Informatie

Wat voor een kinase-assay?


Ik vraag me af waarom we een kinase-assay zouden gebruiken, omdat we de eiwitten uit cellen kunnen extraheren en vervolgens een western kunnen doen met de specifieke antilichamen die we willen gebruiken.


Er is een heel eenvoudig antwoord: schaal. Als een farmaceutisch bedrijf een bibliotheek van miljoenen verbindingen wil screenen om te ontdekken welke de kinase-activiteit van een bepaald doelwit remmen, staan ​​ze niet op het punt een miljoen IP's en een miljoen Western-blots te doen. In plaats daarvan zullen ze recombinante kinase- en substraatpeptiden gebruiken, met een verscheidenheid aan uitleessystemen om uit te kiezen.

Andere redenen zijn onder meer het ontbreken van een goed fosfo-specifiek antilichaam tegen het substraat, zeer lage expressie van het kinase en/of substraat, ingewikkelde protocollen die nodig zijn om het kinase te activeren in vitro, gebrek aan een goed modelsysteem en meer.


405 van 405 producten worden weergegeven

Kinase-onderzoek mogelijk maken met een lichtgevend ADP-detectieplatform en complete kinase-enzymsystemen

De Kinase-profileringssystemen automatiseren

Een luminescente ADP-detectietest voor kinasen


Amerika

De site wordt in het Engels weergegeven.

We gebruiken deze cookies om ervoor te zorgen dat onze site veilig en naar behoren functioneert. Ze zijn noodzakelijk om onze diensten te laten functioneren en kunnen niet worden uitgeschakeld in onze systemen. Ze worden meestal alleen ingesteld naar aanleiding van acties van u die neerkomen op een verzoek om diensten, zoals inloggen, het gebruik van een winkelwagen of het invullen van formulieren. U kunt uw browser zo instellen dat deze cookies blokkeert of u voor deze cookies waarschuwt, maar sommige delen van onze diensten werken niet zonder deze. Net als de andere cookies die we gebruiken, kunnen strikt noodzakelijke cookies first-party cookies of third-party cookies zijn.

We gebruiken deze cookies om uw instellingen en voorkeuren te onthouden. We kunnen deze cookies bijvoorbeeld gebruiken om uw taalvoorkeuren te onthouden.
Voorkeurscookies toestaan

We gebruiken deze cookies om informatie te verzamelen over hoe u met onze diensten omgaat en om ons te helpen deze te meten en te verbeteren. We kunnen deze cookies bijvoorbeeld gebruiken om te bepalen of u interactie heeft gehad met een bepaalde pagina.
Prestatie-/statistiekcookies toestaan

Wij en onze advertentiepartners gebruiken deze cookies om advertenties te leveren, ze relevanter en betekenisvoller voor u te maken, en om de efficiëntie van onze advertentiecampagnes bij te houden, zowel op onze diensten als op andere websites en sociale media.
Marketingcookies toestaan


Kinase-selectiviteitsprofileringssystemen

De Kinase Selectivity Profiling Systems zijn geoptimaliseerd voor snelle en eenvoudige kinaseprofileringsreacties. Deze systemen omvatten kinase- en substraatparen gegroepeerd in enkele kinasefamilies, of als een algemeen panel van kinasen die representatief zijn voor het menselijke kinoom, voor een breed kinaseprofiel. Ze vertrouwen op de beproefde ADP-Glo™ Kinase Assay-technologie om kinaseprofilering snel en eenvoudig te maken. Systemen kunnen ook worden aangepast.

  • Snelle doorlooptijd in een kwestie van uren
  • Flexibele kinaseremmende profilering
  • Stabiel lichtsignaal maakt verwerking van batchplaten mogelijk

Schematisch overzicht van het Kinase-selectiviteitsprofileringssysteem


Geconcentreerde kinasen en substraten/cofactorvoorraden worden eerst verdund en vervolgens gecombineerd met de testverbinding in een plaat met 384 putjes. Na een incubatie van 1 uur wordt de ADP-Glo&trade-assay uitgevoerd. Het resulterende luminescentiesignaal is evenredig met de ADP-concentratie en correleert met kinase-activiteit.


