Informatie

Gebruik van de termen: Enhancer, Upstream activerende sequentie en Downstream activerende sequentie


Van wikipedia

Een stroomopwaartse activeringsreeks of stroomopwaartse activeringssequentie (UAS) is een cis-werkende regulerende sequentie. Het verschilt van de promotor en verhoogt de expressie van een naburig gen.

Opnieuw,

In de genetica, een Versterker is een kort (50-1500 bp) DNA-gebied dat kan worden gebonden door eiwitten (activators) om de kans te vergroten dat transcriptie van een bepaald gen plaatsvindt.

Ik vind geen verschil tussen hen, zijn ze synoniem?

Vanwege zijn essentiële rol bij het activeren van transcriptie, wordt de stroomopwaartse activerende sequentie vaak beschouwd als analoog aan de functie van de versterker in meercellige eukaryoten.

Er lijkt een ander soort regulerende sequentie te bestaan, stroomafwaarts activerend element. Ik denk dat het een ander synoniem is voor versterker die zich stroomafwaarts van de transcriptiestartplaats bevindt.


Eiwitten die binden aan de gist-rDNA-versterker

De transcriptie van ribosomale RNA-genen verschilt in verschillende opzichten van die van andere genen: het gebruik van een gespecialiseerd polymerase, het doorgaans hoge niveau van transcriptie en de tandemrangschikking van de genen. In de gist Saccharomyces cerevisiaeidentificeerden we een nucleotidesequentie in het "niet-getranscribeerde" spacergebied dat veel kenmerken had van een transcriptieverhoger (8). Meer recentelijk is het duidelijk geworden dat transcriptie van deze sequentie plaatsvindt (9) en dat het ook betrokken kan zijn bij een bepaald aspect van de terminatie van 35S-rRNA-transcriptie. De waarschijnlijkheid dat er eiwitfactoren zijn die betrokken zijn bij de beëindiging en activering van transcriptie en dat deze kunnen deelnemen aan de koppeling van de transcriptie van aangrenzende rRNA-genen, bracht ons ertoe om te zoeken naar eiwitten die aan de versterker zouden kunnen binden. We hebben twee van dergelijke eiwitten geïdentificeerd, REB1 en REB2 genaamd, die aan de versterker binden en specifieke sequenties beschermen tegen aanvallen door chemische en enzymatische reagentia. Het is opmerkelijk dat er een tweede REB1-bindingsplaats is ongeveer 210 basenparen stroomopwaarts van de oorsprong van transcriptie van rRNA en dat binding van REB1 aan deze plaats de conformatie van DNA naast de plaats van initiatie verandert.


Toegangsopties

Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

Alle prijzen zijn NET prijzen.
De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

Alle prijzen zijn NET prijzen.


Enhancers en transcriptie

In sommige eukaryote genen zijn er regio's die de transcriptie helpen verhogen of verbeteren. Deze regio's, versterkers genaamd, liggen niet noodzakelijk dicht bij de genen die ze versterken. Ze kunnen zich stroomopwaarts van een gen bevinden, in het coderende gebied van het gen, stroomafwaarts van een gen, of duizenden nucleotiden verwijderd zijn.

Enhancer-regio's zijn bindingssequenties, of plaatsen, voor transcriptiefactoren. Wanneer een DNA-buigend eiwit bindt, verandert de vorm van het DNA (Figuur (PageIndex<1>)). Deze vormverandering maakt de interactie mogelijk van de activatoren die zijn gebonden aan de versterkers met de transcriptiefactoren die zijn gebonden aan het promotorgebied en het RNA-polymerase. Terwijl DNA over het algemeen wordt afgebeeld als een rechte lijn in twee dimensies, is het eigenlijk een driedimensionaal object. Daarom kan een nucleotidesequentie die duizenden nucleotiden verwijderd is, zich omvouwen en een interactie aangaan met een specifieke promotor.


