door cis gecodeerde antisense-RNA's in eukaryoten. Gen. 2007392:134-41.

Goh S, Stach J, Good L. Antisense-effecten van PNA's in bacteriën. Methoden Mol Biol. 20141050:223-36.

Cho KH, Kim JH. Cis-gecodeerde niet-coderende antisense-RNA's in streptokokken en andere bacteriële pathogenen met een laag GC Gram (+) Front Genet. 20156:110-5.

Rasmussen LCV, Sperling-Petersen HU, Mortensen KK. Bacteriën raken in het hart van het centrale dogma: sequentiespecifieke remming. Microb cel feit. 20076:24–8.

Lapidot M, Pilpel Y. Genoombrede natuurlijke antisense-transcriptie: de regulatie ervan koppelen aan de verschillende regulerende mechanismen. EMB-rep. 20067: 1216–22.

Isaacs FJ, Dwyer DJ, Collins JJ. RNA synthetische biologie. Nat Biotechnologie. 200624:545-54.

Caldelari I, Chao Y, Romby P, Vogel J. RNA-gemedieerde regulatie in pathogene bacteriën. Cold Spring Harbor-perspectief in de geneeskunde 201319:123-9

Thomason MK, Bischler T, Eisenbart SK, Forstner KU, Zhang A, Herbig A, et al. Globale transcriptionele startplaatstoewijzing met behulp van differentiële RNA-sequencing onthult nieuwe antisense-RNA's in Escherichia coli. J Bacteriol. 2015197:18–28.

Duygu B, Poels EM, Da Costa Martins PA. Genetica en epigenetica van aritmie en hartfalen. Front Genet. 201330:202-4.

Wagner EG. Dood de boodschapper: bacterieel antisense-RNA bevordert mRNA-verval. Nat Struct Mol Biol. 200916:804-6.

Georg J, Hess WR. cis-antisense RNA, een ander niveau van genregulatie in bacteriën. Microbiol Mol Biol Rev. 201175:286–300.

Stazic D, Lindell D, Steglich C. Antisense-RNA beschermt mRNA tegen RNase E-degradatie door RNA-RNA-duplexvorming tijdens faaginfectie. Nuc Acids Res. 201139:4890–9.

Green PJ, Pines O, Inouye M. De rol van antisense-RNA bij genregulatie. Annu Rev Biochem. 198655: 569-97.

Guillier M, Gottesman S, Storz G. Het buitenmembraan moduleren met kleine RNA's. Genen Dev. 200620:2338–48.

Delihas N, Forst S. MicF: een antisense-RNA-gen dat betrokken is bij de reactie van Escherichia coli op globale stressfactoren. J Mol Biol. 2001313:1–12.

Faghihi MA, Wahlestedt C. Regelgevende rollen van natuurlijke antisense-transcripten. Nat Rev Mol Cell Biol. 200910:637–43.

Waters LS, Storz G. Regulerende RNA's in bacteriën. Cel. 2009136:615–28.

Kopf M, Klähn S, Scholz I, Hess WR, Voß B. Variaties in het niet-coderende transcriptoom als aanjager van divergentie tussen stammen en fysiologische aanpassing in bacteriën. Wetenschappelijke Rep. 20155:9560–7.

Mok WW, McManus SA, Li Y. Klein formaat, grote impact: bacteriële functionele nucleïnezuren en hun toepassingen. Chemische biologie van nucleïnezuren: Springer. 201440: 309-323.

Sharma CM, Vogel J. Differentiële RNA-seq: de achterliggende benadering en het verkregen biologische inzicht. Curr Opin Microbiol. 201419:97-105.

Thomason MK, Storz G. Bacteriële antisense RNA's: hoeveel zijn er en wat doen ze? Annu Rev Genet. 201044: 167–88.

Liu SR, Hu CG, Zhang JZ. Regulatory effects of cotranscriptional RNA structure formation and transitions. Wiley interdiscip rev RNA. 201647:503–27.

Lasa I, Toledo-Arana A, Dobin A, Villanueva M, De Los Mozos IR, Vergara-Irigaray M, et al. Genome-wide antisense transcription drives mRNA processing in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011108:20172–7.

Yang Z, Jin X, Rao X, Hu FA. Natural antisense transcript regulates mucD gene expression and biofilm biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. microbiologisch. 201180:768–74.

Wagner EGH, Simons RW. Antisense RNA control in bacteria, phages, and plasmids. Annu Rev Microbiol. 199448:713–42.