Assay Theorie

De biochemische Z'-LYTE-assay maakt gebruik van een op fluorescentie gebaseerd, gekoppeld enzymformaat en is gebaseerd op de differentiële gevoeligheid van gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde peptiden voor proteolytische splitsing (Figuur 1).

In de primaire reactie brengt het kinase het gamma-fosfaat van ATP over naar een enkel tyrosine-, serine- of threonineresidu in een synthetisch FRET-peptide. In de secundaire reactie herkent en splitst een plaatsspecifieke protease niet-gefosforyleerde FRET-peptiden. Fosforylering van FRET-peptiden onderdrukt splitsing door het ontwikkelingsreagens. Splitsing verstoort FRET tussen de donor (d.w.z. coumarine) en acceptor (d.w.z. fluoresceïne) fluoroforen op het FRET-peptide, terwijl niet-gesplitste, gefosforyleerde FRET-peptiden FRET behouden. Een ratiometrische methode, die de verhouding (de emissieverhouding) van donoremissie tot acceptoremissie na excitatie van de donorfluorofoor bij 400 nm berekent, wordt gebruikt om het reactieverloop te kwantificeren, zoals weergegeven in de onderstaande vergelijking.

Een belangrijk voordeel van deze ratiometrische methode voor het kwantificeren van de voortgang van de reactie is de eliminatie van well-to-well variaties in FRET-peptideconcentratie en signaalintensiteiten. Als resultaat levert de test zeer hoge Z'-factorwaarden (>0.7) op bij een laag percentage fosforylering.

Zowel gesplitste als niet-gesplitste FRET-peptiden dragen bij aan de fluorescentiesignalen en dus aan de emissieverhouding. De mate van fosforylering van het FRET-peptide kan worden berekend uit de emissieverhouding. De emissieverhouding zal laag blijven als het FRET-peptide gefosforyleerd is (d.w.z. geen kinaseremming) en hoog zijn als het FRET-peptide niet-gefosforyleerd is (d.w.z. kinaseremming).


Universele tyrosinekinase-assaykit

Eiwittyrosinekinase (PTK) is een enzym dat cruciaal is voor de signaaltransductieroutes die celproliferatie, differentiatie en carcinogenese regelen. PTK's worden ingedeeld in twee families: membraanreceptor-PTK's zoals insuline en EGF-receptor en niet-receptorgebonden PTK's zoals Src en FAK. Membraanreceptor PTK's bevatten drie domeinen: de extracellulaire, membraan intrinsieke en intracellulaire domeinen. De extracellulaire en membraan intrinsieke domeinen binden aan liganden zoals hormonen en groeifactoren, terwijl het intracellulaire domein de actieve plaats van PTK bevat. Receptor-PTK's brengen signalen rechtstreeks de cel in via ligand-gemedieerde tyrosinefosforylering. Niet-receptorgebonden PTK's missen het intrinsieke domein van het membraan en zijn onderverdeeld in drie typen op basis van hun cellulaire locatie (d.w.z. membraan, cytoplasmatisch of nucleair). Niet-receptorgebonden PTK's nemen deel aan verschillende functies, waaronder signaaltransductie en cel-celcontactreacties.

Eiwittyrosinekinase (PTK) is een enzym dat cruciaal is voor de signaaltransductieroutes die celproliferatie, differentiatie en carcinogenese regelen. PTK's worden geclassificeerd in twee families: membraanreceptor-PTK's zoals insuline en EGF-receptor en niet-receptorgebonden PTK's zoals Src en FAK. Membraanreceptor-PTK's bevatten drie domeinen: de extracellulaire, membraan-intrinsieke en intracellulaire domeinen. De extracellulaire en membraan intrinsieke domeinen binden aan liganden zoals hormonen en groeifactoren, terwijl het intracellulaire domein de actieve plaats van PTK bevat. Receptor-PTK's brengen signalen rechtstreeks de cel in via ligand-gemedieerde tyrosinefosforylering. Niet-receptorgebonden PTK's missen het intrinsieke domein van het membraan en zijn onderverdeeld in drie typen op basis van hun cellulaire locatie (d.w.z. membraan, cytoplasmatisch of nucleair). Niet-receptorgebonden PTK's nemen deel aan verschillende functies, waaronder signaaltransductie en cel-celcontactreacties.