Discussie

De promotorsequenties die we definiëren omvatten significante delen van het SCBV ORF III-gen. De SCBV839-sequentie, die de grootste activiteit heeft in tijdelijke testen, overlapt met 525 eiwitcoderende nucleotiden. De sequenties die het ORF III-gen overlappen, bevatten de meeste promotoractiviteit zoals aangetoond door het SCBV333-fragment dat slechts 20 bp van het ORF III-gen bevat en slechts 10% van de promotoractiviteit van de SCBV839-sequentie heeft (Figuur 3). Het SCBV282-versterkerfragment bevat 189 bp aan ORF III-coderende sequentie. Een vergelijkbare situatie wordt gevonden in Arabidopsis waar regulerende elementen voor de promotor van ZWICHEL (ZWI) gen worden gevonden in exon- en intronsequenties van de aangrenzende HYDROXYISOBUTYRL-CoA HYDROLASE 1 (CHY1) gen [49].

De versterkersequenties in de SCBV-IM-promoter waren in staat om de activiteit van de afgeknotte ZmADH1-promotor te verhogen (Figuur 4), maar deze chimere promoters waren veel zwakker dan de intacte SCBV-IM-promoter in de tijdelijke testen (Figuur 3). Dit verschil is zo groot dat het onwaarschijnlijk is dat het het resultaat is van verschillende celpreparaten en mogelijk het resultaat is van de SCBV-IM stroomopwaartse activerende sequenties die verschillend interageren met de heterologe kern ZmADH1-promoter en de natieve SCBV-IM-promotor. Vergelijkbare resultaten werden gezien wanneer de CaMV 35S-enhancer stroomopwaarts van de CaMV 19S-kernpromoter werd geplaatst [38].

Deletie-analyse van de SCBV-IM-promoter toonde aan dat het verwijderen van sequenties van −770 tot −507 een daling van 30% in promotoractiviteit veroorzaakte, terwijl het verwijderen van sequenties van −770 tot −264 een daling van 90% in activiteit veroorzaakte (Figuur 3). Het was daarom enigszins verrassend om te zien dat de chimere promoter SCBV537::ZmADH1 (met SCBV-IM-sequenties 689 tot −153) minder activiteit had dan de chimere promoter SCBV282::ZmADH1 (met SCBV-IM-sequenties −434 tot − 153) aangezien het langere fragment in de promotordeletie-analyse de meeste activiteit had. Verrassende resultaten worden vaak verkregen wanneer delen van promoters worden toegevoegd of verwijderd en zelfs kleine delen van promoters kunnen dramatische effecten hebben. Dey en Matti [15] toonden bijvoorbeeld aan dat het verwijderen van 50 bp van de MMV-promotor de activiteit 10-voudig verhoogde en Simon et al. [50] toonde aan dat het verwijderen van 54 bp van de Binnen Geen Buiten promotor van Arabidopsis zou een tot zwijgen gebrachte promotor kunnen omkeren.

Meerdere kopieën van de SCBV-IM-enhancer veroorzaken een toename van de activiteit van de chimere promoters in tijdelijke assays (Figuur 5). Dit komt overeen met wat is waargenomen met de CaMV 35S- en FMV-ehancers [8],[37]-[39] en kan te wijten zijn aan het feit dat meerdere kopieën van de enhancer efficiënter zijn in het werven van transcriptiefactoren naar de promotor.

Het SCBV282-fragment kan werken als een transcriptionele versterker wanneer het aanwezig is in het maïsgenoom in een 4x tandem-array. In gebeurtenissen die de 4x SCBV-IM-versterker stroomopwaarts en stroomafwaarts van genen bevatten, en in beide oriëntaties met betrekking tot deze genen, werd verhoogde transcriptieaccumulatie waargenomen (Figuur 7). Bovendien bleek het element accumulatie te veroorzaken van transcripten die niet of in zeer lage niveaus aanwezig zijn in niet-transgene lijnen. Dit toont aan dat de SCBV-IM-enhancer kan worden gebruikt voor activatiemarkering in maïs. De SCBV-IM-versterkers verhoogden de expressie van 2 van de 8 genen die niet-detecteerbare expressie vertoonden in niet-transgene controleplanten. Dit is vergelijkbaar met sommige onderzoeken die ectopische expressie van genen hebben gerapporteerd wanneer de CaMV 35S-versterkers in de buurt integreren [51], [52].


