Informatie

Slechte RNA-kwaliteit van zebravisembryo's


Doet iemand routinematig RNA-isolatie van zebravisembryo's?

Ik heb embryo's uit verschillende stadia, maar allemaal onder de 24 pk. Dit is het protocol dat ik volg:

  1. Neem 10-20 embryo's
  2. Een keer wassen met milliQ water
  3. Behandel met 1 mg/ml Proteinase-K (5 min met zacht schudden) om te dechorionate
  4. Was opnieuw met milliQ water
  5. Water verwijderen en 250 µl Trizol . toevoegen
  6. Homogeniseren door pipetteren
  7. voeg 750 µl meer trizol toe
  8. Voer de standaard trizol-extractiestap uit (met chlorofom)
  9. Neem de waterige fase en was opnieuw met 200 µl chloroform
  10. Neerslag RNA met isopropanol
  11. Driemaal wassen met 70% ethanol
  12. oplossen in nucleasevrij water

Ondanks dit alles krijg ik een slechte A260/A230: ~0.4

Bovendien gebeurt dit consistent in alle steekproeven. De RNA-banden zien er goed uit op de gel.

Ik heb vele malen RNA-isolatie uit cellijnen en weefsels gedaan en heb dit probleem nooit onder ogen gezien. Is dit gebruikelijk bij zebravisembryo's? Is er een andere manier om dit op te lossen dan door kits te gebruiken?


Meestal had ik geen problemen met RNA-extracties - van verschillende gekweekte cellen en een aantal verschillende weefsels van muizen. Als ik naar je protocol kijk, is dit vrijwel hetzelfde als het protocol dat we gebruikten of het protocol dat hier wordt aanbevolen voor zebravisembryo's. Dit protocol "Zuivering van RNA met behulp van TRIzol (TRI-reagens)" lijkt ook interessant.

Wat kan gebeuren is een besmetting door fenol of koolhydraten, dan gebruikten we meestal onderstaand protocol om het monster op te ruimen. U kunt ook op kolommen gebaseerde methoden gebruiken, maar deze zijn duurder.

  • voeg 1/10 vol NH4OAc (5M), 2,5 volume 100% koude EtOH (100%) en 10 µg glycogeen toe (voor totaal RNA gebruikten we meestal geen co-precipitatiemiddelen) en meng goed
  • incubeer 30 min bij -80°C
  • centrifugeer 20 min bij 12000g bij 4°C en verwijder het supernatant
  • wassen met 75% ijskoude EtOH
  • centrifugeer 5 min bij 12000 g bij 4 ° C en verwijder supernatant
  • Resuspendeer de pellet in RNAse-vrij water (kan even duren)

Deze toevoeging aan het protocol werkte en een goede RNA-kwaliteit werd verkregen:

homogenisatie

  • Homogeniseerde de embryo's, gesuspendeerd (en ingevroren) in trizol door ze door insulinespuiten van 2 ml te halen. (Ongeveer 10 keer).

Wassen

  • 2 keer gewassen met 500 µl 80% ethanol
  • 3 keer gewassen met 500 µl 70% ethanol

Dechorionation was overbodig en Proteinase-K-behandeling was te hard voor embryo's in een vroeg stadium. Dus ik dechorionate deze keer niet.

Ik denk dat het aantal wasbeurten kan worden verminderd (1×80% en 2×70%) maar hier heb ik me aan gehouden (uit bijgeloof :P)


Bekijk de video: Alevins danio rerio (December 2021).