De Universal Tyrosine Kinase Assay Kit is een in vitro enzym-immunoassay-kit bedoeld voor de kwantitatieve bepaling van tyrosinekinase-activiteit in hechtende of suspensiecelkweekextracten. De kit kan ook worden gebruikt om PTK-activiteitsniveaus en hun regulatie te meten, evenals voor de in vitro screening van PTK-remmers. De kit bevat een microtiterplaat met 96 putjes gecoat met PTK-substraat, een fosfotyrosine (pY20)-mierikswortelperoxidase (HRP) antilichaam en een HRP-substraat (TMBZ). Seriële verdunningen van bereid celextract kunnen naast een ATP-oplossing aan de met PTK-substraat gecoate microtiterplaat worden toegevoegd, waardoor fosforylering van tyrosine mogelijk wordt. De monsteroplossing wordt vervolgens verwijderd en de plaat wordt grondig gewassen en geblokkeerd. Na een blokkeringsstap wordt pY20-HRP toegevoegd, geïncubeerd en vervolgens vervangen door de TMBZ-oplossing. De daaruit voortvloeiende kleurontwikkeling maakt het mogelijk de PTK-activiteit van het monster te bepalen door de monsterabsorptie bij 450 nm te vergelijken met de voor de standaard verkregen absorptie (via een uitgezette standaardcurve).


Bronnen voor Kinase Biologie

De Kinase-profileringssystemen automatiseren

Leer hoe u Promega-kinase-assays gebruikt voor het snel screenen van samengestelde bibliotheken.

ADP-Glo: een luminescente ADP-detectietest voor kinasen

In vitro-onderzoeken naar het werkingsmechanisme van kinaseremmers en resistentiemechanismen tegen geneesmiddelen van gemuteerde kinasen.

Een kwantitatieve techniek om de betrokkenheid van kinase-targets in levende cellen te meten

In dit webinar rapporteren we het gebruik van een energieoverdrachtstechniek (NanoBRET) in de eerste kwantitatieve benadering voor het profileren van kinasebezetting van een testverbinding in levende cellen.

Onderzoek naar ontdekking van kleine moleculen

Blijf op de hoogte van Promega-evenementen, producten en nieuws.

&kopie Promega Corporation 2021. Alle rechten voorbehouden.


Waar wordt het voor gebruikt?

Een CK-test wordt meestal gebruikt om spierblessures en ziekten te diagnosticeren en te controleren. Deze ziekten omvatten:

    , een zeldzame erfelijke ziekte die zwakte, afbraak en functieverlies van skeletspieren veroorzaakt. Het komt vooral voor bij mannen.
  • Rhabdomyolis, een snelle afbraak van spierweefsel. Het kan worden veroorzaakt door een ernstig letsel, een spierziekte of een andere aandoening.

De test kan worden gebruikt om een ​​hartaanval te diagnosticeren, hoewel niet vaak. CK-testen waren vroeger een veel voorkomende test voor hartaanvallen. Maar een andere test, troponine genaamd, blijkt beter te zijn in het detecteren van hartschade.


Eiwitkinase C (PKC)

Proteïnekinase C (PKC) is een AGC-kinase dat serine- en threonineresiduen in veel doeleiwitten fosforyleert. Het werd voor het eerst geïdentificeerd in 1977 in rundercerebellum door Nishizuka en collega's als een proteïnekinase dat histon en protamine fosforyleerde. Sindsdien is zijn betrokkenheid bij veel biologische processen aangetoond, waaronder ontwikkeling, geheugen, differentiatie, proliferatie en carcinogenese. Ooit gedacht dat het een enkel eiwit was, is het nu bekend dat PKC een grote familie van enzymen omvat die verschillen in structuur, cofactorvereisten en functie. Er zijn tien isovormen van PKC geïdentificeerd, variërend in weefselexpressie en cellulaire compartimentering, waardoor specifieke interacties met substraten mogelijk zijn.