Materialen en methodes

P2C2- (SCID.adh2C2)-, 32D- en Raw264.7-cellen werden gekweekt en getransfecteerd met een reeks Bcl11b-sequentiegebonden luciferase en geel fluorescerend eiwit (mCitrine, YFP) reporterconstructen zoals hierin beschreven. 17,18 DNA-methylatie werd gemeten door middel van bisulfiet-DNA-sequencing. Major Peak-mutaties (MP) werden gegenereerd door fusie-PCR met primers weergegeven in aanvullende tabel 1 (beschikbaar op de Bloed website). Lange-afstands-DNA-interactie werd gemeten met de Chromatin Conformation Capture-assay. 19,20 Bacteriële artificiële chromosoom (BAC) reporters werden gegenereerd door recombinatie. 21,22 Toegangsnummer voor TCF-1 ChIP-seq-gegevens: GSE46662. Gedetailleerde methoden worden gegeven in aanvullende materialen en methoden. In één figuur werden cellen gebruikt van de thymus en de milt van de muis. Deze dieren werden gefokt en onderhouden in onze kolonie in Caltech en werden volledig gebruikt volgens de door de Institutional Animal Care and Use Committee goedgekeurde protocollen.


RESULTATEN

Een kenmerk van pol II-versterkers is dat ze de genexpressie vanop afstand kunnen beïnvloeden. Regulerende sequenties van genen die zijn getranscribeerd door RNA-polymerase III (pol III) bevinden zich daarentegen normaal in de buurt van het gen en kunnen niet over lange afstanden werken (25). In overeenstemming met deze observatie, hebben onze studies over de regulering van UAS G - SNR6 , een gist-pol III-gen dat wordt geactiveerd door de TFIIIC-subeenheid τ138 aan de UAS te binden G sequentie via de fusie met het Gal4p DNA-bindende domein (DBD) (26, 27), geven aan dat het splitsen van deze UAS G - SNR6 gen om de UAS . te verschuiven G element naar een verder weg gelegen locatie vermindert de expressie aanzienlijk (zie hieronder). Dergelijke functionele verschillen tussen pol II- en pol III-regulerende sequenties vormden de basis voor het systeem dat we hebben opgezet om de modus van versterkeractiviteit te onderzoeken in vivo . Voor dit systeem hebben we de mogelijkheid overwogen dat het werkingsmechanisme van een pol II-versterker (wat dat ook is, d.w.z. scanning, linking of looping) naast het ontwrichte kunstmatige pol III-regulerende element zou kunnen helpen om de communicatie tussen dit element te herstellen (UAS G ) en de pol III-promotor en maken zo activering van de SNR6 pol III-gen op afstand. Figuur 1 geeft schematisch de moleculaire basis van dit systeem weer. De SNR6 gen en a lacZ reportergen getranscribeerd van een pol II-promoter werden geligeerd in uiteenlopende oriëntaties. stroomafwaarts van SNR6 , plaatsten we vijf Gal4p-bindingsplaatsen (UAS G ) en daarnaast vier bindingsplaatsen (BS) voor LexA als de pol II-versterker. Een chimeer eiwit dat het activeringsdomein van Gal4p gefuseerd met LexA (Lex-AD) draagt, werd gebruikt als de pol II-specifieke activator. Om de promotorarchitectuur van metazoën beter na te bootsen, werd een enkele LexA-bindingsplaats proximaal van de GAL1 TATA-box om de werking van de versterker op afstand te vergemakkelijken (7) (Figuur 1). Dit pol II-pol III-reporterconstruct werd geïntegreerd in het genoom van een giststam die een deletie van de endogene SNR6 gen. Omdat deze knock-out dodelijk is, hebben we een functionele SNR6 allel met een deletie van 6 bp ( SNR6-6 ) op een episomaal plasmide gemarkeerd met de URA3 gen dat de uitputting van het endogene wildtype U6-snRNA volledig aanvult en niet wordt beïnvloed door Gal4DBD-τ138. Met dit markergen konden we de expressie van de UAS . volgen G - SNR6 reportergen door te selecteren op het verlies van de SNR6-6 episomaal plasmide na celgroei op 5-FOA-media (26, 28). De efficiëntie van celgroei op dit selectieve medium correleert met het expressieniveau van de UAS G - SNR6 gen ( 26 ) (zie hieronder). Bovendien is het kortere U6 snRNA-product van de SNR6-6 allel gedragen door de URA3 -gemarkeerd centromeer plasmide maakt het mogelijk om de expressie van beide te volgen SNR6 allelen in een enkele primer-extensie-assay, aangezien de SNR6-6 is gemakkelijk te onderscheiden van het product van de SNR6 reportergen door gelelektroforese. In onze experimentele opstelling maken de drie hierboven beschreven modellen verschillende voorspellingen van de vereisten voor reactivering van de gesplitste UAS G - SNR6 pol III-reportergen door de pol II-versterker. Deze voorspellingen zijn getest (zie hieronder).

