Informatie

11: Recombinant DNA evalueren - biologie


  • 11.1: DNA klonen - Plasmidevectoren
    Veel bacteriën bevatten extra-chromosomale DNA-elementen die plasmiden worden genoemd. Dit zijn meestal kleine (enkele 1000 bp), cirkelvormige, dubbelstrengs moleculen die onafhankelijk van het chromosoom repliceren en in grote aantallen in een cel aanwezig kunnen zijn. In het wild kunnen plasmiden worden overgedragen tussen individuen tijdens bacteriële paring en soms zelfs tussen verschillende soorten. Plasmiden dragen vaak genen voor pathogeniteit en resistentie tegen geneesmiddelen.
  • 11.2: DNA-analyse - Gelelektroforese
    Een oplossing van DNA is kleurloos en behalve dat ze bij hoge concentraties viskeus is, is ze visueel niet te onderscheiden van water. Daarom zijn technieken zoals gelelektroforese ontwikkeld om DNA te detecteren en te analyseren.

Doel

Het doel van deze prospectieve studie was om de veiligheid en effectiviteit van recombinant humaan morfogenetisch eiwit-2 (rhBMP-2) op een absorbeerbare collageenspons (ACS) te evalueren in vergelijking met een autogeen bottransplantaat bij gebruik voor 2-traps maxillaire sinusbodemvergroting. De studie beoordeelde nieuwe botvorming, plaatsingsintegratie en functionele belasting na 6 maanden en op lange termijn gedurende 2 jaar.

Materialen en methodes

In totaal werden 160 proefpersonen gerandomiseerd, ingeschreven en gevolgd van januari 1999 tot februari 2004 in 21 centra in de Verenigde Staten. De proefpersonen met een aangeboren bothoogte van minder dan 6 mm werden behandeld met 1,50 mg/ml rhBMP-2/ACS of met een autotransplantaat. De hoogte- en dichtheidsmetingen werden gekwantificeerd door computertomografiescans. Kernbiopten werden verkregen bij plaatsing van tandimplantaten en gebruikt voor histologische analyse. De veiligheid werd geëvalueerd door middel van orale onderzoeken, röntgenfoto's, serumchemie en hematologie.

Resultaten

In elke groep werd 6 maanden postoperatief een significante hoeveelheid nieuw bot gevormd. De gemiddelde verandering in bothoogte bij de rhBMP-2/ACS-proefpersonen was 7,83 ± 3,52 mm versus 9,46 ± 4,11 mm voor de proefpersonen met een bottransplantaat. Zes maanden na tandheelkundige restauratie was het geïnduceerde bot in de rhBMP-2/ACS-groep significant dichter dan dat in de bottransplantaatgroep. Er werden geen duidelijke verschillen gevonden in de histologische parameters die tussen de 2 groepen werden geëvalueerd. Het nieuwe bot was vergelijkbaar met het oorspronkelijke bot in dichtheid en structuur in beide groepen. Het slagingspercentage voor de rhBMP-2/ACS-groep was 79% (64 van de 81 proefpersonen), en 201 van de 251 implantaten die in de bottransplantaatgroep waren geplaatst en 199 van de 241 implantaten die in de rhBMP-2/ACS-groep waren geplaatst, werden geïntegreerd, behouden , en functioneel 6 maanden na het laden. Er werden geen bijwerkingen geacht gerelateerd te zijn aan de rhBMP-2/ACS-behandeling. De autotransplantaatgroep bleek een percentage van 17% te hebben van langdurige paresthesie, pijn of loopstoornis gerelateerd aan de oogst van het bottransplantaat.

Conclusies

De resultaten van onze multicenter, gerandomiseerde, prospectieve, klinische studie hebben de effectiviteit en veiligheid van rhBMP-2/ACS aangetoond in vergelijking met bottransplantaat voor sinusbodemvergroting. Het primaire eindpunt van het onderzoek werd overschreden, en de implantaten die in rhBMP-2/ACS- en bottransplantaatgroepen waren geplaatst, presteerden op dezelfde manier na functionele belasting.