Chen S, Zhang A, Blyn LB, Storz G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. J Bacteriol. 2004186:6689–97.

Sillers R, Al-Hinai MA, Papoutsakis ET. Aldehyde-alcohol dehydrogenase and/or thiolase overexpression coupled with CoA transferase downregulation lead to higher alcohol titers and selectivity in Clostridium acetobutylicum fermentations. Biotechnol Bioeng. 2009102:38–49.

Wagner EGH, Altuvia S, Romby P. 12 Antisense RNAs in bacteria and their genetic elements. Adv Genet. 200246:361–98.

Faridani OR, Nikravesh A, Pandey DP, Gerdes K, Good L. Competitive inhibition of natural antisense Sok-RNA interactions activates Hok-mediated cell killing in Escherichia coli. Nucleïnezuren Res. 200634:5915–22.

Kawano M, Aravind L, Storz G. An antisense RNA controls synthesis of an SOS-induced toxin evolved from an antitoxin. Mol Microbiol. 200764:738–54.

Kawano M. Divergently overlapping cis-encoded antisense RNA regulating toxin-antitoxin systems from E. coli: hok/sok, ldr/rdl, symE/symR. RNA Biol. 20129:1520–7.

Moghaddam MM, Khodi S, Mirhosseini A. Quorum Sensing in Bacteria and a Glance on Pseudomonas aeruginosa. Clin Microbial. 20143:1–10.

Aghamollaei H, Moghaddam MM, Kooshki H, Heiat M, Mirnejad R, Barzi NS. Detection of Pseudomonas aeruginosa by a triplex polymerase chain reaction assay based on lasI/R and gyrB genes. J Infec Public Health. 20158:314–22.

Romby P, Vandenesch F, Wagner EGH. The role of RNAs in the regulation of virulence-gene expression. Curr Opin Microbiol. 20069:229–36.

Liu JM, Camilli A. A broadening world of bacterial small RNAs. Curr Opin Microbiol. 201013:18–23.

Courtney C, Chatterjee A. cis-Antisense RNA and Transcriptional Interference: Coupled Layers of Gene Regulation. J Gene Ther. 20142:9–15.

Papenfort K, Vogel J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Celgastheermicrobe. 20108:116–27.

Delihas N. Regulation of gene expression by trans-encoded antisense RNAs. Mol Microbiol. 199515:411–4.

Gottesman S. The small RNA regulators of Escherichia coli: roles and mechanisms. Annu Rev Microbiol. 200458:303–28.

Qin D, Xu C. Study strategies for long non-coding RNAs and their roles in regulating gene expression. Cell Mol Biol Letters. 201520:323–49.

Wahlestedt C. Natural antisense and noncoding RNA transcripts as potential drug targets. Drug Discov Today. 200611:503–8.

Wall ME, Hlavacek WS, Savageau MA. Design of gene circuits: lessons from bacteria. Nat Rev Genet. 20045:34–42.

Kemmer C, Neubauer P. Antisense RNA based down-regulation of RNaseE in E. coli. Microb Cell Fact. 20065:38–44.

Tummala SB, Junne SG, Papoutsakis ET. Antisense RNA Downregulation of Coenzyme A Transferase Combined with Alcohol-Aldehyde Dehydrogenase Overexpression Leads to Predominantly Alcohologenic Clostridium acetobutylicum Fermentations. J Bacteriol. 2003185:3644–53.

Desai RP, Papoutsakis ET. Antisense RNA strategies for metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum. Appl Environ Microbiol. 199965:936–45.

Bouazzaoui K, LaPointe G. Use of antisense RNA to modulate glycosyltransferase gene expression and exopolysaccharide molecular mass in Lactobacillus rhamnosus. J Microbiol Methods. 200665:216–25.

Sturino JM, Klaenhammer TR. Engineered bacteriophage-defence systems in bioprocessing. Nat Rev Microbiol. 20064:395–404.

Ghafourian S, Raftari M, Sadeghifard N, Sekawi Z. Toxin-antitoxin systems: classification, biological function and application in biotechnology. Curr Issues Mol Biol. 20146:9–14.

Alessandra S, Flavio S. BMB reports: Artificial antisense RNAs silence LacZ in E. coli by decreasing target mRNA concentration. Biochem Mol Biol Rep. 200841:568–84.