De giststam die de reporterconstructen draagt ​​die schematisch in figuur 1 zijn afgebeeld, werd getransformeerd met plasmiden die de in figuur 2 aangegeven pol II- en pol III-transcriptiefactoren tot expressie brengen. Activering van de SNR6 reportergen werd gevolgd door aliquots van deze gistculturen te spotten op zowel permissieve (−Leu −Trp SD) als niet-permissieve (−Leu −Trp SD + 5-FOA) platen om te selecteren op die cellen die de episomale kopie van SNR6 . Expressie van de pol III-transcriptiefactor τ138 zonder de Gal4p DBD-groep veroorzaakte geen activering van de UAS G - SNR6 (Figuur 2A) of van de lacZ (Figuur 2B) reportergenen. Expressie van de pol II transcriptionele activator Lex-AD sterk geactiveerd lacZ genexpressie (Figuur 2B), maar activeerde de expressie van de UAS . niet G - SNR6 gen (Figuur 2A). Expressie van de Gal4DBD-τ138 fusie-eiwit geactiveerde transcriptie van de UAS G - SNR6 gen (Figuur 2A), maar niet van de lacZ reportergen (Figuur 2B). Het combineren van de pol II (Lex-AD) en de pol III (Gal4DBD-τ138) activatoren had een licht maar reproduceerbaar negatief effect op hun activiteiten. Ze waren echter in staat om expressie van hun respectievelijke reportergenen te induceren, ook wanneer ze gelijktijdig aanwezig waren op het reporter-DNA (Figuur 2A en B). In een controle-experiment hebben we de groei gevolgd op 5-FOA-platen van een isogene stam die een reporterconstruct draagt ​​zonder de UAS G - SNR6 gen, maar verder alle andere hierboven beschreven sequenties draagt. Figuur 2C laat zien dat geen van de tot expressie gebrachte transcriptiefactoren de groei van deze giststam stimuleerde op platen die 5-FOA bevatten, wat erop wijst dat selectieve groei van cellen die het volledige reporterconstruct dragen een direct effect was van de activering van de reporter SNR6 gen. Deze resultaten laten zien dat de divergent georiënteerde genen functioneel zijn, zelfs wanneer beide polymerasen worden geactiveerd, en dat de pol II-activator de genexpressie van het pol III-reportergen niet direct beïnvloedde en vice versa.