Invoering

De immuunrespons tegen virale pathogenen omvat specifieke en niet-specifieke mechanismen. Cytokinen zijn peptiden die een rol kunnen spelen bij de niet-specifieke immuniteit [1]. Interferon (IFN) is een soort zeer actief multifunctioneel glycoproteïne en het is een belangrijk cytokine met een breed scala aan biologische activiteiten [2]. Interferon is een secretoir glycoproteïne dat door de biologische cellen wordt geproduceerd wanneer het wordt blootgesteld aan de invloed van het virus of een ander inducerend middel [3]. Interferon heeft vele soorten biologische activiteit, zoals antivirale activiteit, immuunregulatie enzovoort [4]. Interferon is een belangrijk onderdeel van het afweersysteem van het lichaam. Interferon heeft een breedspectrumresistentie [5]. Wanneer interferon inwerkt op de organische weefselcellen van het lichaam, kan het het vermogen krijgen om weerstand te bieden aan een verscheidenheid aan virussen en microben [6]. Interferon heeft een strikte selectiviteit voor een somatische cel en heeft een relatieve soortspecificiteit. Maar de specificiteit is relatief, niet absoluut [7]. Interferon kan worden onderverdeeld in type I en type II [8]. Interferon van type I is een product van vele genfamilies, waaronder 14-20 interferon α genen, 1 soort interferon β gen interferon van type α bevat slechts één familielid, namelijk het interferon g [9]. Type I interferonen zijn de meest effectieve antivirale cytokinen. Type I interferon-genen bevinden zich op chromosoom 9, en zijn gescheiden in een “moderne” en een 𠇊ncestral” groep met onderscheidende effecten op de cellen. Interferonen α worden vertegenwoordigd door een grote familie van structureel verwante genen, terwijl IFN-β wordt gecodeerd door een enkel gen [1, 10, 11].

Het vlees en de eieren van Coturnix waren heerlijk in China en stonden bekend als 𠇊nimal's ginseng”. Momenteel is het aantal Coturnix opgehaald is ongeveer 200 miljoen in China, dat is 1/5 van de wereldproductie. Coturnix is een belangrijk onderdeel van de economische dierlijke productie in China. Maar het optreden van aviaire influenza en Newcastle-ziekten vormden een ernstige bedreiging voor de productie van Coturnix. tot stand brengen van de Coturnix immuunsysteem, op zoek naar een nieuwe en efficiënte immuunroute voor veiligheid maakt het noodzakelijk om te fokken Coturnix. Het onderzoek naar interferon bij dieren blijft daarentegen achter. Daar/Dit is nog steeds het hoofdverblijf/onderwerp? in fundamenteel onderzoek en klinische proeven, en de meeste concentreren zich op enkele dieren zoals varkens, kippen en vissen. Maar de laatste jaren is er grote vooruitgang geboekt. Er komen commercieel interferon van varkens, honden, kippen en recombinant interferon op de markt. Er zijn echter zeer weinig onderzoeksrapporten over de Coturnix interferon.


Klinische onderzoeken voor het verbeteren van TACE

De TACE-procedure varieert sterk tussen verschillende artsen en klinische centra, en de techniek en het aantal toedieningen voor het bereiken van maximale tumorregressie en optimaal resultaat blijft onduidelijk. Als zodanig zijn veel van de huidige klinische onderzoeken die TACE evalueren gericht op het onderzoeken van het gebruik van verschillende chemotherapeutische en emboliserende middelen om de procedure te optimaliseren, en er is ook veel belangstelling geweest voor het combineren van gerichte therapieën met de TACE-procedure [13]. Sorafenib, een multikinaseremmer die momenteel het enige systemische chemotherapeuticum is dat door de Amerikaanse FDA is goedgekeurd voor HCC-behandeling, is bijvoorbeeld ook interessant geweest voor gebruik in combinatie met TACE. Van sorafenib is bekend dat het VEGFR remt, wat angiogenese en overleving en groei van tumorcellen bevordert, en wordt geactiveerd door hypoxie. Aangezien de TACE-procedure zelf berust op een combinatie van chemotherapie met de inductie van een hypoxische tumormicro-omgeving om tumornecrose te initiëren, is er grote belangstelling geweest voor het gebruik van sorafenib in combinatie met de TACE-procedure om de activering van angiogenese door TACE-geïnduceerde hypoxie te remmen. Een klinische fase II-studie, de SPACE-studie, onderzocht echter het gebruik van sorafenib plus TACE met doxorubicine-afgevende kralen en vond geen significant verschil in tijd tot progressie bij HCC-patiënten vergeleken met TACE alleen [14]. Een fase III-onderzoek naar het gebruik van sorafenib in combinatie met TACE vond vergelijkbare resultaten [15].

Een aantal klinische onderzoeken hebben het gebruik van TACE in combinatie met andere gerichte anti-angiogene middelen geëvalueerd, maar de meeste hebben negatieve resultaten opgeleverd. Fase III-onderzoeken die bijvoorbeeld brivanib, een dubbele remmer van VEGFR en FGFR [16], en orantinib, een remmer van VEGFR en PDGFR [17] evalueerden, lieten beide geen verbeterde algehele overleving zien met combinatietherapie. Twee fase II-onderzoeken evalueerden bevacizumab, een anti-VEGF monoklonaal antilichaam, in combinatie met TACE, wat aantoonde dat het gebruik van bevacizumab antitumoractiviteit vertoonde, wat verdere studies rechtvaardigt [18,19], hoewel er momenteel geen fase III-onderzoeken gaande zijn.