Singh SB, Phillips JW, Wang J. Highly sensitive target-based whole-cell antibacterial discovery strategy by antisense RNA silencing. Curr Opin Drug Discov Dev. 200710:160–5.

Genilloud O. The re-emerging role of microbial natural products in antibiotic discovery. Antonie Van Leeuwenhoek. 2014106:173–88.

Nikravesh A, Dryselius R, Faridani OR, Goh S, Sadeghizadeh M, Behmanesh M, et al. Antisense PNA accumulates in Escherichia coli and mediates a long post-antibiotic effect. Mol Ther. 200715:1537–42.

Ji Y, Yin D, Fox B, Holmes DJ, Payne D, Rosenberg M. Validation of antibacterial mechanism of action using regulated antisense RNA expression in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett. 2004231:177–84.

Good L, Stach JE. Synthetic RNA silencing in bacteria – antimicrobial discovery and resistance breaking. Front Microbiol. 20112:185–94.

Liang JC, Bloom RJ, Smolke CD. Engineering biological systems with synthetic RNA molecules. Mol cel. 201143:915–26.

Hong P, Li W, Li J. Applications of aptasensors in clinical diagnostics. Sensors. 201212:1181–93.

Said N, Rieder R, Hurwitz R, Deckert J, Urlaub H, Vogel J. In vivo expression and purification of aptamer-tagged small RNA regulators. Nucleïnezuren Res. 200937:e133.

Wu Z, Liu X, Liu L, Deng H, Zhang J, Xu Q, et al. Regulation of lncRNA expression. Cell Mol Biol Lett. 201419:561–75.

Qi L, Lucks JB, Liu CC, Mutalik VK, Arkin AP. Engineering naturally occurring trans-acting non-coding RNAs to sense molecular signals. Nucleïnezuren Res. 201240:5775–86.

Neupert J, Karcher D, Bock R. Design of simple synthetic RNA thermometers for temperature-controlled gene expression in Escherichia coli. Nucleïnezuren Res. 200836:e124.

Lavelle C, Busi F, Arluison V. Multiple Approaches for the Investigation of Bacterial Small Regulatory RNAs Self- assembly. RNA Nanotechnology and Therapeutics: Springer. 201510:21–42.

Saragliadis A, Krajewski SS, Rehm C, Narberhaus F, Hartig JS. Thermozymes: Synthetic RNA thermometers based on ribozyme activity. RNA Biol. 201310:1009–16.

Neupert J, Bock R. Designing and using synthetic RNA thermometers for temperature-controlled gene expression in bacteria. Nat Protoc. 200949:1262–73.

Waldminghaus T, Kortmann J, Gesing S, Narberhaus F. Generation of synthetic RNA-based thermosensors. Biol Chem. 2008389:1319–26.

Hebert CG, Valdes JJ, Bentley WE. Beyond silencing--engineering applications of RNA interference and antisense technology for altering cellular phenotype. Curr Opin Biotechnologie. 200819:500–5.

Chang TH, Wu LC, Lin JH, Huang HD, Liu BJ, Cheng KF, et al. Prediction of small non-coding RNA in bacterial genomes using support vector machines. Expert Syst Appl. 201037:5549–57.

Song Y, Hahn T, Thompson IP, Mason TJ, Preston GM, Li G, et al. Ultrasound-mediated DNA transfer for bacteria. Nucleïnezuren Res. 200735:e129.

Luo D, Saltzman WM. Synthetic DNA delivery systems. Nat Biotechnologie. 200018:33–7.

Järver P, Coursindel T, Andaloussi SE, Godfrey C, Wood MJ, Gait MJ. Peptide-mediated cell and in vivo delivery of antisense oligonucleotides and siRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 20121:e27.

Saei AA, Barzegari A, Majd MH, Asgari D, Omidi Y. Fe3O4 nanoparticles engineered for plasmid DNA delivery to Escherichia coli. J Nanopart Res. 201416:1–11.

Heiat M, Aghamollaei H, Moghaddam MM, Kooshki H. Using CM11 peptide as a cell Permeable agent for the Improvement of conventional plasmid transformation methods in Escherichia coli and Bacillus subtilis. Minerva Biotecnol. 201426:149–57.

Shepherd J, Ibba M. Bacterial transfer RNAs. FEMS Microbiol Rev. 201539:280–300.


RNA interference (RNAi)

In testing the effects of antisense RNA, one should use sense RNA of the same coding region as a controle. Surprisingly, preparations of sense RNA often turn out to be as effective an inhibitor as antisense RNA.