De PKC-familie is verdeeld in drie groepen, die verschillen in de cofactorvereisten van de enzymen conventionele (c)PKC-isovormen (bestaande uit α, βl ,II en γ), die calcium en diacylglycerol (DAG) nodig hebben voor activering van nieuwe (n)PKC-isovormen (bestaande uit δ, ε, η , en θ waarvoor DAG en atypische (a) PKC-isovormen nodig zijn, namelijk ζ en ι (ook bekend als λ, de muizenhomoloog van humaan PKCι) die noch calcium noch DAG nodig hebben. Eiwitkinase D (PKD) is een afzonderlijke kinasefamilie die oorspronkelijk werd geclassificeerd als een PKC-subgroep (PKCμ, PKCv). De PKC-gerelateerde kinasen (PRK/PKN) bevatten kinasedomeinen die homoloog zijn aan PKC's. Deze zijn niet nauw verwant aan de PKC-familie vanwege zeer verschillende regulerende domeinen, maar ze kunnen worden beschouwd als onderdeel van de PKC-superfamilie.

Alle PKC's bezitten een fosfolipide-bindend domein voor membraaninteractie. De algemene structuur van een PKC-molecuul bestaat uit een katalytisch en een regulerend domein, samengesteld uit een aantal geconserveerde gebieden, afgewisseld met gebieden met een lagere homologie, de variabele domeinen.

Activering van cPKC's omvat translocatie van het cytosol naar het celmembraan door de membraangerichte modules in te schakelen. In het geval van cPKC's bevordert een toename van intracellulair calcium eerst de binding van het C2-domein aan anionische lipiden. Het C1-domein bindt DAG (of forbolesters, functionele DAG-analogen) en fosfatidylserine (PS), waardoor de conventionele en nieuwe PKC's naar het membraan worden gerekruteerd, waar ze substraten kunnen fosforyleren. Specifieke verankeringseiwitten (geïmmobiliseerd op bepaalde intracellulaire plaatsen) lokaliseren het kinase op zijn plaats van werking. Deze eiwitten omvatten 'receptoren voor geactiveerd C-kinase' (RACKS), 'receptoren voor inactief C-kinase' (RICKS), 'A-kinase-ankereiwitten' (AKAPS) en 'substraten die interageren met C-kinase' (STICKS). ). Bovendien kunnen nucleaire lokalisatiesignalen (NLS) of nucleaire exportsignalen (NES) PKC de kern in of uit sturen.

Sommige, zo niet alle, PKC-isovormen kunnen proteolytisch worden gesplitst in het scharnier tussen de regulerende en katalytische domeinen door proteasen zoals het door calcium geactiveerde calpaïne, waardoor een vrije, cofactor-onafhankelijke, katalytische subeenheid wordt gegenereerd die bekend staat als proteïnekinase M (PKM). Dit 'calpaïneproduct' moet niet worden beschouwd als een 'ongereguleerd' enzym, aangezien de vorming ervan in feite wordt gereguleerd door proteolyse. Splitsing is een fysiologisch relevant alternatief activeringsmechanisme voor isozymen zoals PKCδ, dat optreedt in processen zoals apoptose, waar caspases een belangrijke rol lijken te spelen.

Alle PKC's, behalve de δ-isovorm, vertonen zogenaamde PEST-sequenties, hydrofiele polypeptidesegmenten verrijkt met proline (P), glutaminezuur (E), serine (S) en threonine (T), die zich richten op eiwitten voor afbraak door het proteasoom. Een bijkomend niveau van complexiteit is duidelijk na de waarneming dat defosforylering van geactiveerde PKC's ze blijkbaar vatbaar maakt voor ubiquitinatie en afbraak. De neerwaartse regulatie van PKC wordt daarom ook gereguleerd door specifieke fosfatasen en ubiquitine-ligasen.

PKC-isovormen worden verwerkt door drie geordende priming-fosforyleringen. De eerste fosforylering wordt gekatalyseerd door fosfoinositide-afhankelijke kinase (PDK-1) en vindt plaats in de activeringslus (T500 in PKCβII). Deze fosforylering veroorzaakt twee fosforylaties aan het carboxy-uiteinde (T641 en S660 inII). Elke fosforyleringsgebeurtenis induceert conformationele veranderingen in het PKC-molecuul die resulteren in veranderde thermische stabiliteit, weerstand tegen fosfatasen en katalytische competentie.