Er is ook interesse in het evalueren van de haalbaarheid van op genen gebaseerde therapie in combinatie met TACE, dat het voordeel heeft van gelokaliseerde afgifte terwijl de systemische toxiciteit wordt verminderd, en het potentieel heeft om gepersonaliseerde geneeskunde-initiatieven te bevorderen door zich te richten op individuele tumorkenmerken. Verschillende eerdere klinische onderzoeken ter evaluatie van gecombineerde gentherapie en TACE-benaderingen hebben gemengde resultaten opgeleverd, maar een klinische fase II-onderzoek waarin recombinant adenovirus tot expressie wordt gebracht p53 tumorsuppressorgen in combinatie met TACE ( <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT02418988","term_id":"NCT02418988">> NCT02418988) en een klinische fase III-studie ter evaluatie het antitumorrecombinant humaan adenovirus type 5 in combinatie met TACE ( <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT01869088","term_id":"NCT01869088">> NCT01869088) zijn momenteel aan de gang [20]. Klinische onderzoeken naar farmacologische middelen of gentherapie in combinatie met TACE zijn samengevat in Tabel 1 .


2 soorten virale vaccins

Er is een grote diversiteit aan virale vaccins. In de handel verkrijgbare vaccins tegen virale pathogenen kunnen in drie algemene typen worden ingedeeld: levende verzwakte vaccins, geïnactiveerde vaccins en subunitvaccins (Fig. 1) [15]. Binnen deze algemeen aanvaarde classificatie kunnen verschillende technologische benaderingen worden toegepast, die aanleiding geven tot het ontwerp van verschillende subtypes van vaccins.

2.1 Levende verzwakte vaccins

Levende verzwakte virale vaccins gebruiken levende virussen en waren het eerste type vaccin dat werd gebruikt. Historisch gezien werden levende virussen aanvankelijk gebruikt door middel van inenting. Hoewel inentingsprocedures nog steeds worden gebruikt bij veterinaire vaccinatie, is dit voor menselijk gebruik niet langer het geval. Het enige type levende virussen dat voor menselijke vaccinatie wordt gebruikt, zijn levende verzwakte (gelicentieerde) of gevectoriseerde vaccins (in klinische ontwikkeling). Er zijn verschillende benaderingen om virussen te verzwakken. Een van de meest gebruikte procedures is het kweken van de virussen in vreemde gastheren, als dierlijke celculturen, waar ze slecht repliceren. Er zijn verschillende vaccins ontwikkeld met behulp van deze procedure, waaronder vaccins tegen poliovirus, mazelen of rubella [8]. Tegenwoordig kunnen levende verzwakte vaccins worden verkregen via aanvullende moleculaire strategieën zoals: herschikking (bijv. influenza en rotavirus) [16], mutatie of deletie van virale genen (bijv. denguevirus) [17], of codon-deoptimalisatie (bijv. poliovirus) [18] ]. Een punt van zorg met betrekking tot levende verzwakte vaccins is de mogelijkheid van terugkeer naar een virulente vorm, zoals gezien bij het eerste orale poliovaccin. In deze context bieden geïnactiveerde vaccins veiligere alternatieven voor verzwakte vaccins.

2.2 Geïnactiveerde vaccins

Geïnactiveerde vaccins worden gegenereerd door de ziekteverwekker te doden of te vernietigen. Dit kan worden bereikt met chemische middelen, bijvoorbeeld met formaline of formaldehyde, of fysiek door warmte of bestraling. Er zijn verschillende geïnactiveerde virale vaccins in de handel verkrijgbaar tegen bijvoorbeeld influenza, rabiës of poliovirus (Tabel 1). Naast een veiliger profiel in vergelijking met verzwakte virale vaccins, zijn geïnactiveerde vaccins ook stabieler. Hoewel geïnactiveerde vaccins voor sommige pathogenen behoorlijk effectief zijn, induceren ze voor andere geen effectieve en/of langdurige immuniteit, aangezien ze geen aanleiding geven tot een cytotoxische immuunrespons van T-cellen, wat belangrijk is om intracellulaire pathogenen als virussen efficiënt te bestrijden. Daarom worden vaak meerdere doses en hulpstoffen gebruikt [19].

