Informatie

A7. Moleculaire basis van interacties met hoge affiniteit - biologie


Wat onderscheidt hoge en lage affiniteitsbinding op moleculair niveau? Hebben interacties met hoge affiniteit veel intramoleculaire H-bindingen, zoutbruggen, van der Waals-interacties, of zijn hydrofobe interacties het belangrijkst? Onlangs zijn de kristalstructuren van een verscheidenheid aan antilichaam-eiwitcomplexen bepaald om de basis van affiniteitsrijping van antilichaammoleculen te bestuderen. Het is algemeen bekend dat antilichamen die worden opgewekt bij blootstelling aan een vreemd molecuul (antigeen) aanvankelijk een lagere affiniteit hebben dan antilichamen die later in de immuunrespons worden afgegeven. Een ongelooflijk aantal verschillende antilichamen kan worden gemaakt door antilichaamproducerende B-cellen vanwege genetische mechanismen (combinatie van verschillende variabele regio's van antilichaamgenen door splitsing, onnauwkeurige splitsing en hypermutatie van kritische nucleotiden in de genen van antigeenbindende regio's van antilichamen). Klonen van antilichaamproducerende cellen met hogere affiniteit worden geselecteerd door binding en klonale expansie van deze cellen. Onderzoekers bestudeerden de kristalstructuur van 4 verschillende antilichamen die aan dezelfde plaats (epitoop) op het eiwitantigeen lysozym bonden. Verhoogde affiniteit was gecorreleerd met een groter begraven apolair oppervlak en niet met een verhoogd aantal H-bindingen of zoutbruggen.

Tabel: kenmerken van antilichaam: kippenei-lysozymcomplexen (HEL)
AntilichaamH26-HELH63-HELH10-HELH8-HEL
Kd (nM)7.143.600.3130.200
Intermoleculaire interacties
H-bindingen24252023
VDW-contacten159144134153
zoutbruggen1111

Begraven oppervlakte

ΔASURF (A2)1,8121,8251,8241,872
ΔASURF-polair (A2)1,1491,1011,0751,052
ΔASURF-apolair (A2)663724749820

Li, Y. et al. Natuur: structurele biologie. 6, blz. 484 (2003)

Elektrostatische interacties tussen biologische moleculen zijn nog steeds zeer belangrijke interacties, ook al beschouwen we ze als niet-specifiek. Wees getuige van de interactie van DNA-bindende eiwitten met positieve domeinen met het negatieve polyanion, DNA. De eerste ontmoeting zal elektrostatisch van oorsprong zijn en uiteraard belangrijk om de eiwitten op DNA te richten waar aanvullende specifieke interacties kunnen plaatsvinden.

In een soortgelijk voorbeeld (Yeung, T et al.), werd onlangs gemeld dat matig positief geladen eiwitten naar endosomen en lysosomen worden geleid door interacties met negatief geladen membraanfosfatidylserine (PS), terwijl meer positief geladen eiwitten naar het binnenoppervlak zijn gericht van het plasmamembraan, dat is verrijkt met PS en gefosforyleerde fosfatidylinositolderivaten (PIP2, PIP3), zoals hieronder weergegeven.

Figuur: negatief geladen fosfolipiden in biologische membranen

Om dit te bestuderen gebruikten ze het C2-domein van lactadherine (Lact-C2) uit melk dat PS bindt in aanwezigheid van calcium. Het C2-domein was covalent gekoppeld aan het groen fluorescerende eiwit, een eiwit dat een interne fluorofoor bevat die bestaat uit drie aminozuren (Ser65-Tyr66-Gly67) die spontaan cycliseren bij het vouwen om een ​​fluorofoor te produceren die groen licht uitstraalt. Een fusiegen van Lact-C2 en GFP werd geïntroduceerd in wildtype (WT) en mutante gist zonder PS. Het was gebonden aan de binnenfolder in WT-cellen en aan endosoom- en lysosoomblaasjes, maar werd diffuus gevonden door cytoplasma in mutante cellen. Ze maakten ook kationische sondes met farnesyl-staarten eraan vastgemaakt die de oplosbare sondes aan membranen konden verankeren. De meest positief geladen sondes werden gerekruteerd naar de binnenste bijsluiter van het plasmamembraan, terwijl de minder geladen sondes werden gerekruteerd naar interne blaasjes. De auteurs speculeren dat PS op cytoplasmatische membraanlagen signaaltransductie-eiwitten naar deze regio's kan richten.

Antilichamen met oneindige affiniteit. Chmura et al. PNAS. 98, blz. 8480 (1998)

Docking

De hierboven beschreven kwantitatieve methoden verduidelijken het mechanisme van binding niet. Er zijn computerprogramma's ontwikkeld waarmee een ligand (klein molecuul of zelfs een ander eiwit) aan een ander eiwit kan worden gekoppeld. De automatische koppeling van flexibele liganden aan eiwitten kan worden gemodelleerd met behulp van Autodock. AutoDock bevat de volgende programma's:

  1. AutoDock zorgt voor het koppelen van het ligand aan een reeks rasters die het doeleiwit beschrijven;
  2. AutoGrid berekent deze rasters vooraf;
  3. AutoTors stelt in welke bindingen als roteerbaar in het ligand zullen worden behandeld.

Moleculair Docking Web

Moleculaire dynamische simulaties kunnen ook worden gebruikt om de feitelijke bindings- en ontbindingsprocessen te bestuderen.

De overvolle cel

De meeste bindingsonderzoeken worden in vitro uitgevoerd met verdunningsconcentraties van zowel macromolecuul als ligand. Zijn deze omstandigheden illuster van omstandigheden in een cel? Het antwoord is nee! Cellen zijn erg vol met organellen, macromoleculaire complexen en cytoskeletcomponenten die de cel interne architectuur geven, enz. De totale macromolecuulconcentratie in de cel wordt geschat op zo hoog als 400 g/1L = 400 g/1000 ml = 0,4 g /ml = 400 mg/ml. Probeer een in water oplosbaar eiwit zoals albumine op te lossen tot die concentraties! Van 5 tot 40% van het totale cellulaire volume wordt ingenomen door grote moleculen, en in het bovenste bereik is er zeer weinig ruimte voor andere grote macromoleculen.


Bekijk de video: Bio bovenbouw - Samenlevingsvormen en populatiedynamiek - Ecologie #1 (November 2021).