De eerste volledige kristalstructuur van PKC werd verkregen voor de nieuwe isovorm θ. Eerdere structurele informatie werd verkregen uit kristallen van de regulerende domeinen en door het katalytische domein te modelleren met proteïnekinase A.

De onderstaande tabel bevat geaccepteerde modulatoren en aanvullende informatie. Voor een lijst met aanvullende producten, zie het gedeelte "Vergelijkbare producten" hieronder.

Voetnoten

een) Verwerkingssites vermeld.

B) Voor een gedetailleerde lijst van bindende partners, zie Referentie: Poole, A.W., et al. "PKC-interagerende eiwitten: van functie tot farmacologie." Trends Pharmacol Sci, 25, 528-535 (2004).

C) PKCα pseudosubstraatplaatssequentie RFARKGALRQKNVHEVKDH. PKCε pseudosubstraatplaatssequentie PRKRQGAVRRRVHQVNGH (onderstreept zijn veranderlijke plaatsen voor fosforyleerbare residuen). Substraten niet bepaald op alle isovormen.

NS) Specifieke lipide-activator van aPKC's onbekend. Er is minder bekend over activatoren/substraten/remmers van aPKC's dan nPKC's dan cPKC's. Activators niet bepaald op alle isovormen.

e) GF 109203X (Gö 6850 ook bekend als BIM 1) toont potentierangorde van α>βI>ε>δ>ζ. Bisindolylmaleimiden (Ro-verbindingen, BIM 1, Gö 6976) remmen alle PKC's in potentierangorde van cPKCs>nPKCs>aPKC's (in het algemeen) Calphostin C remt DAG-plaats in regulerend domein BIM 1 en Ro-verbindingen werken op ATP-plaats Chelerythrinechloride remt substraatplaats in katalytisch domein.

Afkortingen

AKAP: A-kinase verankerende proteïne
Aprinocarsen: ISIS 3521
Cdk2: Cycline-afhankelijke kinase 2
CGP41251: (PKC412): Staurosporinederivaat
CGP54345: ATP analoog
CGP53506: N-(3-nitrofenyl)-4-(3-pyridyl)-2-pyrimidinamine
eEF-1α: Eukaryote verlengingsfactor-1α-peptide, residuen 422-443.
6976: 5,6,7,13-Tetrahydro-13-methyl-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazool-12-propaannitril
6983: 2-[1-(3-Dimethylaminopropyl)-5-methoxyindol-3-yl]-3-(1H-indol-3-yl)maleïmide
GF 109203X: 3-[1-[3-(Dimethylamino)propyl]-1H-indol-3-yl]-4-(1H-indol-3-yl)-1H-pyrrool-2,5-dion (Gö6850)
LIP: PKC 1 interactief eiwit naar PKC λ interactief eiwit
LY-333531: 9-[(Dimethylamino)methyl]-6,7,10,11-tetrahydro-(9S)-NH,18H-5,21:12,15-dimetheno-dibenzo[e,k]pyrrolo[3,4-h ][1,4,13]oxadiazacyclohexadecine-18,20(19H)dion
K252a: Staurosporine-gerelateerde alkaloïde
MARCKS-peptide: Gemyristoyleerd alaninerijk C-kinasesubstraat, Ac-phe-lys-lys-ser-phe-lys-leu-NH2
MBP: Myeline basiseiwit
NPC 15437: S-2,6-Diamino-N-[[1'-(1''oxotridecyl)-2'-piperidinyl]methyl]hexanamide-dihydrochloride
PB1: Phox en Bem1p bindend domein
PDA: Forbol 12, 13-diacetaat
PDBu: Forbol 12, 13-dibutyraat
PDD: Forbol 12, 13-didecanoaat
Pleckband: Bloedplaatjes en leukocyten C-kinase substraateiwit
PMA: Forbol 12-myristaat 13-acetaat
PS: Fosfatidylserine
REK: Receptoren voor geactiveerd C-kinase
Ro 31-7549: 2-[1-3(Aminopropyl)indol-3-yl]-3(1-methyl-1H-indol-3-yl)maleïmide
Ro 31-8220: 2-<1-[3-(Amidinothio)propyl]-1H-indol-3-yl>-3-(1-methylindol-3-yl)-maleïmide)
STAT: Signaaltransducers en activatoren van transcriptie
STOK: Substraten die interageren met C-Kinase
Syntide 2: H-pro-leu-ala-arg-thr-leu-ser-val-ala-gly-leu-pro-gly-lys-lys-OH
TPA: Tetra-forbolacetaat
UCN-01: 7-Hydroxy-staurosporine
ZIP: PKC Zeta interactie eiwit