Vaccintype Beschrijving Cellen Toestand ref.
Levend/verzwakt Oraal poliovaccin (OPV) – verzwakt vaccin geproduceerd door de passage van het virus door niet-menselijke cellen Vero licentie [ 119 ]
RotaTeq® – Pentavalent vaccin dat (vijf) levende verzwakte reassortant rotavirussen bevat Vero licentie [ 120 ]
Varilix® – Gevriesdroogd preparaat van verzwakt virus afgeleid van de Oka-stam, vaccin tegen varicella MRC5 licentie [ 121 ]
pokkenvaccin ACAM2000 – Verzwakt op vaccinia gebaseerd pokkenvaccin Vero licentie [ 122 ]
Geïnactiveerd Imovax® – Monovalent vaccin met geïnactiveerde hondsdolheid MRC5 licentie [ 123 ]
Havrix® – Geïnactiveerd hepatitis A-vaccin met formaldehyde MRC5 licentie [ 124 ]
Geïnactiveerd poliovaccin (IPV) – Trivalent geïnactiveerd poliovirus Vero licentie [ 125 ]
Optaflu® – Trivalent celkweek-afgeleid griepvaccin MDCK licentie [ 90 ]
Subeenheid Eiwit Flublok® – Recombinant trivalent hemagglutinine (rHA)-vaccin geproduceerd in insectencelcultuur met BEV's expresSF+ licentie [ 22 ]
Glycoproteïne B - recombinant afgeknot uitgescheiden vorm van gB CHO Fase II [ 126 ]
DEN1-80E – Geadjuveerd recombinant envelopeiwitvaccin ter bescherming tegen dengue-virus Drosophila S2 Fase l [ 127 ]
Subeenheid VLP GenHevacB® – Vaccinmiddelen hepatitis B bestaande uit PreS1 en preS2 van HBV S-antigeen geassembleerd tot HBV-achtige deeltjes CHO licentie [ 9 ]
Cervarix® – Vaccin tegen HPV-infectie bestaande uit HPV L1-capside-eiwit van HPV16 en HPV18 geassembleerd tot een HPV-achtig deeltje Hoog5 licentie [ 11 ]
NCT01596725 - Influenza-ruggengraat (M1-structureel eiwit) met HA en NA van influenza H1N1 Sf9 Fase l [ 128 ]
Subeenheid Vectored Vaccin Ad26.ENVA.01 – Ad26-vector voor de expressie van een gemodificeerd HIV-env-glycoproteïne (gp140HIV-1Clade A) HAAR.96 Fase II [ 129 ]
ChimeriVAX® – Chimeer YF17D/DEN-vaccin tegen dengue met behulp van een verzwakt gelekoortsvirus als vector die codeert voor PrM- en E-genen van dengue Vero Fase III [ 130 ]
AVX601 – Vaccin tegen HCMV het gebruikt alfavirus als vector voor de expressie van HCMV gB/pp65/IE1 Vero Fase l [ 131 ]

2.3 Subeenheidvaccins

Subeenheidvaccins bevatten slechts delen van de ziekteverwekker. Deze vaccins gebruiken immunodominante antigenen, specifieke delen van het virus (volledige eiwitten of peptiden) waarvan bekend is dat ze de aanmaak van neutraliserende antilichamen (Nabs) stimuleren. Virale subeenheidvaccins zijn een verdere ontwikkeling van geïnactiveerde virale vaccins, maar in plaats van antilichamen tegen alle pathogene antigenen te genereren, worden slechts één of slechts enkele antigenen gebruikt. De echte uitdaging bij de ontwikkeling van subeenheidvaccins is om te identificeren welke antigenen beschermende immuniteit induceren [20]. Voorbeelden van beschikbare subunit virale vaccins zijn het hepatitis B-vaccin (bijv. GSK's Engerix® of Merck's RecombivaxHB®) of het onlangs goedgekeurde griepvaccin Flublok® (Protein Sciences). De subeenheidvaccins voor hepatitis B worden geproduceerd door middel van recombinanttechnologie met behulp van gist- of CHO-cellen [9, 21]. Het Flublok®-vaccin is een recombinant trivalent hemagglutinine (rHA)-vaccin geproduceerd in insectencelcultuur met behulp van het baculovirus-expressiesysteem [22]. Net als bij geïnactiveerde vaccins zijn subeenheidvaccins stabiel en worden ze als veiliger beschouwd dan levende verzwakte vaccins. Hun belangrijkste nadeel is de lagere immuunrespons die wordt opgewekt in vergelijking met levend verzwakt, waarvoor gelijktijdige toediening van adjuvantia en vaak meerdere doses vereist is [15].

Complexe vaccinontwerpen zoals VLP's, DNA-vaccins, gevectoriseerde vaccins en gevectoriseerde VLP's-vaccins worden vaak geclassificeerd als subeenheidvaccins omdat ze slechts een paar antigenen van de ziekteverwekker verschaffen, hetzij in de vorm van eiwit of genetisch materiaal. Ten behoeve van deze review zullen we deze typen vaccins verder beschrijven.

VLP's zijn deeltjes die zichzelf assembleren uit van virus afgeleide structurele antigenen, die de driedimensionale structuur van de ziekteverwekker nabootsen. VLP's zijn niet-infectieus, replicatiedefect en bevatten geen genetisch materiaal. Daarom worden VLP's als veiliger beschouwd dan levende verzwakte vaccins.

VLP's kunnen worden onderverdeeld in niet-omhulde of omhulde VLP's op basis van hun structuur. Niet-omhulde VLP's zijn typisch samengesteld uit een of meer eiwitten van het virus die zichzelf assembleren tot deeltjes en geen gastheereiwitten incorporeren. Omhulde VLP's zijn complexere structuren omdat ze zijn gewikkeld in een lipidemembraan (een envelop) dat is afgeleid van de productiecel, waar doelantigenen zijn verankerd [23].