De afstand tussen de Gal4DBD-τ138-bindende UAS G element en de SNR6 gen op het basisreporterconstruct (Figuur 1) werd stapsgewijs verhoogd door een DNA-fragment van 100, 200 of 400 bp tussen deze twee sequenties te introduceren (Figuur 3A). Vervolgens hebben we het niveau van getest SNR6 en β-galactosidase transcriptionele activering van deze pol III-reporterconstructen in aanwezigheid van Gal4DBD-τ138, Lex-AD of de combinatie van Gal4DBD-τ138 en Lex-AD, en vergeleken met het activeringsniveau van de spacerloze UAS G - SNR6 . Het stapsgewijs vergroten van de afstand tussen de UAS G element en de SNR6 gen leidde tot een snelle daling van SNR6 expressie zoals gevolgd door primer-extensie-assays (Figuur 3B en C). Activering van de lacZ gen door de pol II-activator Lex-AD werd slechts verminderd tot -60% van de oorspronkelijke activiteit door de insertie van het 200 bp spacer-DNA (Figuur 3D, middelste en rechter paneel). We hebben getest of de verminderde SNR6 expressie, veroorzaakt door het verplaatsen van de UAS G element verder stroomafwaarts van SNR6 , kan worden gered door een pol II-activator die is gekoppeld aan de externe versterker. We hebben waargenomen dat cellen die de spacer-reporterconstructen van 100 en 200 bp droegen, maar niet de cellen die het spacerloze construct droegen, hoger vertoonden (reporter) SNR6 transcriptieniveaus wanneer gecotransformeerd met Gal4DBD-τ138 en de pol II-activator Lex-AD dan wanneer getransformeerd met Gal4DBD-τ138 alleen (vergelijk 'geen spacer' in Figuur 3B, lanen 1 en 5, '100 bp spacer' lanen 2 en 6, '200 bp spacer' lanen 3 en 7, en figuur 4B). Figuur 3C plot de SNR6 uitdrukking als functie van de afstand tussen de verslaggever SNR6 en de UAS G element. De co-expressie van Gal4DBD-τ138 en Lex-AD nam toe SNR6 expressie alleen op afstanden (100 en 200 bp) waarop Lex-AD in staat was de te activeren lacZ gen. Deze resultaten laten zien dat het helpende effect van de pol II-activator Lex-AD op de werking van Gal4DBD-τ138 alleen optrad in het geval van de grotere afstand tussen de bindingsplaatsen voor dit eiwit en de SNR6 volgorde. Het helpende effect werd niet waargenomen wanneer de bindingsplaatsen voor Gal4DBD-τ138 proximaal van het pol III-gen waren.

We vroegen daarom of dit helpende effect van de pol II-activator ook afhankelijk is van de aanwezigheid van de pol II-promotor en de pol II-versterker. Zoals getoond in figuur 4, vereiste een dergelijk helpend effect van de pol II-activator de aanwezigheid van zowel de pol II-versterker als de promotorsequenties, aangezien de deletie van een van deze elementen de stimulatie van SNR6 genexpressie. de afgenomen SNR6 expressie van de 'no-spacer', 'enhancer-deleted' en 'promoter-deleted' reporterstammen in aanwezigheid van zowel de pol II- als pol III-activatoren, in vergelijking met de aanwezigheid van de pol III-activator alleen, is waarschijnlijk te wijten aan tot hetzelfde niet-specifieke remmende effect (squelching) als in de controle-experimenten. In overeenstemming met deze verklaring werd ook een lichte afname van de groeisnelheid in aanwezigheid van de tot overexpressie gebrachte pol II-activator waargenomen voor alle geteste giststammen onder niet-selectieve omstandigheden (gegevens niet getoond). Deze resultaten laten zien dat de gelijktijdige aanwezigheid van pol II-enhancer en -promotor noodzakelijk is voor het helpende effect van de pol II-activator Lex-AD op de werking van Gal4DBD-τ138 op een grotere afstand tussen de bindingsplaatsen voor dit eiwit en de SNR6 volgorde.