R: Rat
H: Menselijk
m: Muis
rb: Konijn


Database-inhoud

We hebben 31 verschillende soorten experimenteel bewijs gedefinieerd die relevant zijn voor het definiëren van kinase-doelen in een hiërarchisch geclassificeerd formaat, eerst door categorieën met hoge doorvoer of lage doorvoer en vervolgens onderverdeeld in fysiek, biochemisch, genetisch en fenotypisch bewijs (Figuur S2 in aanvullend bestand 2). Gegevens die voor alle HTP-categorieën werden ingevoerd, werden in bulk geëxtraheerd uit de overeenkomstige publicaties, terwijl het LTP-bewijs, met betrekking tot specifieke fosforyleringsassays, rechtstreeks werd ingevoerd door een groep deskundige curatoren (Figuur 1).

We hebben relevante artikelen voor elke individuele kinase uit PubMed gehaald door historisch te zoeken in elk gepubliceerd artikel met betrekking tot de query-kinase. Vervolgens vergeleken we onze informatie met gegevens van BioGRID, om aanvullende publicaties te extraheren die mogelijk zijn gemist tijdens ons curatieproces. Meer dan 5.000 publicaties werden tot augustus 2010 onderzocht op LTP-kinase-interacties en alle vermeldingen werden ingevoerd met de overeenkomstige PMID's. Curaties werden ook uitgevoerd op basis van definities voor het experimentele bewijs beschreven op de website onder elke specifieke categorie (Figuur S1 in aanvullend bestand 2).

Curatieproces

Bidirectionele interacties (bijvoorbeeld fysieke interacties, synthetische letale interacties) werden in beide richtingen ingevoerd, terwijl unidirectionele interacties (bijvoorbeeld biochemische interacties, synthetische onderdrukking) alleen werden ingevoerd waar een fenotype duidelijk was gekoppeld aan een specifiek kinase. Bewijs voor interacties tussen kinasen en andere genen of eiwitten werd ingevoerd met bijbehorende PMID's ('kinase-gen interaction'), inclusief de eerste auteur en het jaar van publicatie. Directionaliteit werd toegevoegd als notities waar nodig (bijvoorbeeld doseringsdodaliteit) en specifieke allelische interacties en experimenteel ontwerp werden ook in meer detail beschreven in de notitiesectie door de curator. Biochemische gegevens met betrekking tot stroomopwaartse regulatoren van kinasen werden niet samengesteld. Als gegevens met betrekking tot een conclusie niet werden getoond in de publicatie of aanvullend materiaal, werd het bewijs niet geldig geacht voor opname in de database. Als er meer dan één publicatie was die dezelfde interactie ondersteunde, werd elke PMID afzonderlijk ingevoerd. Voor cycline-afhankelijke kinasen met meerdere regulerende subeenheden, werd de geassocieerde cycline ook samengesteld indien gespecificeerd in de literatuur. Elke curator kreeg gedetailleerde richtlijnen om de consistentie te behouden en kreeg een set kinasen toegewezen voor literatuurcuraties. In het geval dat een publicatie echter informatie bevatte voor meer dan één kinase of tussen een kinasepaar, werden de gegevens voor alle kinasen van een enkel artikel in KID ingevoerd om curatiefouten door middel van interne kruiscontroles tot een minimum te beperken.