De geordende en repetitieve structuur die VLP's vertonen, heeft uitstekende zelfadjuvante eigenschappen die zowel aangeboren als adaptieve immuunresponsen kunnen opwekken [24]. VLP's kunnen inderdaad een effectieve immuunbescherming creëren zonder het gebruik van co-adjuvansmoleculen en vereisen lagere doses dan oplosbare eiwitantigenen (zie [25] voor een overzicht). Bovendien bevordert de VLP-structuur de opname ervan door antigeenpresenterende cellen (APC's) die essentieel zijn om langdurige immuunbescherming op te wekken [11]. APC's vertonen de vreemde antigenen die zijn gecomplexeerd met belangrijke histocompatibiliteitscomplexen (MHC's) op hun oppervlak. T-cellen kunnen deze complexen herkennen via hun T-celreceptoren (TCR's) die een immuunrespons starten door B- en CD8+-lymfocyten te stimuleren [24].

De eerste VLP die voor humaan gebruik was goedgekeurd, was het humaan papillomavirus (HPV)-vaccin Gardasil® van Merck, geproduceerd in gist [10] (Tabel 1). HPV Cervarix® werd kort daarna goedgekeurd en wordt geproduceerd met behulp van het Baculovirus Expression System (BEVS) dat gebruikmaakt van insectencellen [11]. Cervarix® is een bivalent HPV-vaccin (L1-eiwitten van HPV-16 en HPV-18) dat geïndiceerd is voor de preventie van baarmoederhalskanker en werd goedgekeurd door de EMA in 2007 en door de FDA goedgekeurd in 2009.

De structurele diversiteit en functionele veelzijdigheid van VLP voorspellen de intensivering van het VLP-onderzoek en de toekomstige ontwikkeling van innovatieve vaccinontwerpen.

DNA-vaccins werden ontwikkeld als bacteriële plasmiden die werden geconstrueerd om een ​​gecodeerd antigeen tot expressie te brengen. Ze worden in vivo toegediend door de cellen van de patiënt te transfecteren, waardoor zowel cellulaire als humorale immuniteit wordt opgewekt [26]. DNA-vaccins zijn goedgekeurd voor diergeneeskundig gebruik (bijv. West Nile-Innovator®-vaccin voor paarden [27] en Apex®-IHN voor zalmachtigen [28]), maar nog niet voor menselijk gebruik. Een van de eerste knelpunten in verband met DNA-vaccins was de lage potentie die is verbeterd door de ontwikkeling van efficiëntere toedieningssystemen in vivo en verbeterde formuleringen met adjuvantia (voor een overzicht van DNA-vaccins zie [26]).

Er zijn meer complexe subeenheidvaccins voorgesteld. De engineering van moderne vaccins op basis van verschillende soorten gevectoriseerde vaccins en VLP's zal in de volgende sectie verder worden besproken.


Subeenheid Vaccins

In plaats van de hele ziekteverwekker bevatten subeenheidvaccins alleen de componenten, of antigenen, die het immuunsysteem het beste stimuleren. Hoewel dit ontwerp vaccins veiliger en gemakkelijker te produceren kan maken, vereist het vaak de incorporatie van adjuvantia om een ​​sterke beschermende immuunrespons op te wekken, omdat de antigenen alleen niet voldoende zijn om adequate immuniteit op lange termijn te induceren.

Door alleen de essentiële antigenen in een vaccin op te nemen, kunnen bijwerkingen worden geminimaliseerd, zoals blijkt uit de ontwikkeling van een nieuwe generatie kinkhoestvaccins. De eerste kinkhoestvaccins, geïntroduceerd in de jaren 1940, bestonden uit geïnactiveerde Bordetella pertussis bacteriën. Hoewel ze effectief zijn, veroorzaakten volcellige kinkhoestvaccins vaak kleine bijwerkingen zoals koorts en zwelling op de injectieplaats. Dit zorgde ervoor dat veel mensen het vaccin mijden, en tegen de jaren zeventig had de dalende vaccinatiegraad geleid tot een toename van nieuwe infecties. Fundamenteel onderzoek bij het NIAID en elders, evenals door het NIAID ondersteund klinisch werk, hebben geleid tot de ontwikkeling van acellulaire (geen cellen bevattende) kinkhoestvaccins die zijn gebaseerd op individuele, gezuiverde B. kinkhoest componenten. Deze vaccins zijn even effectief als hele-celvaccins, maar het is veel minder waarschijnlijk dat ze bijwerkingen veroorzaken.