We redeneerden dat de verminderde SNR6 expressie, veroorzaakt door een grotere afstand tussen de UAS G element en de SNR6 promotor kan worden gered door de vorming van een lus die de op afstand gelegen gebonden activator Gal4DBD-τ138 dicht bij de SNR6 promotor. Pol II-enhancer-activering in gist is beperkt tot een afstand van ∼1200 bp (5 – 7). Een gist-pol II-versterker die niet in staat is om een ​​reportergen te activeren vanwege zijn grote afstand tot de respectieve promotor (>1200 bp), zou daarom kunnen worden gered op een manier die vergelijkbaar is met de redding van de SNR6 uitdrukking. Reactivering van een ver verwijderde versterker zou daarom een ​​eiwit vereisen dat de versterker-promoter communicatie vergemakkelijkt door de versterker dicht bij de gereguleerde promotor te brengen, waardoor het tussenliggende DNA wordt doorgelust. GAGA, een eiwit dat wordt gecodeerd door de essentiële Trithorax-achtig ( tr ) gen van Drosophila melanogaster , is aangetoond dat het een groot aantal chromosomale taken uitvoert en vereist is voor de expressie van een breed scala aan verschillende genen (29 - 32). In vitro GAGA vergemakkelijkt de transcriptie van ver verwijderde versterkers door ze te koppelen aan hun verwante promotor door middel van oligomerisatie wanneer ze aan DNA zijn gebonden (24, 33, 34). Daarom is een factor als GAGA in staat om ver verwijderde versterkers te koppelen aan zijn respectievelijke promotor in vitro zou enhancers in staat moeten stellen om transcriptie te activeren vanaf grotere afstanden tussen enhancer en promotor dan die van nature voorkomen in gist. EEN lacZ reportergen geflankeerd door verschillende GAGA-elementen met vier USA G -bindingsplaatsen tussen het 3'-uiteinde van de' lacZ gen en de stroomafwaartse GAGA-elementen werden geïntegreerd in het genoom (Figuur 5A). Zoals verwacht van eerdere werken, activeerden noch de klassieke activator Gal4p noch GAGA, waarvan is aangetoond dat ze als een desilencer in plaats van een klassieke activator werken, de transcriptie van de lacZ reportergen (35). Co-expressie resulteerde echter in een lage maar robuuste expressie van de reporter. Dit is niet alleen opmerkelijk vanwege de ongekende afstand, maar ook omdat is aangetoond dat klassieke pol II-activators in gist niet werken vanuit posities stroomafwaarts van de TATA-box (36, 37). We concluderen daarom dat Gal4p wordt gerekruteerd in een regio stroomopwaarts van de TATA-box van de Gal1 promotor door de multimeriserende GAGA-factoren gebonden aan de overeenkomstige plaatsen stroomafwaarts en stroomopwaarts van de lacZ gen.


ENHANCER SUPPRESSOREN

Zoals eerder vermeld, vergeleken met chemische mutagenese, P-element mutagenese is inefficiënt omdat letale mutaties worden geproduceerd door slechts 12% van de inserties, terwijl EMS 60 tot 80% letale mutaties per chromosoom induceert. Er zijn twee strategieën ontwikkeld om te interfereren met endogene versterkers om de mutatie-efficiëntie van P elementen. De eerste blokkeert de activiteit van versterkers door gebruik te maken van a P element dat sequenties bevat die zijn gebonden door een eiwit genaamd Suppressor of Hairy-wing (Su[Hw]) dat de interactie van enhancers met endogene promoters blokkeert (Roseman et al., 1995 Figuur 2B). Su(Hw)-bindingsplaatsen werden oorspronkelijk ontdekt omdat ze nodig zijn voor de mutagene activiteit van zigeuner transponeerbare elementen (Corces en Geyer, 1991). Su(Hw) wordt tijdens de ontwikkeling in de meeste weefsels tot expressie gebracht (Harrison et al., 1993), en de associatie van dit eiwit met zijn bindingsplaats (aanwezig in wildtype zigeuner element) voorkomt interactie van een versterker met zijn promotor. Dus invoeging van a zigeuner element tussen een versterker en een promotor stelt Su (Hw) effectief in staat om de interactie tussen versterker en promotor te blokkeren (Holdridge en Dorsett, 1991 Roseman et al., 1993). P elementen die Su(Hw)-bindingsplaatsen bevatten, zijn bijzonder nuttig omdat de meeste P elementen worden ingevoegd in de 5'-regulerende sequenties van genen. de gewijzigde P elementen die de Su(Hw) bindingsplaatsen bevatten, werken als een krachtiger mutageen dan regulier P elementen, waarbij 27% versus 12% van de inserties letaliteit veroorzaakt (Roseman et al., 1995).