Kwaliteitsbeoordeling voor elke experimentele categorie en definitie van KID-scores

Om de kwaliteit van elke afzonderlijke experimentele categorie te beoordelen bij het identificeren van kinase-substraatparen, hebben we een eenvoudige scoringsmethode gebruikt die de waarschijnlijkheid evalueert dat een interessecategorie een echt kinase-substraatpaar identificeert in tegenstelling tot een vals positief. We verzamelden een positieve trainingsset van kinase-substraatinteracties, gekozen door de curatoren op basis van de volgende criteria uit literatuur met een lage doorvoer: 1) een gedefinieerde fysieke interactie tussen het kinase-substraatpaar 2) het vermogen van de kinase om het substraat te fosforyleren in vitro 3) het vermogen van het kinase om het substraat te fosforyleren in vivo en 4) of de plaats of het effect van de fosforyleringsgebeurtenis bekend was (tabel S3 in aanvullend bestand 1). De positieve trainingsset omvat 121 interacties voor 40 kinasen en is niet bevooroordeeld voor een bepaalde experimentele categorie. We vergeleken de frequentie van interacties in elke experimentele categorie met de frequentie die wordt verwacht in een negatieve trainingsset, die we hebben gedefinieerd als kinase-eiwitinteracties die waarschijnlijk niet representatief zijn voor bonafide kinase-substraat interacties. Om dit te doen, moesten we de frequentie berekenen van een experimenteel gegevenspunt in elke categorie in een set eiwitten die geen substraten zijn. Omdat we zelden de eiwitten kennen die geen substraten zijn van een bepaald kinase, is het definiëren van een negatieve set een uitdaging. Om het aantal experimentele gegevenspunten te verkrijgen, hebben we conservatief alle experimentele gegevens gebruikt die in KID werden gevonden en die geen deel uitmaakten van de positieve trainingsset. Om de relatieve frequentie in de negatieve trainingsset te berekenen, moesten we deze waarde delen door de grootte van de negatieve trainingsset. In principe zou dit de totale interactieruimte zijn (alle kinasen vermenigvuldigd met alle genen) minus de verzameling van alle bonafide eiwit-kinase substraat interacties. In de praktijk bemonsteren de meeste datasets echter niet de volledige interactieruimte (bijvoorbeeld HTP in vitro kinase-assays) en de negatieve set moet worden genormaliseerd om dit weer te geven. Daarom beschouwden we de HTP-negatieve trainingssetgrootte als een vijfde van de totale interactieruimte (een vijfde keer het aantal kinasen vermenigvuldigd met het aantal genen). De negatieve trainingssetgrootte voor de LTP-categorieën moet ook worden aangepast met dezelfde redenering, aangezien LTP-experimenten nog minder van de volledige interactieruimte hebben bemonsterd. Om de grootte van de negatieve LTP-trainingsset te bepalen, hebben we de verhouding berekend van het aantal interacties dat wordt getoond door LTP-experimenten tot het aantal interacties dat wordt getoond door HTP-experimenten, en de negatieve trainingssetgrootte voor de LTP-categorieën verminderd met deze verhouding (HTP negatieve trainingsset vermenigvuldigd met de ratio). Daarom nemen we aan dat HTP- en LTP-experimenten hetzelfde vermogen hebben om kinase-substraatinteracties te detecteren, maar dat HTP-experimenten een veel grotere ruimte verkennen. Door deze aanpassingen uit te voeren op de negatieve trainingssets, zijn we van mening dat de score een relatief onbevooroordeelde maatstaf is voor de verrijking van het succes van elke categorie bij het identificeren van onze positieve trainingsset.

Het gewicht voor elke categorie wordt gedefinieerd als de logratio van de frequentie van een bepaalde categorie van experimenten die een kinase-substraatpaar uit de positieve trainingsset ondersteunen in vergelijking met de negatieve set. Als een bepaalde experimentele categorie bijvoorbeeld 50% van de positieve trainingsset maar 10% van de negatieve trainingsset identificeerde, dan zou de score voor deze categorie ongeveer de logaritme van (50/10) zijn. We stellen de positieve trainingsset voor als de matrix G, waarbij Gj, ik = 1, als de i e experimentele categorie een interactie rapporteerde tussen het j e kinase-substraatpaar. De negatieve trainingsset wordt op dezelfde manier gedefinieerd als Rj, ik, waarbij R ofwel de HTP- ofwel de LTP-negatieve trainingsset is. De score is dus:

waar NR en NG zijn de maten van de hierboven besproken positieve en negatieve trainingssets. Eén (1) telling werd aan elke categorie toegevoegd als een pseudo-telling in de positieve set. In de negatieve set, NR/NG werd toegevoegd als een pseudo-telling, om ervoor te zorgen dat de verhouding van experimentele waarnemingen tot een ingestelde grootte hetzelfde was in de positieven en negatieven, Sl = 0 voor die categorie. Een vergelijkbare waarschijnlijkheidsratio werd onlangs gebruikt door Yu et al. [27], zonder de pseudo-telling of een genormaliseerde negatieve trainingsset. Voor het j e vermeende kinase-substraatpaar wordt de KID-score gedefinieerd als:

waar xik, j = 1 toen het i-de experiment werd gerapporteerd voor het j-de vermeende kinase-substraatpaar.