Sommige vaccins om bacteriële infecties te voorkomen, zijn gebaseerd op de polysachariden, of suikers, die de buitenste laag van veel bacteriën vormen. Het eerste gelicentieerde vaccin tegen Haemophilus influenzae type B (Hib), uitgevonden door NIH's National Institute of Child Health and Human Development en verder ontwikkeld door NIAID-ondersteunde onderzoekers, was een polysacharide vaccin. Het nut ervan was echter beperkt, omdat het geen sterke immuunrespons opwekte bij zuigelingen - de leeftijdsgroep met de hoogste incidentie van Hib-ziekte. NIH-onderzoekers ontwikkelden vervolgens een zogenaamde geconjugeerd vaccin waarin het Hib-polysacharide is bevestigd, of "geconjugeerd", aan een eiwitantigeen om verbeterde bescherming te bieden. Deze formulering verhoogde het vermogen van het immuunsysteem van jonge kinderen om het polysacharide te herkennen en immuniteit te ontwikkelen aanzienlijk. Tegenwoordig zijn er geconjugeerde vaccins beschikbaar om te beschermen tegen Hib-, pneumokokken- en meningokokkeninfecties.

Andere vaccins tegen bacteriële ziekten, zoals difterie- en tetanusvaccins, zijn bedoeld om immuunreacties op te wekken tegen ziekteverwekkende eiwitten, of toxines, die door de bacteriën worden uitgescheiden. De antigenen in deze zogenaamde toxoïde vaccins zijn chemisch geïnactiveerde toxines, bekend als toxoïden.

In de jaren zeventig luidde de vooruitgang in laboratoriumtechnieken het tijdperk van genetische manipulatie in. Een decennium later werd recombinant-DNA-technologie - waarmee DNA uit twee of meer bronnen kan worden gecombineerd - gebruikt om de eerste te ontwikkelen recombinant eiwitvaccin, het hepatitis B-vaccin. Het vaccinantigeen is een hepatitis B-viruseiwit dat wordt geproduceerd door gistcellen waarin de genetische code voor het virale eiwit is ingebracht.

Vaccins om infectie met het humaan papillomavirus (HPV) te voorkomen, zijn ook gebaseerd op recombinante eiwitantigenen. Begin jaren negentig ontdekten wetenschappers van het National Cancer Institute van NIH dat eiwitten uit de buitenste schil van HPV deeltjes kunnen vormen die sterk op het virus lijken. Deze virusachtige deeltjes (VLP's) veroorzaken een immuunrespons die vergelijkbaar is met die van het natuurlijke virus, maar VLP's zijn niet-infectieus omdat ze niet het genetische materiaal bevatten dat het virus nodig heeft om zich in cellen te vermenigvuldigen. NIAID-wetenschappers hebben een experimenteel VLP-vaccin ontworpen om chikungunya te voorkomen dat robuuste immuunresponsen opwekte in een klinisch onderzoek in een vroeg stadium.

Wetenschappers van het NIAID en andere instellingen ontwikkelen ook nieuwe strategieën om eiwitsubeenheidantigenen aan het immuunsysteem te presenteren. Als onderdeel van de inspanningen om een ​​universeel griepvaccin te ontwikkelen, ontwierpen NIAID-wetenschappers een experimenteel vaccin met het eiwit ferritine, dat zichzelf kan assembleren tot microscopisch kleine stukjes genaamd nanodeeltjes die een eiwitantigeen vertonen. Een experimenteel griepvaccin op basis van nanodeeltjes wordt geëvalueerd in een vroeg stadium bij mensen. De op nanodeeltjes gebaseerde technologie wordt ook beoordeeld als een platform voor de ontwikkeling van vaccins tegen het MERS-coronavirus, het respiratoir syncytieel virus (RSV) en het Epstein Barr-virus.

Andere relatief recente ontwikkelingen in laboratoriumtechnieken, zoals het vermogen om atomaire structuren van eiwitten op te lossen, hebben ook bijgedragen aan de vooruitgang in de ontwikkeling van subeenheidvaccins. Door bijvoorbeeld de driedimensionale structuur van een eiwit op het RSV-oppervlak gebonden aan een antilichaam op te lossen, identificeerden NIAID-wetenschappers een belangrijk gebied van het eiwit dat zeer gevoelig is voor neutraliserende antilichamen. Ze waren vervolgens in staat om het RSV-eiwit te modificeren om de structurele vorm waarin het de neutralisatiegevoelige plaats vertoont, te stabiliseren.

Hoewel de meeste subunitvaccins zich richten op een bepaalde ziekteverwekker, ontwikkelen wetenschappers ook vaccins die een brede bescherming kunnen bieden tegen verschillende ziekten. NIAID-onderzoekers lanceerden in 2017 een klinische proef in een vroege fase van een vaccin om door muggen overgedragen ziekten zoals malaria, zika, chikungunya en knokkelkoorts te voorkomen. Het experimentele vaccin, ontworpen om een ​​immuunrespons op muggenspeeksel op te wekken in plaats van een specifiek virus of parasiet, bevat vier recombinante eiwitten uit de speekselklieren van muggen.