In een tweede strategie, gebaseerd op het EP-element, worden meerdere UAS-sites geïntegreerd voor een minimale promotor aan het 3'-uiteinde van de P element (Figuur 2C). Bij het inbrengen wordt de P element maakt ectopische expressie mogelijk van elk genomisch gen dat zich aan het 3'-uiteinde van de' P-elementinsertie (Rorth, 1996 Figuur 2C), waardoor de toegang van een endogene versterker tot zijn verwante promotor wordt voorkomen. Zoals weergegeven in figuur 2C, is de P element bevat, naast een Su(Hw)-bindingsplaats, in totaal 14 UAS-plaatsen stroomopwaarts van een Drosophila-promoter. Nadat een eerste set EP-inserties is gegenereerd, kunnen EP-bevattende stammen worden gekruist met stammen die GAL4 tot expressie brengen in een specifieke cel of weefsel, waardoor verkeerde expressie van genen in cellen of weefsels gespecificeerd door de GAL4-expressiestam mogelijk wordt. De GAL4-stam kan ofwel een enhancer-detectorstam zijn of een stam die GAL4 tot expressie brengt vanaf een gekloneerde promotor (Rorth, 1996, Rorth et al., 1998). Het voordeel van deze methode is dat deze voorwaardelijk is en zelfs screening op lethal-effect of steriele mutaties mogelijk maakt. Bovendien is het efficiënt omdat dezelfde set EP-stammen kan worden gebruikt om de effecten van verkeerde expressie in veel verschillende weefsels te bestuderen, door ze eenvoudigweg te kruisen met verschillende GAL4-stammen. Bovendien moet elk fenotype met functieverlies dat wordt veroorzaakt door het EP-element of de onnauwkeurige excisie ervan worden vergeleken met het fenotype dat wordt veroorzaakt door de ectopische expressie van genen die bij insertie worden geïnduceerd. De valkuil van deze strategie is natuurlijk dat overmatige of verkeerde expressie niet-specifieke fenotypes kan veroorzaken die niet gerelateerd zijn aan de normale functie van het gen.


Conclusies

Onze studie toont duidelijk aan dat de eerste maar distale versterker een essentiële rol speelt bij het handhaven van de basislijn van de doelgenexpressie. We stellen een versterkerketenmodel voor en onthullen een hiërarchisch mechanisme voor genregulatie dat de eerste versterker en meerdere redundante versterkers bevat. Een regulerend domein wordt gestart vanuit deze eerste versterker door stabiele primaire contacten op te bouwen met de doelpromotor, samen met een reeks overtollige versterkers die aan elkaar zijn geketend via versterker-versterker-interacties. Samenvattend geven onze bevindingen uit dit werk de distale en multi-contactkenmerken van de eerste kritische versterkers aan en kunnen ze inzicht verschaffen in het organisatiemechanisme van complexe regulerende domeinen.