Om te berekenen P-waarden voor de gescoorde interacties, hebben we het bewijsmateriaal in elke experimentele categorie in de database gerandomiseerd en de gerandomiseerde database gescoord. De resulterende scoreverdeling werd gebruikt om P-waarden.

In figuur 2 hebben we voor de ROC-curve met BioGRID alleen positieven overwogen die in beide datasets aanwezig waren bij het berekenen van de echte positieve snelheid.

In figuur 5 is, hoewel de vouwverrijking voor elke dataset vergelijkbaar is met ons scoreschema, geen schatting van de bemonsterde interactieruimte vereist omdat de meeste datasets het aantal geteste interacties aangeven, behalve voor fysieke interactiegegevens die zijn verzameld met behulp van massaspectrometrietechnieken, waarvoor we gingen uit van volledige dekking. De grootte van de negatieve trainingsset is aangepast om overeen te komen met hun gerapporteerde dekking van de interactieruimte (aantal geteste kinasen vermenigvuldigd met het aantal geteste genen). We merken op dat de score voor elke experimentele categorie een schatting is, terwijl de verrijking voor elke dataset exact is.

KID-schema

Afbeelding S6 in Aanvullend bestand 2 vat het algemene schema voor KID samen, dat een back-end en front-end samenstelling heeft. De back-end wordt beheerd via een intern gebruikersbedieningspaneel dat wordt beheerd door meerdere curatoren. Curatoren gebruiken een relationeel databaseschema dat consistente invoer afdwingt, zodat elk individu automatisch eerdere invoer door andere curatoren voor elk kinase-gen/eiwit-paar kan observeren. Het systeem maakt directe wijziging, verwijdering of toevoeging van meer experimenteel bewijs en interne kruisvalidatie door curatoren mogelijk. Samengestelde interacties worden vervolgens gecompileerd in een enkele interactietabel die, bij gegevensinvoer of wijziging, wordt gebruikt om automatisch de scorefunctie voor elke categorie te kalibreren en om volledige databaseback-ups te genereren. Ook wordt elke wijziging van de curator automatisch gelogd voor administratieve doeleinden. De front-end van de database doorzoekt het relationele databaseschema via Ajax om snelle feedback van gevraagde informatie mogelijk te maken. Met het querysysteem kan de hele database worden gefilterd op basis van meerdere vermeldingen in verschillende combinaties (Figuur S1 in aanvullend bestand 2). De query wordt vervolgens door de server geparseerd om de gevraagde reeks interacties te identificeren, die op hun beurt direct worden weergegeven door de KID-interface. Deze gegenereerde uitvoer kan worden gedownload als een door tabs gescheiden kopie of Cytoscape-compatibel netwerkbestand, of direct worden weergegeven als een interactienetwerk met behulp van Cytoscapeweb [42]. Een lijst van alle database-interacties kan worden bekeken in Aanvullend bestand 3.

Correlaties van kinasen op basis van hun doelen

We verzamelden de doelen van alle kinasen binnen onze gouden standaard (strenge grenswaarde) en voerden een algehele vergelijking uit met behulp van de correlatiecoëfficiënt van Pearson. De correlatiegrens vertegenwoordigt a P-waarde van 0,05 in de t-teststatistieken. De resultaten van de correlatievergelijkingen werden vervolgens onderworpen aan een grafische analyse met behulp van een edge-weighted schema in Cytoscape [23]. Functionele verrijkingsanalyse werd uitgevoerd met behulp van FunSpec, een webgebaseerde clusterinterpreter voor gist [41].


Bekijk de video: How to measure Kinase activity with HTRF KinEASE assay kit I Cisbio (Januari- 2022).