Abstract

Een knelpunt voor productontwikkeling kan een betrouwbare expressie van actief doeleiwit zijn. Een breed scala aan recombinante eiwitten in ontwikkeling, waaronder een steeds groeiend aantal niet-natuurlijke eiwitten, wordt tot expressie gebracht in een verscheidenheid aan expressiesystemen. EEN Pseudomonas fluorescens expressieplatform is speciaal ontwikkeld voor de productie van recombinante eiwitten. De ontwikkeling van een geïntegreerde moleculaire toolbox van expressie-elementen en gastheerstammen, samen met de automatisering van stamscreening, wordt beschreven. Voorbeelden van stamscreening en opschalingsexperimenten laten een snelle ontwikkeling zien van expressiestammen die een grote verscheidenheid aan eiwitten in een oplosbare actieve vorm produceren.

Hoogtepunten

► Bacteriële recombinante eiwitexpressiesystemen worden besproken. ► We schetsen belangrijke moleculaire hulpmiddelen voor snelle recombinante eiwitproductie. ► Voorbeelden laten zien dat Pseudomonas fluorescens is een robuust en effectief productiesysteem voor oplosbare en actieve recombinante eiwitten.


Staphylococcus aureus is een wereldwijde ziekteverwekker die mastitis veroorzaakt in melkveestapels. Tekortkomingen in controleprogramma's hebben de ontwikkeling van vaccins tegen deze ziekteverwekker aangemoedigd. Deze studie evalueerde de vaccinkandidaat VacR, waaronder recombinant S. aureus eiwitklonteringsfactor A (rClf), fibronectinebindend eiwit A (rFnBP) en hemolysine bèta (rBt), geformuleerd met een nieuw immuunstimulerend complex. Er werden vergelijkingen gemaakt tussen gezonde drachtige vaarzen die ofwel VacR (N = 8 VacR-groep) of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) plus adjuvans (controlegroep) SC in het supramammaire lymfekliergebied op dag 45 en 15 vóór de verwachte afkalfdatum. Bloed- en voormelkmonsters werden 7 tot 60 dagen na het kalven verzameld.

Na het afkalven produceerden vaarzen in de VacR-groep een hoger totaal IgG (IgGtotaal) titers tegen elke component, in zowel serum (rBt, 3,4 × 105 rClf, 3,1 × 105 rFnBP, 2,3 × 10 5 ) als melk (rBt, 2,6 × 104 rClf, 1,3 × 104 rFnBP, 1,1 × 104 ), dan controlevaarzen (P < 0,0001). Er waren verhoogde concentraties van IgG1 en IgG2 in VacR-groep (P < 0,05), in zowel serum als melk. De humorale respons bleef hoog gedurende de periode die het meest vatbaar was voor intramammaire infecties (P < 0,01). Antilichamen geproduceerd tegen S. aureus rClf en rFnBP verminderden de bacteriële hechting aan fibronectine en fibrinogeen met respectievelijk 73% en 67% (P < 0,001). Melkantilichamen tegen deze adhesines geremd S. aureus invasie van een borstepitheelcellijn (MAC-T), resulterend in 15,7% van de bacteriën geïnternaliseerd (P < 0,0001). Er was een ongeveer 6-voudige verlaging van de hemolyse-titer voor het natieve hemolysine in de VacR-groep vergeleken met de controlegroep (P < 0,0001) en een significante toename van het aandeel positieve neutrofielen (VacR, 29,7% PBS, 13,1%) en de gemiddelde fluorescentie-index (VacR, 217,4 PBS, 152,6 P < 0,01) in de VacR-groep. De resultaten suggereren dat VacR een waardevolle vaccinkandidaat is tegen: S. aureus infecties, en verdient verdere veldproeven en experimentele uitdagingen.


Impact van het gebruik van verschillende promotors en matrixbevestigingsgebieden op het expressieniveau van recombinant eiwit en de stabiliteit in stabiel getransfecteerde CHO-cellen

Een hoog expressieniveau en expressiestabiliteit op lange termijn zijn vereist voor de productie van therapeutische eiwitten in zoogdiercellen. Drie veelgebruikte promotors van het simian virus 40 (SV40), het CHO-elongation factor 1α-gen (EF1α), en het humane cytomegalovirus major direct early gen (CMV) en twee matrixaanhechtingsgebieden van het kippenlysozymgen (cMAR) en het humane cytomegalovirus interferon β (iMAR) werden geëvalueerd voor het verbeteren van het niveau van recombinant genexpressie en stabiliteit in stabiel getransfecteerde CHO-cellen. Bij afwezigheid van MAR-elementen gaf de SV40-promotor een lager expressieniveau maar een hogere stabiliteit dan de EF1α-promotor en de CMV-promotor. De opname van MAR-elementen verhoogde niet de geïntegreerde genkopieën voor alle promotors, maar verhoogde het expressieniveau voor alleen de SV40-promotor. De verhoogde genexpressie was te wijten aan een toename van mRNA-niveaus. Geen van beide MAR-elementen verbetert de stabiliteit van genexpressie tijdens langdurige kweek. De combinaties van SV40-promoter- en MAR-elementen zijn de beste voor het verkrijgen van zowel een hoog expressieniveau als stabiliteit. De hier gepresenteerde informatie zou waardevol zijn voor degenen die vectoren ontwikkelen voor het genereren van CHO-cellijnen met stabiele en hoge productiviteit.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Gerandomiseerde studie ter evaluatie van recombinant humaan botmorfogenetisch proteïne-2 voor extractie-socketvergroting

Afdeling orale geneeskunde, infectie en immuniteit, Harvard School of Dental Medicine, Boston, MA.