Waarom? It seems that the preparations of sense RNA often are contaminated with hybrids: sense and antisense strands that form a double helix of double-stranded RNA (dsRNA). Double-stranded RNA corresponding to a particular gene is a powerful suppressant of that gene. In fact, the suppressive effect of antisense RNA probably also depends on its ability to form dsRNA (using the corresponding mRNA as a template).

The ability of dsRNA to suppress the expression of a gene corresponding to its own sequence is called RNA-interferentie (RNAi). It is also called post-transcriptional gene silencing of PTGS.

Small interfering RNAs (siRNAs)

  • 21 nucleotides. These bind to complementary sequences on mRNA molecules cutting the molecule apart.
  • 22 nucleotides. These block translation of mRNA molecules.
  • 24 nucleotides. These mediate the methylation of DNA.

In each case, the two strands of each fragment separate &mdash releasing the antisense strand. With the aid of a protein, both 21-nt and 22-nt molecules bind to a complementary sense sequence on a molecule of mRNA. If the base-pairing is exact, the mRNA is destroyed (21-nt) or its translation inhibited (22-nt). In all three cases, the result is inhibition of gene expression.

Because of their action, these fragments of RNA have been named "small (or short) interfering RNA" (siRNA).

The complex of siRNA and protein is called the "RNA-lnduced silencing Complex" (RISC).

SiRNAs can also interfere with transcription

There is growing evidence that siRNAs can also inhibit the transcription of genes

  • perhaps by binding to complementary sequences on DNA of
  • perhaps by binding to the nascent RNA transcript as it is being formed.

How these siRNAs &mdash synthesized in the cytosol &mdash gain access to the DNA in the nucleus is unknown.

Synthetic siRNA molecules that bind to gene promoters can &mdash in the laboratory &mdash repress transcription of that gene. The repression is mediated by methylation of the DNA in the promoter and, perhaps, methylation of histones in the vicinity.

There is a strain of rice (LGC-1) that produces abnormally low levels of proteins called glutelins. It turns out that of several glutelin genes found in rice

  • two closely-similar glutelin genes are located back to back on the same chromosome.
  • In LGC-1, a deletion has occurred between the two genes which removes the signal that would normally stop transcription after the first gene.
  • Thus RNA polymerase II transcribes right past the first gene and on into the second.
  • The result is a messenger RNA with almost-identical sequences running in opposite directions.
  • This causes the mRNA to fold up into a molecule of double-stranded RNA (dsRNA).
  • A Dicer-like enzyme cuts up the dsRNA into small interfering RNAs (siRNAs) that suppress further transcription of those genes as well as other glutelin genes.

Why RNAi?

RNAi has been found to operate in such diverse organisms as plants, fungi, and animals such as Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, and even mice and the zebrafish. Such a universal cell response must have an important function. Wat kan het zijn?

  • Some viruses of both plants and animals have a genome of dsRNA. And many other viruses of both plants and animals have an RNA genome that in the host cell is briefly converted into dsRNA [link to examples]. So RNAi may be a weapon to counter infections by these viruses by destroying their mRNAs and thus blocking the synthesis of essential viral proteins. may be transcribed into RNA molecules with regions that are double-stranded. RNAi could then destroy these.
  • RNA interference may be the unexpected dividend of another basic process of controlling gene expression discussed below.

RNAi as a tool

In any case, the discovery of RNAi adds a promising tool to the toolbox of molecular biologists. Introducing dsRNA corresponding to a particular gene will knock out the cell's own expression of that gene. (Feeding C. elegans Aan E coli manufacturing the dsRNA will even do the trick.)

In the 24 March 2005 issue of Natuur, Sönnichsen et al reported that they have injected dsRNAs corresponding to 20,326 of C. elegans's genes (98% of the total!) and monitored the effect of each on embryonic development from the completion of meiosis (following fertilization) through the second mitotic division that produces the 4-cell embryo.

(Another thousand genes produced phenotypic effects that were seen at later stages of development.)

Because RNAi can be done in particular tissues at a chosen time, it often provides an advantage over conventional gene "knockouts" where the missing gene is carried in the germline and thus whose absence may kill the embryo before it can be studied.

Another Example: screening genes for their effect on drug sensitivity

  • Distribute your cells in thousands of wells and add &mdash from a "library" of thousands of siRNAs representing the entire genome &mdash siRNA molecules targeting the expression of one gene to each well.
  • Add the drug to all the wells.
  • See which wells have cells that respond.