Elektronisch aanvullend materiaal

Diagram van transgene constructies

Extra bestand 1: . Schema's met relevante details van de geteste transgenen en bijbehorende acroniemen. Kernelementen zijn onder meer: cfos - minimale promotor [34] KalTA4 - een geoptimaliseerd Gal4-VP16-fusie-eiwit [43] GI - beta-globine-intron van konijn om mRNA-stabiliteit te bevorderen [89] vader - SV40 of rundergroeihormoon polyadenylatiesequenties 2xNRSE - een tandemherhaling van een 21 bp consensus NRSE-site [33], lox - loxP recombinatie sites om transgene cassette swapping mogelijk te maken [92] UAS - 17 bp stroomopwaartse activatorsequentie [63] specifiek voor het Gal4 DNA-bindende domein (met aangegeven aantal herhalingen, bijv. 5x of 14x) E1b - een basale promotor uit karper beta-actine [37] CREST1 - een 800-bp enhancer-element gekenmerkt als een craniaal motorneuron-specifiek element [35] 2A - een varkens 2A virale peptidesequentie [86] die equimolaire expressie van multicistronische boodschappen bevordert [87] nfsB - Escherichia coli gen dat codeert voor het prodrug-converterende bacteriële enzym nitroreductase (Ntr) dat chemisch geïnduceerde celablatie bevordert [52, 53, 88] HIJ - een 365-bp-promotorelement van het zebravis-uitbroedingsenzym 1a locus (he1a) die gemakkelijke detectie van UAS-reporterlijnen mogelijk maakt bij afwezigheid van Gal4-VP16-stuurprogramma-elementen (zie aanvullend bestand 5). Fluorescerende verslaggevers inbegrepen: M-YFP - een membraan-gelabeld (dual palmitoylation sequentie van de Xenopus-kloof43 locus [93] 'verbeterd' geel fluorescerend eiwit (EYFP) M-tYFP - een membraangelabeld (hetzelfde als hierboven) monomeer 'tag' geel fluorescerend eiwit (tagYFP) mCherry - een monomeer rood fluorescerend eiwit [94]. (PNG 107 KB)

Enhancer trap vergelijkingen ±NRSE

Extra bestand 2: . Confocale beelden van een extra 12 NRCK (linker vak) en 6 CK (rechter vak) lijnen worden getoond ter ondersteuning van de fenotypische gegevens samengevat in figuur 1S. Elke regel wordt aangeduid met een transgeen allelnummer (bijv. gmc601) en met de fenotypische karakterisering (bijv. neuraal, gemengd, niet-neuraal) rechtsonder in elke beeldset. Aanvullende beeldgegevens met hoge resolutie zijn online beschikbaar op [47]. (PNG 2 MB)

Hoge resolutie beeldvorming van branchiomotor neuron labeling

Extra bestand 3: . (A-E) Confocale beelden van 6-dpf NRC1CK-5xY2N transgene lijn (Tg(2xNRSE-CREST1-cfos:KalTA4, 5xUAS-E1b:YFP-2A-nfsB)lmc003) die specifieke etikettering van branchiomotor neuron ganglia toont. Toen NRSE-sites stroomopwaarts van CREST1-cfos werden geplaatst, werd expressie beperkt tot subpopulaties van craniale motorneuronen, het expressiepatroon dat oorspronkelijk werd gekenmerkt als CREST1-gespecificeerd [35]. (B, C) Motorische ganglia-expressie omvatte hersenzenuw X (vagus, pijl in het gebied van de achterhersenen), VII (gezicht, pijlpunt omlaag), anterieure en posterieure V (trigeminaal, pijlpunt omhoog) IV en III (respectievelijk trochleair en oculomotorisch, rechts pijlpunt). (D, E) Niet-geïdentificeerde dalende spinale zenuw. (PNG 273 KB)

Vroege neuronale expressie van NRSE Gal4-drivertransgenen

Extra bestand 4: . Confocale beelden van 2-dpf triple transgene lijn (Et(2xNRSE-cfos:KalTA4) gmc607 Tg(14xUAS:nfsB-mCherry)c264 Tg(elavl3:EGFP)knu3) met typische vroege neurale expressie (pijlen geven dubbel gelabelde neuronale cellen aan) van NRCK-lijnen (NRSE Gal4-drivers). (PNG 373 KB)