Correspondentie: Dr. Joseph P. Fiorellini, Harvard School of Dental Medicine, Department of Oral Medicine, Infection and Immunity, 188 Longwood Ave., Boston, MA 02115. Fax: 617/432-1897 e-mail: [email protected] .edu .Zoek naar meer artikelen van deze auteur

Afdeling orale geneeskunde, infectie en immuniteit, Harvard School of Dental Medicine, Boston, MA.

Afdeling Parodontologie, University of Texas Health Science Center in San Antonio, San Antonio, TX.

Privé praktijk, Portland OR.

Wyeth/Genetics Institute, Cambridge, MA.

Universitaire kaak- en aangezichtschirurgie, Charlotte, NC.

Afdeling Tandheelkunde, Universiteit van Chicago, Chicago, IL.

Afdeling Parodontologie, University of Texas Health Science Center in San Antonio, San Antonio, TX.

Afdeling orale geneeskunde, infectie en immuniteit, Harvard School of Dental Medicine, Boston, MA.

Instituut voor geavanceerde tandheelkundige studies, Swampscott, MA.

Afdeling orale geneeskunde, infectie en immuniteit, Harvard School of Dental Medicine, Boston, MA.

Correspondentie: Dr. Joseph P. Fiorellini, Harvard School of Dental Medicine, Department of Oral Medicine, Infection and Immunity, 188 Longwood Ave., Boston, MA 02115. Fax: 617/432-1897 e-mail: [email protected] .edu .Zoek naar meer artikelen van deze auteur

Afdeling orale geneeskunde, infectie en immuniteit, Harvard School of Dental Medicine, Boston, MA.

Afdeling Parodontologie, University of Texas Health Science Center in San Antonio, San Antonio, TX.

Privé praktijk, Portland OR.

Wyeth/Genetics Institute, Cambridge, MA.

Universitaire kaak- en aangezichtschirurgie, Charlotte, NC.

Afdeling Tandheelkunde, Universiteit van Chicago, Chicago, IL.

Afdeling Parodontologie, University of Texas Health Science Center in San Antonio, San Antonio, TX.

Afdeling orale geneeskunde, infectie en immuniteit, Harvard School of Dental Medicine, Boston, MA.

Instituut voor geavanceerde tandheelkundige studies, Swampscott, MA.

Abstract

Achtergrond: Conventionele dentoalveolaire botreconstructie omvat vaak het gebruik van transplantatiematerialen met of zonder barrièremembranen. Het doel van deze studie was om de werkzaamheid van botinductie voor de plaatsing van tandheelkundige implantaten te evalueren door twee concentraties van recombinant humaan botmorfogenetisch eiwit-2 (rhBMP-2) afgegeven op een bioabsorbeerbare collageenspons (ACS) in vergelijking met placebo (alleen ACS). ) en geen behandeling in een model van een menselijk mondwanddefect na tandextractie.

Methoden: Tachtig patiënten die lokale alveolaire nokvergroting nodig hadden voor buccale wanddefecten (≥50% buccaal botverlies van de extractiekoker) van de maxillaire tanden (bicuspiden naar voren) onmiddellijk na tandextractie werden geïncludeerd. Twee opeenvolgende cohorten van elk 40 patiënten werden dubbel gemaskeerd en kregen 0,75 mg/ml of 1,50 mg/ml rhBMP-2/ACS, placebo (alleen ACS) of geen behandeling in een verhouding van 2:1:1. De werkzaamheid werd beoordeeld door de hoeveelheid botinductie te evalueren, de geschiktheid van het alveolaire botvolume om een ​​enossaal tandimplantaat te ondersteunen en de noodzaak van een secundaire augmentatie.

Resultaten: Assessment of the alveolar bone indicated that patients treated with 1.50 mg/ml rhBMP-2/ACS had significantly greater bone augmentation compared to controls (P ≤0.05). The adequacy of bone for the placement of a dental implant was approximately twice as great in the rhBMP-2/ACS groups compared to no treatment or placebo. In addition, bone density and histology revealed no differences between newly induced and native bone.

Conclusie: The data from this randomized, masked, placebocontrolled multicenter clinical study demonstrated that the novel combination of rhBMP-2 and a commonly utilized collagen sponge had a striking effect on de novo osseous formation for the placement of dental implants. J Periodontol 200576:605-613.


Bekijk de video: DNA REKOMBINANPLASMID REKOMBINANREKAYASA GENETIK (November 2021).