Some other promising applications of RNAi

In mammalian cells, introducing dsRNA fragments only reduces gene expression temporarily. However, mammalian cells can be infected with a DNA vector that encodes an RNA molecule of 50&ndash80 nucleotides called a "small hairpin RNA" (shRNA) containing a sequence corresponding to the gene that one wishes to suppress. As the shRNA is synthesized, dicer converts it into a typical siRNA molecule. Because the cell can continuously synthesize shRNA, the interference is long-lasting. In fact, with vectors that become integrated in the host genome, RNAi can be passed on to the descendants.

The 19 June 2003 issue of Natuur reported on coffee plants that were engineered to express a transgene that makes siRNA that interferes &mdash by RNAi &mdash with the expression of a gene needed to make cafeïne. So perhaps "decaf" coffee will one day no longer require the chemical removal of caffeine from coffee beans.

Monsanto has received approval to market transgenic corn (maize) that expresses a dsRNA corresponding to the sequence of an essential gene in the western corn rootworm, a devastating pest of the crop. After ingesting this dsRNA, the insect's own cells process it into an siRNA that targets the gene's mRNA for destruction and kills the worm in a few days.

Amplification of RNAi

In C. elegans, plants, and neurospora, the introduction of a few molecules of dsRNA has a potent and long-lasting effect. In plants, the gene silencing spreads to adjacent cells (through plasmodesmata) and even to other parts of the plant (through the phloem). RNAi within a cell can continue after mitosis in the progeny of that cell. Triggering of RNAi in C. elegans can even pass through the germline into its descendants.

Such amplification of an initial trigger signal suggests a catalytic effect. It turns out that these organisms have RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) that uses the mRNA targeted by the initial antisense siRNA as a template for the synthesis of more siRNAs. Synthesis of these "secondary" siRNAs even occurs in adjacent regions of the mRNA. So not only can these secondary siRNAs target additional areas of the original mRNA, but they are potentially able to silence mRNAs of other genes that may carry the same sequence of nucleotides.

  • may complicate the interpretation of gene suppression experiments as the expression of other genes may be suppressed in addition to the target gene
  • raises a warning flag for the use of RNAi to suppress single genes in human therapy (although RdRPs and amplification have not been observed in mammalian cells).

RNAi in human therapy

Because its target is so specific, the possibility of using RNAi to shut down the expression of a single gene has created great excitement that a new class of therapeutic agents is on the horizon.

Recently (10 August 2018) the U. S. FDA approved its first siRNA drug. Patisiran (Onpattro®) will be used to treat the genetic disorder hereditary transthyretin-mediated amyloidosis.

Transthyretin is a serum protein synthesized in the liver which transports retinol (vitamin A) and thyroxin in the blood. Mutations in the gene encoding transthyretin can produce a modified protein with a propensity to clump into aggregates causing amyloid deposits which damage nerves and other tissues.

The patisiran siRNA binds to the transthyretin messenger RNA (mRNA) interfering with its translation and thus the synthesis of the mutated version of transthyretin. Patients treated with patisiran showed marked improvement of their signs and symptoms. (However, they often needed to take vitamin A supplements.)

Patisiran is likely going to be the first of many siRNA-mediated therapies. Many clinical trials are currently underway exploring the use of siRNA molecules in the treatment of a wide variety of diseases. Een voorbeeld:

A siRNA that binds to the messenger RNA from which a protein designated PCSK9 is translated reduces the level of low-density lipoproteins (LDLs, "bad" cholesterol) in the circulation. PCSK9 is a serine protease which binds to the complex of LDL and its receptor (LDLR) promoting the degradation of the receptor within the cell. With fewer LDL receptors returning to the cell surface [View] to remove more LDLs, the level of LDLs in the blood rises. By reducing the synthesis of PCSK9 within the cell, the siRNA brings down the concentration of "bad" cholesterol in the blood potentially reducing the risk of heart attacks and other cardiovascular problems.

Another approach: Antisense oligonucleotides (ASOs) are synthetic molecules that &mdash because they, too, are antisense &mdash also block mRNA translation. Several have been approved for human therapy. [Link]


Programme

Welcome from the organisers: EMBL and IIT
Host: Mehrnoosh Rayner, Head of Alumni Relations, EMBL

  • Giorgio Metta, Scientific Director, IIT, Genoa
  • Cornelius Gross, Interim Head & Senior Scientist, EMBL Rome, Monterotondo
  • Stefano Gustincich, Associate Director for Technologies for Life Science (LifeTech) &ndash Director Central RNA Lab at IIT, Genoa

Session 1: Non-coding RNAs in Health and Disease
Host: Irene Bozzoni, Professor, IIT & Sapienza University, Rome

  • Ana Boskovic, Group Leader, EMBL Rome
    &ldquoSmall RNAs-transferring information between generators&rdquo
  • Gian Gaetano Tartaglia, Group Leader, IIT, Genoa & Sapienza University, Rome
    &ldquoNon-coding RNAs and phase separation rule the world&rdquo
  • Adrian Krainer, St. Giles Foundation Professor & Deputy Director of Programs, CSHL Cancer Research Center Cold Spring Harbor Laboratory
    &ldquoFrom Base Pairs to Bedside: Antisense Modulation of RNA Splicing&rdquo
  • Mara Maldotti, Postdoc, University of Turin
    "The acetyltransferase p300 is recruited to enhancers by lncRNAs via triple
    helix formation"
  • Michela A. Denti, Associate Professor, University of Trento
    &ldquoA therapeutic approach for 4R tauopathies based on siRNAs switching Tau
    splicing isoforms&rdquo
  • Sara Formichetti, Ph.D Student, EMBL Rome
    &ldquoThe role of O-GlcNAcylation in mammalian transcriptional regulation&rdquo
  • Jacopo Manigrasso, Ph.D Student, IIT
    &ldquoFunctional Dynamics of Pre-mRNA Splicing Unveiled at Atomic Resolution&rdquo
  • Eleonora Perego Postdoc, IIT
    &ldquoFluorescence Fluctuation Spectroscopy with a SPAD array detector to
    unravel the dynamics of RNA in living cells&rdquo
  • Carmela Rubolino, Postdoc, IIT
    &ldquoTarget-Directed miRNA degradation in breast cancer&rdquo
  • Gloria Ferrari Bravo, PhD Student, University of Trieste
    &ldquoAn evolutionarily conserved pathway dependent on the prolyl-isomerase PIN1 protects the genome&rdquo
  • Iain Mattaj, Director, Human Technopole, Milan (EMBL Director General, 2005-2018)
    &ldquoHow RNA got me to Human Technopole

Session 2: RNA in Disease Prevention and Therapy - part 1
Host: Juergen Bauer, Deputy Managing Director, EMBLEM, Heidelberg

  • Ennio De Gregorio, Head of Research & Development Center, GSK Vaccines, Siena
    (EMBL Predoctoral Fellow, 1996-1999)
    &ldquoRNA vaccine platforms&rdquo
  • Lucia Faccio, Partner, Sofinnova-Telethon Fund, Sofinnova Partners, Milan
    &ldquoSofinnova Partners: two decades of investment in outstanding Italian science&rdquo

Session 2: RNA in Disease Prevention and Therapy - part 2
Host: Juergen Bauer, Deputy Managing Director, EMBLEM, Heidelberg

  • Patrick Baumhof, VP Formulation & Delivery, Curevac, Tübingen
    &ldquomRNA based therapeutics: SARS-CoV-2 vaccine CVnCoV&rdquo

Panel discussion: RNA in Disease Prevention and Therapy
Moderator: Alfredo Nicosia, Professor, University of Naples (EMBL Postdoc, 1986-1990, Heidelberg)

  • Irene Bozzoni, Professor, IIT & Sapienza University, Rome
  • Ennio De Gregorio, GSK Vaccines, Siena
  • Juergen Bauer, EMBLEM, Heidelberg
  • Stefano Gustincich, IIT, Genova
  • Cristian Jung, Dementia Discovery Fund, London
  • Patrick Baumhof, Curevac, Tübingen

afsluitend Remarks

  • Stefano Gustincich, Associate Director for Technologies for Life Science (LifeTech), Director Central RNA Lab at IIT, Genoa
  • Cornelius Gross, Interim Head of EMBL Rome, Monterotondo

Mode of Action of Antisense RNA | Genetica

In this article we will discuss about the mode of action of antisense RNA.

Several possible mechanisms are involved during antisense inhibition of specific gene. Following are some of the most promising mode of actions have been suggested (Fig. 22.3).

Action in the Nucleus Premise:

One of the earliest methods in antisense inhibition is carried out by blocking transcription. This happens to be within nuclear premise. It was shown that transcribed antisense RNA can have influential role in interfering RNA processing stage. Successful interferences are inflicted by blocking splicing of the mRNA. Thus, unspliced RNA or unprocessed RNA itself is not in a position to move out from nuclear premise and enter for translation process.

Formation of RNA-RNA duplex due to binding of sense and antisense transcript is quite unstable and are susceptible to be attacked by nuclease. Degradation of duplex RNA is then inevitable. In addition, duplex state of RNA hinder the processing or easy transport of sense mRNA across the nuclear membrane.

Action in Cytoplasmic Premise:

RNA-RNA duplex may sometime escape from nuclear premise without being killed by nucleases. Inside the cytoplasm inhibition may also occur at translation stage when antisense transcript would compete with the ribosomes to bind specifically at 5′ end of the sense RNA (mRNA).

Generally, ribosomes are assembled on single-stranded mRNA and initiates translation. But binding of sense and antisense RNA (RNA duplex) completely prevents ribosome assembly on RNA duplex molecule in duplex status or assembled ribosomes cannot move along with duplex RNA. Therefore, completely arrest the translation process.

Binding of antisense RNA to target mRNA at specific sequence play a role in inhibiting translation process. While constructing artificial antisense gene on several occasions, a small fragment containing Shine—Dalgarno sequence for ribosome binding and the coding region will be inserted into expression vector into opposite orientation.

The resulting gene yields antisense RNA that is complementary to the ribosome binding site region of the mRNA. A shorter, antisense RNA lacking most of the sequence complementary to the 5′ leader region of the mRNA was found to be less effective. These results clearly indicated to be importance of 5′ untranslated complementarity and/or the length of the complementary region in antisense RNA activity.

Further support for such evidence comes from the finding that cells engineered to produce antisense RNA complementary to the 5′ region of the tetracycline mRNA than controlled cultures. The extent of antisense RNA length and amino terminal complementarity appear to be correlated with high inhibition levels. Similarly, in the case of CAT antisense RNA, the RNAs complementary to the 5′ end of the target mRNA was more effective.


The Genetics of Circadian Rhythms

Patricia L. Lakin-Thomas , . Stuart Brody , in Advances in Genetics , 2011

1 frq antisense RNA

Two antisense transcripts from the frq locus have been identified, and their roles in regulating frq expression have been investigated ( Kramer et al., 2003 ). Antisense frq RNA is rhythmically produced, but in antiphase to sense RNA, and its transcription is light induced. This light induction requires the WCC, which directly binds to the promoter of the antisense RNA following a short light pulse ( Smith et al., 2010 ). When antisense frq expression is abolished, there is a delay in the expression of sense frq and a similar delay in the onset of the conidiation rhythm. The most dramatic effect is an increased response to phase resetting by light of the conidiation rhythm in the strains without antisense frq ( Kramer et al., 2003 ). Antisense frq therefore seems to oppose the function of sense frq in the light response and may play a role in moderating the level of frq expression ( Crosthwaite, 2004 ).


Role of RNA in Biology

RNA, in one form or another, touches nearly everything in a cell. RNA carries out a broad range of functions, from translating genetic information into the molecular machines and structures of the cell to regulating the activity of genes during development, cellular differentiation, and changing environments.

RNA is a unique polymer. Like DNA, it can bind with great specificity to either DNA or another RNA through complementary base pairing. It can also bind specific proteins or small molecules, and, remarkably, RNA can catalyze chemical reactions, including joining amino acids to make proteins.

All the RNA in cells are themselves copies of DNA sequences contained in the genes of a cell's chromosomes. Genes that are copied—"transcribed"—into the instructions for making individual proteins are often referred to as "coding genes." The genes that produce RNAs used for other purposes are therefore called "noncoding RNA" genes.

RNA molecules assemble proteins and modify other RNAs

Several key classes of RNA molecules help convert the information contained in the cell's DNA into functional gene products like proteins. Messenger RNAs (mRNAs) are copies of individual protein-coding genes, and serve as an amplified read-out of each gene's nucleic acid sequence. Two key noncoding RNAs participate in the assembly of the proteins specified by mRNAs. Ribosomal RNA (rRNA) constitutes the core structural and enzymatic framework of the ribosome, the machine that synthesizes proteins according to the instructions contained in the sequence of an mRNA. Transfer RNAs (tRNAs) use complementary base pairing to decode the three-letter "words" in the mRNA, each corresponding to an amino acid to be sequentially incorporated into a growing protein chain.

Most RNA molecules, once transcribed from the chromosomal DNA, require structural or chemical modifications before they can function. In eukaryotic cells, mRNAs are assembled from longer RNA transcripts by the spliceosome, which consists of spliceosomal RNAs and protein partners. Spliceosomal RNAs help discard intervening sequences (introns) from pre-mRNA transcripts and splice together the mRNA segments (exons) to create what can be a complex assortment of distinct protein-coding mRNAs from a single gene. Many noncoding RNAs also require post-transcriptional modifications. For instance, ribosomal RNAs receive numerous chemical modifications that are required for proper ribosome assembly and function. These modifications are introduced by protein enzymes in conjunction with specialized noncoding RNAs (called snoRNAs) that base pair with the rRNA and guide the modifying enzymes to precise locations on the rRNA.

Some RNAs possess intrinsic enzymatic activity and can directly catalyze RNA modification reactions. These catalytic RNAs include certain self-splicing RNA transcripts, ribozymes, and RNAse P, an RNA enzyme that trims the ends of tRNA precursors in essentially all cells.

RNA molecules regulate gene expression

Regulation of the production of proteins from coding genes is the basis for much of cellular and organismal structure, differentiation, and physiology. Diverse classes of noncoding RNAs participate in gene regulation at many levels, affecting the production, stability, or translation of specific mRNA gene products.

In prokaryotes (for example, bacteria), small antisense RNAs exert a variety of gene regulatory activities by base pairing specifically to their target mRNAs. Also common in prokaryotes are riboswitches, noncoding RNA sequences that usually function as regulatory domains contained within longer mRNAs. Riboswitches regulate the activity of their host mRNAs by binding to small molecules such as nucleotides or amino acids, sensing the abundance of those small molecules and regulating the genes that make or use them accordingly.

Eukaryotic cells contain thousands of small RNAs associated with various RNA interference (RNAi) pathways. For example, microRNAs (miRNAs) are regulatory RNAs approximately 22 nt long that are produced from longer transcripts that contain a certain kind of double-stranded "hairpin" structure. miRNAs associate with a protein of the Argonaute class, and base-pair specifically to mRNAs to inhibit their stability or translation. There are hundreds of miRNA genes in plants and animals, and each miRNA can regulate the activity of hundreds of protein-coding genes. Therefore, miRNAs individually and collectively have a profound impact on the development and physiology of multicellular eukaryotes.

Small interfering RNAs (siRNAs) are similar in length to microRNAs and are also associated with Argonaute proteins. Unlike miRNAs, which are produced from specific genetic loci that have evolved to regulate mRNAs, siRNAs can derive from essentially any transcribed region of the genome. siRNAs typically act directly upon the locus from which they are produced. So, siRNAs occur in cells where genes are under ongoing self-regulation by RNAi.
A major role for certain classes of small noncoding RNAs is defense of the cell against viruses, transposons, and other nucleic acid sequences that pose a potential threat to cellular homeostasis or genome stability. The response of some cells against viral infection includes the production of siRNAs complementary to the virus. Many endogenous siRNAs in eukaryotic cells specify the silencing of transposons and repeat sequences that are already resident in the genome. Similarly, in animals the Piwi-associated RNAs (piRNAs) promote genome integrity by silencing transposons and repeat sequences.

Another class of regulatory RNA consists of diverse kinds of longer noncoding transcripts that generally function to regulate the expression of distant genetic loci, often by suppressing or promoting their transcription. For example, the rox RNAs of the fruit fly seems to facilitate the remodeling of chromosome structure to allow the male X chromosome to be transcribed at twice the rate as a single X chromosome in females, which have two X's. Similarly, the Xist RNA in mammals helps inactivate one of the two X chromosomes in females, allowing males and females to have equivalent levels of gene expression from the X chromosome. Xist is one example of a broader class of very versatile regulatory RNAs known as long intergenic noncoding RNAs (lincRNAs). lincRNAs can act as scaffolds for the assembly of complexes of transcriptional regulatory proteins, and can facilitate the recruitment of defined combinations of protein regulators to specific genes.

This is an official Page of the University of Massachusetts Medical School

RNA Therapeutics Institute (RTI) &bull 368 Plantation St Worcester, Massachusetts 01605


Bekijk de video: mRNA Splicing (November 2021).